Summary
Her presenterer vi en protokoll for å utføre to-foton kalsiumavbildning i dorsalforhjernen til voksen sebrafisk.
Abstract
Voksen sebrafisk (Danio rerio) utviser et rikt repertoar av atferd for å studere kognitive funksjoner. De har også en miniatyrhjerne som kan brukes til å måle aktiviteter på tvers av hjernegrupper gjennom optiske bildebehandlingsmetoder. Rapporter om registrering av hjerneaktivitet hos voksne sebrafisk som oppfører seg har imidlertid vært mangelvare. Denne studien beskriver prosedyrer for å utføre to-foton kalsiumavbildning i den dorsale forhjernen til voksen sebrafisk. Vi fokuserer på tiltak for å hindre voksne sebrafisk i å bevege hodet, noe som gir stabilitet som muliggjør laserskanning av hjerneaktiviteten. De hodebeherskede dyrene kan fritt bevege kroppsdelene sine og puste uten hjelpemidler. Prosedyren tar sikte på å forkorte tiden for hodestøtteoperasjon, minimere hjernens bevegelse og maksimere antall registrerte nevroner. Et oppsett for å presentere et oppslukende visuelt miljø under kalsiumavbildning er også beskrevet her, som kan brukes til å studere nevrale korrelater underliggende visuelt utløst atferd.
Introduction
Kalsiumfluorescensavbildning med genetisk kodede indikatorer eller syntetiske fargestoffer har vært en kraftig metode for å måle nevronaktivitet hos dyr som oppfører seg, inkludert ikke-menneskelige primater, gnagere, fugler og insekter1. Aktiviteten til hundrevis av celler, opptil ca. 800 μm under hjerneoverflaten, kan måles samtidig ved hjelp av multifotonavbildning 2,3. Aktiviteten til spesifikke celletyper kan også måles ved å uttrykke kalsiumindikatorer i genetisk definerte nevronpopulasjoner. Anvendelse av avbildningsmetoden for små virveldyrmodeller åpner for nye muligheter innen nevronberegning på tvers av hjernegrupper.
Sebrafisk er et mye brukt modellsystem i nevrovitenskapelig forskning. Larvesebrafisk rundt 6 dager etter befruktning har blitt brukt til kalsiumavbildning på grunn av deres miniatyrhjerne og gjennomsiktige kropp4. Juvenil sebrafisk (3-4 uker gammel) brukes også til å studere nevrale mekanismer som ligger til grunn for sensorimotoriske baner 5,6. Imidlertid er det maksimale ytelsesnivået for kompleks atferd, inkludert assosiativ læring og sosial atferd, nådd i en eldre alder 7,8. Dermed er det nødvendig med en pålitelig protokoll for å studere flere kognitive funksjoner i hjernen til voksne sebrafisk ved hjelp av avbildningsmetoder. Mens sebrafisklarver og unge sebrafisk kan bygges inn i agarose for in vivo-avbildning, lider voksen sebrafisk ved 2 måneder eller eldre av hypoksi under slike forhold og er fysisk for sterke til å holdes tilbake av agarose. Derfor er det nødvendig med en kirurgisk prosedyre for å stabilisere hjernen og gjøre det mulig for dyret å puste fritt gjennom gjellene.
Her beskriver vi en hodestøtteprotokoll som innebærer en ny utforming av en enkelt hodestang. Den reduserte operasjonstiden på 25 min er dobbelt så rask som den tidligere metoden9. Vi beskriver også utformingen av opptakskammeret (semi-sekskantet tank), hodetrinnet og en hurtiglåsmekanisme for å kombinere de to delene9. Til slutt beskrives også oppsettet for å presentere en oppslukende visuell stimulans for å studere visuelt utløst hjerneaktivitet og atferd. Samlet sett kan prosedyrene beskrevet her brukes til å utføre to-foton kalsiumavbildning i genetisk definerte cellepopulasjoner i en hodebehersket voksen sebrafisk, noe som muliggjør undersøkelse av hjerneaktiviteter under ulike atferdsparadigmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica. Detaljer om forskningsverktøyene finner du i materialfortegnelsen.
1. Klargjøring av opptakskammer
- Forbered en semi-sekskantet tank, en bunnplate og et hodetrinn (figur 1A; Tilleggsfiler 1-3). Hodetrinnet består av to metallstolper festet til en sirkulær plate. Den sirkulære platen inneholder spor som kan låses på bunnplaten. Etter å ha blitt låst sammen, legges hodetrinnet og bunnplaten i bunnen av den halvsekskantede tanken.
- Plasser den halvsekskantede tanken på mikroskopets eksperimentelle plattform. Plattformen skal kunne bevege seg i X- og Y-retningen uten å treffe grensen for oversettelsestrinnet.
- Rett det 810 nm infrarøde (IR) lyset og kameraet mot hovedscenen for atferdsopptak. Sørg for at synsfeltet til kameraet er stort nok til å passe en voksen sebrafisk.
- For å forhindre at to-foton laseren og den visuelle stimulansen forstyrrer atferdsopptak, sett opp et 875 nm kortpassfilter og et 700 nm langpassfilter foran kameraet, henholdsvis.
- For å presentere den visuelle stimulansen, fest tilbakeprojeksjonsfilmer på innsiden av de tre veggene i den halvsekskantede tanken (figur 1A).
- Rett de tre projektorene mot tankens tre overflater. De tre bildene bør justeres for å danne en kontinuerlig visuell scene. For å forhindre at projektorlys forurenser kalsiumfluorescenssignalet, plasser et filter med nøytral tetthet og et rødt fargefilter (600 nm, langpass) foran hver projektor, og plasser et båndpassfilter (510/80 nm) foran fotomultiplikatorrøret (PMT).
Figur 1: Instrumenter som kreves for hodestøttekirurgi. (A) Hurtiglåsmekanismen mellom den sirkulære platen på hodetrinnet og bunnplaten inne i den halvsekskantede tanken. Dataassistert konstruksjon (CAD) av de skreddersydde delene finner du i tilleggsfiler 1-4. (B) Ω-formet hodestang for hodestøtten. (C) Den treaksede mikromanipulatoren som brukes til å plassere hodestangen til festestedet. Innfelt: orientering av hodestangen i leire. (D) Kanoner for å holde fisken under operasjonen. Innfelt: orientering av fisk i kanonen. (E) Lastemodul for fisk og mikromanipulatoren som brukes til å laste fisken på hodetrinnet. Innfelt: orientering av fisk i modulen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Hodestøtte kirurgi
- Forbered en Ω-formet hodestang (figur 1B; Tilleggsfil 4) for sebrafiskens hodestøtte. For å gjøre dette, fest et stykke oljebasert modelleringsleire til en treakset mikromanipulator. Sørg for at leiren er solid nok til å holde hodestangen, men myk nok til å løsne fra hodestangen etter hodestøtten.
- Sett en arm av hodestangen inn i leiren og orienter hodestangen horisontalt (figur 1C). Dette vil sikre at den senere festingen av hodestangen på sebrafisken blir jevn.
MERK: Hodestangen kan være laget av titan (24 mg) eller rustfritt stål (43 mg) og kan gjenbrukes til flere eksperimenter. Hodestangmaterialet påvirker ikke oppførselen til voksen sebrafisk (vektområder fra 300-1000 mg) under hodestøtte. - Forbered kanonen, et hult rør for å holde fiskekroppen på plass under operasjonen (figur 1D).
- Forbered 0,03% og 0,01% tricaine methanesulfonate (TMS; se materialfortegnelse) i fisketankvann. Dette vil bli brukt til å bedøve og vedlikeholde fisken i bedøvet tilstand under operasjonen.
- Forbered fire vevspinner for å fjerne overflødig hud og vann fra festestedene på skallen. For å forberede hver vattpinne, kutt et papirhåndkle i en 3 cm firkant og brett langs diagonalen for å produsere en rørlignende struktur. Vri endene av røret til et fint punkt. Festestedet er veldig lite, så et fint punkt gir finere kontroll over vattpinnen.
- Forbered en fiskelastingsmodul for mikromanipulatoren (figur 1E).
MERK: Modulen består av to stålstolper holdt sammen av en rettvinklet stolpeklemme. Den ene stolpen festes til mikromanipulatoren, mens den andre stolpen holder en roterende stolpeklemme som bærer fisken. Modulen brukes til å plassere fisken på hodestadiet med fin kontroll. Den roterende stolpeklemmen fungerer som en pitch adjuster for å endre pitchvinkelen på fisken. - Bedøv fisken med 0,03% TMS i fisketankvann. Gjennom de følgende trinnene, bruk en sprøyte for å levere 0,01% TMS i fisketankvann til munnen i korte pulser hver 90 s. Vannstrømmen fra perfusjonen skal indusere gjellebevegelse. Dette vil gjøre at fisken kan overleve i mer enn 40 min under operasjonen.
MERK: Tg [neuroD: GCaMP6f] brukes på grunn av sitt brede uttrykk for kalsiumindikatoren i forhjernen både ved larver og voksne stadier10.
MERK: Bruk eventuelt tyngdekraftperfusjon for å gi konstant vannstrøm til munnen i perioder i kirurgi hvor begge hender er opptatt. - Pakk fisken inn i en kapsel (figur 2A) som holder fisken inne i kanonen.
- Pakk den bedøvede fisken i et stykke fuktig papirvev fra spissen av halen til rundt 1 mm caudalt til gjellene. Sørg for at innpakningen er tett for å forhindre at fisken glir ut av vevet.
- Pakk et mykt plastrør med en langsgående spalt (f.eks. en mellomstor varmekrympeslange kuttet åpen) rundt papirvevet for å dekke fisken fra enden av halen til rundt 2 mm caudal til gjell. Slangen sørger for at fiskens kropp holder seg rett gjennom hele operasjonen.
- Pakk et papirhåndkle rundt slangen til en diameter som er omtrent lik kanonens diameter.
- Pakk et mykt plastrør kuttet fra pæren på en plastoverføringspipette rundt papirhåndkleet. Dette sikrer at kapselen kan lastes jevnt inn i kanonen.
- Last fisken inn i kanonen.
- Bruk en skalpell for å fjerne huden som dekker festestedene, to trekantede områder av skallen rostrolateralt til lillehjernen og over gjellene (figur 2B), og fjern deretter huden som dekker området mellom festestedene. Bruk tørkeservietter til å tørke ut festestedene og fjerne eventuell gjenværende hud.
- Bruk en justerbar plattform for å støtte hodet under hudfjerning, men plattformen må ikke komme i kontakt med øynene for å unngå øyeskade under operasjonen.
MERK: Grundig fjerning av huden på festestedene er avgjørende for å redusere bevegelsesartefakter under avbildning.
- Bruk en justerbar plattform for å støtte hodet under hudfjerning, men plattformen må ikke komme i kontakt med øynene for å unngå øyeskade under operasjonen.
- Påfør en dråpe vevslim (se materialfortegnelsen) i midten av hvert festested ved hjelp av en 10 μL pipettespiss.
NOTAT: Vevlim dekker festestedene og tørker raskt ut. Vevslimet gir et bindingsgrensesnitt mellom skallen og tannsementen som brukes til å lime hodestangen, og forhindrer vann fra gjellene i å nå festestedet. - Sett fiskekroppen i oppreist stilling og plasser hodestangen litt over og kaudalt til festestedene som forberedelse til liming av hodestang.
- Forbered dental sement (se materialfortegnelse) og bruk den umiddelbart til å lime hodestangen til skallen (figur 2C). Prosedyren er tidssensitiv og må gjøres innen 45 s.
- Bland en liten skje polymer med fire dråper rask monomer og en dråpe katalysator V. Rør blandingen jevnt i 15 s.
- Bruk en mikropipette og en 10 μL pipettespiss for å påføre blandingen på festestedene og området mellom stedene. Unngå å dekke gjellene og øynene.
- Trykk hodestangen forsiktig på sementen ved hjelp av mikromanipulatoren. Dekk hodestangen med gjenværende sement.
- Vent i 12 min for å tillate herding av dental sement. Unngå vannkontakt med sementen.
- For å forbedre optisk tilgang til forhjernen for kalsiumavbildning, fjern huden over telencephalon. Hudfjerning kan gjøres på 3 minutter med fem kutt ved hjelp av en skalpell (figur 2D). Pass på at lipiddråper som fester seg til overflaten av skallene fjernes.
- Etter herding, fjern leire fra hodestangen.
- Overfør hele kapselen fra kanonen til pitch-adjustereren i fiskelastemodulen til mikromanipulatoren.
- Bruk mikromanipulatoren til å plassere fisken. Hodestangen skal plasseres på toppen av metallstolpene på hovedtrinnet. Øk tonevinkelen på fisken litt, slik at overflaten av forhjernen bedre kan justeres til det optiske planet under to-foton avbildning.
- Lim hodestangen til metallstolpene med ultrafiolett (UV)-herdbart lim. En 15 s UV-eksponering er tilstrekkelig for herding.
- Trekk ut fisken fra kapselen og lås hovedtrinnet på bunnplaten i den halvsekskantede tanken.
- Fordyp dyret i fisketankvann. Fisken skal begynne å puste og komme seg fra anestesi innen 1-2 min.
MERK: Bruk eventuelt sprøyteperfusjon for å levere ferskvann til munnen.
Figur 2: Viktige trinn ved hodestøttekirurgi . (A) Kapselens sammensetning inne i kanonen. (B) Festesteder på skallen (rød). Røde piler angir blodkarsteder. (C) Øverst: hodestang festet til fiskeskallen. Bunn: fisk lastet på hodestadiet. (D) Kutt som trengs for å fjerne huden over forhjernen. Tall angir skjæresekvensen. Unngå hudfjerning på det merkede stedet (pilspiss) for å forhindre blødning av dyret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. To-foton bildebehandling
- Slå på laseren og vent i 30 minutter til strømmen stabiliserer seg. Sett bølgelengden til 920 nm og effekt til rundt 50 mW ved prøven.
MERK: Laserstrålen som styres av resonansskanneren, beveger seg sakte ved snupunktene i skannebanen. For å forhindre vevskader, brukes en Pockels-celle til å redusere laserkraften ved snupunktene. - Plasser registreringskammeret med den hodesikrede sebrafisken på forsøksplattformen (figur 3A). Plattformen skal kunne bevege seg i X- og Y-retningen uten å treffe grensen for oversettelsestrinnet.
- Plasser objektivlinsen så nær forhjerneoverflaten som mulig. Objektivlinsen skal være rettet mot forkanten av pupillen (figur 3B).
- Åpne laserlukkeren og aktiver PMT. Løft gradvis objektivlinsen (~1 mm) til den dorsale forhjernen avsløres i fluorescensbildet (figur 3C).
- For å øke antall registrerte nevroner, bruk en piezoaktuator for å ta bilder på flere dybder (seks bildeplan, 15 μm fra hverandre). Dette vil øke datautbyttet på bekostning av bildefrekvensen. Aktiver rask skanning på Z-aksen for å styre piezoaktuatoren (jevn modus, antall skiver = 6, trinnstørrelse = 15 μm, bølgeform = sagtann, flybacktid = 4 ms, aktuatorforsinkelse = 8 ms).
- For atferdsregistrering, slå på 810 nm infrarøde (IR) lys på begge sider av tanken. Juster vinkelen for å belyse hele kroppen, som skal være godt synlig i kameraet.
- Slå på projektorene.
- Start registrering av data.
Figur 3: Oppsett for å utføre kalsiumavbildning, atferdsregistrering og visuell stimulusvisning . (A) Tre projektorer presenterer en visuell stimulans på veggene i den semi-sekskantede tanken. IR-lys på siden brukes til å belyse sebrafiskens kropp. (B) Plassering av objektivlinsen. Venstre: sett forfra. Høyre: sett fra siden. Avstanden mellom 16x objektivlinsen og den målrettede hjerneregionen er rundt 2,5 mm. (C) Eksempel to-foton bilde. Venstre: maksimal projeksjon av hele den dorsale forhjernen i Tg[neuroD:GCaMP6f]. Høyre: zoomet inn bilde for å avsløre nevroner over flere hjernegrupper. Innfelt: en høyere forstørrelse fra en annen hjernegruppe. Bilder er gjennomsnitt av 10 s data registrert ved 5Hz. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen består av to deler: hodestøttekirurgi og to-foton kalsiumavbildning av nevronaktiviteter i forhjernen. Suksessen til kirurgi er definert av dyrets overlevelse og stabiliteten til hodestøtten. Overlevelsesraten kan forbedres sterkt ved hyppig perfusjon av 0,01% TMS-løsning gjennom munnen under operasjonen. Fisk skal komme seg fra anestesi og puste aktivt innen 1-2 min etter å ha blitt nedsenket i fisketankvann. To-foton kalsiumavbildning muliggjør aktivitetsregistrering av individuelle nevroner i den dorsale forhjernen på en dybde opp til 200 μm fra hjerneoverflaten gjennom intakte hodeskaller (~ 40 μm i tykkelse). Dette avbildningsområdet dekker flere soner i dorsaltelencephalon (D), inkludert medialsonen (Dm), rostraldelen av sentralsonen (rDc), den kaudale delen av sentralsonen (cDc) og lateralsonen (Dl). Til sammen utgjør de 30 % av telencephalonet hos voksne sebrafisk (Fig 3C). Med volumetrisk avbildning ved hjelp av piezoaktuatoren registrerer vi vanligvis aktiviteten til 150 nevroner i Dl eller cDc, og 300 nevroner i Dm og rDc i Tg [neuroD: GCaMP6f] 10. Samtidig atferdsopptak utføres under hjerneavbildning, noe som gjør det mulig å identifisere nevronkorrelater av motoriske utganger (figur 4).
Under to-foton avbildning bør halebevegelser ikke indusere en synlig bevegelsesartefakt i bildet. En liten (<1 μm) og forbigående bevegelse kan observeres under ekstrem kamp. Disse bevegelsene er vanligvis reversible, slik at avbildningen kan fortsette etterpå. Vi observerer også en langsom drift (<1 μm min-1) i lateral og aksial retning9. For å forhindre tap av nevroner på grunn av aksial prøvedrift, begrenser vi vanligvis vår bildebehandlingsøkt til 10 minutter. Fotobleking av kalsiumindikatoren bør ikke observeres etter en 10 min bildebehandlingsøkt under laserstyrken som er spesifisert.
Figur 4: Atferdssporing og nevral aktivitetsmønster hos voksne sebrafisker. (A) Et eksempel på kameraopptak av atferd (ventral visning). (B) Aktivitet av forhjernenevroner (ΔF / F, svart) og halebevegelsesintensitet (blå). Intensiteten av halebevegelsen ble kvantifisert ved gjennomsnittet av den absolutte pikselvise forskjellen mellom suksessive videorammer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Utforming av bunnplaten. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Utforming av den sirkulære platen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Design av den halvsekskantede tanken. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Utforming av hodestang. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 1: Feilsøkingsdetaljer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å begrense hodet til voksen sebrafisk for to-foton kalsiumavbildning. Det er to kritiske trinn for å oppnå en hodestøtte som er stabil nok til laserskanning. Først må hodestangen limes til de spesifikke festestedene til hodeskallene. Andre deler av skallen er ofte for tynne til å gi mekanisk stabilitet og kan til og med bli brukket under sterke kroppsbevegelser. For det andre må huden over festestedene fjernes grundig. Restvann bør også tørkes grundig. Dette gjør at skallen kan binde seg tett til vevslimet. En tabell som viser potensielle problemer, årsakene til dem og løsningene er gitt (tilleggstabell 1).
På grunn av den buede geometrien til sebrafiskens forhjerne, beveger eksitasjonsstrålen og den resulterende emisjonen seg gjennom forskjellige tykkelser av hjernevevet over bildeplanet. Dermed varierer fluorescensen av nevroner avbildet i en optisk seksjon basert på nevronets avstand fra hjernegrensen. Dette fører til lavt datautbytte i en opptaksøkt. Problemet er spesielt alvorlig ved avbildning av Dl og cDc (figur 3C). Her bruker vi en piezoaktuator til å utføre opptak over flere aksiale posisjoner, noe som kompromitterer bildefrekvensen, men øker antall registrerte nevroner. Det er viktig at ettersom nevronaktiviteter ved flere aksiale posisjoner registreres i en enkelt atferdsøkt, har dataene en høyere statistisk kraft sammenlignet med aktivitetsdata registrert fra flere atferdsøkter. Alternativt kan tre-foton imaging2 og adaptiv optikk11 registrere nevronaktivitetene i dype vev og slappe av problemet med høy krumning. Imidlertid bør repetisjonsfrekvensen av tre-foton lasere og den heterogene strukturen av skaller vurderes.
Sammenlignet med tidligere metoder 9,12 som bruker flere metalldeler for å stabilisere hodet, gjorde den nåværende tilnærmingen en betydelig forbedring ved å bruke et enkelt stykke av en Ω-formet hodestang. Denne forenklede designen reduserer operasjonstiden med 50%. Protokollen er også lettere å lære og kan vanligvis mestres innen 2 uker etter trening. Selv om operasjonstiden i stor grad er redusert sammenlignet med forrige protokoll9, observerte vi ikke åpenbare forskjeller i overlevelse eller atferd under hodestøtten. For eksempel er varigheten av tiden hvor dyret forblir aktivt under mikroskopet lik (3-8 timer, avhengig av dyret). Tiden som kreves for at dyret skal våkne opp fra anestesi etter operasjonen, er også lik (1-2 min). Den transgene linjen10 som brukes i denne protokollen involverer et enkelt transgen som koder for kalsiumindikatoren i forhjernen fra larvestadiet til voksen alder, lik uttrykkstidslinjen for den triple transgene linjen som ble brukt i en tidligere studie12.
For øyeblikket har protokollen følgende begrensninger. For det første kan nevronaktivitet avbildes gjennom skallen på en dybde opp til 200 μm fra hjerneoverflaten ved hjelp av et to-foton mikroskop. Bildekvaliteten på ulike dybder er tidligere kvantifisert 9,12. Disse bildedybdene gir tilgang til de dorsale forhjerneområdene Dm, Dc og Dl, men utelukker potensielt de ventrale forhjerneområdene Vv, Vs, Vp og Vd hos voksne sebrafisker. I tillegg er optisk tilgang til størstedelen av midthjernen og bakhjernen hindret av tilstedeværelsen av hodestang og tannsement. Ytterligere modifikasjoner av protokollen er nødvendig for å utføre avbildning i disse hjernegruppene. Videre begrenser vi vanligvis en bildebehandlingsøkt til 10 minutter for å forhindre betydelig prøvedrift. Den potensielle årsaken til driften er svekkelsen av bindingen mellom skallen og vevslimet etter kraftige halebevegelser. Hvis det er behov for lengre opptaksøkter, kan volumetrisk avbildning med små aksiale trinn etterfulgt av 3D-bilderegistrering utføres.
Denne hodestøtteprotokollen åpner for flere fremtidige applikasjoner. For det første kan to-foton kalsiumavbildning, optogenetiske manipulasjoner, elektrofysiologi eller til og med ultralydavbildning utføres in vivo. Med tre-foton avbildning kan nevronaktivitet over hele forhjernen også registreres2. I tillegg kan en mekanisk enhet konstrueres for å reversibelt gripe og frigjøre de to endene av hodestangen, noe som muliggjør langsgående undersøkelse av nevral aktivitet og kretsmorfologi over dager. Til slutt gir det visuelle displayoppsettet vi beskrev et 180° horisontalt synsfelt for dyret. Oppsettet kan brukes til å konstruere et oppslukende virtuelt virkelighetsmiljø som samhandler med hodebehersket fisk9. Samlet sett muliggjør denne protokollen aktivitetsmåling av nevronpopulasjoner over hele pallium for å oppføre seg voksen sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Institute of Molecular Biology, Academia Sinica og National Science and Technology Council, Taiwan. Maskinverkstedet ved Institutt for fysikk, Academia Sinica, hjalp til med å produsere spesialdesignede deler. Vi vil også takke P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Sveits) for utformingen av hurtiglåsmekanismen til hovedtrinnet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen - GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P.
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
