Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65443
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University

Summary

Mikroarray polimer profilleme (MAPP), biyolojik numunelerdeki glikanların bileşimsel analizi için yüksek verimli bir tekniktir.

Abstract

Mikrodizi polimer profilleme (MAPP), bitki ve alg dokuları, gıda malzemeleri ve insan, hayvan ve mikrobiyal numuneler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik numunelerdeki glikanların ve glikokonjugatların bileşimini ve nispi bolluğunu sistematik olarak belirlemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşımdır. Mikroarray teknolojisi, minyatürleştirilmiş, yüksek verimli bir tarama platformu sağlayarak, glikanlar ve yüksek oranda spesifik glikana yönelik moleküler problar arasındaki binlerce etkileşimin, yalnızca az miktarda analit kullanılarak eşzamanlı olarak karakterize edilmesine izin vererek bu yöntemin etkinliğini destekler. Bileşen glikanlar, numuneden sırayla ekstrakte edilmeden ve doğrudan nitroselüloz membranlar üzerine hareketsiz hale getirilmeden önce kimyasal ve enzimatik olarak fraksiyone edilir. Glikan bileşimi, spesifik glikan tanıyan moleküler probların gasp edilmiş ve basılmış moleküllere bağlanmasıyla belirlenir. MAPP, monosakkarit ve bağlantı analizi ve kütle spektrometrisi gibi geleneksel glikan analiz tekniklerini tamamlayıcı niteliktedir. Bununla birlikte, glikan tanıyan moleküler problar, biyolojik etkileşimlerin ve fonksiyonel rollerin aydınlatılmasına yardımcı olabilecek glikanların yapısal konfigürasyonları hakkında fikir verir.

Introduction

Glikanlar yaşamın her alanında her yerde bulunur ve diğer makromoleküllere kıyasla yapı ve işlev açısından benzersiz bir çeşitlilik sergiler1. Bununla birlikte, karmaşıklıkları, biyosentez ve glikozidik bağlardaki değişkenlikleri ve glikan yapılarını incelemek için uygun yöntemlerin azlığı nedeniyle, yapılardaki ve işlevlerdeki bu çeşitliliğe ilişkin anlayışımız nispeten sınırlıdır2.

Birçok glikan analiz tekniği yıkıcıdır ve glikanların, ilgili üç boyutlu ve biyolojik bağlamları gizleyebilen kurucu monosakkaritlerine parçalanmasını gerektirir3. Tersine, topluca glikan tanıyan moleküler problar (GRMP'ler) olarak bilinen monoklonal antikorlar (mAb'ler), karbonhidrat bağlama modülleri (CBM'ler), lektinler, viral aglütininler ve mikrobiyal adezinler4, spesifik epitopları tanır ve bunlara bağlanır ve karmaşık çoklu glikan matrisleri içindeki glikanları tespit etmek ve ayırt etmek için araçlar olarak kullanılabilir 5,6.

Burada, geniş bir biyolojik numune yelpazesine uygulanabilen glikan analizi için hızlı, çok yönlü ve tahribatsız bir yöntem olan mikrodizi polimer profilleme (MAPP) sunuyoruz. Yöntem, çeşitli biyolojik ve endüstriyel/ticari sistemlerden glikanları analiz etmek için sağlam ve yüksek verimli bir teknoloji sağlamayı amaçlamaktadır. MAPP, binlerce moleküler etkileşimin paralel olarak profillenmesine izin vermek için glikanla yönlendirilmiş moleküler probların tanıma özgüllüğünü tekrarlanabilir, yüksek performanslı mikrodizi tarama teknolojisi ile birleştirir. Bu yaklaşımın çıktısı, ilgilenilen bir numune veya doku içindeki glikanların bileşimi ve nispi bolluğu hakkında tanısal içgörüdür.

MAPP, bağımsız, bağımsız bir yöntem olarak veya immünofloresan mikroskobu 7,8,9 ve monosakkarit veya bağlantı analizi10,11 gibi diğer biyokimyasal tekniklerle birlikte kullanılabilir. Bu teknik ayrıca, saf ve yapısal olarak iyi tanımlanmış oligosakkarit standartları12 ile basılmış dizileri kullanarak, yeni GRMP'lerin epitop özgüllüklerini haritalamak için de kullanılabilir. MAPP'nin enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi diğer yöntemlere göre önemli bir avantajı, küçük numune hacimleri13,14 ile uyumluluğudur. Ayrıca, MAPP önemli ölçüde daha yüksek verimli analiz15 sunar ve basılı numuneler nitroselüloz16 üzerine hareketsiz hale getirildiğinde kuru ve stabil olduğundan etkili bir numune koruma şekli sağlar.

GRMP'lerin bağlanması genellikle, belirli bir polisakkarit sınıfına (ksilan, mannan, ksiloglukan, vb.) özgü bir bağlanma bölgesi (epitop) oluşturan bir dizi bitişik şeker kalıntısının varlığına bağlıdır. 17. Buna karşılık, çoğu biyokimyasal teknik, örneğin monosakkarit bileşimi veya metilasyon analizi kullanılarak ölçülen bireysel şeker kalıntıları (ksiloz, mannoz, glikoz), çoklu polisakkarit sınıflarının bileşenleri olabilir ve bu nedenle atanması zorolabilir 18.

MAPP, bir teknoloji boşluğuna, yani az miktarda malzeme kullanarak çeşitli kaynaklardan birden fazla glikanı hızlı bir şekilde analiz etme yeteneğine yanıt olarak geliştirilmiştir. MAPP, son otuz yılda geliştirilen ve karakterize edilen GRMP'lerin kapsamlı repertuarından yararlanır: 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. MAPP'nin geliştirilmesi, tekniğin sürekli olarak iyileştirilmesi ve optimize edilmesiyle yinelemeli bir süreç olmuştur. Şu anda MAPP'nin glikanların merkezi rol oynadığı çeşitli doğal ve endüstriyel sistemlere uygulanmasını açıklayan önemli bir literatür var 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Burada, MAPP için mevcut son teknolojiyi açıklıyoruz.

Protocol

MAPP yönteminin ana deneysel aşamaları Şekil 1'de özetlenmiştir.

1. Numunelerin hazırlanması

NOT: Burada yöntem, açıklama amacıyla bitki dokularına uygulanır. Seçilen bitkiler Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon ve birkaç Tayland mango çeşidi (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok ve Nga). Bitkiler ticari önemleri nedeniyle seçildi. İnsan tüketimi için işlenmesi, şu anda yeterince kullanılmayan tarımsal-endüstriyel atıklar üretir ve bu da saf glikanlar da dahil olmak üzere katma değerli ürünler kaynağı sağlayabilir. Bu nedenle, biyoprospektif amaçlar için atık bitki biyokütlesinin glikan bileşimini karakterize etmek için MAPP uygulandı.

  1. Bitki materyalini farklı dokulara ayırın (örneğin kök, gövde ve yapraklar).
  2. Bitki dokularını 40 °C'de sıcak hava fırınında 12-24 saat kurutun (numuneye göre süreyi azaltın/artırın). Alternatif olarak, numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve ardından ~4 gün boyunca liyofilize edin.
  3. Numuneleri, bir havan tokmağı ve havan tokmağı veya her tüpte bir bilyalı rulman bulunan mekanik bir doku parçalayıcı (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak ince bir toz halinde homojenize edin.
    NOT: Taze bitki dokusu için homojenizasyondan önce kurutma veya liyofilize edilmesi önerilir. Genel olarak, havan tokmağı ve havan ile homojenizasyon çoğu kuru numune için yeterlidir. Tahıllar, baklagiller ve makarna gibi işlenmiş gıda maddeleri gibi özellikle esnek numuneler için sıvı nitrojende ani dondurma, numune homojenizasyonunun hızını ve verimliliğini artırabilir. Mekanik homojenizasyonun neredeyse tüm numune türleriyle uyumlu olduğunu, önemli ölçüde daha hızlı ve daha az emek yoğun olduğunu ve aynı ekipmanın (yani havan ve havan) tekrar tekrar kullanılmasından kaynaklanan numune çapraz kontaminasyonu riskini etkili bir şekilde en aza indirdiğini gördük.

2. Alkolde çözünmeyen kalıntının (AIR) hazırlanması

  1. 50-100 mg havada kurutulmuş ve homojenize edilmiş numune materyaline 1,5 mL %70 (h/h) etanol ekleyin.
  2. Karıştırmak için iyice vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve peleti saklayın.
  3. Kalan pelete 1.5 mL metanol ve kloroform (1:1 [h/h]) ekleyin. Girdap, santrifüj ve süpernatanı adım 2.2'ye göre atın.
  4. Kalan pelete 1.5 mL% 100 aseton ekleyin. Girdap, santrifüj ve süpernatanı adım 2.2'ye göre atın.
  5. Elde edilen peleti, kalan asetonun buharlaşmasını sağlamak için gece boyunca bir çeker ocakta veya kuruyana kadar bir vakumlu santrifüjde yerleştirin.
    NOT: AIR malzemesi gerekli olana kadar ortam sıcaklığında saklanabilir.

3. Glikan ekstraksiyonu

NOT: Mümkünse, yeniden süspansiyona yardımcı olmak için tüm ekstraksiyon adımlarını her tüpte bir bilyalı rulman bulunan bir doku parçalayıcıda gerçekleştirin. Bir doku parçalayıcısı mevcut değilse, bunun yerine sürekli karıştırma veya çalkalama ile ekstraksiyonlar yapılabilir. Bu mümkün değilse ekstraksiyon süresini uzatmak gerekebilir.

  1. 10 mg AIR malzemesine 30 μL/mg 50 mM sikloheksandiamintetraasetik asit (CDTA; bkz . Malzeme Tablosu), pH 7.5 ekleyin.
  2. 27 Hz'de 2 dakika, ardından 10 Hz'de 2 saat çalkalayın.
  3. 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı tutun, steril bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve 4 °C'de döner bir çalkalayıcıda saklayın.
  4. Artık pelete 30 μL/mg 4 M NaOH +% 0.1 (a/h) NaBH4 ekleyin.
    DİKKAT: NaBH4 yutulduğunda toksiktir. Kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Çeker ocak altında tutun. Toz oluşumundan kaçının. Toz solumaktan kaçının. Ürünün su ile temas etmesine izin vermeyin.
  5. 3.2'den 3.3'e kadar olan adımları tekrarlayın. Kalan NaOH'yi çıkarmak için kalan peleti iki veya üç kez dH2O ile yıkayın.
  6. Peletlere 30 μL/mg selülaz (tercihen GH5 endo-1,4-β-glukanaz, uygun enzim tamponunda, üretici tarafından önerildiği gibi; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve enzim optimum sıcaklığında 16 saat inkübe edin.
  7. Numuneleri 10.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tutun, temiz mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve döner bir çalkalayıcıda 4 °C'de saklayın. Numuneler çıkarıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede basılmalıdır.
  8. Saklanan tüm ekstraktları tekrar 10.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Numunelerde partikül ve kalıntı bulunmamalıdır. Gerekirse mikrodizi baskıdan önce 0,2 μm döndürme filtresinden geçirin. Özellikle viskoz numuneler, mikroarrayer kılcal damarları ve yazıcı kafası kolayca tıkanabileceğinden, mikroarray analizi ile uyumsuzdur. Genel bir kural olarak, kullanıcılar yazdırmak için tasarlanan tüm numuneleri standart bir düşük hacimli pipetle pipetleyebilmelidir.

4. Standartların hazırlanması

  1. SterildH 2O'da tanımlanmış glikan standartlarının (Tablo 1) 1 mg / mL çözeltilerini hazırlayın. Standart olarak pachyman kullanılıyorsa, bunun yerine 4 M NaOH içinde çözün ve çözündürmeyi takiben buzlu asetik asit ile nötralize edin.
  2. Hazırlanan standartları, tam çözünmeye izin vermek için gece boyunca 4 °C'de döner bir çalkalayıcı üzerinde saklayın.
  3. Herhangi bir kalıntıyı pelet haline getirmek için tüm standartları 10.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Elde edilen süpernatant, sonraki baskı için kullanılır.

5. Mikrodizi baskı

  1. Gliserol sistemi tamponunda siyah Hint mürekkebi/çizim mürekkebinin 1:20 (h/h) seyreltmesini hazırlayın (GSB; %47 gliserol, %52.9dH2O, %0.06 Triton X-100 ve %0.04 biyosit [suda %0.15-%0.17 bakır nitrat ve %1.4-%2.0 magnezyum nitrat] ve filtre sterilize edin) (Malzeme Tablosuna bakın) ve 15.000 x g'da (oda sıcaklığında) 10 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Yazdırılan mikrodizilerin membran üzerinde görsel olarak algılanabilmesi için, yazdırılan numunelerin etrafında bir üst ve alt kenarlık oluşturmak için mürekkep çözeltisi gereklidir. Bununla birlikte, mürekkep çözeltisinin tortu içermesi muhtemeldir. Baskı için tüm solüsyonlarda partikül bulunmamalıdır, bu nedenle pipetleme sırasında tortuyu bozmaktan kaçının. Artık mümkün olmadığında atın ve taze hazırlayın. Çözelti, partikülleri gidermek için kolayca filtrelenemez.
  2. İlk 384 oyuklu plakanın ilk bölümüne 40 μL mürekkep çözeltisi ve GSB ekleyin (Şekil 2).
  3. Tüm seyreltme 1 (D1) kuyucuklarına 25 μL GSB ekleyin. Tüm seyreltme 2, 3 ve 4 (D2-D4) kuyucuklarına 40 μL GSB ekleyin.
  4. Ekstrakte edilen glikan örneklerini ve tanımlanmış glikan substratlarını sırasıyla D1 kuyucuklarına 25 μL ekstrakte edilmiş glikan örneği ekleyerek GSB ile 1:1 (h/v) seyreltin.
  5. D1 kuyucuğundan 10 μL numune alarak ve D2 kuyucuğuna ekleyerek her numuneyi dört kez seri olarak seyreltin. Karıştırmak için bir pipetle hafifçe aspire edin.
  6. D2 kuyusundan 10 μL numune alıp D3 kuyucuğuna ilave ederek işlemi tekrarlayın.
  7. D4 kuyusu için tekrarlayın. Karıştırdıktan sonra, her bir kuyucuğun 40 μL'lik bir nihai hacmi içermesi için D4 kuyucuğundan 10 μL atın.
  8. Son plakanın son bloğuna 40 μL mürekkep çözeltisi ve GSB ekleyin.
  9. Plakaları yapışkan bir plaka kapağıyla örtün ve 3.000 x g'da (oda sıcaklığı) 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra kabarcık kalmadığından emin olun ve gerekirse tekrarlayın.
  10. Temassız bir piezoelektrik mikrodizi baskı robotu kullanarak, aşağıdaki adımları izleyerek numuneleri nitroselüloz membran üzerine yazdırın (Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: Optimum baskı kalitesi için önerilen işlemler aşağıdadır; Bununla birlikte, gerekli olan spesifik parametreler nihayetinde kullanılan cihaza bağlı olacaktır. Kullanıcıların, cihazları için gereken uygun özelleştirmeleri ve yazdırma ayarlarını görüşmek üzere cihaz üreticisiyle iletişime geçmelerini öneririz.
    1. Yazdırmadan önce, atık tampon haznesini boşaltın ve temiz tampon haznesini gerektiği gibi temiz GSB ile doldurun. Cihazı açın ve entegre bir nem ve sıcaklık kontrol sistemine sahipse >10 dakika stabilize olmasına izin verin. Mikroarrayer'ı açın ve sistemi başlatın.
      NOT: Cihazın iç basıncını belirlemek için bir test yapılması önerilir. Basınç çok düşükse, yüksek basınçlı bir temizleme yapılması gerekebilir. Yine, belirli bir cihazın özel çalışmasını görüşmek için cihaz üreticisiyle iletişime geçin.
    2. Kalıntıları ve olası kirleticileri temizlemek için yazıcı kafasını ve kılcal damarları GSB ile birkaç kez temizleyin. Tek başına bir GSB plakası yükleyerek veya cihazı, yüklü bir plakadan numune aspirasyonunu atlayarak doğrudan temiz tampon haznesinden yazdıracak şekilde ayarlayarak bir test baskısı çalıştırması gerçekleştirin.
      NOT: Test baskısının bir nitroselüloz membran kullanılarak gerçekleştirilmesi gerekli değildir; Temiz mikroskop lamları yeterlidir ve spot boyutunun, şeklinin ve kalitesinin numune baskısından önce görsel olarak değerlendirilebilmesi avantajını sunar.
    3. Ekstrakte edilmiş glikan numunelerini yazdırırken, sistemi her numune arasında temiz GSB ile yıkanacak şekilde programlayın.
      NOT: Tipik olarak, yazdırılan nokta başına numune hacmi 100 pL ila 10 nL'dir ve seçilen numune hacmine bağlı olarak spot boyutu 20 μm ila 100 μm arasında değişir. Bir kaynak 384 oyuklu plakadan 100 mikrodizi yazdırmak, sistem yıkama dahil olmak üzere yaklaşık 40 dakika sürer. Ortaya çıkan mikrodiziler yaklaşık 1cm2 boyutunda olacaktır. Ek plakalar, dizinin uzunluğunu plaka başına yaklaşık 1 cm artıracaktır. Basılı mikrodizi tasarımının bir şeması Şekil 3'te gösterilmektedir. Mikrodiziler yazdırıldıktan sonra hemen kullanıma hazırdır ve birkaç yıl saklanabilir. Baskı sırasında numunelerin potansiyel buharlaşması nedeniyle herhangi bir nedenle baskı işinin tekrarlanması gerekirse, yeni bir numune plakasının yüklenmesi ve orijinal plakanın atılması önerilir.
    4. Haftada bir kez, yazıcı kafasını ve kılcal damarları iyice temizleyin. Bunu, GSB'de 1:20 oranında seyreltilmiş konsantre NaOH içeren 384 oyuklu bir madde yükleyerek yapın ve mikroskop slaytları üzerine 40 dakika ila 1 saat arasında bir baskı işlemi gerçekleştirin. Kullanıcılar, devam etmeden önce bu temizleme solüsyonunun cihazlarıyla uyumlu olduğundan emin olmalıdır.
  11. Yazdırılan mikrodizi için üretilen benzersiz ızgara dosyasını (.gal dosyası) aşağı akış analizi için hazır olarak kaydedin.

6. Mikrodizi problama

  1. Nitroselüloz membrandan tek, özdeş basılı mikrodizileri kesin ve bunları sondalama için uygun boyutta bir kaba yerleştirin (örneğin, 12 veya 24 oyuklu bir mikrotitre plakası) (bkz. Dizi, kabın tabanında düz durmalıdır. Prob başına bir mikrodizi gereklidir ve bir teknik kopyayı temsil eder.
  2. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için, mikrodizileri MP-TBST bloke edici tamponda (1x Tris tamponlu salin, pH 7.5, +% 0.1 [v / v] TWEEN 20 [TBST] ve %5 [a / h] yağsız süt tozu ile desteklenmiş 1 saat inkübe edin. Birimin tüm diziyi suya batırmak için yeterli olduğundan emin olun.
  3. İnkübasyonun ardından, MP-TBST'yi çıkarın ve yeni bir MP-TBST hacmi ile değiştirin.
  4. Dizileri monoklonal antikorlar (mAb'ler) veya His etiketli CBM'ler veya diğer GRMP'ler (örn., lektinler), 1:10-1:1,000 oranında seyreltilmiş (üretici tarafından belirtildiği gibi; Malzeme Tablosuna bakınız) MP-TBST'de 2 saat boyunca dönen/sallanan bir çalkalayıcı üzerinde.
  5. İnkübasyonun ardından, moleküler prob çözeltisini çıkarın ve dizileri temiz TBST ile kaplayarak dizilerin tamamen suya daldırıldığından emin olun. Artık prob çözeltisini çıkarmak için TBST'yi hemen çıkarın ve yeni bir hacimle değiştirin. Dizileri 5 dakika boyunca dönen/sallanan bir çalkalayıcıya yerleştirin. 5 dakika sonra TBST'yi çıkarın, yeni bir hacimle değiştirin ve 5 dakika boyunca dönen/sallanan bir çalkalayıcıya yerleştirin.
    NOT: Bu işlem, TBST'nin ilk eklenmesi ve hemen çıkarılması dahil olmak üzere üç kez tekrarlanmalıdır.
  6. Dizileri, sallanan/dönen bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca MP-TBST'de 1:1.000 oranında seyreltilmiş alkalin-fosfataz konjuge ikincil antikorlarla (fare önleyici, sıçan önleyici, tavşan önleyici, anti-His; Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.
    NOT: Yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorları da uygundur, renk gelişimi için tetrametil benzidin (TMB) / hidrojen peroksit substratı ile birlikte kullanılır.
  7. İnkübasyondan sonra, spesifik olarak bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için adım 6.5'e göre yıkama prosedürünü tekrarlayın.
  8. Antikor bağlanmasının kromojenik tespiti için dizileri nitro-mavi tetrazolyum (NBT) / 5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP) renk geliştirme solüsyonunda ( Malzeme Tablosuna bakınız) örtün. Antijen bağlanma bölgelerinde mor çökelti lekeleri oluşana kadar bırakın (tipik olarak 5-30 dakika, ancak reaksiyon hızlı bir şekilde gerçekleşebileceğinden aşırı doygunluğu önlemek için diziler yakından izlenmelidir).
    DİKKAT: BCIP cilt ile temasında zararlıdır ve solunum yolu tahrişine neden olabilir. KKD kullanın. Toz oluşumundan kaçının. Toz solumaktan kaçının.
  9. Reaksiyonu sonlandırmak için dizileri temiz musluk suyuna batırın ve iyice yıkayın.
  10. Dizileri kuruması için ortam sıcaklığında gece boyunca kurutma kağıdı arasına yerleştirin.
  11. Belirgin kusurları olan dizileri atın ve bu gibi durumlarda yoklama protokolünü tekrarlayın (Şekil 4).

7. Analiz ve niceleme

  1. Geliştirilen dizileri bir masaüstü tarayıcı kullanarak inç başına 2.400 nokta (dpi) çözünürlükte tarayın. Görüntüleri TIFF dosyalarına ve ardından negatiflere dönüştürün.
  2. Mikrodizi analiz yazılımını kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), her bir antijen bağlanma bölgesinde üretilen noktanın renk yoğunluğunu hesaplamak ve yerel arka planı çıkarmak için benzersiz .gal ızgara dosyasını her bir mikrodizi görüntüsünün üzerine yerleştirin.
  3. Izgara verilerini .txt dosyası olarak dışa aktarın. Bunlar daha sonra analiz için manuel olarak bir Excel sayfasına aktarılabilir.
  4. Önce her bir numune seyreltmesinde ve ardından dahil edilen herhangi bir biyolojik kopyada spot yoğunluğunun ortalamasını alarak her numune için ortalama bir spot sinyal yoğunluğu değeri oluşturun.
  5. En yüksek ortalama nokta sinyali yoğunluğuna 100 değeri atayın ve kalan verileri buna göre normalleştirin.
    NOT: Normalleştirilmiş ortalama nokta sinyal yoğunlukları daha sonra Excel33'teki koşullu biçimlendirme işlevi kullanılarak veya R ggplot2 paketi40,41'deki geom_tile işlevi kullanılarak bağıl glikan epitop bolluğunun bir ısı haritası olarak sunulabilir.

Representative Results

MAPP, birkaç kuzey Tayland çeşidinden mango kabukları, Coffea arabica kiraz posası ve kahve çekirdeği işleme atıkları ve Tayland siyah sarımsağı, Allium sativum var. ophioscorodon'dan kök, gövde ve yaprak dokusundan oluşan tarımsal biyokütle atığının glikan bileşimini belirlemek için uygulandı. Gıda endüstrisinde fonksiyonel bileşenler olarak çeşitli bitki kaynaklı polisakkaritler kullanılmaktadır42,43. Bu nedenle, bu deneyin amacı, bu bol ve şu anda az kullanılan tarımsal-endüstriyel atık malzemelerin katma değerli saf polisakkaritler için bir kaynak sağlayıp sağlayamayacağını çıkarmaktı.

AIR malzemesi, glikan analizine yönelik numuneleri hazırlamak için rutin olarak kullanılır44. AIR kullanmanın çeşitli avantajları vardır; çözücülerle muamele, endojen CAZyme'leri, metabolitleri, küçük sakkaritleri, lipitleri ve pigmentleri etkili bir şekilde uzaklaştırır, bu da polisakkaritler ve yapısal proteinlerle zenginleştirilmiş numunelerle sonuçlanır34. Ayrıca, AIR üretmek, ısıya dayanıklı olduğu ve birkaç yıl saklanabildiği için numune ömrünü uzatmanın hızlı ve etkili bir yoludur.

Kurucu glikanların üç karışık fraksiyonu, CDTA, NaOH ve selülaz kullanılarak bitki AIR materyalinden sırayla ekstrakte edildi. CDTA, Ca2+ çapraz bağlı de-esterifiye pektinlerin bitki hücre duvarlarından çıkarılmasına izin veren Ca2+ iyonlarını şelatlar45. Alkali koşullar, hidrojen bağının bozulması ve selüloz mikrofibrilleri ile hemiselüloz arasındaki ester bağlarının sabunlaşması ve lignin ve hemiselüloz arasındaki sabunlaşması nedeniyle mannan, ksilan ve β-glukan gibi ağırlıklı olarak hemiselülozların salınmasına izin verir46. Bacillus spp.'den rekombinant bir endo-1,4-β-glukanaz, yapısal selüloz mikrofibrillerinin amorf bölgelerini parçalamak için kullanıldı ve hücre duvarları içinde selüloza bağlı kalıntı glikanları serbest bıraktı47. Bu yöntem, glikanları etkili bir şekilde bu üç geniş gruba ayırsa da, numunelerin saf olmadığına dikkat edilmelidir; ekstraksiyon yönteminin doğası gereği, numunede mevcutsa, hemiselüloz kaçınılmaz olarak ekstrakte edilecek ve daha sonra CDTA ve selülaz fraksiyonlarında değişen derecelerde tespit edilecektir. Benzer şekilde, numunede mevcutsa, NaOH ekstraksiyonunda bir miktar pektin tespit edilecektir.

Ekstrakte edilmiş glikan fraksiyonlarını kovalent olmayan bağlantı11 yoluyla nitroselüloz üzerine hareketsiz hale getirmek için temassız, piezoelektrik bir mikrodizi baskı robotu kullanıldı ve 300 özdeş mikrodizi oluşturuldu. Tanımlanmış glikan standartları (Tablo 1) de basılı mikrodizilere pozitif kontroller olarak dahil edildi (Şekil 5). Seçilen glikan standartları için elde edilen MAPP bağlanma profili, daha önce bildirilen epitop özgüllüklerine karşılık gelir. Örneğin, LM21 çoklu mannan polisakkaritlere (galaktomannan ve glukomannan) güçlü bağlanma sergilerken, LM22 galaktomannan25'e sadece zayıf bağlanma sergiledi. Benzer şekilde, LM19 tercihen esterden arındırılmış homogalakturonan48'e ve LM15 demirhindi tohumu ksiloglucan23'e bağlıdır.

Selülozik olmayan bitki hücre duvarı polisakkaritlerinin teşhisi olan 16 epitopun nispi bolluğu, glikana yönelik monoklonal antikorların (Tablo 2) basılı ekstraktlara bağlanmasıyla tespit edildi (Şekil 6). Ekstrakte edilen glikanların çoğunluğu alkalin NaOH fraksiyonu içinde tespit edildi. Test edilen tüm mango çeşitlerinin kabuklarında ksilan / arabinoksilanı temsil eden mAbs LM10 ve LM11 için güçlü bağlanma sinyalleri kaydedildi. Sarımsak örnekleri içinde, LM10 ve LM11 tercihen kök dokusu ekstraktına (Sarımsak R) bağlandı ve yaprak dokusu ekstraktına (Sarımsak L) sadece zayıf bağlanma sergiledi. Kısmen metil-esterlenmiş veya esterleştirilmemiş homogalakturonanı temsil eden LM19, bazı mango çeşidi ekstraktlarına (Aokrong ve Talabnak) güçlü bir şekilde bağlanmış, ancak diğer çeşitlerde (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok ve Nga) sadece zayıf bağlanmıştır veya bağlanması tespit edilememiştir. Ek olarak, LM19 sadece kahve hamuru fraksiyonlarına bağlandı ve daha önce yarı saflaştırılmış kahve pektininden oluştuğu düşünülen kahve çekirdeği işleme atık malzemesine bağlanmadı (yayınlanmamış veriler).

Figure 1
Şekil 1: MAPP yöntemindeki başlıca deneysel adımlar. (A) Numuneler ince tozlar oluşturmak üzere homojenize edilir. (B) Homojenize edilmiş numuneler, AIR'lerini izole etmek için işlenir. (C) Kurucu glikanlar, özel bir ekstraksiyon rejimi kullanılarak sırayla ekstrakte edilir. (D) Ekstrakte edilen glikan fraksiyonları, mürekkep ve GSB, nitroselüloz üzerine baskı için plaka düzenine göre 384 oyuklu plakalara aktarılır. (E) Basılı mikrodiziler, seçilen GRMP'lerle incelenir. (F) Basılı glikan fraksiyonlarına GRMP bağlanması, veriler bir ısı haritası olarak sunulmadan önce ölçülür ve analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Ekstrakte edilen glikan numunesi/standardı başına dört seyreltme ile numune, mürekkep ve GSB yüklemesi için 384 oyuklu bir plaka düzeni örneği. Farklı renkler, farklı ekstraksiyon reaktiflerinden kaynaklanan numuneleri belirtirken, farklı tonlar seri seyreltmeleri temsil eder. Koddaki ilk sayı numune numarasını temsil ederken, bitiş numarası seyreltme numarasını temsil eder (D1 seyreltme bir, D2 seyreltme iki vb. anlamına gelir). Örneğin, iyi etiketlenmiş bir '12D3', glikan numunesi 12, seyreltme üç'ü temsil eder. Kuyu plakaları, altı sütun ve sekiz sıradan oluşan sekiz özdeş bölüme ayrılmalıdır. İlk kalıbın ilk bölümü yalnızca mürekkep ve tampon içermeli ve örnek kalıp düzenine benzemelidir. Ekstrakte edilen glikan numuneleri daha sonra plaka düzenine göre sonraki plaka bölümlerine yüklenebilir. Aynı plaka bölümüne farklı ekstraksiyon reaktifleri yüklenmemelidir. Bir bölümün tamamını doldurmak için yeterli numune yoksa, o bölümdeki kalan tüm kuyucukları tamponla doldurun; Boş kuyu bırakmayın. Birden fazla kalıp gerekiyorsa, tüm numuneler yüklendikten sonraki bölüm üç alternatif mürekkep sütunu içermelidir ve GSB - bu, yazdırılan numune sayısına bağlı olarak sekizinci bölüm olmayabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Basılı mikrodizi tasarımının şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Temsili mikrodiziler. (A) Bağlayıcı değil. (B) Bağlama sinyali, yüksek arka plan sinyali tarafından engellenir. (C) NBT / BIP ile aşırı doygunluk nedeniyle genelleştirilmiş mavi / mor boyama. (D) Yüksek substrat konsantrasyonu nedeniyle kusurlu problama. (E) Temiz olmayan yazıcı kafası nedeniyle hatalı baskı. (F) Birkaç numuneye güçlü bağlanma. (G) Birçok numuneye güçlü bağlanma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tanımlanmış glikan standartlarına monoklonal antikor bağlanması, baskı ve sondalama işlemini doğrulamak için dahil edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Tarımsal biyokütle atıklarından ekstrakte edilen glikanların MAPP'si. Örnekler arasında kahve posası atıkları (kahve posası ve kahve pektini), çeşitli Tayland çeşitlerinden mango kabukları (AO, Aokrong; KO, Kam; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; MH, Mahachanok; CDTA, NaOH ve selülaz (Bacillus spp. selülaz 5A) kullanılarak NG, Nga) ve siyah sarımsak yaprakları (Sarımsak L), gövde (Sarımsak S), ampul (Sarımsak BG) ve kökler (Sarımsak R). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: MAPP analizinde pozitif kontroller olarak kullanılan tanımlanmış ticari polisakkarit standartları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Ekstrakte edilmiş bitki glikan mikrodizilerinin sorgulanması için seçilen glikana yönelik monoklonal antikorlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada açıklanan MAPP tekniği artık glikan analizi için iyi kurulmuş bir yöntemdir. Temel ilkeler ilk olarak 2007'detanımlanmıştır 11, ancak teknik, mikroarray teknolojisindeki en son yeniliklerden, moleküler prob geliştirmeden ve glikan biyokimyası anlayışımızdaki ilerlemelerden yararlanmak için sürekli bir gelişim sürecinden geçmiştir. Genel olarak, glikanlar, özellikle polisakkaritler, yapısal karmaşıklıkları ve heterojenlikleri45 ve ayrıca kolayca dizilenememeleri veya sentezlenememeleri nedeniyle proteinlerden ve nükleotidlerden daha zordur1. Çoğu durumda, tek bir teknik glikan karmaşıklığını kesin olarak deşifre edemez; bu nedenle, MAPP genellikle diğer yöntemlerle birlikte kullanılır. AIR, diğer glikan analiz yöntemlerininçoğuyla 34 uyumlu olduğundan, veri kümelerinin daha sonra karşılaştırılmasını kolaylaştırdığından, AIR hazırlığının genellikle MAPP için bir başlangıç noktası olarak seçilmesinin nedenlerinden biri de budur.

AIR hazırlığından önce numunenin homojenleştirilmesi nedeniyle, bazı uzamsal bilgiler her zaman kaybolur. Bununla birlikte, polisakkaritler numunelerden sırayla salındığından, elde edilen fraksiyonlarda epitopların varlığı, o numunenin moleküler mimarisi ve bileşimi hakkında bilgi sağlar17. Bu nedenle, uygun bir ekstraksiyon rejiminin seçilmesi, yöntemin başarısı için kritik öneme sahiptir. Ekstraksiyon yönteminin uygunluğunu birden fazla parametre belirler: hücresel yapı, zaman, sıcaklık, pH, basınç, çözücünün iyonik kuvveti ve katı partikül numunesinin inceliği49. Kurucu glikanları başarılı bir şekilde ekstrakte etme ve numunenin temsili bir bileşim resmini oluşturma olasılığını en üst düzeye çıkarmak için giderek daha agresif çözücülerin kullanılması önerilir. Çoğu numune için, CDTA, NaOH ve selülaz, bitki kaynaklı depolama ve hücre duvarı polisakkaritlerini uzaklaştırmak için yeterlidir 33,50,51,52. Bazı doku örnekleri için,CaCl2, HCl ve Na2CO3'ü de içeren bir hibrit ekstraksiyonrejiminin başarılı olduğu gösterilmiştir53, deniz mikroalg örnekleri ise etilendiamintetraasetik asit (EDTA) eklenmesini gerektirebilir10.

Mikrodiziler, pozitif kontroller olarak kullanılacak bir dizi saf, tanımlanmış glikan standardı içermelidir5. Dahil edilen standartlar, numunenin niteliğine göre değiştirilmelidir. Yazdırıldıktan sonra uygun GRMP'lerin seçilmesi gerekir. Hibridoma mAb'lerinin polisakkarit yapılara dönüşmesi zordur54; Glikan bağlayıcı antikorların yükseltilmesi zordur ve düşük afiniteye sahip olabilir55. Neyse ki, CBM'ler için gen dizisi bilgisi, rekombinant ekspresyon4 ve bağlanma özgüllüklerinin mühendisliği için göreceli kolaylıkla elde edilebilir56,57. Etkileyici bir GRMP kataloğu geliştirilmiş olsa da, çoğu artık ticari kaynaklardan elde edilebilirken, doğada var olan glikan yapılarının çeşitliliğine göre, sadece küçük bir kısmı üretilmiş ve başarılı bir şekilde karakterize edilmiştir58. Bu, belirli yapıları algılama ve ayırt etme yeteneğini sınırlayabilir. Bağlanma özgüllüğünün iyi karakterize edildiği, mevcut olması beklenen her bir ana glikan yapısını temsil eden bir veya iki prob kullanılarak bir ilk sondalama deneyi yapılması tavsiye edilir. Sonraki sondalama deneylerinde, prob listesi daha geniş bir glikan yelpazesini kapsayacak ve ince yapılara daha derine inecek şekilde genişletilebilir.

Sıradan olmasına rağmen, her inkübasyon adımından sonra mikrodizilerin iyice yıkanmasını sağlamak, problama prosedürünün başarısı için esastır. Spesifik olarak bağlı olmayan probların etkisiz bir şekilde çıkarılması, renk gelişimini takiben yüksek bir arka plan sinyaline neden olarak sonucu gizleyebilir. Bu durumda, yeni bir mikrodizi ile başlayarak sondalama prosedürünü tekrarlamak gerekir. Ayrıca, dizilere az miktarda ve sadece kenarları forseps ile tutularak dokunulmalıdır; Nitroselüloz membran kırılgandır ve kolayca zarar görebilir. Renk geliştirme çözümü, çatlaklarda ve kırışıklıklarda toplanarak aşırı doygunluğa neden olur ve bu da dizi analizini engeller.

MAPP hızlı, uyarlanabilir ve kullanışlıdır. Bu yöntem, herhangi bir biyolojik veya endüstriyel sistemden türetilen hayvansal, mikrobiyal veya bitki glikanları ile uyumludur, ekstrakte edilebildikleri ve nitroselüloz üzerinde hareketsiz hale getirilebildikleri ve uygun moleküler problara sahip oldukları sürece. Üretilen veriler, diğer glikan analiz yöntemleriyle kolayca elde edilemeyen ayrıntılı, yarı kantitatif, bileşimsel içgörü sağlar.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgments

Yazarlar, mikrodizi robotikle ilgili uzman tavsiyeleri için ArrayJet'e teşekkür eder. SS ve JS, Chiang Mai Üniversitesi, Temel Fon 2022'nin (FF65/004) desteğini kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) Megazyme P-LICHN
1,4-β-D-Mannan Megazyme P-MANCB
384-well microtiter plate Greiner Bio-One M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) Melford B74100-1.0
Acetone Sigma 270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag Jackson ImmunoResearch 300-055-240
Arabinoxylan (wheat) Megazyme P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software Media Cybernetics Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) NZYTech CZ0564
BAM antibodies SeaProbes Various
Black drawing ink (indian ink) Winsor & Newton GWD030
Carbohydrate binding modules NZYTech Various
CCRC antibodies CarboSource Various
CDTA Sigma 319945
Chloroform Sigma PHR1552
Ethanol Sigma 1.11727
Galactan (potato) Megazyme P-GALPOT
Galactomannan (carob) Megazyme P-GALML
Glycerol solution Sigma 49781-5L
Gum tragacanth (legumes) Sigma-Aldrich G1128
INCh antibodies INRA Various
LM and JIM antibodies PlantProbes Various
Marathon Argus Microarray Printer ArrayJet
Methanol Sigma  34860
Monoclonal antibodies Biosupplies Australia Various
NaBH4 Sigma 452882
NaOH Sigma S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT) Melford N66000-1.0
Nitrocellulose membrane Thermo Fisher Scientific 88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%) Danisco NA
ProClin 200 Sigma 48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) Megazyme P-RHAGN
Rotating mixer Fisher Scientific 88-861-050
Rotating/rocking Shaker Cole-Parmer
Skimmed milk powder Marvel
Spin filter Costar Spin-X 8160
Stainless steel beads Qiagen 69989
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris Sigma 93362
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Xylan (beechwood) Megazyme P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind) Megazyme P-XYGLN
β-Glucan (oat) Megazyme P-BGOM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amicucci, M. J., et al. A nonenzymatic method for cleaving polysaccharides to yield oligosaccharides for structural analysis. Nature Communications. 11 (1), 3963 (2020).
  2. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Evolution of glycan diversity. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  3. Willats, W. G. T., McCartney, L., Knox, J. P. Pectin cell biology: complexity in context. Advances in Pectin and Pectinase Research. , Springer. Netherlands. 147-157 (2003).
  4. Cummings, R. D., et al. Glycan-recognizing probes as tools. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  5. Bakshani, C. R., et al. Analysis of glycans in a Burnt-on/Baked-on (BoBo) model food soil using Microarray Polymer Profiling (MAPP) and immunofluorescence microscopy. Food Chemistry. 410, 135379 (2023).
  6. Salmeán, A. A., Willats, W. G. T., Ribeiro, S., Andersen, T. J., Ellegaard, M. Over 100-year preservation and temporal fluctuations of cell wall polysaccharides in marine sediments. Frontiers in Plant Science. 13, 785902 (2022).
  7. Cid, M., et al. Recognition of the helical structure of β-1,4-galactan by a new family of carbohydrate-binding modules. Journal of Biological Chemistry. 285 (46), 35999-36009 (2010).
  8. Runavot, J. -L., et al. Non-cellulosic polysaccharides from cotton fibre are differently impacted by textile processing. PLoS One. 9 (12), e115150 (2014).
  9. Ahl, L. I., et al. Analyses of aloe polysaccharides using carbohydrate microarray profiling. Journal of AOAC International. 101 (6), 1720-1728 (2018).
  10. Vidal-Melgosa, S., et al. Diatom fucan polysaccharide precipitates carbon during algal blooms. Nature Communications. 12 (1), 1150 (2021).
  11. Moller, I., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant Journal. 50 (6), 1118-1128 (2007).
  12. Ruprecht, C., et al. A synthetic glycan microarray enables epitope mapping of plant cell wall glycan-directed antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  13. Cummings, R. D., et al. Principles of glycan recognition. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  14. Gao, C., et al. Glycan microarrays as chemical tools for identifying glycan recognition by immune proteins. Frontiers in Chemistry. 7, 833 (2019).
  15. Vidal-Melgosa, S., et al. A new versatile microarray-based method for high throughput screening of carbohydrate-active enzymes. Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9020-9036 (2015).
  16. Willats, W. G. T., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: A novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  17. Sørensen, I., et al. The charophycean green algae provide insights into the early origins of plant cell walls. The Plant Journal. 68 (2), 201-211 (2011).
  18. Liu, D., Tang, W., Yin, J. -Y., Nie, S. -P., Xie, M. -Y. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development. Food Hydrocolloids. 116, 106641 (2021).
  19. Pattathil, S., et al. A comprehensive toolkit of plant cell wall glycan-directed monoclonal antibodies. Plant Physiology. 153 (2), 514-525 (2010).
  20. Verhertbruggen, Y., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. The Plant Journal. 59 (3), 413-425 (2009).
  21. Rydahl, M. G., et al. Development of novel monoclonal antibodies against starch and ulvan - implications for antibody production against polysaccharides with limited immunogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 9326 (2017).
  22. McCartney, L., Marcus, S. E., Knox, J. P. Monoclonal antibodies to plant cell wall xylans and arabinoxylans. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (4), 543-546 (2005).
  23. Marcus, S. E., et al. Pectic homogalacturonan masks abundant sets of xyloglucan epitopes in plant cell walls. BMC Plant Biology. 8, 60 (2008).
  24. Pedersen, H. L., et al. Versatile high resolution oligosaccharide microarrays for plant glycobiology and cell wall research. The Journal of Biological Chemistry. 287 (47), 39429-39438 (2012).
  25. Marcus, S. E., et al. Restricted access of proteins to mannan polysaccharides in intact plant cell walls. The Plant Journal. 64 (2), 191-203 (2010).
  26. Smallwood, M., Martin, H., Knox, J. P. An epitope of rice threonine-and hydroxyproline-rich glycoprotein is common to cell wall and hydrophobic plasma-membrane glycoproteins. Planta. 196 (3), 510-522 (1995).
  27. Smallwood, M., Yates, E. A., Willats, W. G. T., Martin, H., Knox, J. P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabinogalactan-proteins in rice and carrot. Planta. 198 (3), 452-459 (1996).
  28. Wisniewski, J. P., Rathbun, E. A., Knox, J. P., Brewin, N. J. Involvement of diamine oxidase and peroxidase in insolubilization of the extracellular matrix: implications for pea nodule initiation by Rhizobium leguminosarum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13 (4), 413-420 (2000).
  29. Jones, L., Seymour, G. B., Knox, J. P. Localization of pectic galactan in tomato cell walls using a monoclonal antibody specific to (1[->]4)-β-D-galactan. Plant Physiology. 113 (4), 1405-1412 (1997).
  30. Willats, W. G., Marcus, S. E., Knox, J. P. Generation of a monoclonal antibody specific to (1→5)-α-L-arabinan. Carbohydrate Research. 308 (15), 149-152 (1998).
  31. Cornuault, V., et al. LM6-M: a high avidity rat monoclonal antibody to pectic α-1, 5-L-arabinan. BioRxiv. , 161604 (2017).
  32. Sutherland, P., Hallett, I., Jones, M. Probing cell wall structure and development by the use of antibodies: a personal perspective. New Zealand Journal of Forestry Science. 39, 197-205 (2009).
  33. Mikkelsen, M. D., et al. Ancient origin of fucosylated xyloglucan in charophycean green algae. Communications Biology. 4 (1), 754 (2021).
  34. Fangel, J. U., Jones, C. Y., Ulvskov, P., Harholt, J., Willats, W. G. T. Analytical implications of different methods for preparing plant cell wall material. Carbohydrate Polymers. 261, 117866 (2021).
  35. Moore, J. P., et al. Analysis of plant cell walls using high-throughput profiling techniques with multivariate methods. The Plant Cell Wall: Methods and Protocols. , Springer. New York. 327-337 (2020).
  36. Gao, Y., Fangel, J. U., Willats, W. G. T., Moore, J. P. Tracking polysaccharides during white winemaking using glycan microarrays reveals glycoprotein-rich sediments. Food Research International. 123, 662-673 (2019).
  37. Solden, L. M., et al. Interspecies cross-feeding orchestrates carbon degradation in the rumen ecosystem. Nature Microbiology. 3 (11), 1274-1284 (2018).
  38. Fangel, J. U., et al. Tracking polysaccharides through the brewing process. Carbohydrate Polymers. 196, 465-473 (2018).
  39. Mravec, J., et al. Pea border cell maturation and release involve complex cell wall structural dynamics. Plant Physiology. 174 (2), 1051-1066 (2017).
  40. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. New York. NY. (2009).
  41. Gu, Z. Complex heatmap visualization. iMeta. 1 (3), 43 (2022).
  42. Nasrollahzadeh, M., Nezafat, Z., Shafiei, N., Soleimani, F. Polysaccharides in Food Industry. , Elsevier. Iran. (2021).
  43. Shao, P., et al. Recent advances in improving stability of food emulsion by plant polysaccharides. Food Research International. 137, 109376 (2020).
  44. Sanz, M. L., Martínez-Castro, I. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates. Journal of Chromatography. A. 1153 (1-2), 74-89 (2007).
  45. Bethke, G., Glazebrook, J. Cyclohexane diamine tetraacetic acid (CDTA) extraction of plant cell wall pectin. Bio-Protocol. 4 (24), e1357 (2014).
  46. Lu, Y., He, Q., Fan, G., Cheng, Q., Song, G. Extraction and modification of hemicellulose from lignocellulosic biomass: A review. Green Processing and Synthesis. 10 (1), 779-804 (2021).
  47. Jayasekara, S., Ratnayake, R. Microbial cellulases: an overview and applications. Cellulose. 22, 92 (2019).
  48. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., Ordaz-Ortiz, J. J., Knox, J. P. An extended set of monoclonal antibodies to pectic homogalacturonan. Carbohydrate Research. 344 (14), 1858-1862 (2009).
  49. Villares, A., Mateo-Vivaracho, L., Guillamón, E. Structural features and healthy properties of polysaccharides occurring in mushrooms. Agriculture. 2 (4), 452-471 (2012).
  50. Kračun, S. K., et al. Carbohydrate microarray technology applied to high-throughput mapping of plant cell wall glycans using comprehensive microarray polymer profiling (CoMPP). Methods in Molecular Biology. 1503, 147-165 (2017).
  51. Rajasundaram, D., et al. Understanding the relationship between cotton fiber properties and non-cellulosic cell wall polysaccharides. PLoS One. 9 (11), e112168 (2014).
  52. Michalak, L., et al. Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut. Nature Communications. 11 (1), 5773 (2020).
  53. Salmeán, A. A., Hervé, C., Jørgensen, B., Willats, W. G., Mravec, J. Microarray glycan profiling reveals algal fucoidan epitopes in diverse marine metazoans. Frontiers in Marine Science. 4, 293 (2017).
  54. Knox, J. P. Revealing the structural and functional diversity of plant cell walls. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 308-313 (2008).
  55. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17-23 (2007).
  56. Stephen, P., Tseng, K. -L., Liu, Y. -N., Lyu, P. -C. Circular permutation of the starch-binding domain: inversion of ligand selectivity with increased affinity. Chemical Communications. 48 (20), 2612-2614 (2012).
  57. Gunnarsson, L. C., Dexlin, L., Karlsson, E. N., Holst, O., Ohlin, M. Evolution of a carbohydrate binding module into a protein-specific binder. Biomolecular Engineering. 23 (2-3), 111-117 (2006).
  58. Moller, I., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchical clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25 (1), 37-48 (2008).

Tags

Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP) Yüksek Verimli Glikan Analizi Glikanlar Glikokonjugatlar Biyolojik Örnekler Bitki Dokuları Alg Dokuları Gıda Malzemeleri İnsan Örnekleri Hayvan Örnekleri Mikrobiyal Örnekler Mikroarray Teknolojisi Tarama Platformu Glikan Yönelimli Moleküler Problar Analitler Kimyasal Fraksiyonlama Enzimatik Fraksiyonlama Nitroselüloz Membranlar Glikan Bileşimi Glikan Tanıyan Moleküler Problar Konvansiyonel Glikan Analiz Teknikleri Monosakkarit Analizi Bağlantı Analizi Kütle Spektrometresi
Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bakshani, C. R., Sangta, J.,… More

Bakshani, C. R., Sangta, J., Sommano, S., Willats, W. G. T. Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis. J. Vis. Exp. (199), e65443, doi:10.3791/65443 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter