Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Microarray Polymer Profiling (MAPP) til analyse af glycan med høj kapacitet

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65443
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University

Summary

Microarray polymer profiling (MAPP) er en high-throughput teknik til sammensætningsanalyse af glycaner i biologiske prøver.

Abstract

Microarray polymer profiling (MAPP) er en robust og reproducerbar tilgang til systematisk bestemmelse af sammensætningen og den relative overflod af glycaner og glycokonjugater inden for en række biologiske prøver, herunder plante- og algevæv, fødevarematerialer og prøver fra mennesker, dyr og mikrobielle. Microarray-teknologi understøtter effektiviteten af denne metode ved at tilvejebringe en miniaturiseret screeningsplatform med høj kapacitet, der gør det muligt at karakterisere tusindvis af interaktioner mellem glycaner og meget specifikke glycanstyrede molekylære sonder samtidigt ved kun at bruge små mængder analysander. Bestanddele glycaner fraktioneres kemisk og enzymatisk, før de ekstraheres sekventielt fra prøven og direkte immobiliseres på nitrocellulosemembraner. Glykansammensætningen bestemmes ved fastgørelse af specifikke glycangenkendende molekylære sonder til de afpressede og trykte molekyler. MAPP supplerer konventionelle glykananalyseteknikker, såsom monosaccharid- og koblingsanalyse og massespektrometri. Imidlertid giver glykangenkendende molekylære sonder indsigt i de strukturelle konfigurationer af glycaner, som kan hjælpe med at belyse biologiske interaktioner og funktionelle roller.

Introduction

Glykaner er allestedsnærværende på alle områder af livet og udviser uovertruffen mangfoldighed i struktur og funktion sammenlignet med andre makromolekyler1. På grund af deres kompleksitet, variabilitet i biosyntese og glycosidbindinger og manglen på passende metoder til dissekering af glykanstrukturer er vores forståelse af denne mangfoldighed i strukturer og funktioner imidlertid relativt begrænset2.

Mange glykananalyseteknikker er destruktive og nødvendiggør nedbrydning af glycaner i deres bestanddele monosaccharider, hvilket kan skjule relevante tredimensionelle og biologiske sammenhænge3. Omvendt genkender og binder monoklonale antistoffer (mAbs), kulhydratbindingsmoduler (CBM'er), lektiner, virale agglutininer og mikrobielle adhæsiner, samlet kendt som glycangenkendende molekylære sonder (GRMP'er)4, til specifikke epitoper og kan bruges som værktøjer til at detektere og skelne mellem glycaner inden for komplekse multiglycanmatricer 5,6.

Her præsenterer vi microarray polymer profiling (MAPP), en hurtig, alsidig og ikke-destruktiv metode til glykananalyse, der kan anvendes til et bredt spektrum af biologiske prøver. Metoden sigter mod at tilvejebringe en robust og høj kapacitet til analyse af glycaner fra forskellige biologiske og industrielle / kommercielle systemer. MAPP forener genkendelsesspecificiteten af glykanrettede molekylære sonder med reproducerbar, højtydende microarray-screeningsteknologi for at gøre det muligt at profilere tusindvis af molekylære interaktioner parallelt. Resultatet af denne tilgang er diagnostisk indsigt i sammensætningen og den relative overflod af glycaner i en prøve eller væv af interesse.

MAPP kan anvendes som en uafhængig, enkeltstående metode eller sammen med andre biokemiske teknikker, såsom immunofluorescensmikroskopi 7,8,9 og monosaccharid- eller koblingsanalyse10,11. Teknikken kan også bruges til at kortlægge epitopspecificiteter af nye GRMP'er ved hjælp af arrays trykt med rene og strukturelt veldefinerede oligosaccharidstandarder12. En stor fordel ved MAPP i forhold til andre metoder, såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), er dens kompatibilitet med små prøvevolumener 13,14. Desuden tilbyder MAPP signifikant højere gennemstrømningsanalyse15 og giver en effektiv form for prøvekonservering, da trykte prøver er tørre og stabile, når de immobiliseres på nitrocellulose16.

Bindingen af GRMP'er er generelt afhængig af tilstedeværelsen af et antal sammenhængende sukkerrester, der tilsammen danner et bindingssted (epitop), der er unikt for en bestemt polysaccharidklasse (xylan, mannan, xyloglucan osv.) 17. I modsætning hertil kan de enkelte sukkerrester (xylose, mannose, glucose), der kvantificeres ved hjælp af de fleste biokemiske teknikker, f.eks. monosaccharidsammensætning eller methyleringsanalyse, være bestanddele af flere polysaccharidklasser og dermed vanskelige at tildele18.

MAPP er udviklet som reaktion på et teknologisk hul, nemlig evnen til hurtigt at analysere flere glykaner fra en række forskellige kilder ved hjælp af små mængder materiale. MAPP udnytter det omfattende repertoire af GRMP'er, der er blevet udviklet og karakteriseret i løbet af de sidste tre årtier 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Udviklingen af MAPP har været en iterativ proces, hvor teknikken løbende er blevet forfinet og optimeret. Der er nu en betydelig mængde litteratur, der beskriver anvendelsen af MAPP på forskellige naturlige og industrielle systemer, hvor glycaner spiller centrale roller 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Her beskriver vi den aktuelle state of the art for MAPP.

Protocol

De vigtigste eksperimentelle stadier af MAPP-metoden er opsummeret i figur 1.

1. Forberedelse af prøver

BEMÆRK: Her anvendes metoden på plantevæv til illustrative formål. De udvalgte planter var Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon og flere thailandske mangosorter (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok og Nga). Planterne blev udvalgt for deres kommercielle betydning. Deres forarbejdning til konsum genererer i øjeblikket underudnyttet agroindustrielt affald, som kan udgøre en kilde til merværdiprodukter, herunder rene glycaner. MAPP blev således anvendt til at karakterisere glykansammensætningen af affaldsanlæggets biomasse til bioprospekteringsformål.

  1. Adskil plantematerialet i forskellige væv (f.eks. Rod, stilk og blade).
  2. Plantevævet tørres i en varmluftsovn ved 40 °C i 12-24 timer (nedsættelse/forøgelse af tiden i overensstemmelse med prøven). Alternativt kan du snapfryse prøverne i flydende nitrogen og derefter fryse i ~4 dage.
  3. Prøverne homogeniseres til et fint pulver ved hjælp af en støder og mørtel eller en mekanisk vævslysator (se materialetabellen) med et kugleleje i hvert rør.
    BEMÆRK: For frisk plantevæv anbefales tørring eller frysetørring før homogenisering. Generelt er homogenisering med en stød og mørtel tilstrækkelig til de fleste tørre prøver. For særligt modstandsdygtige prøver, såsom korn, bælgfrugter og forarbejdede fødevarer som pasta, kan snapfrysning i flydende nitrogen øge hastigheden og effektiviteten af prøvehomogenisering. Vi har fundet ud af, at mekanisk homogenisering er kompatibel med næsten alle prøvetyper, er betydeligt hurtigere og mindre arbejdskrævende og effektivt minimerer risikoen for krydskontaminering af prøver ved gentagen brug af det samme udstyr (dvs. stød og mørtel).

2. Fremstilling af alkoholuopløselige rester (AIR)

  1. Tilsæt 1,5 ml 70% (v / v) ethanol til 50-100 mg lufttørret og homogeniseret prøvemateriale.
  2. Vortex blandes grundigt og centrifugeres derefter ved 10.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Den resulterende supernatant kasseres med en pipette og pelletten.
  3. Til den resterende pellet tilsættes 1,5 ml methanol og chloroform (1: 1 [v / v]). Der centrifugeres hvirvelstrøm, og supernatanten kasseres, jf. trin 2.2.
  4. Til den resterende pellet tilsættes 1,5 ml 100% acetone. Der centrifugeres hvirvelstrøm, og supernatanten kasseres, jf. trin 2.2.
  5. Anbring den resulterende pellet enten natten over i en stinkhætte for at lade den resterende acetone fordampe eller i en vakuumcentrifuge, indtil den er tør.
    BEMÆRK: AIR-materiale kan opbevares ved omgivelsestemperatur, indtil det er nødvendigt.

3. Ekstraktion af glykaner

BEMÆRK: Hvis det er muligt, skal du udføre alle ekstraktionstrin i en vævslyser med et kugleleje i hvert rør for at hjælpe resuspension. Hvis en vævslyser ikke er tilgængelig, kan ekstraktioner udføres i stedet med kontinuerlig omrøring eller omrystning. Det kan være nødvendigt at forlænge ekstraktionstiden, hvis dette ikke er muligt.

  1. Til 10 mg AIR-materiale tilsættes 30 μL/mg 50 mM cyclohexanediamintetraeddikesyre (CDTA; se materialetabel), pH 7,5.
  2. Ryst ved 27 Hz i 2 minutter, efterfulgt af 10 Hz i 2 timer.
  3. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Den færdige supernatant bevares, tilsættes til et sterilt mikrocentrifugeglas, og den opbevares ved 4 °C på en rotationsryster.
  4. Til den resterende pellet tilsættes 30 μL/mg 4 M NaOH + 0,1 % (w/v) NaBH4.
    FORSIGTIG: NaBH4 er giftigt ved indtagelse. Brug personlige værnemidler. Håndtag under en stinkhætte. Undgå støvdannelse. Undgå at indånde støv. Lad ikke produktet komme i kontakt med vand.
  5. Gentag trin 3.2 til 3.3. Vask den resterende pellet to eller tre gange med dH2O for at fjerne den resterende NaOH.
  6. Der tilsættes 30 μL/mg cellulase (helst GH5 endo-1,4-β-glucanase i passende enzymbuffer - som anbefalet af producenten; se materialetabellen) til pellet og inkuberes ved enzymets optimale temperatur i 16 timer.
  7. Prøverne centrifugeres ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C . Supernatanten tilbageholdes, overføres til rene mikrocentrifugeglas og opbevares ved 4 °C på en rotationsryster. Når prøverne er ekstraheret, skal de udskrives hurtigst muligt.
  8. Alle de lagrede ekstrakter centrifugeres igen ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    BEMÆRK: Prøverne skal være fri for partikler og snavs. Før om nødvendigt gennem et 0,2 μm centrifugeringsfilter inden mikroarray-udskrivning. Særligt viskøse prøver er uforenelige med mikroarray-analyse, da mikroarrayer-kapillærerne og printhovedet let kan blive tilstoppede. Som hovedregel bør brugerne kunne pipette alle prøver, der er beregnet til udskrivning med en standard lavvolumenpipette.

4. Udarbejdelse af standarder

  1. Der fremstilles 1 mg/ml opløsninger af definerede glykanstandarder (tabel 1) i steriledH2O. Hvis du bruger pachyman som standard, opløses i 4 M NaOH i stedet og neutraliseres med iseddike efter opløselighed.
  2. Opbevar de tilberedte standarder natten over ved 4 °C på en rotationsryster for at muliggøre fuldstændig opløselighed.
  3. Centrifuger alle standarder i 10 minutter ved 10.000 x g ved 4 °C for at pelletere eventuelt snavs. Den færdige supernatant anvendes til efterfølgende trykning.

5. Microarray-udskrivning

  1. Forbered en 1:20 (v/v) fortynding af sort indisk blæk/tegneblæk i glycerolsystembuffer (GSB; kombiner 47% glycerol, 52,9%dH2O, 0,06% Triton X-100 og 0,04% biocid [0,15%-0,17% kobbernitrat og 1,4%-2,0% magnesiumnitrat i vand] og filtrer steriliser) (se materialetabel) og centrifuger i 10 minutter ved 15.000 x g (stuetemperatur).
    BEMÆRK: Blækopløsning er nødvendig for at skabe en øverste og nederste kant omkring de trykte prøver, så de trykte mikroarrays kan detekteres visuelt på membranen. Imidlertid indeholder blækopløsningen sandsynligvis sediment. Alle opløsninger skal være fri for partikler til udskrivning, så undgå at forstyrre sedimentet ved pipettering. Kassér og tilbered frisk, når dette ikke længere er muligt. Opløsningen kan ikke let filtreres for at fjerne partikler.
  2. Der tilsættes 40 μL blækopløsning og GSB til den første del af den første plade med 384 brønde (figur 2).
  3. Der tilsættes 25 μL GSB til alle fortyndingshuller 1 (D1). Der tilsættes 40 μL GSB til alle fortyndingsbrønde 2, 3 og 4 (D2-D4).
  4. De ekstraherede glycanprøver og definerede glycansubstrater fortyndes 1:1 (v/v) med GSB ved at tilsætte 25 μL ekstraheret glycanprøve til D1-hullerne i rækkefølge.
  5. Hver prøve fortyndes serielt fire gange ved at udtage 10 μL af prøven fra D1-brønden og tilsætte til D2-brønden. Opsug forsigtigt med en pipette for at blande.
  6. Processen gentages ved at tage 10 μL prøve fra D2-brønden og tilsætte den til D3-brønden.
  7. Gentag for D4-brønden. Efter blanding kasseres 10 μL fra D4-brønden, så hvert hul indeholder et slutvolumen på 40 μL.
  8. Tilsæt 40 μL blækopløsning og GSB til den sidste blok af den endelige plade.
  9. Dæk pladerne med et klæbepladedæksel og centrifuger i 10 minutter ved 3.000 x g (stuetemperatur). Sørg for, at der ikke er bobler tilbage efter centrifugering, og gentag om nødvendigt.
  10. Brug en berøringsfri piezoelektrisk mikroarray-udskrivningsrobot til at udskrive prøverne på nitrocellulosemembranen (se materialetabellen) ved at følge nedenstående trin.
    BEMÆRK: Nedenfor anbefales handlinger for optimal udskriftskvalitet; De specifikke parametre, der kræves, vil dog i sidste ende afhænge af det anvendte instrument. Vi anbefaler, at brugerne kontakter instrumentproducenten for at diskutere de relevante tilpasninger og udskriftsindstillinger, der kræves til deres enhed.
    1. Før udskrivning skal du tømme affaldsbufferbeholderen og fylde den rene bufferbeholder med ren GSB efter behov. Tænd for instrumentet, og lad det stabilisere sig i >10 min, hvis det har et integreret fugtigheds- og temperaturstyringssystem. Tænd mikroarrayeren, og initialiser systemet.
      BEMÆRK: Det anbefales at køre en test for at bestemme instrumentets indre tryk. Hvis trykket er for lavt, kan det være nødvendigt at udføre en højtryksrensning. Kontakt igen instrumentproducenten for at diskutere den specifikke betjening af det specifikke instrument.
    2. Rens printhovedet og kapillærerne flere gange med GSB for at fjerne snavs og potentielle forurenende stoffer. Udfør en testudskrivning ved enten at ilægge en GSB-plade alene eller indstille instrumentet til at udskrive direkte fra det rene bufferreservoir og omgå prøveaspiration fra en ilagt plade.
      BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at udføre testudskriften ved hjælp af en nitrocellulosemembran; Rene mikroskopdias er tilstrækkelige og giver den fordel, at spotstørrelsen, formen og kvaliteten kan vurderes visuelt inden prøveudskrivning.
    3. Når du udskriver ekstraherede glykanprøver, skal du programmere systemet til at skylle med ren GSB mellem hver prøve.
      BEMÆRK: Typisk er prøvevolumen pr. udskrevet spot 100 pL til 10 nL, og spotstørrelsen varierer fra 20 μm til 100 μm, afhængigt af den valgte prøvevolumen. Udskrivning af 100 mikroarrays fra en kilde 384-brønds plade tager cirka 40 minutter, inklusive systemskylning. De resulterende mikroarrays vil være ca. 1 cm2 i størrelse. Yderligere plader øger arrayets længde med ca. 1 cm pr. plade. Et skema over det trykte microarray-design er vist i figur 3. Når de er udskrevet, er mikroarrayerne klar til brug med det samme og kan opbevares i flere år. Hvis udskriftsjobbet af en eller anden grund skal gentages på grund af den potentielle fordampning af prøver under udskrivning, anbefales det, at der lægges en ny prøveplade i, og at den originale plade kasseres.
    4. Rengør printhovedet og kapillærerne grundigt en gang om ugen. Gør dette ved at indlæse en 384-brønd, der indeholder en 1:20 fortynding af koncentreret NaOH i GSB, og udfør en 40 min til 1 times udskrivning på mikroskopglas. Brugere bør sikre, at denne rengøringsløsning er kompatibel med deres instrument, før de fortsætter.
  11. Gem den unikke gitterfil (.gal-fil), der er produceret til det udskrevne mikroarray, klar til downstreamanalyse.

6. Microarray-sondering

  1. Klip individuelle, identiske trykte mikroarrays ud af nitrocellulosemembranen og læg dem i en beholder af passende størrelse til sondering (f.eks. En 12- eller 24-brønds mikrotiterplade) (se materialetabel). Arrayet skal ligge fladt på bunden af fartøjet. Der kræves et mikroarray pr. sonde og repræsenterer en teknisk replikat.
  2. For at reducere uspecifik binding inkuberes mikroarrayerne i 1 time i MP-TBST-blokerende buffer (1x Tris-bufret saltvand, pH 7,5, + 0,1% [v/v] TWEEN 20 [TBST] og suppleret med 5% [w/v] skummetmælkspulver; se materialetabel) på en roterende/gyngerystende ryster. Sørg for, at diskenheden er tilstrækkelig til at nedsænke hele arrayet.
  3. Efter inkubation fjernes MP-TBST, og den erstattes med et nyt volumen MP-TBST.
  4. Inkuber arrayerne med monoklonale antistoffer (mAbs) eller His-mærkede CBM'er eller andre GRMP'er (f.eks. lektiner), fortyndet 1:10-1:1.000 (som specificeret af producenten; se materialetabel) i MP-TBST i 2 timer på en roterende/rokkende ryster.
  5. Efter inkubation fjernes molekylsondeopløsningen, og arrayerne dækkes i ren TBST, hvilket sikrer, at arrayerne er helt nedsænket. For at fjerne resterende sondeopløsning skal du straks fjerne TBST og udskifte med et nyt volumen. Placer arrays på en roterende/rokkende shaker i 5 min. Efter 5 minutter fjernes TBST, udskiftes med en ny lydstyrke og anbringes på en roterende/gyngerystende ryster i 5 min.
    BEMÆRK: Denne proces skal gentages tre gange, ikke inklusive den første tilføjelse og øjeblikkelig fjernelse af TBST.
  6. Inkuber arrayerne med alkalisk-fosfatasekonjugerede sekundære antistoffer (anti-mus, anti-rotte, antikanin, anti-Hans, alt efter hvad der er relevant; se materialetabel) fortyndet 1:1.000 i MP-TBST i 2 timer på en vippende/roterende ryster.
    BEMÆRK: Peberrodsperoxidase-konjugerede sekundære antistoffer er også egnede, der anvendes sammen med tetramethylbenzidin (TMB) / hydrogenperoxidsubstrat til farveudvikling.
  7. Efter inkubation gentages vaskeproceduren i henhold til trin 6.5 for at fjerne ikke-specifikt bundne sekundære antistoffer.
  8. Dæk arrayerne i nitroblåt tetrazolium (NBT)/5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) farveudviklingsopløsning (se materialetabel) til kromogen påvisning af antistofbinding. Lad være, indtil lilla udfældningspletter udvikler sig på antigenbindingsstederne (typisk 5-30 minutter, men arrayerne skal overvåges nøje for at undgå overmætning, da reaktionen kan forekomme hurtigt).
    FORSIGTIG: BCIP er skadeligt, når det kommer i kontakt med huden og kan forårsage irritation af luftvejene. Brug personlige værnemidler. Undgå støvdannelse. Undgå at indånde støv.
  9. For at afslutte reaktionen skal du nedsænke arrayerne i rent ledningsvand og vaske grundigt.
  10. Placer arrays mellem blotting papir natten over ved omgivelsestemperatur for at tørre.
  11. Kassér arrays med åbenlyse defekter, og gentag sondeprotokollen i sådanne tilfælde (figur 4).

7. Analyse og kvantificering

  1. Scan de udviklede systemer med en opløsning på 2.400 dpi (dots per inch) ved hjælp af en desktopscanner. Konverter billederne til TIFF-filer og derefter til negativer.
  2. Ved hjælp af mikroarray-analysesoftware (se materialetabellen) overlejres den unikke .gal-gitterfil på hvert mikroarray-billede for at beregne farveintensiteten af det sted, der produceres på hvert antigenbindingssted, og trække den lokale baggrund fra.
  3. Eksportér gitterdataene som en .txt fil. Disse kan derefter importeres manuelt til et Excel-ark til analyse.
  4. Der genereres en gennemsnitlig værdi for spotsignalintensiteten for hver prøve ved at beregne gennemsnittet af spotintensiteten først på tværs af hver prøvefortynding og derefter på tværs af eventuelle inkluderede biologiske replikater.
  5. Tildel en værdi på 100 til den højeste gennemsnitlige spotsignalintensitet, og normaliser de resterende data i overensstemmelse hermed.
    BEMÆRK: Normaliserede gennemsnitlige spotsignalintensiteter kan derefter præsenteres som et varmekort over relativ glykanepitopoverflod ved hjælp af den betingede formateringsfunktion i Excel33 eller ved hjælp af funktionen geom_tile i R ggplot2-pakke40,41.

Representative Results

MAPP blev anvendt til at bestemme glykansammensætningen af biomasseaffald fra landbruget, der omfatter mangoskaller fra flere nordthailandske sorter, Coffea arabica kirsebærmasse og kaffebønneforarbejdningsaffald og rod-, stamme- og bladvæv fra thailandsk sort hvidløg, Allium sativum var. ophioscorodon. Flere planteafledte polysaccharider anvendes i fødevareindustrien som funktionelle ingredienser42,43. Formålet med dette eksperiment var således at udlede, om disse rigelige og i øjeblikket underudnyttede agroindustrielle affaldsmaterialer kan give en kilde til værditilvækst rene polysaccharider.

AIR-materiale anvendes rutinemæssigt til at forberede prøver beregnet til glykananalyse44. Der er flere fordele ved at bruge AIR; behandling med opløsningsmidler fjerner effektivt endogene CAZymer, metabolitter, små saccharider, lipider og pigmenter, hvilket resulterer i prøver beriget med polysaccharider og strukturelle proteiner34. Desuden er produktion af AIR en hurtig og effektiv måde at øge prøvens levetid på, da den er termostabil og kan opbevares i flere år.

Tre blandede fraktioner af bestanddele glycaner blev sekventielt ekstraheret fra plante AIR-materiale ved hjælp af CDTA, NaOH og cellulase. CDTA chelaterer Ca2+ ioner, som tillader fjernelse af Ca2+ tværbundne de-esterificerede pektiner fra plantecellevægge45. Alkaliske forhold tillader overvejende hemicelluloser, såsom mannan, xylan og β-glucan, at blive frigivet på grund af forstyrrelsen af hydrogenbinding og forsæbning af esterbindinger mellem cellulosemikrofibriller og hemicellulose og henholdsvis lignin og hemicellulose46. En rekombinant endo-1,4-β-glucanase fra Bacillus spp. blev anvendt til at nedbryde amorfe områder af de strukturelle cellulosemikrofibriller og frigive resterende glycaner bundet til cellulose i cellevæggene47. Selvom denne metode effektivt adskiller glycaner i disse tre brede grupper, skal det bemærkes, at prøverne ikke er rene; På grund af selve ekstraktionsmetodens natur vil hemicellulose, hvis den er til stede i prøven, uundgåeligt blive ekstraheret og efterfølgende detekteret i varierende grad i CDTA- og cellulasefraktionerne. Ligeledes vil noget pektin blive detekteret i NaOH-ekstraktionen, hvis det er til stede i prøven.

En berøringsfri, piezoelektrisk mikroarray-printrobot blev brugt til at immobilisere ekstraherede glycanfraktioner på nitrocellulose via ikke-kovalent vedhæftning11 og dannede 300 identiske mikroarrays. Definerede glykanstandarder (tabel 1) blev også inkluderet i de trykte mikroarrays som positive kontroller (figur 5). MAPP-bindingsprofilen opnået for de valgte glycanstandarder svarer til tidligere rapporterede epitopspecificiteter. For eksempel udviste LM21 stærk binding til flere mannanpolysaccharider (galactomannan og glucomannan), mens LM22 kun udviste svag binding til galactomannan25. Tilsvarende er LM19 fortrinsvis bundet til de-esterificeret homogalacturonan48 og LM15 bundet til tamarindfrø xyloglucan23.

Den relative forekomst af 16 epitoper, diagnostisk af ikke-celluloseholdige plantecellevægspolysaccharider, blev påvist ved binding af glycanrettede monoklonale antistoffer (tabel 2) til trykte ekstrakter (figur 6). Størstedelen af de ekstraherede glycaner blev påvist i den alkaliske NaOH-fraktion. Der blev registreret stærke bindingssignaler for mAbs LM10 og LM11, der repræsenterer xylan/arabinoxylan, i skrælene af alle de testede mangosorter. Inden for hvidløgsprøverne bandt LM10 og LM11 fortrinsvis til rodvævsekstrakt (hvidløg R) og udviste kun svag binding til bladvævsekstraktet (hvidløg L). LM19, der repræsenterer delvist methylesterificeret eller ikke-esterificeret homogalacturonan, stærkt bundet til nogle mangosortekstrakter (Aokrong og Talabnak), men kun bundet svagt, eller dets binding var uopdagelig i andre sorter (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok og Nga). Derudover bandt LM19 kun til kaffepulpfraktionerne og bandt ikke til kaffebønneforarbejdningsaffaldsmaterialet, der tidligere blev anset for at bestå af halvrenset kaffepektin (upublicerede data).

Figure 1
Figur 1: Større eksperimentelle trin i MAPP-metoden. (A) Prøver homogeniseres til dannelse af fine pulvere. (B) De homogeniserede prøver behandles for at isolere deres AIRs. (C) De glycaner, der indgår i glycanerne, ekstraheres sekventielt ved hjælp af et skræddersyet ekstraktionsregime. (D) De ekstraherede glycanfraktioner, blæk og GSB overføres til plader med 384 brønde i henhold til pladelayoutet til udskrivning på nitrocellulose. (E) De trykte mikroarrays undersøges med udvalgte GRMP'er. (F) GRMP-binding til de trykte glycanfraktioner kvantificeres og analyseres, før data præsenteres som et varmekort. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på et 384-brønds pladelayout til prøve-, blæk- og GSB-ilægning med fire fortyndinger pr. ekstraheret glycanprøve/standard. Forskellige farver angiver prøver, der stammer fra forskellige ekstraktionsreagenser, mens forskellige nuancer repræsenterer serielle fortyndinger. Det første tal i koden repræsenterer prøvenummeret, mens sluttallet repræsenterer fortyndingsnummeret (D1 angiver fortynding en, D2 angiver fortynding to osv.). For eksempel repræsenterer en brønd mærket '12D3' glycanprøve 12, fortynding tre. Brøndplader skal opdeles i otte identiske sektioner bestående af seks kolonner og otte rækker. Den første del af den første plade må kun indeholde trykfarve og buffer og ligne eksempelpladelayoutet. Ekstraherede glykanprøver kan derefter indlæses i efterfølgende pladesektioner i henhold til pladelayoutet. Forskellige ekstraktionsreagenser må ikke fyldes i samme pladesektion. Hvis der ikke er tilstrækkelige prøver til at fylde en hel sektion, fyldes alle resterende huller i dette afsnit med buffer. Efterlad ikke nogen brønde tomme. Hvis der kræves flere plader, skal det næste afsnit, efter at alle prøver er indlæst, indeholde tre skiftende kolonner med blæk og GSB - dette er muligvis ikke afsnit otte, afhængigt af antallet af prøver, der udskrives. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematisk gengivelse af trykt microarray-design. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative mikroarrays. (A) Ingen binding. (B) Bindingssignalet skjules af et højt baggrundssignal. (C) Generaliseret blå / lilla farvning på grund af overmætning med NBT / BCIP. (D) Defekt sondering på grund af høj substratkoncentration. (E) Defekt udskrivning på grund af det urene printhoved. (F) Stærk binding til få prøver. (G) Stærk binding til mange prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Monoklonal antistofbinding til definerede glykanstandarder, inkluderet for at validere udskrivnings- og sondeprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: MAPP af glycaner udvundet af biomasseaffald fra landbruget. Prøverne omfatter kaffepulpaffald (kaffemasse og kaffepektin), mangoskaller fra flere thailandske sorter (AO, Aokrong; KO, Kam; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; MH, Mahachanok; NG, Nga) og sorte hvidløgsblade (hvidløg L), stilk (hvidløg S), løg (hvidløg BG) og rødder (hvidløg R) ved hjælp af CDTA, NaOH og cellulase (Bacillus spp. cellulase 5A). Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Definerede kommercielle polysaccharidstandarder anvendt i MAPP-analyse som positive kontroller. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Glykanrettede monoklonale antistoffer udvalgt til undersøgelse af ekstraherede planteglykanmikroarrays. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

MAPP-teknikken beskrevet her er nu en veletableret metode til glykananalyse. De grundlæggende principper blev først beskrevet i 200711, men teknikken har gennemgået løbende udvikling for at udnytte de nyeste innovationer inden for microarray-teknologi, molekylær sondeudvikling og fremskridt i vores forståelse af glykanbiokemi. Generelt er glycaner, især polysaccharider, mere udfordrende at analysere end proteiner og nukleotider på grund af deres strukturelle kompleksitet og heterogenitet45, samt det faktum, at de ikke let kan sekventeres eller syntetiseres1. I mange tilfælde kan ingen enkelt teknik dechiffrere glykankompleksitet endeligt; således bruges MAPP ofte med andre metoder. Dette er en af grundene til, at AIR-forberedelse normalt vælges som udgangspunkt for MAPP, da AIR er kompatibel med de fleste andre glykananalysemetoder34, hvilket letter den efterfølgende sammenligning af datasæt.

På grund af homogenisering af prøven før AIR-forberedelse går nogle rumlige oplysninger altid tabt. Da polysaccharider imidlertid frigives sekventielt fra prøver, giver tilstedeværelsen af epitoper i de opnåede fraktioner information om prøvens molekylære arkitektur og sammensætning17. Valg af et passende ekstraktionsregime er således afgørende for metodens succes. Flere parametre bestemmer ekstraktionsmetodens egnethed: cellulær struktur, tid, temperatur, pH, tryk, opløsningsmidlets ionstyrke og finhed af den faste partikelprøve49. Det anbefales, at en række stadig mere aggressive opløsningsmidler anvendes for at maksimere sandsynligheden for vellykket ekstraktion af glycanbestanddele og opbygning af et repræsentativt sammensætningsbillede af prøven. For de fleste prøver er CDTA, NaOH og cellulase tilstrækkelige til at fjerne planteafledt opbevaring og cellevægspolysaccharider 33,50,51,52. For nogle vævsprøver har et hybridekstraktionsregime, der også omfatterCaCl2, HCI ogNa2CO3, vist sig at være vellykket53, mens marine mikroalgeprøver kan kræve tilsætning af ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)10.

Mikroarrays bør omfatte en række rene, definerede glykanstandarder, der skal anvendes som positive kontroller5. Inkluderede standarder bør ændres i overensstemmelse med stikprøvens art. Når de er udskrevet, skal der vælges passende GRMP'er. Genereringen af hybridoma mAbs til polysaccharidstrukturer er udfordrende54; Glykanbindende antistoffer er vanskelige at hæve og kan have lav affinitet55. Heldigvis kan gensekvensinformation for CBM'er opnås relativt let for rekombinant ekspression4 og engineering af deres bindingsspecificiteter56,57. Selv om der er udviklet et imponerende katalog over GRMP'er, hvor de fleste nu er tilgængelige fra kommercielle kilder, er der i forhold til mangfoldigheden af glykanstrukturer, der findes i naturen, kun blevet produceret og karakteriseret med succes58. Dette kan begrænse evnen til at opdage og skelne mellem visse strukturer. Det tilrådes at udføre et indledende sondeforsøg ved hjælp af en eller to sonder, der er repræsentative for hver større glykanstruktur, der forventes at være til stede, for hvilken bindingsspecificiteten er velkarakteriseret. I efterfølgende sondeeksperimenter kan sondelisten udvides til at dække et bredere udvalg af glycaner og dykke dybere ned i fine strukturer.

Selvom det er dagligdags, er det grundlæggende for sonderingprocedurens succes at sikre, at mikroarrays vaskes grundigt efter hvert inkubationstrin. Den ineffektive fjernelse af ikke-specifikt bundne sonder vil sandsynligvis skjule resultatet ved at forårsage et højt baggrundssignal efter farveudvikling. I dette tilfælde er det nødvendigt at gentage sonderingsproceduren, begyndende med et nyt mikroarray. Desuden bør arrays røres sparsomt og kun ved at holde kanterne med tang; Nitrocellulosemembranen er sprød og let beskadiget. Farveudviklingsløsningen samler sig i revner og folder, hvilket forårsager overmætning, hvilket forhindrer arrayanalyse.

MAPP er hurtig, tilpasningsdygtig og praktisk. Denne metode er kompatibel med dyre-, mikrobielle eller planteglycaner afledt af ethvert biologisk eller industrielt system, så længe de kan ekstraheres og immobiliseres på nitrocellulose, og for hvilke man har passende molekylære sonder. De genererede data giver detaljeret, semikvantitativ, sammensætningsmæssig indsigt, som ikke let kan opnås via andre glykananalysemetoder.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende ArrayJet for deres ekspertrådgivning vedrørende microarray robotik. SS og JS vil gerne anerkende støtten fra Fundamental Fund 2022 (FF65/004), Chiang Mai University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) Megazyme P-LICHN
1,4-β-D-Mannan Megazyme P-MANCB
384-well microtiter plate Greiner Bio-One M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) Melford B74100-1.0
Acetone Sigma 270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag Jackson ImmunoResearch 300-055-240
Arabinoxylan (wheat) Megazyme P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software Media Cybernetics Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) NZYTech CZ0564
BAM antibodies SeaProbes Various
Black drawing ink (indian ink) Winsor & Newton GWD030
Carbohydrate binding modules NZYTech Various
CCRC antibodies CarboSource Various
CDTA Sigma 319945
Chloroform Sigma PHR1552
Ethanol Sigma 1.11727
Galactan (potato) Megazyme P-GALPOT
Galactomannan (carob) Megazyme P-GALML
Glycerol solution Sigma 49781-5L
Gum tragacanth (legumes) Sigma-Aldrich G1128
INCh antibodies INRA Various
LM and JIM antibodies PlantProbes Various
Marathon Argus Microarray Printer ArrayJet
Methanol Sigma  34860
Monoclonal antibodies Biosupplies Australia Various
NaBH4 Sigma 452882
NaOH Sigma S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT) Melford N66000-1.0
Nitrocellulose membrane Thermo Fisher Scientific 88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%) Danisco NA
ProClin 200 Sigma 48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) Megazyme P-RHAGN
Rotating mixer Fisher Scientific 88-861-050
Rotating/rocking Shaker Cole-Parmer
Skimmed milk powder Marvel
Spin filter Costar Spin-X 8160
Stainless steel beads Qiagen 69989
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris Sigma 93362
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Xylan (beechwood) Megazyme P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind) Megazyme P-XYGLN
β-Glucan (oat) Megazyme P-BGOM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amicucci, M. J., et al. A nonenzymatic method for cleaving polysaccharides to yield oligosaccharides for structural analysis. Nature Communications. 11 (1), 3963 (2020).
  2. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Evolution of glycan diversity. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  3. Willats, W. G. T., McCartney, L., Knox, J. P. Pectin cell biology: complexity in context. Advances in Pectin and Pectinase Research. , Springer. Netherlands. 147-157 (2003).
  4. Cummings, R. D., et al. Glycan-recognizing probes as tools. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  5. Bakshani, C. R., et al. Analysis of glycans in a Burnt-on/Baked-on (BoBo) model food soil using Microarray Polymer Profiling (MAPP) and immunofluorescence microscopy. Food Chemistry. 410, 135379 (2023).
  6. Salmeán, A. A., Willats, W. G. T., Ribeiro, S., Andersen, T. J., Ellegaard, M. Over 100-year preservation and temporal fluctuations of cell wall polysaccharides in marine sediments. Frontiers in Plant Science. 13, 785902 (2022).
  7. Cid, M., et al. Recognition of the helical structure of β-1,4-galactan by a new family of carbohydrate-binding modules. Journal of Biological Chemistry. 285 (46), 35999-36009 (2010).
  8. Runavot, J. -L., et al. Non-cellulosic polysaccharides from cotton fibre are differently impacted by textile processing. PLoS One. 9 (12), e115150 (2014).
  9. Ahl, L. I., et al. Analyses of aloe polysaccharides using carbohydrate microarray profiling. Journal of AOAC International. 101 (6), 1720-1728 (2018).
  10. Vidal-Melgosa, S., et al. Diatom fucan polysaccharide precipitates carbon during algal blooms. Nature Communications. 12 (1), 1150 (2021).
  11. Moller, I., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant Journal. 50 (6), 1118-1128 (2007).
  12. Ruprecht, C., et al. A synthetic glycan microarray enables epitope mapping of plant cell wall glycan-directed antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  13. Cummings, R. D., et al. Principles of glycan recognition. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  14. Gao, C., et al. Glycan microarrays as chemical tools for identifying glycan recognition by immune proteins. Frontiers in Chemistry. 7, 833 (2019).
  15. Vidal-Melgosa, S., et al. A new versatile microarray-based method for high throughput screening of carbohydrate-active enzymes. Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9020-9036 (2015).
  16. Willats, W. G. T., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: A novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  17. Sørensen, I., et al. The charophycean green algae provide insights into the early origins of plant cell walls. The Plant Journal. 68 (2), 201-211 (2011).
  18. Liu, D., Tang, W., Yin, J. -Y., Nie, S. -P., Xie, M. -Y. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development. Food Hydrocolloids. 116, 106641 (2021).
  19. Pattathil, S., et al. A comprehensive toolkit of plant cell wall glycan-directed monoclonal antibodies. Plant Physiology. 153 (2), 514-525 (2010).
  20. Verhertbruggen, Y., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. The Plant Journal. 59 (3), 413-425 (2009).
  21. Rydahl, M. G., et al. Development of novel monoclonal antibodies against starch and ulvan - implications for antibody production against polysaccharides with limited immunogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 9326 (2017).
  22. McCartney, L., Marcus, S. E., Knox, J. P. Monoclonal antibodies to plant cell wall xylans and arabinoxylans. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (4), 543-546 (2005).
  23. Marcus, S. E., et al. Pectic homogalacturonan masks abundant sets of xyloglucan epitopes in plant cell walls. BMC Plant Biology. 8, 60 (2008).
  24. Pedersen, H. L., et al. Versatile high resolution oligosaccharide microarrays for plant glycobiology and cell wall research. The Journal of Biological Chemistry. 287 (47), 39429-39438 (2012).
  25. Marcus, S. E., et al. Restricted access of proteins to mannan polysaccharides in intact plant cell walls. The Plant Journal. 64 (2), 191-203 (2010).
  26. Smallwood, M., Martin, H., Knox, J. P. An epitope of rice threonine-and hydroxyproline-rich glycoprotein is common to cell wall and hydrophobic plasma-membrane glycoproteins. Planta. 196 (3), 510-522 (1995).
  27. Smallwood, M., Yates, E. A., Willats, W. G. T., Martin, H., Knox, J. P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabinogalactan-proteins in rice and carrot. Planta. 198 (3), 452-459 (1996).
  28. Wisniewski, J. P., Rathbun, E. A., Knox, J. P., Brewin, N. J. Involvement of diamine oxidase and peroxidase in insolubilization of the extracellular matrix: implications for pea nodule initiation by Rhizobium leguminosarum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13 (4), 413-420 (2000).
  29. Jones, L., Seymour, G. B., Knox, J. P. Localization of pectic galactan in tomato cell walls using a monoclonal antibody specific to (1[->]4)-β-D-galactan. Plant Physiology. 113 (4), 1405-1412 (1997).
  30. Willats, W. G., Marcus, S. E., Knox, J. P. Generation of a monoclonal antibody specific to (1→5)-α-L-arabinan. Carbohydrate Research. 308 (15), 149-152 (1998).
  31. Cornuault, V., et al. LM6-M: a high avidity rat monoclonal antibody to pectic α-1, 5-L-arabinan. BioRxiv. , 161604 (2017).
  32. Sutherland, P., Hallett, I., Jones, M. Probing cell wall structure and development by the use of antibodies: a personal perspective. New Zealand Journal of Forestry Science. 39, 197-205 (2009).
  33. Mikkelsen, M. D., et al. Ancient origin of fucosylated xyloglucan in charophycean green algae. Communications Biology. 4 (1), 754 (2021).
  34. Fangel, J. U., Jones, C. Y., Ulvskov, P., Harholt, J., Willats, W. G. T. Analytical implications of different methods for preparing plant cell wall material. Carbohydrate Polymers. 261, 117866 (2021).
  35. Moore, J. P., et al. Analysis of plant cell walls using high-throughput profiling techniques with multivariate methods. The Plant Cell Wall: Methods and Protocols. , Springer. New York. 327-337 (2020).
  36. Gao, Y., Fangel, J. U., Willats, W. G. T., Moore, J. P. Tracking polysaccharides during white winemaking using glycan microarrays reveals glycoprotein-rich sediments. Food Research International. 123, 662-673 (2019).
  37. Solden, L. M., et al. Interspecies cross-feeding orchestrates carbon degradation in the rumen ecosystem. Nature Microbiology. 3 (11), 1274-1284 (2018).
  38. Fangel, J. U., et al. Tracking polysaccharides through the brewing process. Carbohydrate Polymers. 196, 465-473 (2018).
  39. Mravec, J., et al. Pea border cell maturation and release involve complex cell wall structural dynamics. Plant Physiology. 174 (2), 1051-1066 (2017).
  40. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. New York. NY. (2009).
  41. Gu, Z. Complex heatmap visualization. iMeta. 1 (3), 43 (2022).
  42. Nasrollahzadeh, M., Nezafat, Z., Shafiei, N., Soleimani, F. Polysaccharides in Food Industry. , Elsevier. Iran. (2021).
  43. Shao, P., et al. Recent advances in improving stability of food emulsion by plant polysaccharides. Food Research International. 137, 109376 (2020).
  44. Sanz, M. L., Martínez-Castro, I. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates. Journal of Chromatography. A. 1153 (1-2), 74-89 (2007).
  45. Bethke, G., Glazebrook, J. Cyclohexane diamine tetraacetic acid (CDTA) extraction of plant cell wall pectin. Bio-Protocol. 4 (24), e1357 (2014).
  46. Lu, Y., He, Q., Fan, G., Cheng, Q., Song, G. Extraction and modification of hemicellulose from lignocellulosic biomass: A review. Green Processing and Synthesis. 10 (1), 779-804 (2021).
  47. Jayasekara, S., Ratnayake, R. Microbial cellulases: an overview and applications. Cellulose. 22, 92 (2019).
  48. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., Ordaz-Ortiz, J. J., Knox, J. P. An extended set of monoclonal antibodies to pectic homogalacturonan. Carbohydrate Research. 344 (14), 1858-1862 (2009).
  49. Villares, A., Mateo-Vivaracho, L., Guillamón, E. Structural features and healthy properties of polysaccharides occurring in mushrooms. Agriculture. 2 (4), 452-471 (2012).
  50. Kračun, S. K., et al. Carbohydrate microarray technology applied to high-throughput mapping of plant cell wall glycans using comprehensive microarray polymer profiling (CoMPP). Methods in Molecular Biology. 1503, 147-165 (2017).
  51. Rajasundaram, D., et al. Understanding the relationship between cotton fiber properties and non-cellulosic cell wall polysaccharides. PLoS One. 9 (11), e112168 (2014).
  52. Michalak, L., et al. Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut. Nature Communications. 11 (1), 5773 (2020).
  53. Salmeán, A. A., Hervé, C., Jørgensen, B., Willats, W. G., Mravec, J. Microarray glycan profiling reveals algal fucoidan epitopes in diverse marine metazoans. Frontiers in Marine Science. 4, 293 (2017).
  54. Knox, J. P. Revealing the structural and functional diversity of plant cell walls. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 308-313 (2008).
  55. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17-23 (2007).
  56. Stephen, P., Tseng, K. -L., Liu, Y. -N., Lyu, P. -C. Circular permutation of the starch-binding domain: inversion of ligand selectivity with increased affinity. Chemical Communications. 48 (20), 2612-2614 (2012).
  57. Gunnarsson, L. C., Dexlin, L., Karlsson, E. N., Holst, O., Ohlin, M. Evolution of a carbohydrate binding module into a protein-specific binder. Biomolecular Engineering. 23 (2-3), 111-117 (2006).
  58. Moller, I., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchical clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25 (1), 37-48 (2008).

Tags

Microarray polymer profilering (MAPP) high-throughput glycan analyse glycaner glycokonjugater biologiske prøver plantevæv algevæv fødevarematerialer humane prøver dyreprøver mikrobielle prøver Microarray teknologi screening platform glycan-rettede molekylære sonder analysander kemisk fraktionering enzymatisk fraktionering nitrocellulosemembraner glycansammensætning glycan-genkendende molekylære sonder konventionelle glycananalyseteknikker monosaccharidanalyse Koblingsanalyse massespektrometri
Microarray Polymer Profiling (MAPP) til analyse af glycan med høj kapacitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bakshani, C. R., Sangta, J.,… More

Bakshani, C. R., Sangta, J., Sommano, S., Willats, W. G. T. Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis. J. Vis. Exp. (199), e65443, doi:10.3791/65443 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter