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Medicine

Tuina-Intervention im Kaninchenmodell der Kniearthrose

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65763
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1, 1, 3, 1, 3, 3
1Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 2Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 3Shandong University of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Tuina-Intervention in einem Kaninchenmodell der Kniearthrose.

Abstract

Die Kniearthrose (KOA) ist vor allem durch degenerative Veränderungen des Knorpels des Kniegelenks und der umliegenden Weichteile gekennzeichnet. Die Wirksamkeit von Tuina bei der Behandlung von KOA wurde bestätigt, aber der zugrunde liegende Mechanismus muss noch untersucht werden. Diese Studie zielt darauf ab, ein wissenschaftlich durchführbares KOA-Kaninchenmodell zu etablieren, das mit Tuina behandelt wurde, um die zugrundeliegenden Mechanismen aufzudecken. Zu diesem Zweck wurden 18 6 Monate alte männliche neuseeländische Kaninchen nach dem Zufallsprinzip in Schein-, Modell- und Tuina-Gruppen mit jeweils 6 Kaninchen eingeteilt. Das KOA-Modell wurde durch Injektion von 4%iger Papainlösung in die Kniegelenkshöhle etabliert. Die Tuina-Gruppe wurde 4 Wochen lang mit Tuina in Kombination mit der Kniegelenks-Rotationskorrekturmethode interveniert. Nur das Standard-Greifen und die Fixierung wurden in Schein- und Modellgruppen durchgeführt. Am Ende der 1-wöchigen Intervention wurde der Bewegungsumfang des Kniegelenks (ROM) beobachtet und eine Knorpelhämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) durchgeführt. Die Studie zeigt, dass Tuina die Chondrozyten-Apoptose hemmen, Knorpelgewebe reparieren und das Kniegelenk-ROM wiederherstellen kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie die wissenschaftliche Durchführbarkeit der Tuina-Behandlung für KOA-Modellkaninchen demonstriert und ihre potenzielle Anwendung bei der Untersuchung von KOA und ähnlichen Kniegelenkserkrankungen hervorhebt.

Introduction

Die Kniearthrose (KOA) ist eine degenerative Erkrankung des Kniegelenks, die sich hauptsächlich durch Knieschmerzen, Schwellungen, Verformungen und Bewegungseinschränkungen äußert, mit einer hohen Behinderungsrate und einer höheren Prävalenz bei Frauen, wobei im Jahr 2019 weltweit 527,81 Millionen Patienten mit Arthrose auftraten und ihre globale Prävalenz 60,6 % der gesamten globalen Prävalenz von OA ausmachte1. Klinisch wird die Behandlung der KOA in der Regel in nicht-chirurgische und chirurgische Therapien unterteilt. Zu den nicht-chirurgischen Therapien gehören Physiotherapie, Pharmakotherapie und Injektionstherapie mit plättchenreichem Plasma 2,3. Tuina ist eine gängige, sichere, zuverlässige und effektive Behandlungsmethode in der chinesischen Medizin. In dieser Studie wird Tuina in Kombination mit der Methode der Kniegelenks-Rotationskorrektur zur Behandlung von KOA eingesetzt. Tuina-Techniken wie die rotatorische Knet- und Pressmethode können das Muskelgewebe ausgleichen, Schmerzen lindern, den Entzündungsfaktorspiegel anpassen, den Gewebestoffwechsel verbessern und die Degeneration des Gelenkknorpels hemmen 4,5. Die Methode der Kniegelenks-Rotationskorrektur kann die Ausrichtung der Knochen und Gelenke der unteren Gliedmaßen anpassen, die Kniegelenkslücke verbessern, die normale Kraftlinie wiederherstellen und die Biomechanik der unteren Gliedmaßen ausgleichen 6,7,8,9. Widerstandsübungen können Muskelmasse und Kraft verbessern und die Erneuerung des Knorpelgewebes fördern10,11. Eine vorläufige Studie ergab, dass dieses Tuina-Protokoll bei der Behandlung von KOA signifikant wirksamer ist als orale Glucosaminsulfat-Kapseln, mit einem schnelleren Wirkungseintritt und einer signifikanten Hemmung der Chondrozytendegeneration und der Reparatur von geschädigtem Knorpelgewebe12. Bei der Behandlung von KOA haben nichtsteroidale Antirheumatika im Vergleich zur Tuina-Therapie Nebenwirkungen und eine unbefriedigende Langzeitwirksamkeit, relativ hohe chirurgische Risiken und Kosten und erfordern bestimmte Indikationen für eine chirurgische Behandlung mit postoperativen Problemen und periprothetischen Komplikationen13,14,15. Im Vergleich zu medikamentöser Therapie und Operation bietet die Tuina-Behandlung bei KOA mehrere Vorteile, darunter reduzierte Nebenwirkungen, geringeres Risiko, erhöhte Sicherheit, Kosteneffizienz und länger anhaltende Wirksamkeit. Darüber hinaus kann es Kniegelenkschmerzen, Schwellungen, Knacken und Bewegungseinschränkungen wirksam lindern 6,13,16,17.

Der Mechanismus von Tuina zur Behandlung von KOA muss jedoch geklärt werden, was die Verbesserung und Perfektionierung des Behandlungsprotokolls für KOA einschränkt. Daher ist die Untersuchung des Mechanismus der Tuina-Intervention bei KOA durch Tierversuche eine effektive Methode. Kaninchen haben im Vergleich zu Ratten ein sanftmütiges Temperament und größere Kniegelenke. Die anatomische Struktur und die biochemischen Indizes des Knorpels ähneln denen des Menschen, so dass es ein geeignetes Thema ist, um den Mechanismus der Kniegelenkserkrankung von Tuina18 zu untersuchen. Das KOA-Modell, das durch die Injektion von Papain in die Kniegelenkshöhle von Kaninchen etabliert wurde, hat die Vorteile einer kurzen Modellierungszeit, eines reduzierten Traumas, einer hohen Erfolgsrate, einer hohen Überlebensrate und eines ähnlichen pathologischen Mechanismus wie KOA19. Ziel dieser Studie ist es, ein wissenschaftlich durchführbares tierexperimentelles Protokoll für die Tuina-Intervention bei KOA zu etablieren und den Mechanismus von Tuina zu untersuchen.

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Protocol

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Affiliated Hospital der Shandong University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Zulassungsnummer: 2020-29).

1. Versuchstiere

  1. Aufzucht von 18 6 Monate alten, normal hochwertigen männlichen neuseeländischen Kaninchen (2,75 ± 0,25 kg) in Standard-Einzelkäfigen (12 h Hell-Dunkel-Zyklus, Temperatur 20-24 °C, Luftfeuchtigkeit 40%-60%).

2. Gruppierungsmethode

  1. Wählen Sie 6 der 18 neuseeländischen Kaninchen als Scheingruppe mit der Zufallszahlenmethode aus und ordnen Sie die restlichen 12 Kaninchen der Modellierungsgruppe zu.
  2. Nach erfolgreicher Modellierung teilen Sie die Modellierungsgruppe Kaninchen nach der Zufallszahlenmethode in die Modell- und Tuina-Gruppen auf, wobei sich in jeder Gruppe 6 Kaninchen befinden.
  3. Führen Sie die Tuina-Intervention in der Tuina-Gruppe durch. Führe das gleiche Greifen und Fixieren in der Schein- und Modellgruppe ohne Tuina durch. 4 Wochen lang jeden zweiten Tag anwenden (Abbildung 1).

3. Etablierung des KOA-Modells

  1. Führen Sie in Woche 1 eine adaptive Fütterung an Kaninchen im Standardzustand durch. Ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung. Legen Sie Kaninchen auf die rechte Seite in die Kaninchenfixierboxen, um sie 15 Minuten am Tag zu beruhigen. Befestigen Sie ihre Köpfe auf den Kopfbefestigungsplatten. Befestigen Sie die Befestigungsplatten und Schrauben so, dass sich die Kaninchen nicht bewegen können. Tragen Sie Schutzhandschuhe, wenn Sie die Kaninchen greifen und fixieren (Abbildung 1).
  2. Legen Sie an den Tagen 1, 4 und 7 von Woche 2 alle 18 Kaninchen auf der rechten Seite in die Kaninchen-Fixierboxen (Abbildung 1). Führen Sie die unten genannten Vorgänge aus.
  3. Injizieren Sie 3% Pentobarbital-Natrium (1 ml/kg) in die marginale Ohrvene des Kaninchens. Rasieren Sie das linke Kniegelenk des Kaninchens mit einem Tierrasierer, so dass keine Haare auf der freiliegenden Haut zu sehen sind.
  4. Desinfizieren Sie das linke Kniegelenk des Kaninchens von innen nach außen mit medizinischem Jodophor und 75%igem Alkohol (Abbildung 2A).
  5. Beugen Sie das linke Kniegelenk des Kaninchens um 60°. Führen Sie eine Nadel (22G, 0,7 mm x 30 mm) von Waixiyan ein. Injizieren Sie 4%ige Papainlösung (0,1 ml/kg, durchschnittlich 0,275 ml für ein 2,5 kg schweres Tier) in die Kniegelenkshöhle der Modellierungsgruppe. Injizieren Sie eine gleiche Menge 0,9%iger Natriumchloridlösung in die Scheingruppe. Diese Injektionsdosis wird vom Tier gut vertragen, ohne Anzeichen von Schmerzen oder Leiden zu verursachen (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Waixiyan (EX-LE5) befindet sich in der seitlichen Aussparung des Patellabandes und Neixiyan (EX-LE4) befindet sich in der medialen Aussparung des Patellabandes20,21,22.
  6. Drücken Sie 2 Minuten lang auf die Lochblende, um ein Verschütten der Lösung zu vermeiden.
  7. Lege deine Hände über und unter das linke Kniegelenk des Kaninchens. Beugen Sie das Kniegelenk des Kaninchens sanft und passiv und strecken Sie es 10-mal innerhalb des physiologischen Bewegungsbereichs (ROM), um die Lösung gleichmäßig in die Kniegelenkshöhle zu infiltrieren15. Beobachten Sie das Kaninchen für die Dauer der Modellierung alle 8 Stunden. Verabreichen Sie Buprenorphin SR (0,18 mg/kg), wenn die Kaninchen Anzeichen von Versteck, Zittern der Gliedmaßen, flacher und schneller Atmung oder sogar Beißen und Kratzen zeigen.
  8. In Woche 7 ist das linke Knie des Kaninchens in gebeugter Position geschwollen, mit erhöhtem Muskeltonus um das Knie mit Knötchen und Striae, erhöhter lokaler schmerzhafter Reizreaktion, vermindertem Knie-ROM, lahmem Gang und Verlagerung des Schwerpunkts auf die gesunde Seite. Dies bestimmt den Erfolg des KOA-Modells (Abbildung 1, Abbildung 2C)23,24.

4. Tuina-Manipulation

  1. Führen Sie vor der Manipulation von Tuina ein Training mit dem Instrument zur Bestimmung der Parameter der Tuina-Technik durch. Trainieren Sie 1 Monat lang 1 Stunde pro Tag mit demselben Fachmann.
    1. Führen Sie die rotatorische Knet- und Pressmethode mit dem Daumen auf der Tuina-Manipulationssimulationsplattform mit einer Kraft von 5 N und einer Frequenz von 60 Mal/min durch (Abbildung 3A,C).
    2. Analysieren Sie die Kraft in drei Richtungen der X-, Y- und Z-Achse mit der Tuina-Software zur Verarbeitung von Manipulationsparametern und überprüfen Sie die Größe, Frequenz und Aktionszeit der Kraft, die auf dem Bildschirm angezeigt werden (Abbildung 3B, D).
    3. Bewerten Sie die mechanischen Parameter der Tuina-Manipulation und standardisieren Sie die Tuina-Manipulation mit der Software während des Trainings. Halten Sie die standardisierte rotatorische Knet- und Pressmethode mit dem Daumen mit einer Kraft von 5 N, einer Frequenz von 60 mal/min und einer kontinuierlichen Betriebszeit von 10 min bei. Siehe die standardisierte quantitative Wellenform der Manipulation in Abbildung 3B, D25, 26, 27.
  2. Legen Sie das Kaninchen auf der rechten Seite in die Kaninchen-Fixierbox. Streicheln Sie das Kaninchen 10 Sekunden lang sanft, um das Kaninchen zu beruhigen und zu entspannen21. Führen Sie dann die Tuina-Intervention durch.
  3. Führen Sie die rotatorische Knetmethode mit dem Daumen auf die linken Kniegelenkmuskeln, Sehnenknoten und Patellamuskeln des Kaninchens durch, mit Auf- und Ab-Round-Trip-Manipulation mit einer Kraft von 5 N und einer Frequenz von 60 Mal/min für 5 Minuten.
  4. Drücken Sie mit dem Daumenende Yanglingquan (GB 34), Yinlingquan (SP 9), Waixiyan (EX-LE5), Neixiyan (EX-LE4), Heding (EX-LE2), Xuehai (SP 10), Liangqiu (ST 34) und Weizhong (BL 40)20,21,22 mit einer Kraft von 5 N und einer Frequenz von 60 Mal/min und betätigen Sie jeden Punkt 30 s lang.
  5. Führen Sie die rotierende Korrekturmethode am Kaninchenkniegelenk durch und führen Sie dies 3x separat für jedes Tier in der Gruppe durch.
    1. Fixieren Sie den Oberschenkelknochen mit einer Hand. Legen Sie die andere Hand zuerst hinter das Kniegelenk und fixieren Sie dann die lateralen und medialen Tibiakondylen mit Daumen bzw. Ringfinger. Fixieren Sie die Kniekehle mit dem Zeige- und Mittelfinger. Üben Sie Zug- und Drehkraft aus.
    2. Fixieren Sie den Oberschenkelknochen mit einer Hand. Fixieren Sie die medialen und lateralen Ränder der Kniescheibe mit dem Daumen und den kleinen Fingern der anderen Hand. Fixieren Sie die Patellabasis mit dem Zeige-, Mittel- und Ringfinger. Wenden Sie eine Verdrehkraft an.
    3. Halten Sie die Richtung der Zugkraft parallel zur Längsachse des Schienbeins und die Richtung der Torsionskraft in einer Linie mit der Richtung des unteren Xiyan. Verwenden Sie die Finger, um die Haut an Ort und Stelle zu halten, um Reibung zwischen der Haut und den Fingern zu vermeiden.

5. Vermessung des Kniegelenks-ROM

HINWEIS: Beruhigen Sie das Kaninchen vor der Messung. Der Messstatistiker und der Messtechniker unterscheiden sich voneinander.

  1. Messen Sie die Beweglichkeit des linken Kniegelenks von Kaninchen jeder Gruppe zu Beginn des Experiments und am Ende jeder Woche.
  2. Positionieren Sie das Kaninchen auf der rechten Seite in der Kaninchenfixierbox und fixieren Sie den linken Oberschenkelknochen mit einer Hand.
  3. Richten Sie die Mitte des Kreises des medizinischen Arthroskops an der lateralen Mitte des linken Kniegelenks des Kaninchens aus. Verlängern Sie den Fixationsarm so, dass er parallel zur Linienverlängerung verläuft, die die Mitte des Kreises mit dem Trochanter major verbindet. Strecken Sie den beweglichen Arm so aus, dass er parallel zur Längsachse des Schienbeins verläuft.
  4. Legen Sie die andere Hand auf die Längsachse des Schienbeins, ca. 9 cm vom Kniegelenk entfernt. Manuell ca. 750-850 g Drehmoment bei einer Winkelgeschwindigkeit von 3°/saufbringen 28.
  5. Führen Sie dies so lange durch, bis sich das Kniegelenk des Kaninchens nicht mehr bewegt. Notieren Sie die Anzahl der Grad, die das Goniometer anzeigt, wenn sich das Gelenk nicht mehr bewegt. das ist das Kniegelenk ROM. Achten Sie beim Lesen darauf, dass die Sichtlinie senkrecht zur Oberfläche des Lineals verläuft.
  6. Messen Sie das ROM für jedes Knie 3x und nehmen Sie den Durchschnittswert28.

6. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung

  1. Musterkollektion
    1. 1 Woche nach dem Ende des Eingriffs (Abbildung 1) legen Sie das Kaninchen auf die rechte Seite in die Kaninchenfixierungsbox (Kaninchen bleiben eher entspannt, wenn sie auf der rechten Seite liegen). Injektion von Pentobarbiton (100 mg/kg) in die Randvene des Kaninchenohrs zur humanen Euthanasie29,30.
    2. Öffnen Sie die linke Kniehöhle schnell mit einem Skalpell, einer Schere und einer hämostatischen Pinzette, um das Weichgewebe zu entfernen, das um den Knorpel des distalen Oberschenkelknochens herum befestigt ist.
    3. Eine ca. 1 cm x 1 cm große Knorpelknochenprobe des distalen Oberschenkelknochens wird mit einer Beißzange entnommen und zur Reinigung in Kochsalzlösung gelegt.
  2. Fixierung und Entkalkung
    1. Legen Sie den Knorpel in 4%ige Paraformaldehydlösung und fixieren Sie ihn 72 h lang.
    2. 12 h unter fließendem Wasser abspülen. 6 Wochen in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Entkalkungslösung entkalken. Wechseln Sie die EDTA-Entkalkungslösung alle 3 Tage. Bestimmen Sie den Endpunkt der Entkalkung, wenn das Knochengewebe weich und flexibel wird, leicht gebogen und mit einer Nadel31 glatt durchstochen werden kann.
  3. Austrocknung von eingebetteten Abschnitten
    1. Legen Sie die Probe zur Dehydrierung in einen automatischen Dörrautomaten.
    2. Legen Sie das gewachste und beschnittene Gewebe 1 h lang auf den Boden eines quadratischen Behälters mit gelöstem Paraffinwachs. Lege sie in einen Kühlofen, bis sie abgekühlt und zu harten Blöcken erstarrt sind. Schneiden Sie den in Paraffin eingebetteten Gewebeblock in einem Slicer auf eine Dicke von 4 μm.
    3. Falten Sie die Abschnitte in der Bleichmaschine auseinander, legen Sie sie dann auf selbstklebende Objektträger, nummerieren Sie sie und trocknen Sie sie mit einer Scheibenbackmaschine und einem Ofen.
  4. Entwachsung und Hydratation
    1. Die Stücke bei 65 °C 60 min backen.
    2. Die Abschnitte 7 Minuten lang in Xylol einweichen, gefolgt von 2 weiteren Runden in frischem Xylol für jeweils 7 Minuten.
    3. Die Scheibe 5 Minuten lang in wasserfreiem Ethanol einweichen, gefolgt von jeweils 2 Minuten in 95 % Ethanol, 85 % Ethanol und 75 % Ethanol.
    4. Die Abschnitte 2 Minuten lang in destilliertem Wasser einweichen.
  5. Hämatoxylin-Färbung: Färbeschnitte mit Hämatoxylin für 20 s. Spülen Sie die Abschnitte unter fließendem Wasser ab. Abschnitte in Salzsäure-Ethanol-Fraktionierung für 3 s einweichen. Spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in Leitungswasser ab.
  6. Eosin-Refärbung: Färben Sie Schnitte 30 s lang mit Eosin. Spülen Sie die Abschnitte mit Leitungswasser ab.
  7. Dehydrierung für Transparenz der Probe
    1. Die Abschnitte werden zweimal für jeweils 3 s in 95%iges Ethanol eingelegt, gefolgt von einem 3 s langen Einlegen in wasserfreies Ethanol.
    2. Legen Sie die Scheiben erneut für 1 Minute in wasserfreies Ethanol, gefolgt von 2 Runden Xylolwäsche für jeweils 1 Minute.
  8. Versiegelung der Scheiben: Nehmen Sie die Scheiben heraus, lassen Sie neutrale Gummiversiegelung fallen, decken Sie sie mit einem Deckglas ab und lassen Sie die Scheiben in einem Abzug trocknen, bis sie geruchlos sind.
  9. Fotografieren der Probe: Beobachten und fotografieren Sie unter dem Sichtfeld eines Lichtmikroskops bei 100x.
  10. Bewertung: Bewerten Sie das Knorpelgewebe anhand des Mankin-Scores für jede Gruppe32.

7. Datenanalyse

  1. Analysieren Sie die experimentellen Daten statistisch mit Hilfe einer Analysesoftware. Wenn die Daten einer Normalverteilung unterzogen wurden, vergleichen Sie zwei Gruppen von Stichproben mit dem t-Test und mehrere Gruppen mit einer unidirektionalen ANOVA.
  2. Drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus. Darstellen Sie die Ergebnisse als statistische Diagramme mit kommerzieller Software. Die Unterschiede waren bei p < 0,05 statistisch signifikant.

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Representative Results

Der Grad der eingeschränkten Beweglichkeit des Knies und der Schädigung des Knorpelgewebes spiegelt den Schweregrad der KOA wider. Das ROM des Kniegelenks spiegelt den Grad der Einschränkung der Kniegelenksbewegung wider. Je kleiner das Kniegelenks-ROM ist, desto gravierender ist die Einschränkung der Kniegelenksbewegung. Im Gegenteil, je größer das Kniegelenks-ROM ist, desto normaler ist der Grad der Kniebewegung. Die HE-Färbung zur Beobachtung der Morphologie und Struktur des Knorpelgewebes spiegelt den Grad der Schädigung des Knorpelgewebes wider. Je unregelmäßiger die Oberfläche des Knorpelgewebes, desto höher das Vorhandensein von Rissen und Defekten, je geringer die Anzahl der Chondrozyten, je dünner die Dicke der Knorpelschicht, je ungeordneter die Anordnung der Zellen, je ungleichmäßiger die Verteilung der Zellen, je unklarer die Schichten, desto weniger klar und vollständig die Gezeitenlinie, Je höher der Mankin-Score, desto schwerwiegender ist die Schädigung des Knorpelgewebes des Kniegelenks, und umgekehrt, desto normaler ist das Knorpelgewebe32. Bei der Erstellung des KOA-Modells kann der Erfolg der Modellierung durch die Beobachtung des Grades der Einschränkung der Kaninchenkniegelenksbewegung bestimmtwerden 23,24. Die Wirksamkeit von Tuina kann durch die Beobachtung der Verbesserung des Grades der Einschränkung der Kniegelenksbewegung und des Grades der Knorpelgewebeschädigung bei Eingriffen in das Kaninchenkniegelenk durch Tuina12 bestimmt werden.

Nach Woche 7 zeigte der Vergleich des linken Kniegelenks der beiden Kaninchengruppen, dass die Muskeln in der Modellierungsgruppe steifer waren und die Bewegung eingeschränkt war, mit einem ROM von 74,67° ± 1,21°, was niedriger war als die 140,17° ± 1,33° in der Scheingruppe, was auf eine erfolgreiche Modellierung hindeutet (Abbildung 2C, Abbildung 4).

Nach der 12. Mess- und Analysewoche betrug das Kniegelenks-ROM der Scheingruppe, der Modellgruppe und der Tuina-Gruppe 140,33° ± 1,37°, 76,33° ± 1,37° bzw. 134,33° ± 1,51°, und die Kniegelenksbeweglichkeit der Tuina-Gruppe war signifikant höher als die der Modellgruppe (p < 0,01), was darauf hindeutet, dass Tuina die Kniegelenksfunktion von KOA-Kaninchen verbessern konnte (Abbildung 5).

Die HE-Färbung des Knorpels des linken Kniegelenks von Kaninchen in jeder Gruppe zeigte, dass die Knorpelgewebeoberfläche der Scheingruppe glatt und intakt war, die Anzahl der Chondrozyten 331,67 ± 13,98 betrug, die Dicke der Knorpelschicht 259,42 ± 41,97 μm betrug, die Zellen gut angeordnet und gleichmäßig verteilt waren, die Werte klar waren, die Gezeitenlinien waren klar, kontinuierlich und vollständig, und der Mankin-Wert betrug 0,33 ± 0,52. Im Vergleich zur Scheingruppe war die Knorpelgewebeoberfläche der Modellgruppe unregelmäßig mit Defekten und Fissuren, die Anzahl der Chondrozyten betrug 29,50 ± 8,04, die Dicke der Knorpelschicht betrug 103,15 ± 24,64 μm, die Zellen waren ungeordnet, ungleichmäßig verteilt, die Schichten waren nicht klar, die Gezeitenlinien waren nicht klar und unvollständig, und der Mankin-Score betrug 9,33 ± 1,03. Im Vergleich zur Modellgruppe hatte der Knorpel der Tuina-Gruppe eine regelmäßige Oberfläche mit weniger Defekten und Fissuren, die Anzahl der Chondrozyten betrug 291,83 ± 8,18, die Dicke der Knorpelschicht betrug 183,58 ± 15,34 μm, die Zellen waren geordneter angeordnet, leicht ungleichmäßig verteilt, die Schichten waren klarer und die Gezeitenlinien waren relativ klar und vollständig, und der Mankin-Score betrug 3,00 ± 0,63 (Abbildung 6)15,23,33. Die Anzahl der Zellen, die Knorpelschichtdicke und der Mankin-Score waren in der Tuina-Gruppe signifikant besser als in der Modellgruppe (p < 0,001), was darauf hindeutet, dass Tuina das beschädigte Knorpelgewebe reparieren konnte.

Figure 1
Abbildung 1: Protokoll für die Etablierung und Tuina von KOA-Modellkaninchen. Nach adaptiver Fütterung von Kaninchen für 1 Woche wird das KOA-Modell 6 Wochen lang auf dem linken Kniegelenk der Kaninchen aufgebaut, mit Injektionen von 4%iger Papainlösung an den Tagen 1, 4 und 7 des Modellierungsbeginns. Das linke Kniegelenk der Kaninchen durch Tuina für 4 Wochen eingreifen, 1 Mal jeden zweiten Tag. Messen Sie nach 1 Woche Fütterung das ROM des linken Kniegelenks der Kaninchen und nehmen Sie Proben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Etablierung des KOA-Modells . (A) Das linke Kniegelenk der Kaninchen wurde präpariert und desinfiziert. (B) Die Nadel wurde aus Waixiyan eingeführt, und 4%ige Papainlösung und 0,9%ige Natriumchloridlösung wurden in die Kniegelenkshöhle von Modellier- bzw. Scheingruppen von Kaninchen injiziert. (C) Die erfolgreich geformten KOA-Modellkaninchen mit eingeschränkter Beweglichkeit des linken Kniegelenks. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Training für Tuina-Techniken mit dem Parameterbestimmungsinstrument der Tuina-Technik. (A) Trainieren Sie die rotatorische Knetmethode mit dem Daumen. (B) Die Kurve des rotatorischen Knetverfahrens mit dem Daumen. (C) Trainieren Sie die Pressmethode mit dem Daumenende. (D) Die Krümmung der Pressmethode mit dem Daumenende. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: ROM des linken Kniegelenks bei Kaninchen vor und nach der Modellierung. Die Daten wurden mittels t-Test über die Schein- und Modellierungsgruppen verarbeitet, und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. ns p > 0,05,***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: ROM des linken Kniegelenks von Kaninchen. Für die Schein-, Modell- und Tuina-Gruppen wurden die Daten von ANOVA verarbeitet, und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. In Woche 1 stieg der ROM in allen drei Gruppen leicht an. Im Vergleich zur Scheingruppe nahm das ROM in der Modell- und Tuina-Gruppe zum Zeitpunkt der Modellierung allmählich ab (p < 0,001). Im Gegensatz zur Modellgruppe stieg das ROM nach der Intervention in der Tuina-Gruppe allmählich an (p < 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: HE-Färbung des Knorpels des Kaninchenkniegelenks . (A) Die HE-Färbung der Scheingruppe. (B) Die HE-Färbung der Modellgruppe. (C) Die HE-Färbung der Tuina-Gruppe. (D) Vergleich der Anzahl der Chondrozyten zwischen den Gruppen. (E) Vergleich der Knorpelschichtdicke zwischen den Gruppen. (F) Vergleich des Mankin-Scores zwischen den Gruppen. Die Daten wurden von ANOVA verarbeitet, und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Nach 12 Wochen war das Knorpelgewebe der Gruppe, wie durch HE-Färbung zu sehen, strukturell intakt mit normaler Zellzahl und -anordnung; Das Knorpelgewebe der Modellgruppe war strukturell zerstört mit geringer Zellzahl und ungeordneter Anordnung; das Knorpelgewebe der Tuina-Gruppe war intakt mit relativ normaler Zellzahl und -anordnung. ***p < 0,001. Maßstabsbalken = 100 μm. N = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das Design des experimentellen Protokolls ist besonders wichtig, um den Mechanismus von Tuina bei der Behandlung von KOA zu untersuchen. Die KOA-Modellierung wurde an Kaninchen durch Injektion von Papain in Waixiyan durchgeführt. Waixiyan befindet sich in der lateralen Krypta des Patellabandes, die leicht zu lokalisieren ist, und der Gelenkspalt zwischen Oberschenkelknochen und Schienbein ist hier während der Kniebeugung groß, was die Injektion in die Kniegelenkshöhle erleichtert und eine Schädigung des umliegenden Gewebes verhindert, so dass es einfach ist, das KOA-Modell34 zu etablieren. Während der Tuina-Intervention bei KOA-Kaninchen wurden die Modellkaninchen entsprechend positioniert, um die Verabreichung von Tuina zu erleichtern. Die Kaninchen wurden in die Kaninchen-Fixierbox auf ihrer gesunden Seite gelegt, mit fixierten Köpfen, und ihre Emotionen wurden beruhigt, um ihren ganzen Körper zu entspannen und nicht zu kämpfen. Um die Stärke und Häufigkeit von Tuina zu standardisieren und die Homogenität der Tuina-Interventionen zu verbessern, wird Tuina von einem Bediener durchgeführt, der eine strenge Schulung in der Tuina-Manipulation mit dem Parameterbestimmungsinstrument der Tuina-Technik absolviert hat.

Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Verwendung von Tuina in Kombination mit der Kniegelenks-Rotationskorrekturmethode zur Behandlung von KOA. Vor der Operation wurde die betroffene untere Extremität des Kaninchens von der Hüfte bis zum Knöchel abgetastet, wobei der Schwerpunkt auf dem Bereich um das Kniegelenk lag, nach Sehnenknoten und Muskelsteifheit gesucht und dann das Kniegelenk gebeugt und gestreckt wurde, um die Höhe von Neixiyan und Waixiyan für eine präzise Tuina-Manipulation zu beobachten. Die rotatorische Knet- und Pressmethode kann Muskelverspannungen und Krämpfe lösen, die Durchblutung des Kniegelenks verbessern, den Stoffwechsel von Entzündungsstoffen fördern und Schwellungen und Schmerzen lindern35,36. Akupunkturpunkte sind die Reaktions- und Behandlungspunkte der Krankheit, und GB 34 und EX-LE2 sind Punkte mit hoher Empfindlichkeit für die Behandlung von KOA, und indem sie stimuliert werden, können sie auf Mastzellen einwirken und so die Freisetzung von 5-Hydroxytryptamin, Tryptase und Histamin37 beeinflussen. Das Data Mining ergab, dass GB 34, SP 9, EX-LE5, EX-LE4, EX-LE2, SP 10, ST 34 und BL 40 in der klinischen Praxis häufig verwendete Akupunkturpunkte sind38,39. Diese Punkte haben die Wirkung, Sehnen und Knoten zu entlasten, die Durchblutung zu aktivieren und Schmerzen zu lindern38,39. Studien haben gezeigt, dass die Stimulation der oben genannten Akupunkturpunkte die Serumspiegel von Entzündungsfaktoren wie Tumornekrosefaktor-α und Interleukin-1β senken und die Zerstörung des Chondrozytenskeletts hemmen kann, wodurch KOA 39,40,41 behandelt wird.

Die Methode der Kniegelenks-Drehkorrektur, die unter aktiven Widerstandsübungen mit einstellbaren Kraftstufen durchgeführt wird, ist einfach durchzuführen und vermeidet die potenzielle Verletzungsgefahr bei der Regulierung der Kniestruktur im Vergleich zu passiven Bewegungstechniken wie Beugung und Kompression. Der Winkel wirkt sich auf das Drehmoment aus, und ein Ungleichgewicht zwischen dem inneren Schließmoment des Kniegelenks und dem Abduktionsmoment kann die abnormale Gelenkbelastung erhöhen, was KOA42,43,44,45 auslösen kann. Einige Studien haben gezeigt, dass die Tuina-Intervention mit regelmäßigem Widerstandstraining die Knochendichte verbessern, Muskelkrämpfe lösen, Muskelmasse und Kraft wiederherstellen, Schmerzen lindern und KOA 46,47,48,49,50 effektiv behandeln kann. Da das Kaninchenknie kleiner ist als das menschliche Knie und keine willkürlichen Widerstandsbewegungen ausführen kann, wurde die ursprüngliche Zwei-Personen-Tuina durch eine Ein-Personen-Zweihand-Tuina ersetzt, um eine bessere Wirksamkeit und einfache Bedienung der Kniegelenk-Rotationskorrekturmethode unter Widerstand12 zu gewährleisten. Indem nun der Oberschenkelknochen des Kaninchens mit einer Hand fixiert wird, um die Widerstandsbewegung zu simulieren, wird mit der anderen Hand die Methode der Kniegelenksrotationskorrektur durchgeführt, indem Dreh- und Zugkraft auf den unteren Xiyan ausgeübt wird, so dass Waixiyan und Neixiyan auf der gleichen Höhe sind und die relative Höhe des medialen und lateralen Tibiaplateaus angepasst wird. Das Kniegelenk kann auch nach innen und außen eingestellt werden, um seine Drehmomente nach innen und außen zu regulieren, die axiale Ausrichtung zu fördern, die Ausrichtung der femorotibialen und femoropatellaren Gelenke anzupassen, die normale Kraftstruktur des Kniegelenks wiederherzustellen, die Kniegelenksbelastung zu reduzieren, die Kniegelenkstabilität zu erhöhen und die normale Beweglichkeit und physiologische Funktion des Kniegelenks wiederherzustellen42, 43,44,45.

Die früheren klinischen Studien des Teams haben die Wirksamkeit dieser Methode bei der Behandlung von KOA gezeigt, und Tierstudien haben gezeigt, dass sie bei der Behandlung von KOA12 wirksamer ist als Glucosaminsulfat. Tuina kann die Signalwege Interleukin 1β (IL-1β) und extrazelluläre signalregulierte Kinase 1/2 (ERK1/2)-nukleärer Transkriptionsfaktor κB (NF-κB) vermitteln, die Konzentration von IL-1β im peripheren Serum und in der Gelenkflüssigkeit von Kaninchen reduzieren, das Expressionsniveau des B-Zell-Lymphoms-2 (Bcl-2) erhöhen und die Expressionsniveaus von ERK1/2, Bcl-2-assoziiertem x-Protein, NF-κB p65 und Cystein-Aspartat-Protease 3 verringern. Dies hilft, die Apoptose und Proliferation von Chondrozyten zu regulieren und das gestörte innere Milieu der Chondrozyten auszugleichen, wodurch die pathologischen Veränderungen im Knorpel verbessertwerden 12.

Die Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass der Eingriff von Tuina von einem Menschen und nicht von einer Maschine durchgeführt wird und es für den Bediener schwierig ist, eine vollständige Homogenität der Stärke und Frequenz von Tuina zu erreichen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Tuina die Entzündung der Kniegelenke wirksam reduzieren, die Degeneration des Knieknorpels hemmen und die normale physiologische Beweglichkeit allmählich wiederherstellen kann, und diese Studie kann ein wissenschaftliches und praktikables Forschungsprotokoll für den Mechanismus der Tuina-Behandlung von Kniegelenkserkrankungen liefern.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass keine potenziellen Interessenkonflikte bestehen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Shandong Provincial Traditional Chinese Medicine Science and Technology Project (2021Q080) und das Qilu School of Traditional Chinese Medicine Academic School Inheritance Project unterstützt [Lu-Wei-Letter (2022) 93].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9 % sodium chloride injection Sichuan Keren Pharmaceutical Co. Z22121903
-20°C refrigerator Haier BD-328WL
4 % fixative solution Solarbio P1110
4°C refrigerator Haier SC-315DS
Anhydrous ethanol Sinopharm
Automatic tissue dewatering machine Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co. HP30
Blast drying oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co. DHG-9070A
Coverslip Biyuntian FCGF50
Electric thermostat water bath Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co. HWS-26
Embedding freezing table Changzhou Paishijie Medical Equipment Co. BM450
Embedding machine Changzhou Paishijie Medical Equipment Co. BM450A
Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solution Servicebio G1105-500ML
Fluorescent inverted microscope Leica Leica DM IL LED
Hematoxylin-eosin staining kit Cisco Jet EE0012
Hydrochloric acid Laiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant
Medical joint goniometer KOSLO
Neutral gum Cisco Jet EE0013
Normal-grade male New Zealand rabbit Jinan Xilingjiao Breeding and Breeding Center SCXK (Lu) 2020 0004
Papain(3000 U/mg) Bioss D10366
Pathological tissue bleaching and drying instrument Changzhou Paishijie Medical Equipment Co. PH60
Pet electric clippers Codos CP-3180
Rabbit fixing box any brand
Rotating Slicer Leica 531CM-Y43
Tuina technique parameter determination instrument Shanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd. ZTC-Equation 1
Ventilator TALY ELECTRIC C32
Xylene Fuyu Reagent

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Tuina-Intervention Kaninchenmodell Kniearthrose (KOA) degenerative Veränderungen Knorpel Weichteile Wirksamkeit von Tuina zugrundeliegender Mechanismus wissenschaftlich machbar KOA-Kaninchenmodell Tuina kombiniert mit Kniegelenks-Rotationskorrekturmethode Kniegelenksbewegungsumfang (ROM) Chondrozyten-Apoptose Knorpelgewebereparatur Kniegelenk-ROM-Wiederherstellung mögliche Anwendung
Tuina-Intervention im Kaninchenmodell der Kniearthrose
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Zhang, S., Zhang, X., Sun, G., Wang, … More

Zhang, S., Zhang, X., Sun, G., Wang, K., Qiao, Y., He, Y., Li, M., Li, H., Zheng, L. Tuina Intervention in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis. J. Vis. Exp. (198), e65763, doi:10.3791/65763 (2023).

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