Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65443
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University

Summary

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח הרכב גליקנים בדגימות ביולוגיות.

Abstract

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) הוא גישה חזקה וניתנת לשחזור לקביעה שיטתית של ההרכב והשפע היחסי של גליקנים וגליקו-מצומדים במגוון דגימות ביולוגיות, כולל רקמות צמחים ואצות, חומרי מזון ודגימות אדם, בעלי חיים ומיקרוביאליים. טכנולוגיית Microarray מבססת את יעילותה של שיטה זו על ידי מתן פלטפורמת סינון ממוזערת בתפוקה גבוהה, המאפשרת לאפיין אלפי אינטראקציות בין גליקנים ובדיקות מולקולריות ספציפיות מאוד המכוונות גליקן במקביל, תוך שימוש בכמויות קטנות בלבד של אנליטים. הגליקנים המרכיבים אותם מופרדים כימית ואנזימטית, לפני שהם מופקים ברצף מהדגימה ומושתקים ישירות על קרומי הניטרוצלולוז. הרכב הגליקן נקבע על ידי חיבור של גשושיות מולקולריות ספציפיות המזהות גליקן למולקולות הנסחטות והמודפסות. MAPP משלים טכניקות ניתוח גליקן קונבנציונליות, כגון ניתוח חד-סוכר והצמדה וספקטרומטריית מסות. עם זאת, בדיקות מולקולריות זיהויות גליקן מספקות תובנה לגבי התצורות המבניות של גליקנים, אשר יכולות לסייע בהבהרת אינטראקציות ביולוגיות ותפקידים פונקציונליים.

Introduction

גליקנים נמצאים בכל תחומי החיים ומפגינים גיוון חסר תקדים במבנה ובתפקוד בהשוואה למקרומולקולות אחרות1. עם זאת, בשל מורכבותם, השונות בביוסינתזה ובקשרים גליקוזידיים, ומיעוט השיטות המתאימות לניתוח מבנים גליקניים, הבנתנו את המגוון הזה במבנים ובפונקציות מוגבלת יחסית2.

טכניקות ניתוח גליקנים רבות הן הרסניות ומחייבות פירוק של גליקנים לחד-סוכרים המרכיבים אותם, מה שיכול לטשטש הקשרים תלת-ממדיים וביולוגיים רלוונטיים3. לעומת זאת, נוגדנים חד-שבטיים (mAbs), מודולים קושרי פחמימות (CBM), לקטינים, אגלוטינינים נגיפיים ודבקים מיקרוביאליים, הידועים ביחד כבדיקות מולקולריות מזהות גליקן (GRMPs)4, מזהים אפיטופים ספציפיים ונקשרים אליהם, וניתן להשתמש בהם ככלים לזיהוי ולהבחנה בין גליקנים בתוך מטריצות מורכבות מרובות גליקנים 5,6.

כאן, אנו מציגים פרופיל פולימרי microarray (MAPP), שיטה מהירה, רב-תכליתית ולא הרסנית לניתוח גליקן הישימה למגוון רחב של דגימות ביולוגיות. השיטה נועדה לספק טכנולוגיה חזקה ובעלת תפוקה גבוהה לניתוח גליקנים ממערכות ביולוגיות ותעשייתיות/מסחריות מגוונות. MAPP מאחד את ספציפיות הזיהוי של בדיקות מולקולריות מכוונות גליקן עם טכנולוגיית סינון microarray הניתנת לשכפול ובעלת ביצועים גבוהים כדי לאפשר פרופיל של אלפי אינטראקציות מולקולריות במקביל. התוצר של גישה זו הוא תובנה אבחנתית לגבי ההרכב והשפע היחסי של גליקנים בתוך מדגם או רקמה מעניינת.

MAPP יכול לשמש כשיטה עצמאית, עצמאית, או בשילוב עם טכניקות ביוכימיות אחרות, כגון מיקרוסקופ immunofluorescence 7,8,9 ו monosaccharide או ניתוח קישור10,11. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי למפות אפיטופים ספציפיים של GRMPs חדשים, באמצעות מערכים המודפסים עם תקני אוליגוסכריד טהורים ומוגדרים היטב מבחינה מבנית12. יתרון עיקרי של MAPP על פני שיטות אחרות, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), הוא התאימות שלה עם נפחי מדגם קטנים13,14. יתר על כן, MAPP מציע ניתוח תפוקה גבוהה משמעותית15 ומספק צורה יעילה של שימור דגימה, מכיוון שהדגימות המודפסות יבשות ויציבות כאשר הן משותקות על ניטרוצלולוז16.

הקשירה של GRMPs תלויה בדרך כלל בנוכחות של מספר שאריות סוכר רציפות היוצרות יחד אתר קשירה (אפיטופ) ייחודי למחלקה פוליסכרידית מסוימת (קסילן, מנאן, קסילוגלוקן וכו'). 17. לעומת זאת, שאריות הסוכר הבודדות (קסילוז, מנוז, גלוקוז) שמכומתות באמצעות רוב הטכניקות הביוכימיות, למשל הרכב חד-סוכרי או ניתוח מתילציה, יכולות להיות רכיבים של מחלקות פוליסכריד מרובות ולכן קשה להקצות אותן18.

MAPP פותח בתגובה לפער טכנולוגי, כלומר היכולת לנתח במהירות גליקנים מרובים ממגוון מקורות תוך שימוש בכמויות קטנות של חומר. MAPP מנצל את הרפרטואר הנרחב של GRMPs שפותחו ואופיינו במהלך שלושת העשורים האחרונים: 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. הפיתוח של MAPP היה תהליך איטרטיבי, עם הטכניקה להיות מעודן בהתמדה אופטימיזציה. כיום קיים גוף ספרות משמעותי המתאר את היישום של MAPP במערכות טבעיות ותעשייתיות שונות שבהן גליקנים ממלאים תפקידים מרכזיים 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. כאן, אנו מתארים את המצב הנוכחי של האמנות עבור MAPP.

Protocol

שלבי הניסוי העיקריים של שיטת MAPP מסוכמים באיור 1.

1. הכנת דוגמאות

הערה: כאן, השיטה מיושמת על רקמות צמחים למטרות המחשה. הצמחים שנבחרו היו Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon, וכמה זני מנגו תאילנדי (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok, ו Nga). המפעלים נבחרו בשל חשיבותם המסחרית. עיבודם לצריכה אנושית מייצר פסולת אגרו-תעשייתית שאינה מנוצלת כיום, אשר עשויה לספק מקור למוצרים בעלי ערך מוסף, כולל גליקנים טהורים. לפיכך, MAPP יושם כדי לאפיין את ההרכב הגליקני של ביומסה צמח פסולת למטרות bioprospecting.

  1. הפרידו את החומר הצמחי לרקמות שונות (למשל, שורש, גזע ועלים).
  2. יבשו את רקמות הצמח בתנור אוויר חם בטמפרטורה של 40°C למשך 12-24 שעות (צמצמו/הגדילו את הזמן בהתאם לדגימה). לחלופין, הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי ולאחר מכן lyophilize במשך ~ 4 ימים.
  3. הומוגניזציה של הדגימות לאבקה דקה באמצעות מזיק וטיט או לייזר רקמות מכני (ראה טבלת חומרים) עם מיסב כדורי בכל צינור.
    הערה: עבור רקמת צמח טרייה, מומלץ לייבש או ליופיליזציה לפני הומוגניזציה. בדרך כלל, הומוגניזציה עם מזיק וטיט מספיקה לרוב הדגימות היבשות. עבור דגימות עמידות במיוחד, כגון דגנים, קטניות ופריטי מזון מעובדים כמו פסטה, הקפאה מהירה בחנקן נוזלי יכולה להגביר את המהירות והיעילות של הומוגניזציה של דגימות. מצאנו כי הומוגניזציה מכנית תואמת כמעט לכל סוגי הדגימות, היא מהירה משמעותית ודורשת פחות עבודה, וממזערת ביעילות את הסיכון לזיהום צולב של דגימות משימוש חוזר באותו ציוד (כלומר, מזיק וטיט).

2. הכנת שאריות אלכוהול בלתי מסיסות (AIR)

  1. הוסף 1.5 מ"ל של אתנול 70% (v/v) ל 50-100 מ"ג של חומר דגימה מיובש באוויר הומוגני.
  2. מערבלים היטב כדי לערבב ולאחר מכן צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט שנוצר באמצעות פיפטה ושמרו על הכדור.
  3. לגלולה הנותרת יש להוסיף 1.5 מ"ל מתנול וכלורופורם (1:1 [v/v]). מערבולת, צנטריפוגה, ולהשליך את הסופרנטנט, לפי שלב 2.2.
  4. לגלולה הנותרת, להוסיף 1.5 מ"ל של 100% אצטון. מערבולת, צנטריפוגה, ולהשליך את הסופרנטנט, לפי שלב 2.2.
  5. הניחו את הגלולה המתקבלת למשך הלילה במכסה אדים כדי לאפשר לשאריות האצטון להתאדות או בצנטריפוגת ואקום עד לייבוש.
    הערה: ניתן לאחסן את חומר האוויר בטמפרטורת הסביבה עד לצורך.

3. מיצוי גליקן

הערה: במידת האפשר, בצע את כל שלבי החילוץ בליזר רקמות עם מיסב כדורי בכל צינור כדי לסייע בהשעיה. אם לייזר רקמות אינו זמין, ניתן לבצע במקום זאת עקירות עם ערבוב או ניעור מתמשך. ייתכן שיהיה צורך להאריך את זמן החילוץ אם הדבר אינו אפשרי.

  1. ל-10 מ"ג של חומר AIR, יש להוסיף 30 μL/mg של 50 mM cyclohexanediaminetetraacetic acid (CDTA; ראו טבלת חומרים), pH 7.5.
  2. נערו ב-27 הרץ במשך 2 דקות, ולאחר מכן 10 הרץ במשך שעתיים.
  3. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C. שמרו על הסופר-נטנט שנוצר, הוסיפו אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C על שייקר סיבובי.
  4. לכדורית השיורית יש להוסיף 30 μL/mg 4 M NaOH + 0.1% (w/v) NaBH4.
    אזהרה: NaBH4 רעיל בבליעה. השתמש בציוד מגן אישי (PPE). יש לטפל מתחת למכסה מנוע. יש להימנע מהיווצרות אבק. הימנעו מנשימת אבק. אין לאפשר למוצר לבוא במגע עם מים.
  5. חזור על שלבים 3.2 עד 3.3. שטפו את הגלולה השיורית פעמיים או שלוש עם dH2O כדי להסיר את שאריות NaOH.
  6. יש להוסיף 30 μL/mg צלולאז (רצוי GH5 endo-1,4-β-glucanase, במאגר אנזימים מתאים - לפי המלצת היצרן; ראה טבלת חומרים) לגלולה ולדגור בטמפרטורה האופטימלית של האנזים למשך 16 שעות.
  7. צנטריפוגה הדגימות ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C . שמרו על הסופר-נטנט, העבירו לצינורות מיקרו-צנטריפוגות נקיים ואחסנו בטמפרטורה של 4°C על שייקר סיבובי. לאחר החילוץ, יש להדפיס את הדגימות בהקדם האפשרי.
  8. צנטריפוגה את כל התמציות המאוחסנות שוב ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    הערה: הדגימות חייבות להיות נקיות מחלקיקים ופסולת. יש לעבור דרך מסנן ספין של 0.2 מיקרומטר לפני הדפסת מיקרו-מערך במידת הצורך. דגימות צמיגות במיוחד אינן תואמות לניתוח microarray מכיוון שנימי המיקרו-מערך וראש ההדפסה יכולים להיסתם בקלות. ככלל, משתמשים צריכים להיות מסוגלים pipette כל דוגמאות המיועדות להדפסה עם פיפטה סטנדרטית בנפח נמוך.

4. הכנת תקנים

  1. הכינו תמיסות 1 מ"ג/מ"ל של תקני גליקן מוגדרים (טבלה 1) ב-dH2O. סטרילי אם אתם משתמשים בפאצ'ימן כסטנדרט, יש להמיס ב-4M NaOH במקום זאת ולנטרל עם חומצה אצטית קרחונית לאחר מסיסות.
  2. יש לאחסן את התקנים המוכנים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C על שייקר סיבובי כדי לאפשר מסיסות מלאה.
  3. צנטריפוגה את כל התקנים למשך 10 דקות ב 10,000 x גרם ב 4 ° C כדי לזרוק כל פסולת. הסופרנאטנט המתקבל משמש להדפסה עוקבת.

5. הדפסת Microarray

  1. הכינו דילול ביחס 1:20 (v/v) של דיו הודי/דיו ציור שחור במאגר מערכת גליצרול (GSB; ערבבו 47% גליצרול, 52.9% dH2O, 0.06% Triton X-100 ו-0.04% ביוציד [0.15%-0.17% חנקתי ו-1.4%-2.0% מגנזיום חנקתי במים] ועיקרו סינון) (ראו טבלת חומרים) וצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 15,000 x גרם (טמפרטורת החדר).
    הערה: תמיסת דיו נחוצה ליצירת גבול עליון ותחתון סביב הדגימות המודפסות, כך שניתן יהיה לזהות חזותית את המערכים המודפסים על הממברנה. עם זאת, סביר להניח שתמיסת הדיו תכיל משקעים. כל התמיסות חייבות להיות נקיות מחלקיקים להדפסה, לכן הימנעו מלהפריע למשקעים בעת הפיפט. יש להשליך ולהכין טרי כאשר הדבר אינו אפשרי עוד. לא ניתן לסנן בקלות את הפתרון כדי להסיר חלקיקים.
  2. הוסף 40 μL של תמיסת דיו ו- GSB לחלק הראשון של לוח 384 הקידוחים הראשון (איור 2).
  3. הוסף 25 μL של GSB לכל בארות דילול 1 (D1). הוסף 40 μL של GSB לכל בארות דילול 2, 3 ו- 4 (D2-D4).
  4. דללו את דגימות הגליקן שחולצו ואת מצעי הגליקן המוגדרים ביחס 1:1 (v/v) עם GSB על ידי הוספת 25 μL של דגימת גליקן שחולצה לבארות D1 לפי הסדר.
  5. לדלל באופן סדרתי כל דגימה ארבע פעמים על ידי לקיחת 10 μL של הדגימה מבאר D1 והוספה לבאר D2. שואפים בעדינות עם פיפטה לערבב.
  6. חזור על התהליך על ידי לקיחת דגימה של 10 μL מבאר D2 והוספתה לבאר D3.
  7. חזור על הפעולה עבור D4 היטב. לאחר הערבוב, יש להשליך 10 μL מבאר D4 כך שכל באר תכיל נפח סופי של 40 μL.
  8. הוסף 40 μL של תמיסת דיו ו- GSB לבלוק הסופי של הלוח הסופי.
  9. מכסים את הצלחות בכיסוי צלחת דבק וצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם (טמפרטורת החדר). יש לוודא שלא נשארות בועות לאחר הצנטריפוגה ולחזור על הפעולה במידת הצורך.
  10. באמצעות רובוט הדפסה פיאזואלקטרי ללא מגע, הדפס את הדגימות על קרום הניטרוצלולוז (ראה טבלת חומרים) לפי השלבים הבאים.
    הערה: להלן פעולות מומלצות לאיכות הדפסה מיטבית; עם זאת, הפרמטרים הספציפיים הנדרשים יהיו תלויים בסופו של דבר במכשיר בו נעשה שימוש. אנו ממליצים למשתמשים ליצור קשר עם יצרן המכשיר כדי לדון בהתאמות האישיות ובהגדרות ההדפסה המתאימות הנדרשות עבור ההתקן שלהם.
    1. לפני ההדפסה, רוקן את מאגר מאגר הפסולת ומלא את מאגר החיץ הנקי ב- GSB נקי, לפי הצורך. הפעל את המכשיר ואפשר לו להתייצב למשך >10 דקות אם יש לו מערכת בקרת לחות וטמפרטורה משולבת. הפעל את המיקרו-מערך ואתחל את המערכת.
      הערה: מומלץ לבצע בדיקה כדי לקבוע את הלחץ הפנימי של המכשיר. אם הלחץ נמוך מדי, ייתכן שיהיה צורך לבצע טיהור בלחץ גבוה. שוב, פנה ליצרן המכשיר כדי לדון בפעולה הספציפית של המכשיר הספציפי.
    2. נקה את ראש ההדפסה ואת הנימים מספר פעמים עם GSB כדי להסיר לכלוך ומזהמים פוטנציאליים. בצע ריצת הדפסת בדיקה על ידי טעינת צלחת GSB בלבד או הגדרת המכשיר להדפסה ישירות ממאגר החיץ הנקי, תוך עקיפת שאיפת הדגימה מלוח טעון.
      הערה: אין צורך לבצע את הדפסת הבדיקה באמצעות קרום ניטרוצלולוז; שקופיות מיקרוסקופ נקיות מספיקות ומציעות את היתרון שניתן להעריך חזותית את גודל הספוט, הצורה והאיכות לפני הדפסת הדגימה.
    3. בעת הדפסת דגימות גליקן שחולצו, תכנת את המערכת לשטוף עם GSB נקי בין כל דגימה.
      הערה: בדרך כלל, נפח הדגימה לכל נקודה מודפסת הוא 100 pL עד 10 nL, וגודל הספוט נע בין 20 מיקרומטר ל- 100 מיקרומטר, בהתאם לנפח הדגימה שנבחר. הדפסת 100 מיקרו-מערכים ממקור אחד של לוח 384 בארות אורכת כ-40 דקות, כולל שטיפת המערכת. המיקרו-מערכים המתקבלים יהיו בגודל של כ-1 ס"מ2 . לוחות נוספים יגדילו את אורך המערך בכ-1 ס"מ לצלחת. סכמה של תכנון המיקרו-מערך המודפס מוצגת באיור 3. לאחר ההדפסה, המיקרו-מערכים מוכנים לשימוש מיידי וניתן לאחסן אותם למשך מספר שנים. אם יש צורך לחזור על עבודת ההדפסה מכל סיבה שהיא, עקב התאדות פוטנציאלית של דוגמאות במהלך ההדפסה, מומלץ לטעון לוח מדגם חדש ולהשליך את הלוח המקורי.
    4. אחת לשבוע, נקו היטב את ראש ההדפסה ואת הנימים. עשו זאת על ידי טעינת באר 384 המכילה דילול של 1:20 של NaOH מרוכז ב-GSB ובצעו ריצת הדפסה של 40 דקות עד שעה על שקופיות במיקרוסקופ. על המשתמשים לוודא שפתרון ניקוי זה תואם למכשיר שלהם לפני שהם ממשיכים.
  11. שמור את קובץ הרשת הייחודי (קובץ .gal) שהופק עבור המיקרו-מערך המודפס המוכן לניתוח במורד הזרם.

6. חיטוט Microarray

  1. גזרו מיקרו-מערכים מודפסים בודדים זהים מממברנת הניטרוצלולוז והניחו אותם בכלי בגודל מתאים לחיטוט (למשל, צלחת מיקרוטיטר של 12 או 24 בארות) (ראו טבלת חומרים). המערך צריך לשכב שטוח על בסיס כלי השיט. מיקרו-מערך אחד נדרש לכל גשושית ומייצג שכפול טכני אחד.
  2. כדי להפחית קשירה לא ספציפית, יש לדגור על המיקרו-מערכים למשך שעה אחת במאגר החוסם MP-TBST (1x מלח חוצץ Tris, pH 7.5, + 0.1% [v/v] TWEEN 20 [TBST] ולהוסיף אבקת חלב דל שומן 5% [w/v]; ראו טבלת חומרים) על שייקר מסתובב/נדנדה. ודא שהנפח מספיק כדי להטביע את המערך כולו.
  3. לאחר הדגירה, הסר את MP-TBST והחלף אותו בנפח חדש של MP-TBST.
  4. לדגור על המערכים עם נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) או CBM עם תיוג His, או GRMPs אחרים (למשל, לקטינים), מדוללים 1:10-1:1,000 (לפי הוראות היצרן; ראה טבלת חומרים) ב-MP-TBST למשך שעתיים על שייקר מסתובב/נדנדה.
  5. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הבדיקה המולקולרית וכסה את המערכים ב- TBST נקי, כדי להבטיח שהמערכים שקועים במלואם. כדי להסיר תמיסת בדיקה שיורית, הסר מיד את TBST והחלף בנפח חדש. הניחו את המערכים על שייקר מסתובב/מתנדנד למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, מוציאים את ה-TBST, מחליפים בנפח חדש ומניחים על שייקר מסתובב/מתנדנד למשך 5 דקות.
    הערה: יש לחזור על תהליך זה שלוש פעמים, לא כולל ההוספה הראשונית וההסרה המיידית של TBST.
  6. יש לדגור על המערכים עם נוגדנים משניים מצומדים אלקליין-פוספטאז (אנטי-עכבר, אנטי-חולדה, אנטי-ארנב, אנטי-שלו, לפי הצורך; ראו טבלת חומרים) מדוללים ביחס של 1:1,000 ב-MP-TBST למשך שעתיים על שייקר נדנדה/מסתובב.
    הערה: נוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידז חזרת מתאימים גם הם, ומשמשים בשילוב עם טטרמתיל בנזידין (TMB)/מצע מי חמצן לפיתוח צבע.
  7. לאחר הדגירה, חזור על הליך השטיפה, לפי שלב 6.5, כדי להסיר נוגדנים משניים שאינם קשורים ספציפית.
  8. כסו את המערכים בתמיסת פיתוח צבע טטרזוליום כחול ניטרו-כחול (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) (ראו טבלת חומרים) לזיהוי כרומוגני של קשירת נוגדנים. השאירו עד שיתפתחו כתמים סגולים באתרי קשירת האנטיגן (בדרך כלל 5-30 דקות, אולם יש לעקוב מקרוב אחר המערכים כדי למנוע רוויית יתר, שכן התגובה יכולה להתרחש במהירות).
    אזהרה: BCIP מזיק כאשר הוא בא במגע עם העור ועלול לגרום לגירוי נשימתי. השתמש ב- PPE. יש להימנע מהיווצרות אבק. הימנעו מנשימת אבק.
  9. כדי לסיים את התגובה, טבלו את המערכים במי ברז נקיים ושטפו במעט.
  10. הניחו את המערכים בין נייר הניקוי למשך הלילה בטמפרטורת הסביבה לייבוש.
  11. השליכו את המערכים עם פגמים ברורים וחזרו על פרוטוקול החיטוט במקרים כאלה (איור 4).

7. ניתוח וכימות

  1. סרוק את המערכים שפותחו ברזולוציה של 2,400 נקודות לאינץ' (dpi) באמצעות סורק שולחני. המר את התמונות לקובצי TIFF ולאחר מכן לתשלילים.
  2. באמצעות תוכנת ניתוח microarray (ראה טבלת חומרים), שכב את קובץ הרשת הייחודי .gal על כל תמונת microarray כדי לחשב את עוצמת הצבע של הכתם שנוצר בכל אתר קשירת אנטיגן ולהחסיר את הרקע המקומי.
  3. יצא את נתוני הרשת כקובץ .txt. לאחר מכן ניתן לייבא אותם באופן ידני לגיליון Excel לצורך ניתוח.
  4. צור ערך ממוצע של עוצמת אות ספוט עבור כל דגימה על-ידי ממוצע עוצמת הספוט תחילה על פני כל דילול דגימה ולאחר מכן על פני כל העתק ביולוגי כלול.
  5. הקצה ערך של 100 לעוצמת אות הספוט הממוצעת הגבוהה ביותר ונרמל את הנתונים הנותרים בהתאם.
    הערה: לאחר מכן ניתן להציג עוצמות אות נקודה ממוצעות מנורמלות כמפת חום של שפע אפיטופים גליקני יחסי באמצעות פונקציית העיצוב המותנה ב- Excel33, או באמצעות הפונקציה geom_tile בחבילת R ggplot240,41.

Representative Results

MAPP יושם כדי לקבוע את הרכב הגליקן של פסולת ביומסה חקלאית, הכוללת קליפות מנגו מכמה זנים צפון תאילנדיים, עיסת דובדבנים Coffea arabica ופסולת עיבוד פולי קפה, ורקמת שורש, גבעול ועלים מכל שחור תאילנדי, Allium sativum var. ophioscorodon. מספר פוליסכרידים ממקור צמחי משמשים בתעשיית המזון כמרכיבים פונקציונליים42,43. לפיכך, מטרת הניסוי הייתה להסיק האם חומרי פסולת אגרו-תעשייתיים נפוצים ובלתי מנוצלים כיום עשויים לספק מקור לרב-סוכרים טהורים בעלי ערך מוסף.

חומר AIR משמש באופן שגרתי להכנת דגימות המיועדות לניתוח גליקן44. ישנם מספר יתרונות לשימוש ב- AIR; טיפול בממסים מסיר ביעילות CAZymes אנדוגניים, מטבוליטים, סוכרים קטנים, שומנים ופיגמנטים, וכתוצאה מכך דגימות מועשרות ברב-סוכרים וחלבונים מבניים34. יתר על כן, ייצור AIR הוא דרך מהירה ויעילה להגדיל את תוחלת החיים של הדגימה, מכיוון שהוא יציב בחום וניתן לאחסן אותו במשך מספר שנים.

שלושה שברים מעורבים של גליקנים המרכיבים הופקו ברצף מחומר AIR צמחי באמצעות CDTA, NaOH וצלולאז. CDTA chelates Ca2+ יונים, המאפשרים הסרה של Ca2+ crosslinked de-esterified pectins מדפנות תאי צמח45. תנאים בסיסיים מאפשרים בעיקר המיצלולוז, כגון מנאן, קסילן ו-β-גלוקן, להשתחרר עקב שיבוש קשרי המימן וספוניפיקציה של קשרי אסטר בין מיקרופיברילים של תאית והמיצלולוז, לבין ליגנין והמיצלולוז, בהתאמה46. אנדו-1,4-β-גלוקנאז רקומביננטי מ-Bacillus spp. שימש לפירוק אזורים אמורפיים של מיקרופיברילי התאית המבנית, תוך שחרור שאריות גליקנים הקשורים לתאית בתוך דפנות התא47. למרות ששיטה זו מפרידה למעשה גליקנים לשלוש קבוצות רחבות אלה, יש לציין כי הדגימות אינן טהורות; מעצם טבעה של שיטת המיצוי, המיצלולוז, אם קיים בדגימה, יחולץ באופן בלתי נמנע ולאחר מכן יזוהה בדרגות שונות בשברים CDTA וצלולאז. כמו כן, חלק מפקטין יזוהה במיצוי NaOH אם קיים בדגימה.

רובוט הדפסת מיקרו-מערך פיאזואלקטרי ללא מגע שימש לשיתוק שברי גליקן שחולצו על ניטרוצלולוז באמצעות חיבור לא קוולנטי11, ויצר 300 מיקרו-מערכים זהים. תקני גליקן מוגדרים (טבלה 1) נכללו גם במיקרו-מערכים המודפסים כבקרות חיוביות (איור 5). פרופיל האיגוד של MAPP המתקבל עבור תקני הגליקן שנבחרו מתאים לספציפיות אפיטופית שדווחה בעבר. לדוגמה, LM21 הציג קשירה חזקה לרב-סוכרים מרובים של המן (גלקטומנן וגלוקומנן), בעוד LM22 הציג קשירה חלשה בלבד לגלקטומנן25. באופן דומה, LM19 קשור באופן מועדף להומוגלקטורונן48 דה-אסטרי ו-LM15 קשור לקסילוגלוקן זרעי תמרינדי23.

השפע היחסי של 16 אפיטופים, שאבחנו פוליסכרידים לא צלולוזיים של דופן תא הצמח, זוהו על-ידי חיבור של נוגדנים חד-שבטיים מכווני גליקן (טבלה 2) לתמציות מודפסות (איור 6). רוב הגליקנים שחולצו זוהו בתוך מקטע NaOH בסיסי. אותות קשירה חזקים נרשמו עבור mAbs LM10 ו-LM11, המייצגים קסילן/ארבינוקסילן, בתוך הקליפות של כל זני המנגו שנבדקו. בתוך דגימות השום, LM10 ו-LM11 נקשרו באופן מועדף לתמצית רקמת שורש (Garlic R) והציגו קשירה חלשה בלבד לתמצית רקמת העלה (Garlic L). LM19, המייצג הומוגלקטורונן מתיל-אסטרי חלקית או לא אסטרי, נקשר בחוזקה לחלק מתמציות זני המנגו (אאוקרונג וטלבנאק), אך נקשר רק חלש, או שלא ניתן היה להבחין בקשירה שלו, בזנים אחרים (צ'וקאנאן, מאמקמדאנג, מאהצ'אנוק ונגה). בנוסף, LM19 נקשר רק לשברים של עיסת הקפה ולא נקשר לחומר פסולת עיבוד פולי הקפה, שבעבר חשבו שהוא מורכב מפקטין קפה מטוהר למחצה (נתונים שלא פורסמו).

Figure 1
איור 1: שלבים ניסיוניים עיקריים בשיטת MAPP. (A) הדגימות עוברות הומוגניות ליצירת אבקות עדינות. (B) הדגימות ההומוגניות מעובדות כדי לבודד את ה-AIR שלהן. (C) הגליקנים המרכיבים מופקים ברצף באמצעות משטר מיצוי מותאם. (D) שברי הגליקן, הדיו וה-GSB שחולצו מועברים ללוחות של 384 בארות, בהתאם לפריסת הלוחות, להדפסה על ניטרוצלולוז. (E) המיקרו-מערכים המודפסים נבדקים עם GRMPs נבחרים. (F) קשירת GRMP לשברי הגליקן המודפסים מכומתת ומנותחת לפני הצגת הנתונים כמפת חום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דוגמה לפריסת לוחות של 384 בארות עבור דגימה, דיו וטעינת GSB עם ארבעה דילולים לכל דגימת גליקן/תקן שחולץ. צבעים שונים מציינים דוגמאות הנובעות מגיבי מיצוי שונים, בעוד שגוונים שונים מייצגים דילול סדרתי. המספר הראשון בקוד מייצג את מספר המדגם, ואילו מספר הסיום מייצג את מספר הדילול (D1 מציין דילול אחד, D2 מציין דילול שניים וכן הלאה). לדוגמה, דגימת גליקן מסומנת היטב '12D3' מייצגת דגימת גליקן 12, דילול שלוש. יש לחלק את לוחות הבאר לשמונה חלקים זהים הכוללים שישה טורים ושמונה שורות. החלק הראשון של הלוח הראשון צריך להכיל דיו ומאגר בלבד ולהיות דומה לפריסת הלוח לדוגמה. לאחר מכן ניתן לטעון דגימות גליקן שחולצו לחלקי הצלחת הבאים בהתאם לפריסת הצלחת. אין לטעון ריאגנטים שונים לאותו קטע צלחת. אם אין מספיק דגימות כדי למלא קטע שלם, מלא את כל הבארות הנותרות באותו קטע בחיץ; אל תשאירו בארות ריקות. אם נדרשים לוחות מרובים, המקטע הבא לאחר טעינת כל הדגימות צריך להכיל שלוש עמודות מתחלפות של דיו ו- GSB - ייתכן שסעיף זה לא יהיה סעיף שמונה, בהתאם למספר הדגימות המודפסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ייצוג סכמטי של תכנון מיקרו-מערך מודפס. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מיקרו-מערכים מייצגים. (A) ללא כריכה. (B) אות האיגוד מוסתר על-ידי אות רקע גבוה. (C) צביעה כללית כחולה/סגולה עקב רוויית יתר עם NBT/BCIP. (ד) חיטוט פגום עקב ריכוז מצע גבוה. (ה) הדפסה פגומה עקב ראש הדפסה לא נקי. (F) קשירה חזקה למספר מועט של דגימות. (G) קשירה חזקה לדוגמאות רבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: קשירת נוגדנים חד-שבטיים לתקני גליקן מוגדרים, כלולה כדי לאמת את תהליך ההדפסה והחיטוט. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: MAPP של גליקנים שהופקו מפסולת ביומסה חקלאית. הדגימות כוללות פסולת עיסת קפה (עיסת קפה ופקטין קפה), קליפות מנגו ממספר זנים תאילנדיים (AO, Aokrong; כו, קם; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; מ"ה, מחחנוק; NG, Nga) ועלי שום שחור (Garlic L), גבעול (Garlic S), פקעת (Garlic BG) ושורשים (Garlic R), באמצעות CDTA, NaOH וצלולאז (Bacillus spp. cellulase 5A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: תקני פוליסכריד מסחריים מוגדרים המשמשים בניתוח MAPP כבקרות חיוביות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: נוגדנים חד-שבטיים מכווני גליקן שנבחרו לחקירת מיקרו-מערכי גליקן צמחיים שחולצו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

טכניקת MAPP המתוארת כאן היא כיום שיטה מבוססת היטב לניתוח גליקנים. העקרונות הבסיסיים תוארו לראשונה בשנת 200711, אך הטכניקה עברה פיתוח מתמשך על מנת לנצל את החידושים האחרונים בטכנולוגיית מיקרו-מערך, פיתוח בדיקות מולקולריות והתקדמות בהבנתנו את הביוכימיה הגליקנית. באופן כללי, גליקנים, במיוחד פוליסכרידים, מאתגרים יותר לניתוח מאשר חלבונים ונוקלאוטידים בשל מורכבותם המבנית וההטרוגניות שלהם45, כמו גם העובדה שלא ניתן לרצף או לסנתז אותםבקלות 1. במקרים רבים, אין טכניקה אחת שיכולה לפענח את מורכבות הגליקן באופן חד משמעי; לכן, MAPP משמש לעתים קרובות עם שיטות אחרות. זוהי אחת הסיבות מדוע הכנת AIR נבחרת בדרך כלל כנקודת התחלה עבור MAPP, שכן AIR תואם לרוב שיטות ניתוח גליקן אחרות34, מה שמקל על ההשוואה הבאה של מערכי נתונים.

בשל הומוגניזציה של הדגימה לפני הכנת AIR, חלק מהמידע המרחבי הולך לאיבוד תמיד. עם זאת, כמו פוליסכרידים משוחררים ברצף מדגימות, נוכחות של אפיטופים בשברים המתקבלים מספק מידע על הארכיטקטורה המולקולרית ואת ההרכב של מדגםזה 17. לכן, בחירת משטר מיצוי מתאים היא קריטית להצלחת השיטה. פרמטרים מרובים קובעים את התאמת שיטת המיצוי: מבנה תאי, זמן, טמפרטורה, pH, לחץ, חוזק יוני של הממס ועדינות דגימת החלקיקים המוצקים49. מומלץ להשתמש במגוון של ממסים אגרסיביים יותר ויותר כדי למקסם את הסבירות למיצוי מוצלח של גליקנים המרכיבים ובניית תמונה קומפוזיציונית מייצגת של הדגימה. עבור רוב הדגימות, CDTA, NaOH וצלולאז מספיקים כדי להסיר אחסון שמקורו בצמחים ורב-סוכרים של דופן התא 33,50,51,52. עבור דגימות רקמה מסוימות, משטר מיצוי היברידי הכולל גם CaCl2, HCl ו- Na2CO3 הוכח כמוצלח53, בעוד שדגימות מיקרו-אצות ימיות עשויות לדרוש תוספת של חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)10.

מיקרו-מערכים צריכים לכלול מגוון של תקני גליקן טהורים ומוגדרים שישמשו כבקרות חיוביות5. יש לשנות את התקנים הכלולים בהתאם לאופי המדגם. לאחר ההדפסה, יש לבחור GRMPs מתאימים. הדור של mAbs היברידי למבנים רב-סוכריים הוא מאתגר54; נוגדנים קושרי גליקן קשים להעלאה ויכולים להיות בעלי זיקה נמוכה55. למרבה המזל, ניתן לקבל בקלות יחסית מידע על רצף גנים עבור CBMs עבור ביטוי רקומביננטי4 והנדסה של סגוליות הקישור שלהם56,57. בעוד קטלוג מרשים של GRMPs פותח, כאשר רובם זמינים כיום ממקורות מסחריים, יחסית למגוון המבנים הגליקניים הקיימים בטבע, רק חלק קטן יוצרו ואופיינו בהצלחה58. זה יכול להגביל את היכולת לזהות ולהפלות בין מבנים מסוימים. מומלץ לבצע ניסוי חיטוט ראשוני באמצעות בדיקה אחת או שתיים המייצגות כל מבנה גליקן עיקרי הצפוי להיות נוכח, אשר ספציפיות הקישור מאופיינת היטב. בניסויי החיטוט הבאים, ניתן להרחיב את רשימת הגשושיות כדי לכסות טווח רחב יותר של גליקנים ולהעמיק במבנים עדינים.

למרות שזה שגרתי, הבטחת שטיפת מיקרו-מערכים ביסודיות לאחר כל שלב דגירה היא בסיסית להצלחת הליך החיטוט. הסרה לא יעילה של גשושיות שאינן קשורות באופן ספציפי עשויה לטשטש את התוצאה על ידי גרימת אות רקע גבוה בעקבות התפתחות צבע. במקרה זה, יש צורך לחזור על הליך חיטוט, החל microarray חדש. יתר על כן, יש לגעת במערכים במשורה ורק על ידי אחיזת הקצוות במלקחיים; קרום הניטרוצלולוז שביר וניזוק בקלות. פתרון פיתוח הצבע נאסף בסדקים וקמטים, וגורם לרוויית יתר, המעכבת ניתוח מערך.

MAPP מהיר, ניתן להתאמה ונוח. שיטה זו מתאימה לגליקנים מן החי, החיידקים או הצמחים שמקורם בכל מערכת ביולוגית או תעשייתית, כל עוד ניתן לחלץ אותם ולשתק אותם על ניטרוצלולוז, ועבורם יש בדיקות מולקולריות מתאימות. הנתונים המופקים מספקים תובנה מפורטת, כמותית למחצה, קומפוזיציונית, שלא ניתן להשיג בקלות באמצעות שיטות ניתוח גליקניות אחרות.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות ל-ArrayJet על עצותיהם המקצועיות בנוגע לרובוטיקה של מיקרו-מערך. SS ו- JS רוצים להכיר בתמיכה מקרן היסוד 2022 (FF65/004), אוניברסיטת צ'יאנג מאי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) Megazyme P-LICHN
1,4-β-D-Mannan Megazyme P-MANCB
384-well microtiter plate Greiner Bio-One M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) Melford B74100-1.0
Acetone Sigma 270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag Jackson ImmunoResearch 300-055-240
Arabinoxylan (wheat) Megazyme P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software Media Cybernetics Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) NZYTech CZ0564
BAM antibodies SeaProbes Various
Black drawing ink (indian ink) Winsor & Newton GWD030
Carbohydrate binding modules NZYTech Various
CCRC antibodies CarboSource Various
CDTA Sigma 319945
Chloroform Sigma PHR1552
Ethanol Sigma 1.11727
Galactan (potato) Megazyme P-GALPOT
Galactomannan (carob) Megazyme P-GALML
Glycerol solution Sigma 49781-5L
Gum tragacanth (legumes) Sigma-Aldrich G1128
INCh antibodies INRA Various
LM and JIM antibodies PlantProbes Various
Marathon Argus Microarray Printer ArrayJet
Methanol Sigma  34860
Monoclonal antibodies Biosupplies Australia Various
NaBH4 Sigma 452882
NaOH Sigma S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT) Melford N66000-1.0
Nitrocellulose membrane Thermo Fisher Scientific 88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%) Danisco NA
ProClin 200 Sigma 48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) Megazyme P-RHAGN
Rotating mixer Fisher Scientific 88-861-050
Rotating/rocking Shaker Cole-Parmer
Skimmed milk powder Marvel
Spin filter Costar Spin-X 8160
Stainless steel beads Qiagen 69989
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris Sigma 93362
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Xylan (beechwood) Megazyme P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind) Megazyme P-XYGLN
β-Glucan (oat) Megazyme P-BGOM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amicucci, M. J., et al. A nonenzymatic method for cleaving polysaccharides to yield oligosaccharides for structural analysis. Nature Communications. 11 (1), 3963 (2020).
  2. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Evolution of glycan diversity. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  3. Willats, W. G. T., McCartney, L., Knox, J. P. Pectin cell biology: complexity in context. Advances in Pectin and Pectinase Research. , Springer. Netherlands. 147-157 (2003).
  4. Cummings, R. D., et al. Glycan-recognizing probes as tools. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  5. Bakshani, C. R., et al. Analysis of glycans in a Burnt-on/Baked-on (BoBo) model food soil using Microarray Polymer Profiling (MAPP) and immunofluorescence microscopy. Food Chemistry. 410, 135379 (2023).
  6. Salmeán, A. A., Willats, W. G. T., Ribeiro, S., Andersen, T. J., Ellegaard, M. Over 100-year preservation and temporal fluctuations of cell wall polysaccharides in marine sediments. Frontiers in Plant Science. 13, 785902 (2022).
  7. Cid, M., et al. Recognition of the helical structure of β-1,4-galactan by a new family of carbohydrate-binding modules. Journal of Biological Chemistry. 285 (46), 35999-36009 (2010).
  8. Runavot, J. -L., et al. Non-cellulosic polysaccharides from cotton fibre are differently impacted by textile processing. PLoS One. 9 (12), e115150 (2014).
  9. Ahl, L. I., et al. Analyses of aloe polysaccharides using carbohydrate microarray profiling. Journal of AOAC International. 101 (6), 1720-1728 (2018).
  10. Vidal-Melgosa, S., et al. Diatom fucan polysaccharide precipitates carbon during algal blooms. Nature Communications. 12 (1), 1150 (2021).
  11. Moller, I., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant Journal. 50 (6), 1118-1128 (2007).
  12. Ruprecht, C., et al. A synthetic glycan microarray enables epitope mapping of plant cell wall glycan-directed antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  13. Cummings, R. D., et al. Principles of glycan recognition. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  14. Gao, C., et al. Glycan microarrays as chemical tools for identifying glycan recognition by immune proteins. Frontiers in Chemistry. 7, 833 (2019).
  15. Vidal-Melgosa, S., et al. A new versatile microarray-based method for high throughput screening of carbohydrate-active enzymes. Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9020-9036 (2015).
  16. Willats, W. G. T., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: A novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  17. Sørensen, I., et al. The charophycean green algae provide insights into the early origins of plant cell walls. The Plant Journal. 68 (2), 201-211 (2011).
  18. Liu, D., Tang, W., Yin, J. -Y., Nie, S. -P., Xie, M. -Y. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development. Food Hydrocolloids. 116, 106641 (2021).
  19. Pattathil, S., et al. A comprehensive toolkit of plant cell wall glycan-directed monoclonal antibodies. Plant Physiology. 153 (2), 514-525 (2010).
  20. Verhertbruggen, Y., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. The Plant Journal. 59 (3), 413-425 (2009).
  21. Rydahl, M. G., et al. Development of novel monoclonal antibodies against starch and ulvan - implications for antibody production against polysaccharides with limited immunogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 9326 (2017).
  22. McCartney, L., Marcus, S. E., Knox, J. P. Monoclonal antibodies to plant cell wall xylans and arabinoxylans. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (4), 543-546 (2005).
  23. Marcus, S. E., et al. Pectic homogalacturonan masks abundant sets of xyloglucan epitopes in plant cell walls. BMC Plant Biology. 8, 60 (2008).
  24. Pedersen, H. L., et al. Versatile high resolution oligosaccharide microarrays for plant glycobiology and cell wall research. The Journal of Biological Chemistry. 287 (47), 39429-39438 (2012).
  25. Marcus, S. E., et al. Restricted access of proteins to mannan polysaccharides in intact plant cell walls. The Plant Journal. 64 (2), 191-203 (2010).
  26. Smallwood, M., Martin, H., Knox, J. P. An epitope of rice threonine-and hydroxyproline-rich glycoprotein is common to cell wall and hydrophobic plasma-membrane glycoproteins. Planta. 196 (3), 510-522 (1995).
  27. Smallwood, M., Yates, E. A., Willats, W. G. T., Martin, H., Knox, J. P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabinogalactan-proteins in rice and carrot. Planta. 198 (3), 452-459 (1996).
  28. Wisniewski, J. P., Rathbun, E. A., Knox, J. P., Brewin, N. J. Involvement of diamine oxidase and peroxidase in insolubilization of the extracellular matrix: implications for pea nodule initiation by Rhizobium leguminosarum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13 (4), 413-420 (2000).
  29. Jones, L., Seymour, G. B., Knox, J. P. Localization of pectic galactan in tomato cell walls using a monoclonal antibody specific to (1[->]4)-β-D-galactan. Plant Physiology. 113 (4), 1405-1412 (1997).
  30. Willats, W. G., Marcus, S. E., Knox, J. P. Generation of a monoclonal antibody specific to (1→5)-α-L-arabinan. Carbohydrate Research. 308 (15), 149-152 (1998).
  31. Cornuault, V., et al. LM6-M: a high avidity rat monoclonal antibody to pectic α-1, 5-L-arabinan. BioRxiv. , 161604 (2017).
  32. Sutherland, P., Hallett, I., Jones, M. Probing cell wall structure and development by the use of antibodies: a personal perspective. New Zealand Journal of Forestry Science. 39, 197-205 (2009).
  33. Mikkelsen, M. D., et al. Ancient origin of fucosylated xyloglucan in charophycean green algae. Communications Biology. 4 (1), 754 (2021).
  34. Fangel, J. U., Jones, C. Y., Ulvskov, P., Harholt, J., Willats, W. G. T. Analytical implications of different methods for preparing plant cell wall material. Carbohydrate Polymers. 261, 117866 (2021).
  35. Moore, J. P., et al. Analysis of plant cell walls using high-throughput profiling techniques with multivariate methods. The Plant Cell Wall: Methods and Protocols. , Springer. New York. 327-337 (2020).
  36. Gao, Y., Fangel, J. U., Willats, W. G. T., Moore, J. P. Tracking polysaccharides during white winemaking using glycan microarrays reveals glycoprotein-rich sediments. Food Research International. 123, 662-673 (2019).
  37. Solden, L. M., et al. Interspecies cross-feeding orchestrates carbon degradation in the rumen ecosystem. Nature Microbiology. 3 (11), 1274-1284 (2018).
  38. Fangel, J. U., et al. Tracking polysaccharides through the brewing process. Carbohydrate Polymers. 196, 465-473 (2018).
  39. Mravec, J., et al. Pea border cell maturation and release involve complex cell wall structural dynamics. Plant Physiology. 174 (2), 1051-1066 (2017).
  40. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. New York. NY. (2009).
  41. Gu, Z. Complex heatmap visualization. iMeta. 1 (3), 43 (2022).
  42. Nasrollahzadeh, M., Nezafat, Z., Shafiei, N., Soleimani, F. Polysaccharides in Food Industry. , Elsevier. Iran. (2021).
  43. Shao, P., et al. Recent advances in improving stability of food emulsion by plant polysaccharides. Food Research International. 137, 109376 (2020).
  44. Sanz, M. L., Martínez-Castro, I. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates. Journal of Chromatography. A. 1153 (1-2), 74-89 (2007).
  45. Bethke, G., Glazebrook, J. Cyclohexane diamine tetraacetic acid (CDTA) extraction of plant cell wall pectin. Bio-Protocol. 4 (24), e1357 (2014).
  46. Lu, Y., He, Q., Fan, G., Cheng, Q., Song, G. Extraction and modification of hemicellulose from lignocellulosic biomass: A review. Green Processing and Synthesis. 10 (1), 779-804 (2021).
  47. Jayasekara, S., Ratnayake, R. Microbial cellulases: an overview and applications. Cellulose. 22, 92 (2019).
  48. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., Ordaz-Ortiz, J. J., Knox, J. P. An extended set of monoclonal antibodies to pectic homogalacturonan. Carbohydrate Research. 344 (14), 1858-1862 (2009).
  49. Villares, A., Mateo-Vivaracho, L., Guillamón, E. Structural features and healthy properties of polysaccharides occurring in mushrooms. Agriculture. 2 (4), 452-471 (2012).
  50. Kračun, S. K., et al. Carbohydrate microarray technology applied to high-throughput mapping of plant cell wall glycans using comprehensive microarray polymer profiling (CoMPP). Methods in Molecular Biology. 1503, 147-165 (2017).
  51. Rajasundaram, D., et al. Understanding the relationship between cotton fiber properties and non-cellulosic cell wall polysaccharides. PLoS One. 9 (11), e112168 (2014).
  52. Michalak, L., et al. Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut. Nature Communications. 11 (1), 5773 (2020).
  53. Salmeán, A. A., Hervé, C., Jørgensen, B., Willats, W. G., Mravec, J. Microarray glycan profiling reveals algal fucoidan epitopes in diverse marine metazoans. Frontiers in Marine Science. 4, 293 (2017).
  54. Knox, J. P. Revealing the structural and functional diversity of plant cell walls. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 308-313 (2008).
  55. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17-23 (2007).
  56. Stephen, P., Tseng, K. -L., Liu, Y. -N., Lyu, P. -C. Circular permutation of the starch-binding domain: inversion of ligand selectivity with increased affinity. Chemical Communications. 48 (20), 2612-2614 (2012).
  57. Gunnarsson, L. C., Dexlin, L., Karlsson, E. N., Holst, O., Ohlin, M. Evolution of a carbohydrate binding module into a protein-specific binder. Biomolecular Engineering. 23 (2-3), 111-117 (2006).
  58. Moller, I., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchical clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25 (1), 37-48 (2008).

Tags

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) ניתוח גליקן בתפוקה גבוהה גליקנים גליקוקוניוגטים דגימות ביולוגיות רקמות צמחים רקמות אצות חומרי מזון דגימות אנושיות דגימות בעלי חיים דגימות מיקרוביאליות טכנולוגיית Microarray פלטפורמת סינון בדיקות מולקולריות מונחות גליקן אנליטים שבירה כימית שבר אנזימטי ממברנות ניטרוצלולוז הרכב גליקן בדיקות מולקולריות מזהות גליקן טכניקות ניתוח גליקן קונבנציונליות אנליזה חד-סוכרית אנליזת קישור ספקטרומטריית מסות
פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bakshani, C. R., Sangta, J.,… More

Bakshani, C. R., Sangta, J., Sommano, S., Willats, W. G. T. Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis. J. Vis. Exp. (199), e65443, doi:10.3791/65443 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter