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Biology

Profilage des polymères par puce à ADN (MAPP) pour l’analyse des glycanes à haut débit

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65443
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University

Summary

Le profilage des polymères par puces à ADN (MAPP) est une technique à haut débit pour l’analyse de la composition des glycanes dans les échantillons biologiques.

Abstract

Le profilage des polymères par puces à ADN (MAPP) est une approche robuste et reproductible permettant de déterminer systématiquement la composition et l’abondance relative des glycanes et des glycoconjugués dans une variété d’échantillons biologiques, y compris les tissus végétaux et algals, les matières alimentaires et les échantillons humains, animaux et microbiens. La technologie des puces à ADN renforce l’efficacité de cette méthode en fournissant une plate-forme de criblage miniaturisée à haut débit, permettant de caractériser simultanément des milliers d’interactions entre des glycanes et des sondes moléculaires hautement spécifiques dirigées par des glycanes, en utilisant uniquement de petites quantités d’analytes. Les glycanes constitutifs sont fractionnés chimiquement et enzymatiquement, avant d’être extraits séquentiellement de l’échantillon et directement immobilisés sur des membranes de nitrocellulose. La composition des glycanes est déterminée par la fixation de sondes moléculaires spécifiques reconnaissant les glycanes aux molécules extorquées et imprimées. Le MAPP est complémentaire aux techniques conventionnelles d’analyse des glycanes, telles que l’analyse des monosaccharides et des liaisons et la spectrométrie de masse. Cependant, les sondes moléculaires reconnaissant les glycanes donnent un aperçu des configurations structurelles des glycanes, ce qui peut aider à élucider les interactions biologiques et les rôles fonctionnels.

Introduction

Les glycanes sont omniprésents dans tous les domaines de la vie et présentent une diversité inégalée de structure et de fonction par rapport aux autres macromolécules1. Cependant, en raison de leur complexité, de la variabilité de la biosynthèse et des liaisons glycosidiques, et de la rareté des méthodes appropriées pour disséquer les structures des glycanes, notre compréhension de cette diversité de structures et de fonctions est relativement limitée2.

De nombreuses techniques d’analyse des glycanes sont destructrices et nécessitent la décomposition des glycanes en monosaccharides constitutifs, ce qui peut obscurcir les contextes tridimensionnels et biologiques pertinents3. À l’inverse, les anticorps monoclonaux (mAb), les modules de liaison aux glucides (CBM), les lectines, les agglutinines virales et les adhésines microbiennes, connus collectivement sous le nom de sondes moléculaires reconnaissant les glycanes (GRMP)4, reconnaissent et se lient à des épitopes spécifiques et peuvent être utilisés comme outils pour détecter et discriminer les glycanes au sein de matrices multi-glycanes complexes 5,6.

Nous présentons ici le profilage des polymères par puce à ADN (MAPP), une méthode rapide, polyvalente et non destructive pour l’analyse des glycanes qui est applicable à un large spectre d’échantillons biologiques. La méthode vise à fournir une technologie robuste et à haut débit pour l’analyse des glycanes provenant de divers systèmes biologiques et industriels/commerciaux. MAPP associe la spécificité de reconnaissance des sondes moléculaires dirigées par les glycanes à une technologie de criblage de puces à ADN reproductible et performante pour permettre de profiler des milliers d’interactions moléculaires en parallèle. Le résultat de cette approche est un aperçu diagnostique de la composition et de l’abondance relative des glycanes dans un échantillon ou un tissu d’intérêt.

MAPP peut être utilisé en tant que méthode indépendante et autonome, ou en conjonction avec d’autres techniques biochimiques, telles que la microscopie à immunofluorescence 7,8,9 et l’analyse des monosaccharides ou de liaison 10,11. La technique peut également être utilisée pour cartographier les spécificités des épitopes de nouveaux GRMP, à l’aide de puces imprimées avec des étalons d’oligosaccharides purs et structurellement bien définis12. L’un des principaux avantages du MAPP par rapport à d’autres méthodes, telles que le test immuno-enzymatique (ELISA), est sa compatibilité avec de petits volumes d’échantillons13,14. De plus, MAPP offre une analyse à un débit nettement plus élevé15 et fournit une forme efficace de conservation des échantillons, car les échantillons imprimés sont secs et stables lorsqu’ils sont immobilisés sur de la nitrocellulose16.

La liaison des GRMP dépend généralement de la présence d’un certain nombre de résidus de sucre contigus qui forment collectivement un site de liaison (épitope) unique à une classe particulière de polysaccharides (xylane, mannane, xyloglucane, etc.) 17. En revanche, les résidus de sucre individuels (xylose, mannose, glucose) qui sont quantifiés à l’aide de la plupart des techniques biochimiques, par exemple la composition des monosaccharides ou l’analyse de la méthylation, peuvent être des composants de plusieurs classes de polysaccharides et donc difficiles à attribuer18.

MAPP a été développé en réponse à une lacune technologique, à savoir la capacité d’analyser rapidement plusieurs glycanes provenant de diverses sources en utilisant de petites quantités de matériau. MAPP capitalise sur le vaste répertoire de GRMP qui ont été développés et caractérisés au cours des trois dernières décennies 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Le développement de MAPP a été un processus itératif, la technique étant constamment affinée et optimisée. Il existe maintenant un corpus substantiel de littérature décrivant l’application de MAPP à divers systèmes naturels et industriels où les glycanes jouent des rôles centraux 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Nous décrivons ici l’état actuel de la technique pour MAPP.

Protocol

Les principales étapes expérimentales de la méthode MAPP sont résumées à la figure 1.

1. Préparation des échantillons

REMARQUE : Ici, la méthode est appliquée aux tissus végétaux à des fins d’illustration. Les plantes sélectionnées étaient Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon, et plusieurs variétés de mangues thaïlandaises (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok et Nga). Les plantes ont été sélectionnées pour leur importance commerciale. Leur transformation pour la consommation humaine génère des déchets agro-industriels actuellement sous-utilisés, qui peuvent constituer une source de produits à valeur ajoutée, y compris des glycanes purs. Ainsi, MAPP a été appliqué pour caractériser la composition en glycanes de la biomasse végétale résiduelle à des fins de bioprospection.

  1. Séparez le matériel végétal en différents tissus (p. ex., racine, tige et feuilles).
  2. Séchez les tissus végétaux dans un four à air chaud à 40 °C pendant 12 à 24 h (diminuer/augmenter le temps en fonction de l’échantillon). Vous pouvez également congeler les échantillons dans de l’azote liquide, puis les lyophiliser pendant ~4 jours.
  3. Homogénéiser les échantillons en une poudre fine à l’aide d’un pilon et d’un mortier ou d’un lyseur mécanique (voir tableau des matériaux) avec un roulement à billes dans chaque tube.
    REMARQUE : Pour les tissus végétaux frais, il est recommandé de les sécher ou de les lyophiliser avant de les homogénéiser. Généralement, l’homogénéisation à l’aide d’un pilon et d’un mortier est suffisante pour la plupart des échantillons secs. Pour les échantillons particulièrement résistants, tels que les céréales, les légumineuses et les aliments transformés comme les pâtes, la congélation rapide dans de l’azote liquide peut augmenter la vitesse et l’efficacité de l’homogénéisation des échantillons. Nous avons constaté que l’homogénéisation mécanique est compatible avec presque tous les types d’échantillons, qu’elle est considérablement plus rapide et moins exigeante en main-d’œuvre, et qu’elle minimise efficacement le risque de contamination croisée des échantillons par l’utilisation répétée du même équipement (c’est-à-dire pilon et mortier).

2. Préparation de résidus insolubles dans l’alcool (AIR)

  1. Ajouter 1,5 mL d’éthanol à 70 % (v/v) à 50 à 100 mg d’échantillon séché à l’air et homogénéisé.
  2. Mélangez soigneusement et centrifugez à 10 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Jetez le surnageant obtenu à l’aide d’une pipette et conservez la pastille.
  3. Ajouter 1,5 mL de méthanol et de chloroforme (1 :1 [v/v]). Vortex, centrifugation et élimination du surnageant, conformément à l’étape 2.2.
  4. Ajouter 1,5 mL d’acétone à 100 % au reste. Vortex, centrifugation et élimination du surnageant, conformément à l’étape 2.2.
  5. Placez la pastille résultante soit pendant la nuit dans une hotte pour permettre à l’acétone résiduelle de s’évaporer, soit dans une centrifugeuse sous vide jusqu’à ce qu’elle soit sèche.
    REMARQUE : Le matériau AIR peut être stocké à température ambiante jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

3. Extraction de glycanes

REMARQUE : Si possible, effectuez toutes les étapes d’extraction dans un lyseur tissulaire avec un roulement à billes dans chaque tube pour faciliter la remise en suspension. Si un lyseur tissulaire n’est pas disponible, les extractions peuvent être effectuées à la place avec une agitation ou une agitation continue. Il peut être nécessaire de prolonger le temps d’extraction si cela n’est pas possible.

  1. À 10 mg de matière AIR, ajouter 30 μL/mg d’acide cyclohexanediaminetétraacétique (CDTA) à 50 mM ; voir le tableau des matériaux), pH 7,5.
  2. Agiter à 27 Hz pendant 2 min, puis à 10 Hz pendant 2 h.
  3. Centrifuger à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Conservez le surnageant obtenu, ajoutez-le dans un tube de microcentrifugation stérile et conservez-le à 4 °C sur un agitateur rotatif.
  4. Ajouter 30 μL/mg 4 M NaOH + 0,1 % (p/v) NaBH4 à la pastille résiduelle.
    ATTENTION : Le NaBH4 est toxique en cas d’ingestion. Utilisez un équipement de protection individuelle (EPI). Manipuler sous une hotte. Évitez la formation de poussière. Évitez de respirer la poussière. Ne laissez pas le produit entrer en contact avec l’eau.
  5. Répétez les étapes 3.2 à 3.3. Lavez le granulé résiduel deux ou trois fois avec du dH2O pour éliminer le NaOH résiduel.
  6. Ajouter 30 μL/mg de cellulase (de préférence GH5 endo-1,4-β-glucanase, dans un tampon enzymatique approprié, tel que recommandé par le fabricant ; voir le tableau des matériaux) à la pastille et incuber à la température optimale de l’enzyme pendant 16 h.
  7. Centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Conserver le surnageant, le transférer dans des tubes de microcentrifugation propres et le conserver à 4 °C sur un agitateur rotatif. Une fois extraits, les échantillons doivent être imprimés dans les plus brefs délais.
  8. Centrifuger à nouveau tous les extraits stockés à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    REMARQUE : Les échantillons doivent être exempts de particules et de débris. Passer à travers un filtre de centrifugation de 0,2 μm avant l’impression sur puce si nécessaire. Les échantillons particulièrement visqueux sont incompatibles avec l’analyse des puces à ADN, car les capillaires des puces à ADN et la tête d’impression peuvent se boucher facilement. En règle générale, les utilisateurs doivent être en mesure de pipeter tous les échantillons destinés à l’impression avec une pipette standard à faible volume.

4. Préparation des normes

  1. Préparer des solutions à 1 mg/mL d’étalons de glycanes définis (tableau 1) dans des dH2O stériles. Si vous utilisez le pachyman en standard, dissoudre dans 4 M de NaOH à la place et neutraliser avec de l’acide acétique glacial après solubilisation.
  2. Conservez les étalons préparés pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur rotatif pour permettre une solubilisation complète.
  3. Centrifuger toutes les normes pendant 10 min à 10 000 x g à 4 °C pour granuler les débris. Le surnageant résultant est utilisé pour l’impression ultérieure.

5. Impression par microréseau

  1. Préparer une dilution de 1 :20 (v/v) d’encre de chine/encre à dessin noire dans un tampon du système glycérol (GSB ; combiner 47 % de glycérol, 52,9 % dH2O, 0,06 % de Triton X-100 et 0,04 % de biocide [0,15 % à 0,17 % de nitrate cuivrique et 1,4 % à 2,0 % de nitrate de magnésium dans l’eau] et filtrer la stérilisation) (voir le tableau des matériaux) et centrifuger pendant 10 min à 15 000 x g (température ambiante).
    REMARQUE : Une solution d’encre est nécessaire pour créer une bordure supérieure et inférieure autour des échantillons imprimés, afin que les puces imprimées puissent être détectées visuellement sur la membrane. Cependant, la solution d’encre est susceptible de contenir des sédiments. Toutes les solutions doivent être exemptes de particules pour l’impression, évitez donc de perturber les sédiments lors du pipetage. Jetez-les et préparez-les frais lorsque cela n’est plus possible. La solution ne peut pas être facilement filtrée pour éliminer les particules.
  2. Ajouter 40 μL de solution d’encre et de GSB dans la première section de la première plaque à 384 puits (Figure 2).
  3. Ajouter 25 μL de GSB dans tous les puits de dilution 1 (D1). Ajouter 40 μL de GSB dans tous les puits de dilution 2, 3 et 4 (D2-D4).
  4. Diluer les échantillons de glycanes extraits et les substrats de glycanes définis 1 :1 (v/v) avec du GSB en ajoutant 25 μL d’échantillon de glycane extrait dans les puits D1 dans l’ordre.
  5. Diluer en série chaque échantillon quatre fois en prélevant 10 μL de l’échantillon du puits D1 et en l’ajoutant au puits D2. Aspirer doucement à l’aide d’une pipette pour mélanger.
  6. Répétez le processus en prélevant 10 μL d’échantillon dans le puits D2 et en l’ajoutant au puits D3.
  7. Répétez l’opération pour le puits D4. Après le mélange, jeter 10 μL du puits D4 afin que chaque puits contienne un volume final de 40 μL.
  8. Ajouter 40 μL de solution d’encre et de GSB au bloc final de la plaque finale.
  9. Couvrir les plaques d’un couvercle de plaque adhésive et centrifuger pendant 10 min à 3 000 x g (température ambiante). Assurez-vous qu’il ne reste pas de bulles après la centrifugation et répétez l’opération si nécessaire.
  10. À l’aide d’un robot d’impression piézoélectrique sans contact, imprimez les échantillons sur la membrane nitrocellulosique (voir le tableau des matériaux) en suivant les étapes ci-dessous.
    REMARQUE : Vous trouverez ci-dessous les actions recommandées pour une qualité d’impression optimale ; Cependant, les paramètres spécifiques requis dépendront en fin de compte de l’instrument utilisé. Nous conseillons aux utilisateurs de contacter le fabricant de l’instrument pour discuter des personnalisations appropriées et des paramètres d’impression requis pour leur appareil.
    1. Avant l’impression, videz le réservoir tampon de déchets et remplissez-le de GSB propre, si nécessaire. Allumez l’instrument et laissez-le se stabiliser pendant >10 min s’il dispose d’un système intégré de contrôle de l’humidité et de la température. Allumez le microarrayer et initialisez le système.
      REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer un test pour déterminer la pression interne de l’instrument. Si la pression est trop basse, il peut être nécessaire d’effectuer une purge à haute pression. Encore une fois, contactez le fabricant de l’instrument pour discuter du fonctionnement spécifique de l’instrument spécifique.
    2. Purgez la tête d’impression et les capillaires plusieurs fois avec du GSB pour éliminer les débris et les contaminants potentiels. Effectuez un test d’impression en chargeant une plaque de GSB seule ou en configurant l’instrument pour qu’il imprime directement à partir du réservoir tampon propre, en contournant l’aspiration de l’échantillon à partir d’une plaque chargée.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’effectuer le test d’impression à l’aide d’une membrane nitrocellulosique ; Des lames de microscope propres sont suffisantes et offrent l’avantage que la taille, la forme et la qualité du spot peuvent être évaluées visuellement avant l’impression de l’échantillon.
    3. Lors de l’impression d’échantillons de glycanes extraits, programmez le système pour qu’il rince avec du GSB propre entre chaque échantillon.
      REMARQUE : En règle générale, le volume d’échantillon par point imprimé est de 100 pL à 10 nL, et la taille du spot varie de 20 μm à 100 μm, selon le volume d’échantillon sélectionné. L’impression de 100 puces à partir d’une plaque de 384 puits prend environ 40 minutes, y compris le rinçage du système. Les puces à ADN résultantes auront une taille d’environ 1 cm2 . Des plaques supplémentaires augmenteront la longueur du réseau d’environ 1 cm par plaque. Un schéma de la conception imprimée de la puce à ADN est présenté à la figure 3. Une fois imprimées, les puces sont prêtes à l’emploi immédiatement et peuvent être stockées pendant plusieurs années. Si le travail d’impression doit être répété pour une raison quelconque, en raison de l’évaporation potentielle des échantillons pendant l’impression, il est recommandé de charger une nouvelle plaque d’échantillon et de jeter la plaque d’origine.
    4. Une fois par semaine, nettoyez soigneusement la tête d’impression et les capillaires. Pour ce faire, chargez un puits de 384 contenant une dilution de 1 :20 de NaOH concentré dans du GSB et effectuez un tirage de 40 min à 1 h sur des lames de microscope. Les utilisateurs doivent s’assurer que cette solution de nettoyage est compatible avec leur instrument avant de continuer.
  11. Enregistrez le fichier de grille unique (fichier .gal) produit pour la puce à ADN imprimée, prêt pour l’analyse en aval.

6. Sonde de puce à ADN

  1. Découpez des puces à ADN imprimées individuelles et identiques dans la membrane de nitrocellulose et placez-les dans un récipient de taille appropriée pour le sondage (p. ex., une plaque de microtitration à 12 ou 24 puits) (voir le tableau des matériaux). Le réseau doit reposer à plat sur la base du récipient. Une puce à ADN est nécessaire par sonde et représente une répétition technique.
  2. Pour réduire la liaison non spécifique, incuber les puces à ADN pendant 1 h dans un tampon bloquant MP-TBST (1x solution saline tamponnée Tris, pH 7,5, + 0,1 % [v/v] TWEEN 20 [TBST] et complétée par 5 % [p/v] de lait écrémé en poudre ; voir Tableau des matériaux) sur un agitateur rotatif/à bascule. Assurez-vous que le volume est suffisant pour immerger l’ensemble de la matrice.
  3. Après l’incubation, retirez le MP-TBST et remplacez-le par un nouveau volume de MP-TBST.
  4. Incuber les puces avec des anticorps monoclonaux (mAbs) ou des CBM marqués His, ou d’autres GRMP (par exemple, des lectines), dilués à l’échelle 1 :10-1 :1 000 (selon les spécifications du fabricant ; voir le tableau des matériaux) dans du MP-TBST pendant 2 h sur un agitateur rotatif/à bascule.
  5. Après l’incubation, retirez la solution de sonde moléculaire et recouvrez les puces de TBST propre, en veillant à ce que les puces soient complètement immergées. Pour éliminer la solution de sonde résiduelle, retirez immédiatement le TBST et remplacez-le par un nouveau volume. Placez les matrices sur un shaker rotatif/à bascule pendant 5 min. Au bout de 5 min, retirez le TBST, remplacez-le par un nouveau volume et placez-le sur un shaker rotatif/à bascule pendant 5 min.
    REMARQUE : Ce processus doit être répété trois fois, sans compter l’ajout initial et le retrait immédiat de TBST.
  6. Incuber les puces avec des anticorps secondaires conjugués à la phosphatase alcaline (anti-souris, anti-rats, anti-lapins, anti-His, selon le cas ; voir le tableau des matériaux) dilués à 1 :1 000 dans du MP-TBST pendant 2 h sur un agitateur à bascule/rotation.
    REMARQUE : Les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort conviennent également, utilisés en conjonction avec un substrat tétraméthylbenzidine (TMB)/peroxyde d’hydrogène pour le développement de la couleur.
  7. Après l’incubation, répétez la procédure de lavage, conformément à l’étape 6.5, pour éliminer les anticorps secondaires non spécifiquement liés.
  8. Recouvrez les puces d’une solution de développement de couleurs au tétrazolium nitro-bleu (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) (voir le tableau des matériaux) pour la détection chromogène de la liaison aux anticorps. Laisser jusqu’à ce que des taches de précipité violettes se développent aux sites de liaison de l’antigène (généralement 5 à 30 minutes, mais les puces doivent être surveillées de près pour éviter la sursaturation, car la réaction peut se produire rapidement).
    ATTENTION : Le BCIP est nocif lorsqu’il est en contact avec la peau et peut provoquer une irritation des voies respiratoires. Utilisez de l’EPI. Évitez la formation de poussière. Évitez de respirer la poussière.
  9. Pour mettre fin à la réaction, plongez les matrices dans de l’eau du robinet propre et lavez-les abondamment.
  10. Placez les matrices entre les papiers buvards pendant la nuit à température ambiante pour les faire sécher.
  11. Éliminez les tableaux présentant des défauts évidents et répétez le protocole de palpage dans de tels cas (Figure 4).

7. Analyse et quantification

  1. Numérisez les matrices développées à une résolution de 2 400 points par pouce (ppp) à l’aide d’un scanner de bureau. Convertissez les images en fichiers TIFF, puis en négatifs.
  2. À l’aide d’un logiciel d’analyse de puces à ADN (voir Tableau des matériaux), superposez le fichier de grille .gal unique sur chaque image de puce à ADN pour calculer l’intensité de couleur de la tache produite à chaque site de liaison à l’antigène et soustraire l’arrière-plan local.
  3. Exportez les données de la grille sous forme de fichier .txt. Ceux-ci peuvent ensuite être importés manuellement dans une feuille Excel pour analyse.
  4. Générez une valeur moyenne de l’intensité du signal ponctuel pour chaque échantillon en faisant la moyenne de l’intensité ponctuelle d’abord sur chaque dilution de l’échantillon, puis sur toutes les répétitions biologiques incluses.
  5. Attribuez une valeur de 100 à l’intensité moyenne la plus élevée du signal spot et normalisez les données restantes en conséquence.
    REMARQUE : Les intensités moyennes normalisées des signaux ponctuels peuvent ensuite être présentées sous la forme d’une carte thermique de l’abondance relative des épitopes glycanes à l’aide de la fonction de mise en forme conditionnelle d’Excel33 ou de la fonction geom_tile du package R ggplot2 40,41.

Representative Results

MAPP a été appliqué pour déterminer la composition en glycanes des déchets de biomasse agricole, comprenant des pelures de mangue de plusieurs variétés du nord de la Thaïlande, de la pulpe de cerise Coffea arabica et des déchets de traitement des grains de café, et des tissus de racines, de tiges et de feuilles d’ail noir thaïlandais, Allium sativum var. ophioscorodon. Plusieurs polysaccharides d’origine végétale sont utilisés dans l’industrie alimentaire comme ingrédients fonctionnels42,43. Ainsi, l’objectif de cette expérience était de déduire si ces déchets agro-industriels abondants et actuellement sous-utilisés pouvaient constituer une source de polysaccharides purs à valeur ajoutée.

Le matériau AIR est couramment utilisé pour préparer des échantillons destinés à l’analyse des glycanes44. L’utilisation d’AIR présente plusieurs avantages ; Le traitement avec des solvants élimine efficacement les CAZymes endogènes, les métabolites, les petits saccharides, les lipides et les pigments, ce qui permet d’obtenir des échantillons enrichis en polysaccharides et en protéines structurelles34. De plus, la production d’AIR est un moyen rapide et efficace d’augmenter la longévité des échantillons, car ils sont thermostables et peuvent être stockés pendant plusieurs années.

Trois fractions mixtes de glycanes constitutifs ont été extraites séquentiellement de la matière AIR végétale à l’aide de CDTA, de NaOH et de cellulase. Le CDTA chélate les ions Ca2+ , qui permettent l’élimination des pectines désestérifiées réticulées Ca2+ des parois cellulaires végétales45. Les conditions alcalines permettent à la plupart des hémicelluloses, telles que le mannane, le xylane et le β-glucane, d’être libérées en raison de la perturbation de la liaison hydrogène et de la saponification des liaisons ester entre les microfibrilles de cellulose et l’hémicellulose, et la lignine et l’hémicellulose, respectivement46. Une endo-1,4-β-glucanase recombinante de Bacillus spp. a été utilisée pour dégrader les régions amorphes des microfibrilles structurelles de la cellulose, libérant des glycanes résiduels liés à la cellulose à l’intérieur des parois cellulaires47. Bien que cette méthode sépare efficacement les glycanes en ces trois grands groupes, il convient de noter que les échantillons ne sont pas purs ; De par la nature même de la méthode d’extraction, l’hémicellulose, si elle est présente dans l’échantillon, sera inévitablement extraite et détectée par la suite à des degrés divers dans les fractions CDTA et cellulase. De même, de la pectine sera détectée dans l’extraction de NaOH si elle est présente dans l’échantillon.

Un robot d’impression piézoélectrique sans contact a été utilisé pour immobiliser les fractions de glycanes extraites sur la nitrocellulose via une fixation non covalente11, formant ainsi 300 puces à ADN identiques. Des étalons de glycanes définis (tableau 1) ont également été inclus dans les puces à ADN imprimées en tant que témoins positifs (figure 5). Le profil de liaison MAPP obtenu pour les étalons de glycanes sélectionnés correspond aux spécificités des épitopes précédemment rapportées. Par exemple, LM21 présentait une forte liaison à plusieurs polysaccharides de mannane (galactomannane et glucomannane), tandis que LM22 ne présentait qu’une faible liaison au galactomannane25. De même, LM19 est lié préférentiellement à l’homogalacturonane désestérifié48 et LM15 est lié à la graine de tamarin xyloglucane23.

L’abondance relative de 16 épitopes, diagnostiqueurs de polysaccharides de la paroi cellulaire végétale non cellulosique, a été détectée par la fixation d’anticorps monoclonaux dirigés contre les glycanes (tableau 2) à des extraits imprimés (figure 6). La majorité des glycanes extraits ont été détectés dans la fraction alcaline de NaOH. De forts signaux de liaison ont été enregistrés pour les anticorps monoclonaux LM10 et LM11, représentant le xylane/arabinoxylane, dans les pelures de toutes les variétés de mangues testées. Dans les échantillons d’ail, LM10 et LM11 se sont liés préférentiellement à l’extrait de tissu racinaire (Ail R) et n’ont montré qu’une faible liaison à l’extrait de tissu foliaire (Ail L). LM19, représentant l’homogalacturonane partiellement estérifié ou non estérifié, s’est fortement lié à certains extraits de variétés de mangues (Aokrong et Talabnak), mais ne s’est lié que faiblement, ou sa liaison était indétectable, chez d’autres variétés (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok et Nga). De plus, le LM19 ne s’est lié qu’aux fractions de pulpe de café et ne s’est pas lié aux déchets de traitement des grains de café, que l’on croyait auparavant composés de pectine de café semi-purifiée (données non publiées).

Figure 1
Figure 1 : Principales étapes expérimentales de la méthode MAPP. (A) Les échantillons sont homogénéisés pour former des poudres fines. (B) Les échantillons homogénéisés sont traités pour isoler leurs ERA. (C) Les glycanes constitutifs sont extraits séquentiellement à l’aide d’un régime d’extraction adapté. (D) Les fractions de glycanes, l’encre et le GSB extraits sont transférés dans des plaques à 384 puits, selon la disposition des plaques, pour être imprimées sur de la nitrocellulose. (E) Les puces à ADN imprimées sont sondées à l’aide de GRMP sélectionnés. (F) La liaison du GRMP aux fractions de glycanes imprimées est quantifiée et analysée avant que les données ne soient présentées sous forme de carte thermique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Exemple d’une disposition de plaque à 384 puits pour le chargement de l’échantillon, de l’encre et du GSB avec quatre dilutions par échantillon/étalon de glycane extrait. Différentes couleurs indiquent des échantillons provenant de différents réactifs d’extraction, tandis que différentes nuances représentent des dilutions en série. Le premier chiffre du code représente le numéro de l’échantillon, tandis que le numéro de fin représente le nombre de dilution (D1 indique la dilution un, D2 indique la dilution deux, et ainsi de suite). Par exemple, un puits étiqueté « 12D3 » représente l’échantillon de glycane 12, dilution trois. Les plaques de puits doivent être divisées en huit sections identiques comprenant six colonnes et huit rangées. La première section de la première plaque ne doit contenir que de l’encre et de la mémoire tampon et ressembler à l’exemple de disposition de la plaque. Les échantillons de glycanes extraits peuvent ensuite être chargés dans des sections de plaque ultérieures en fonction de la disposition de la plaque. Différents réactifs d’extraction ne doivent pas être chargés dans la même section de plaque. S’il n’y a pas suffisamment d’échantillons pour remplir une section entière, remplir tous les puits restants de cette section avec un tampon ; Ne laissez aucun puits vide. Si plusieurs plaques sont requises, la section suivante, une fois que tous les échantillons ont été chargés, doit contenir trois colonnes alternées d’encre et de GSB - il peut ne s’agir pas de la section huit, selon le nombre d’échantillons imprimés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Représentation schématique d’une conception de puce à ADN imprimée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Micropuces représentatives. (A) Pas de liaison. (B) Le signal de liaison est obscurci par un signal de fond élevé. (C) Coloration généralisée en bleu/violet due à une sursaturation en NBT/BCIP. (D) Sonde défectueuse due à une concentration élevée de substrat. (E) Impression défectueuse due à une tête d’impression sale. (F) Forte liaison à quelques échantillons. (G) Forte liaison à de nombreux échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Liaison de l’anticorps monoclonal à des étalons de glycanes définis, inclus pour valider le processus d’impression et de palpage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : MAPP de glycanes extraits de déchets de biomasse agricole. Les échantillons comprennent des déchets de pulpe de café (pulpe de café et pectine de café), des pelures de mangue de plusieurs variétés thaïlandaises (AO, Aokrong ; KO, Kam ; D.P., Rad ; CH, Chokanan ; MA, Mamkamdang ; TL, Talabnak ; MH, Mahachanok ; NG, Nga) et les feuilles d’ail noir (Ail L), la tige (Ail S), le bulbe (Garlic BG) et les racines (Garlic R), en utilisant le CDTA, le NaOH et la cellulase (Bacillus spp. cellulase 5A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Étalons commerciaux définis de polysaccharides utilisés dans l’analyse MAPP en tant que témoins positifs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Anticorps monoclonaux dirigés contre les glycanes sélectionnés pour l’interrogation de puces à glycanes végétales extraites. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

La technique MAPP décrite ici est maintenant une méthode bien établie pour l’analyse des glycanes. Les principes de base ont été décrits pour la première fois en 2007-11, mais la technique a fait l’objet d’un développement continu afin de capitaliser sur les dernières innovations en matière de technologie des puces à ADN, de développement de sondes moléculaires et de progrès dans notre compréhension de la biochimie des glycanes. En général, les glycanes, en particulier les polysaccharides, sont plus difficiles à analyser que les protéines et les nucléotides en raison de leur complexité structurelle et de leur hétérogénéité45, ainsi que du fait qu’ils ne peuvent pas être facilement séquencés ou synthétisés1. Dans de nombreux cas, aucune technique ne peut à elle seule déchiffrer la complexité des glycanes de manière concluante ; ainsi, MAPP est souvent utilisé avec d’autres méthodes. C’est l’une des raisons pour lesquelles la préparation de l’AIR est généralement choisie comme point de départ du MAPP, car l’AIR est compatible avec la plupart des autres méthodes d’analyse des glycanes34, ce qui facilite la comparaison ultérieure des ensembles de données.

En raison de l’homogénéisation de l’échantillon avant la préparation de l’AIR, certaines informations spatiales sont invariablement perdues. Cependant, comme les polysaccharides sont libérés séquentiellement à partir des échantillons, la présence d’épitopes dans les fractions obtenues fournit des informations sur l’architecture moléculaire et la composition de cet échantillon17. Ainsi, le choix d’un régime d’extraction approprié est essentiel au succès de la méthode. De multiples paramètres déterminent l’adéquation de la méthode d’extraction : la structure cellulaire, le temps, la température, le pH, la pression, la force ionique du solvant et la finesse de l’échantillon de particules solides49. Il est recommandé d’utiliser une gamme de solvants de plus en plus agressifs pour maximiser la probabilité d’extraire avec succès les glycanes constitutifs et de construire une image représentative de la composition de l’échantillon. Pour la plupart des échantillons, le CDTA, le NaOH et la cellulase sont suffisants pour éliminer les polysaccharides de stockage et de paroi cellulaire d’origine végétale 33,50,51,52. Pour certains échantillons de tissus, un régime d’extraction hybride comprenant également du CaCl2, du HCl et du Na2CO3 s’est avéré efficace53, tandis que les échantillons de microalgues marines peuvent nécessiter l’ajout d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)10.

Les puces à ADN doivent inclure une gamme d’étalons de glycanes purs et définis à utiliser comme témoins positifs5. Les étalons inclus doivent être modifiés en fonction de la nature de l’échantillon. Une fois imprimés, les GRMP appropriés doivent être sélectionnés. La génération d’anticorps monoclonaux d’hybridomes sur des structures polysaccharidiques est un défi54 ; Les anticorps se liant aux glycanes sont difficiles à élever et peuvent avoir une faible affinité55. Heureusement, il est possible d’obtenir avec une relative facilité l’information sur la séquence des gènes pour l’expression recombinante4 et l’ingénierie de leurs spécificités de liaison56,57. Bien qu’un catalogue impressionnant de GRMP ait été développé, la plupart étant maintenant disponibles à partir de sources commerciales, par rapport à la diversité des structures de glycanes existant dans la nature, seule une petite proportion a été produite et caractérisée avec succès58. Cela peut limiter la capacité de détection et de discrimination entre certaines structures. Il est conseillé d’effectuer une première expérience de sondage à l’aide d’une ou deux sondes représentatives de chaque structure glycane majeure attendue et dont la spécificité de liaison est bien caractérisée. Dans les expériences de sondage ultérieures, la liste des sondes peut être étendue pour couvrir une gamme plus large de glycanes et approfondir les structures fines.

Bien que banale, il est essentiel de s’assurer que les puces à ADN sont soigneusement lavées après chaque étape d’incubation pour assurer le succès de la procédure de sondage. L’élimination inefficace des sondes non spécifiquement liées est susceptible d’obscurcir le résultat en provoquant un signal de fond élevé après le développement de la couleur. Dans ce cas, il est nécessaire de répéter la procédure de palpage, en commençant par une nouvelle puce à ADN. De plus, les réseaux doivent être touchés avec parcimonie et uniquement en tenant les bords avec des pinces ; La membrane nitrocellulosique est cassante et s’endommage facilement. La solution de développement des couleurs s’accumule dans les fissures et les plis, provoquant une sursaturation, ce qui entrave l’analyse des matrices.

MAPP est rapide, adaptable et pratique. Cette méthode est compatible avec les glycanes animaux, microbiens ou végétaux issus de n’importe quel système biologique ou industriel, à condition qu’ils puissent être extraits et immobilisés sur de la nitrocellulose, et pour lesquels on dispose de sondes moléculaires appropriées. Les données générées fournissent des informations détaillées, semi-quantitatives et de composition, qui ne peuvent pas être facilement obtenues par d’autres méthodes d’analyse des glycanes.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier ArrayJet pour ses conseils d’expert en matière de robotique par puce à ADN. SS et JS tiennent à remercier le Fonds fondamental 2022 (FF65/004) de l’Université de Chiang Mai pour son soutien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) Megazyme P-LICHN
1,4-β-D-Mannan Megazyme P-MANCB
384-well microtiter plate Greiner Bio-One M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) Melford B74100-1.0
Acetone Sigma 270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag Jackson ImmunoResearch 300-055-240
Arabinoxylan (wheat) Megazyme P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software Media Cybernetics Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) NZYTech CZ0564
BAM antibodies SeaProbes Various
Black drawing ink (indian ink) Winsor & Newton GWD030
Carbohydrate binding modules NZYTech Various
CCRC antibodies CarboSource Various
CDTA Sigma 319945
Chloroform Sigma PHR1552
Ethanol Sigma 1.11727
Galactan (potato) Megazyme P-GALPOT
Galactomannan (carob) Megazyme P-GALML
Glycerol solution Sigma 49781-5L
Gum tragacanth (legumes) Sigma-Aldrich G1128
INCh antibodies INRA Various
LM and JIM antibodies PlantProbes Various
Marathon Argus Microarray Printer ArrayJet
Methanol Sigma  34860
Monoclonal antibodies Biosupplies Australia Various
NaBH4 Sigma 452882
NaOH Sigma S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT) Melford N66000-1.0
Nitrocellulose membrane Thermo Fisher Scientific 88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%) Danisco NA
ProClin 200 Sigma 48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) Megazyme P-RHAGN
Rotating mixer Fisher Scientific 88-861-050
Rotating/rocking Shaker Cole-Parmer
Skimmed milk powder Marvel
Spin filter Costar Spin-X 8160
Stainless steel beads Qiagen 69989
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris Sigma 93362
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Xylan (beechwood) Megazyme P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind) Megazyme P-XYGLN
β-Glucan (oat) Megazyme P-BGOM

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Bakshani, C. R., Sangta, J., Sommano, S., Willats, W. G. T. Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis. J. Vis. Exp. (199), e65443, doi:10.3791/65443 (2023).

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