Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

उच्च-थ्रूपुट ग्लाइकन विश्लेषण के लिए माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (एमएपीपी)

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65443
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University

Summary

माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (एमएपीपी) जैविक नमूनों में ग्लाइकान के रचनात्मक विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट तकनीक है।

Abstract

माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (एमएपीपी) पौधे और अल्गल ऊतकों, खाद्य सामग्री, और मानव, पशु और माइक्रोबियल नमूनों सहित विभिन्न जैविक नमूनों के भीतर ग्लाइकान और ग्लाइकोकोनजुगेट्स की संरचना और सापेक्ष बहुतायत को व्यवस्थित रूप से निर्धारित करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण है। माइक्रोएरे तकनीक एक लघु, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म प्रदान करके इस पद्धति की प्रभावकारिता को कम करती है, जिससे ग्लाइकान और अत्यधिक विशिष्ट ग्लाइकन-निर्देशित आणविक जांच के बीच हजारों इंटरैक्शन को सहवर्ती रूप से विशेषता दी जा सकती है, केवल थोड़ी मात्रा में विश्लेषणों का उपयोग करके। घटक ग्लाइकान रासायनिक और एंजाइमेटिक रूप से खंडित होते हैं, क्रमिक रूप से नमूने से निकाले जाने से पहले और सीधे नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थिर होते हैं। ग्लाइकन संरचना विशिष्ट ग्लाइकन-पहचानने वाले आणविक जांच के लगाव से निर्धारित होती है जो कि जबरन और मुद्रित अणुओं के लिए होती है। एमएपीपी पारंपरिक ग्लाइकन विश्लेषण तकनीकों का पूरक है, जैसे मोनोसैकराइड और लिंकेज विश्लेषण और मास स्पेक्ट्रोमेट्री। हालांकि, ग्लाइकन-पहचानने वाले आणविक जांच ग्लाइकान के संरचनात्मक विन्यास में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जो जैविक बातचीत और कार्यात्मक भूमिकाओं को स्पष्ट करने में सहायता कर सकते हैं।

Introduction

ग्लाइकान जीवन के सभी डोमेन में सर्वव्यापी हैं और अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स की तुलना में संरचना और कार्य में अद्वितीय विविधता प्रदर्शितकरते हैं। हालांकि, उनकी जटिलता के कारण, जैवसंश्लेषण और ग्लाइकोसिडिक संबंधों में परिवर्तनशीलता, और ग्लाइकन संरचनाओं को विदारक करने के लिए उपयुक्त तरीकों की कमी, संरचनाओं और कार्यों में इस विविधता की हमारी समझ अपेक्षाकृत सीमित है2.

कई ग्लाइकन विश्लेषण तकनीकें विनाशकारी हैं और ग्लाइकान के टूटने को उनके घटक मोनोसेकेराइड में तोड़ने की आवश्यकता होती है, जो प्रासंगिक त्रि-आयामी और जैविक संदर्भों को अस्पष्ट कर सकती हैं3. इसके विपरीत, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस), कार्बोहाइड्रेट बाइंडिंग मॉड्यूल (सीबीएम), लेक्टिन, वायरल एग्लूटीनिन और माइक्रोबियल आसंजन, जिन्हें सामूहिक रूप से ग्लाइकन-पहचानने वाले आणविक जांच (जीआरएमपी)4के रूप में जाना जाता है, विशिष्ट एपिटोप्स को पहचानते हैं और बांधते हैं और जटिल मल्टी-ग्लाइकन मैट्रिसेस 5,6 के भीतर ग्लाइकान के बीच पता लगाने और भेदभाव करने के लिए उपकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

यहां, हम माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (एमएपीपी), ग्लाइकन विश्लेषण के लिए एक तेजी से, बहुमुखी और गैर-विनाशकारी विधि प्रस्तुत करते हैं जो जैविक नमूनों के व्यापक स्पेक्ट्रम पर लागू होता है। विधि का उद्देश्य विविध जैविक और औद्योगिक/वाणिज्यिक प्रणालियों से ग्लाइकान का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत और उच्च-थ्रूपुट तकनीक प्रदान करना है। एमएपीपी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, उच्च प्रदर्शन माइक्रोएरे स्क्रीनिंग तकनीक के साथ ग्लाइकन-निर्देशित आणविक जांच की मान्यता विशिष्टता को एकजुट करता है ताकि हजारों आणविक इंटरैक्शन को समानांतर में प्रोफाइल किया जा सके। इस दृष्टिकोण का उत्पादन एक नमूना या ब्याज के ऊतक के भीतर ग्लाइकान की संरचना और सापेक्ष बहुतायत में नैदानिक अंतर्दृष्टि है।

एमएपीपी का उपयोग एक स्वतंत्र, स्टैंड-अलोन विधि के रूप में किया जा सकता है, या अन्य जैव रासायनिक तकनीकों के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है, जैसे कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी 7,8,9 और मोनोसैकराइड या लिंकेज विश्लेषण10,11। तकनीक भी उपन्यास GRMPs के epitope विशिष्टताओं नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, शुद्ध और संरचनात्मक अच्छी तरह से परिभाषित oligosaccharide मानकों12 के साथ मुद्रित सरणियों का उपयोग कर. एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) जैसे अन्य तरीकों पर एमएपीपी का एक बड़ा फायदा यह है कि छोटे नमूना संस्करणों13,14 के साथ इसकी संगतता है। इसके अलावा, एमएपीपी काफी उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण15 प्रदान करता है और नमूना संरक्षण का एक प्रभावी रूप प्रदान करता है, क्योंकि मुद्रित नमूने नाइट्रोसेल्यूलोज16 पर स्थिर होने पर शुष्क और स्थिर होते हैं।

जीआरएमपी का बंधन आम तौर पर कई सन्निहित चीनी अवशेषों की उपस्थिति पर निर्भर करता है जो सामूहिक रूप से एक बाध्यकारी साइट (एपिटोप) बनाते हैं जो एक विशेष पॉलीसेकेराइड वर्ग (ज़ाइलान, मन्नान, ज़ाइलोग्लुकन, आदि) के लिए अद्वितीय है। 17. इसके विपरीत, व्यक्तिगत चीनी अवशेष (जाइलोज, मैनोज, ग्लूकोज) जो अधिकांश जैव रासायनिक तकनीकों का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की जाती है, उदाहरण के लिए मोनोसैकराइड संरचना या मिथाइलेशन विश्लेषण, कई पॉलीसेकेराइड वर्गों के घटक हो सकते हैं और इस प्रकार18 को असाइन करना मुश्किल है।

एमएपीपी को एक प्रौद्योगिकी अंतराल के जवाब में विकसित किया गया है, अर्थात् छोटी मात्रा में सामग्री का उपयोग करके विभिन्न स्रोतों से कई ग्लाइकान का तेजी से विश्लेषण करने की क्षमता। एमएपीपी जीआरएमपी के व्यापक प्रदर्शनों की सूची को भुनाता है जिन्हें पिछले तीन दशकों में विकसित और विशेषता दी गई है 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. एमएपीपी का विकास एक पुनरावृत्ति प्रक्रिया रही है, जिसमें तकनीक को लगातार परिष्कृत और अनुकूलित किया जा रहा है। अब विभिन्न प्राकृतिक और औद्योगिक प्रणालियों में एमएपीपी के अनुप्रयोग का वर्णन करने वाले साहित्य का एक बड़ा निकाय है जहां ग्लाइकान केंद्रीय भूमिका निभाते हैं 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. यहां, हम एमएपीपी के लिए कला की वर्तमान स्थिति का वर्णन करते हैं।

Protocol

एमएपीपी विधि के मुख्य प्रयोगात्मक चरणों चित्रा 1 में संक्षेप कर रहे हैं.

1. नमूने तैयार करना

नोट: यहां, विधि को उदाहरण के उद्देश्यों के लिए पौधे के ऊतकों पर लागू किया जाता है। चुने गए पौधों में कॉफ़ी अरेबिका, एलियम सैटिवम वर ओफ़ियोस्कोरोडन, और कई थाई आम की किस्में (आओक्रोंग, काम, रेड, चोकानन, ममकमडांग, तालाबनक, महाचानोक और नगा) थीं। संयंत्रों को उनके व्यावसायिक महत्व के लिए चुना गया था। मानव उपभोग के लिए उनका प्रसंस्करण वर्तमान में कम उपयोग किए गए कृषि-औद्योगिक कचरे को उत्पन्न करता है, जो शुद्ध ग्लाइकान सहित मूल्य वर्धित उत्पादों का स्रोत प्रदान कर सकता है। इस प्रकार, एमएपीपी को बायोप्रोस्पेक्टिंग उद्देश्यों के लिए अपशिष्ट संयंत्र बायोमास की ग्लाइकन संरचना को चिह्नित करने के लिए लागू किया गया था।

  1. पौधे की सामग्री को विभिन्न ऊतकों (जैसे, जड़, तना और पत्तियों) में अलग करें।
  2. पौधे के ऊतकों को गर्म हवा के ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर 12-24 घंटे के लिए सुखाएं (नमूने के अनुसार समय घटाएं/बढ़ाएं)। वैकल्पिक रूप से, स्नैप तरल नाइट्रोजन में नमूनों फ्रीज और बाद में ~ 4 दिनों के लिए lyophilize स्नैप.
  3. प्रत्येक ट्यूब में एक गेंद असर के साथ एक मूसल और मोर्टार या एक यांत्रिक ऊतक lyser ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर एक ठीक पाउडर के लिए नमूनों homogenize.
    नोट: ताजा पौधे के ऊतकों के लिए, समरूपीकरण से पहले सुखाने या lyophilizing की सिफारिश की जाती है। आम तौर पर, अधिकांश सूखे नमूनों के लिए मूसल और मोर्टार के साथ समरूपीकरण पर्याप्त होता है। विशेष रूप से लचीला नमूनों के लिए, जैसे अनाज, फलियां, और पास्ता जैसे प्रसंस्कृत खाद्य पदार्थ, तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीजिंग नमूना समरूपता की गति और दक्षता को बढ़ा सकता है। हमने पाया है कि यांत्रिक समरूपता लगभग सभी नमूना प्रकारों के साथ संगत है, काफी तेज और कम श्रम-गहन है, और प्रभावी रूप से एक ही उपकरण (यानी, मूसल और मोर्टार) के बार-बार उपयोग से नमूना क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करता है।

2. शराब अघुलनशील अवशेष (एआईआर) की तैयारी

  1. 50-100 मिलीग्राम हवा में सुखाए और समरूप नमूना सामग्री के लिए 70% (वी / वी) इथेनॉल के 1.5 एमएल जोड़ें।
  2. भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र. एक विंदुक का उपयोग करके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला त्यागें और गोली को बनाए रखें।
  3. शेष गोली के लिए, मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म (1: 1 [वी / वी]) के 1.5 एमएल जोड़ें। भंवर, अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, चरण 2.2 के अनुसार.
  4. शेष गोली के लिए, 100% एसीटोन के 1.5 एमएल जोड़ें। भंवर, अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, चरण 2.2 के अनुसार.
  5. परिणामी गोली या तो एक धूआं हुड में रात भर अवशिष्ट एसीटोन वाष्पित करने के लिए या सूखी तक एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में अनुमति देने के लिए रखें.
    नोट: वायु सामग्री को परिवेश के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि आवश्यक न हो।

3. ग्लाइकन निष्कर्षण

नोट: यदि संभव हो तो, पुन: निलंबन सहायता के लिए प्रत्येक ट्यूब में एक गेंद असर के साथ एक ऊतक lyser में सभी निष्कर्षण कदम प्रदर्शन. यदि एक ऊतक लसीर अनुपलब्ध है, तो लगातार सरगर्मी या झटकों के बजाय अर्क किया जा सकता है। यदि यह संभव नहीं है तो निष्कर्षण समय का विस्तार करना आवश्यक हो सकता है।

  1. 10 मिलीग्राम AIR सामग्री में, 30 μL/mg 50 mM cyclohexanediaminetetraacetic acid (CDTA; सामग्री की तालिकादेखें), pH 7.5 जोड़ें।
  2. 2 मिनट के लिए 27 हर्ट्ज पर हिलाएं, इसके बाद 2 घंटे के लिए 10 हर्ट्ज करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। परिणामी सतह पर तैरनेवाला बनाए रखें, इसे एक बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें, और इसे रोटरी शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. अवशिष्ट गोली में, 30 μL/mg 4 M NaOH + 0.1% (w/v) NaBH4 जोड़ें।
    चेतावनी: NaBH4 निगलने पर विषाक्त है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का प्रयोग करें। एक धूआं हुड के नीचे संभाल। धूल बनने से बचें। धूल में सांस लेने से बचें। उत्पाद को पानी के संपर्क में न आने दें।
  5. 3.3 करने के लिए कदम 3.2 दोहराएँ. अवशिष्ट NaOH को हटाने के लिए अवशिष्ट गोली को dH2O से दो या तीन बार धोएं।
  6. 30 μL/mg सेल्युलस जोड़ें (अधिमानतः GH5 endo-1,4-β-glucanase, उपयुक्त एंजाइम बफर में-निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में; सामग्री की तालिका देखें) गोली के लिए और एंजाइम इष्टतम तापमान पर 16 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला बनाए रखें, साफ microcentrifuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण, और एक रोटरी प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान. एक बार निकाले जाने के बाद, नमूनों को जल्द से जल्द मुद्रित किया जाना चाहिए।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर फिर से सभी संग्रहीत अर्क अपकेंद्रित्र.
    नोट: नमूने कणों और मलबे से मुक्त होना चाहिए। यदि आवश्यक हो तो माइक्रोएरे प्रिंटिंग से पहले 0.2 माइक्रोन स्पिन फिल्टर से गुजरें। विशेष रूप से चिपचिपा नमूने माइक्रोएरे विश्लेषण के साथ असंगत हैं क्योंकि माइक्रोएरे केशिकाएं और प्रिंट हेड आसानी से भरा हो सकता है। एक सामान्य नियम के रूप में, उपयोगकर्ताओं को एक मानक कम मात्रा विंदुक के साथ मुद्रण के लिए इरादा सभी नमूनों विंदुक करने में सक्षम होना चाहिए.

4. मानकों की तैयारी

  1. बाँझ डीएच2ओ में परिभाषित ग्लाइकन मानकों (तालिका 1) के 1 मिलीग्राम/एमएल समाधान तैयार करें। यदि एक मानक के रूप में पचीमैन का उपयोग करते हैं, तो इसके बजाय 4 एम NaOH में भंग करें और घुलनशीलता के बाद ग्लेशियल एसिटिक एसिड के साथ बेअसर करें।
  2. पूर्ण घुलनशीलता की अनुमति देने के लिए एक रोटरी प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर तैयार मानकों को स्टोर करें।
  3. किसी भी मलबे को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सभी मानकों को सेंट्रीफ्यूज करें। परिणामी सतह पर तैरनेवाला बाद में मुद्रण के लिए प्रयोग किया जाता है.

5. माइक्रोएरे प्रिंटिंग

  1. ग्लिसरॉल सिस्टम बफर (जीएसबी) में काली भारतीय स्याही/ड्राइंग स्याही का 1:20 (वी/वी) कमजोर पड़ने तैयार करें; 47% ग्लिसरॉल, 52.9% डीएच2ओ, 0.06% ट्राइटन एक्स-100, और 0.04% बायोसाइड [0.15% -0.17% कप नाइट्रेट और पानी में 1.4% -2.0% मैग्नीशियम नाइट्रेट] और फिल्टर स्टरलाइज़ करें) ( सामग्री की तालिकादेखें) और 15,000 x ग्राम (कमरे के तापमान) पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    नोट: मुद्रित नमूनों के चारों ओर एक ऊपर और नीचे की सीमा बनाने के लिए स्याही समाधान आवश्यक है, ताकि मुद्रित माइक्रोएरे को झिल्ली पर नेत्रहीन रूप से पता लगाया जा सके। हालांकि, स्याही समाधान में तलछट होने की संभावना है। मुद्रण के लिए सभी समाधान कणों से मुक्त होने चाहिए, इसलिए पाइपिंग करते समय तलछट को परेशान करने से बचें। त्यागें और ताजा तैयार करें जब यह संभव न हो। पार्टिकुलेट हटाने के लिए घोल को आसानी से फ़िल्टर नहीं किया जा सकता है।
  2. पहले 384-अच्छी प्लेट (चित्रा 2) के पहले खंड में स्याही समाधान और जीएसबी के 40 माइक्रोन जोड़ें।
  3. सभी कमजोर पड़ने 1 (डी 1) कुओं में जीएसबी के 25 माइक्रोन जोड़ें। सभी कमजोर पड़ने 2, 3, और 4 (डी 2-डी 4) कुओं में जीएसबी के 40 माइक्रोन जोड़ें।
  4. निकाले गए ग्लाइकन नमूनों को पतला करें और क्रम में डी 1 कुओं में निकाले गए ग्लाइकन नमूने के 25 माइक्रोन जोड़कर जीएसबी के साथ ग्लाइकन सब्सट्रेट 1: 1 (वी /
  5. डी 1 अच्छी तरह से नमूना के 10 माइक्रोन लेने और डी 2 को अच्छी तरह से जोड़कर प्रत्येक नमूने को चार बार पतला करें। मिश्रण करने के लिए एक विंदुक के साथ धीरे महाप्राण।
  6. डी 2 से अच्छी तरह से नमूना के 10 माइक्रोन लेने और डी 3 अच्छी तरह से जोड़ने के द्वारा प्रक्रिया को दोहराएं।
  7. D4 के लिए अच्छी तरह से दोहराएं। मिश्रण के बाद, डी 4 अच्छी तरह से से 10 माइक्रोन को त्यागें ताकि प्रत्येक अच्छी तरह से 40 माइक्रोन की अंतिम मात्रा हो।
  8. अंतिम प्लेट के अंतिम ब्लॉक में स्याही समाधान और जीएसबी के 40 माइक्रोन जोड़ें।
  9. प्लेटों को एक चिपकने वाली प्लेट कवर और 3,000 x ग्राम (कमरे के तापमान) पर 10 मिन के लिए अपकेंद्रित्र के साथ कवर करें। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले centrifugation निम्नलिखित रहते हैं और यदि आवश्यक हो तो दोहराएँ.
  10. एक गैर-संपर्क पीजोइलेक्ट्रिक माइक्रोएरे प्रिंटिंग रोबोट का उपयोग करके, नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली ( सामग्री की तालिकादेखें) पर नमूने प्रिंट करें।
    नोट: इष्टतम प्रिंट गुणवत्ता के लिए अनुशंसित कार्रवाइयां नीचे दी गई हैं; हालांकि, आवश्यक विशिष्ट पैरामीटर अंततः उपयोग किए गए उपकरण पर निर्भर करेंगे। हम सलाह देते हैं कि उपयोगकर्ता अपने डिवाइस के लिए आवश्यक उपयुक्त अनुकूलन और प्रिंट सेटिंग्स पर चर्चा करने के लिए उपकरण निर्माता से संपर्क करें।
    1. मुद्रण से पहले, अपशिष्ट बफर जलाशय को खाली करें और आवश्यकतानुसार स्वच्छ बफर जलाशय को स्वच्छ जीएसबी से भरें। उपकरण पर स्विच करें और इसे >10 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति दें यदि इसमें एक एकीकृत आर्द्रता और तापमान नियंत्रण प्रणाली है। माइक्रोएरे पर स्विच करें और सिस्टम को इनिशियलाइज़ करें।
      नोट: उपकरण के आंतरिक दबाव को निर्धारित करने के लिए एक परीक्षण चलाने की सिफारिश की जाती है। यदि दबाव बहुत कम है, तो उच्च दबाव का शुद्धिकरण करना आवश्यक हो सकता है। फिर से, विशिष्ट उपकरण के विशिष्ट संचालन पर चर्चा करने के लिए उपकरण निर्माता से संपर्क करें।
    2. मलबे और संभावित दूषित पदार्थों को हटाने के लिए जीएसबी के साथ कई बार प्रिंट हेड और केशिकाओं को शुद्ध करें। या तो अकेले जीएसबी की एक प्लेट लोड हो रहा है या एक लोड किया गया थाली से नमूना आकांक्षा को दरकिनार करते हुए, सीधे साफ बफर जलाशय से प्रिंट करने के लिए उपकरण की स्थापना करके एक परीक्षण प्रिंट रन करें।
      नोट: नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली का उपयोग करके परीक्षण प्रिंट करना आवश्यक नहीं है; स्वच्छ खुर्दबीन स्लाइड पर्याप्त हैं और लाभ है कि स्पॉट आकार, आकार, और गुणवत्ता नेत्रहीन नमूना मुद्रण से पहले मूल्यांकन किया जा सकता है प्रदान करते हैं.
    3. निकाले गए ग्लाइकन नमूनों को प्रिंट करते समय, प्रत्येक नमूने के बीच साफ जीएसबी के साथ फ्लश करने के लिए सिस्टम को प्रोग्राम करें।
      नोट: आमतौर पर, मुद्रित स्थान प्रति नमूना मात्रा 100 पीएल से 10 एनएल है, और चयनित नमूना मात्रा के आधार पर स्पॉट आकार 20 माइक्रोन से 100 माइक्रोन तक होता है। एक स्रोत 384 अच्छी तरह से थाली से 100 microarrays मुद्रण सिस्टम फ्लशिंग सहित लगभग 40 मिनट, लेता है. परिणामी माइक्रोएरे आकार में लगभग 1 सेमी2 होंगे। अतिरिक्त प्लेटें प्लेट प्रति लगभग 1 सेमी से सरणी की लंबाई में वृद्धि होगी. मुद्रित माइक्रोएरे डिजाइन का एक योजनाबद्ध चित्रा 3 में दिखाया गया है। एक बार मुद्रित होने के बाद, माइक्रोएरे तुरंत उपयोग करने के लिए तैयार होते हैं और कई वर्षों तक संग्रहीत किए जा सकते हैं। मुद्रण के दौरान नमूनों के संभावित वाष्पीकरण के कारण, किसी भी कारण से प्रिंट नौकरी को दोहराया जाना चाहिए, यह अनुशंसा की जाती है कि एक नया नमूना प्लेट लोड किया जाए और मूल प्लेट को त्याग दिया जाए।
    4. सप्ताह में एक बार, प्रिंट हेड और केशिकाओं को अच्छी तरह से साफ करें। जीएसबी में केंद्रित NaOH के 1:20 कमजोर पड़ने वाले 384-अच्छी तरह से लोड करके ऐसा करें और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 40 मिनट से 1 घंटे प्रिंट रन करें। उपयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि आगे बढ़ने से पहले यह सफाई समाधान उनके उपकरण के अनुकूल है।
  11. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए तैयार मुद्रित माइक्रोएरे के लिए उत्पादित अद्वितीय ग्रिड फ़ाइल (.gal फ़ाइल) को सहेजें।

6. माइक्रोएरे जांच

  1. नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली से व्यक्तिगत, समान मुद्रित माइक्रोएरे को काटें और उन्हें जांच के लिए उचित आकार के पोत में रखें (उदाहरण के लिए, एक 12- या 24-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट) ( सामग्री की तालिकादेखें)। सरणी पोत के आधार पर फ्लैट झूठ बोलना चाहिए. जांच प्रति एक माइक्रोएरे की आवश्यकता होती है और एक तकनीकी प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है।
  2. गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए, एमपी-टीबीएसटी ब्लॉकिंग बफर (1x ट्रिस-बफर खारा, पीएच 7.5, + 0.1% [वी/वी] ट्वीन 20 [टीबीएसटी] में 1 घंटे के लिए माइक्रोएरे को इनक्यूबेट करें और 5% [डब्ल्यू / वी] स्किम्ड-मिल्क पाउडर के साथ पूरक; सामग्री की तालिकादेखें) एक घूर्णन / रॉकिंग शेकर पर। सुनिश्चित करें कि वॉल्यूम पूरे सरणी को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त है।
  3. इनक्यूबेशन बाद, एमपी-टीबीएसटी को हटा दें और इसे एमपी-टीबीएसटी की एक ताजा मात्रा के साथ बदलें।
  4. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) या हिस-टैग किए गए सीबीएम, या अन्य जीआरएमपी (जैसे, लेक्टिन) के साथ सरणियों को इनक्यूबेट करें, पतला 1: 10-1: 1,000 (निर्माता द्वारा निर्दिष्ट; सामग्री की तालिका देखें) एमपी-टीबीएसटी में एक घूर्णन / रॉकिंग शेकर पर 2 घंटे के लिए।
  5. इनक्यूबेशन के बाद, आणविक जांच समाधान को हटा दें और स्वच्छ टीबीएसटी में सरणियों को कवर करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सरणियाँ पूरी तरह से जलमग्न हैं। अवशिष्ट जांच समाधान को हटाने के लिए, तुरंत टीबीएसटी को हटा दें और एक ताजा मात्रा के साथ बदलें। 5 मिनट के लिए एक घूर्णन / कमाल के प्रकार के बरतन पर सरणियों रखें. 5 मिनट के बाद, टीबीएसटी को हटा दें, एक ताजा मात्रा के साथ बदलें, और 5 मिनट के लिए घूर्णन/रॉकिंग शेकर पर रखें।
    नोट: इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराया जाना चाहिए, जिसमें टीबीएसटी के प्रारंभिक जोड़ और तत्काल हटाने शामिल नहीं हैं।
  6. क्षारीय-फॉस्फेट संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (एंटी-माउस, एंटी-चूहा, एंटी-खरगोश, एंटी-उसकी, जैसा उपयुक्त हो; सामग्री की तालिका देखें) के साथ सरणियों को इनक्यूबेट करें, एक रॉकिंग/घूर्णन शेकर पर 2 घंटे के लिए एमपी-टीबीएसटी में 1: 1,000 पतला होता है।
    नोट: हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी भी उपयुक्त हैं, रंग विकास के लिए टेट्रामिथाइल बेंजिडाइन (टीएमबी) / हाइड्रोजन पेरोक्साइड सब्सट्रेट के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है।
  7. इनक्यूबेशन बाद, धोने की प्रक्रिया को दोहराएं, चरण 6.5 के अनुसार, गैर-विशेष रूप से बाध्य माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए।
  8. एंटीबॉडी बाइंडिंग के क्रोमोजेनिक डिटेक्शन के लिए नाइट्रो-ब्लू टेट्राज़ोलियम (NBT)/5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-फॉस्फेट (BCIP) कलर डेवलपमेंट सॉल्यूशन (सामग्री की तालिकादेखें) में सरणियों को कवर करें। बैंगनी अवक्षेप धब्बे प्रतिजन बाध्यकारी साइटों पर विकसित होने तक छोड़ दें (आमतौर पर 5-30 मिनट, हालांकि सरणी को ओवरसैचुरेशन से बचने के लिए बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए, क्योंकि प्रतिक्रिया तेजी से हो सकती है)।
    सावधानी: त्वचा के संपर्क में आने पर बीसीआईपी हानिकारक होता है और इससे श्वसन संबंधी जलन हो सकती है। पीपीई का प्रयोग करें। धूल बनने से बचें। धूल में सांस लेने से बचें।
  9. प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए, साफ नल के पानी में सरणियों को डुबोएं और बड़े पैमाने पर धोएं।
  10. सोख्ता कागज के बीच सरणियों को सूखने के लिए परिवेश के तापमान पर रात भर रखें।
  11. स्पष्ट दोषों के साथ सरणियों को त्यागें और ऐसे उदाहरणों में जांच प्रोटोकॉल दोहराएं (चित्र 4)।

7. विश्लेषण और मात्रा का ठहराव

  1. एक डेस्कटॉप स्कैनर का उपयोग कर एक 2,400 डॉट्स प्रति इंच (डीपीआई) संकल्प पर विकसित सरणियों को स्कैन करें. छवियों को TIFF फ़ाइलों में और फिर नकारात्मक में कनवर्ट करें।
  2. माइक्रोएरे विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके, प्रत्येक एंटीजन बाध्यकारी साइट पर उत्पादित स्पॉट की रंग तीव्रता की गणना करने और स्थानीय पृष्ठभूमि को घटाने के लिए प्रत्येक माइक्रोएरे छवि पर अद्वितीय .gal ग्रिड फ़ाइल को ओवरले करें।
  3. ग्रिड डेटा को .txt फ़ाइल के रूप में निर्यात करें. फिर इन्हें विश्लेषण के लिए एक्सेल शीट में मैन्युअल रूप से आयात किया जा सकता है।
  4. प्रत्येक नमूना कमजोर पड़ने के बाद पहले और फिर किसी भी जैविक प्रतिकृति में शामिल स्पॉट तीव्रता औसत द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए एक मतलब स्पॉट संकेत तीव्रता मूल्य उत्पन्न करें।
  5. उच्चतम माध्य स्थान सिग्नल तीव्रता के लिए 100 का मान असाइन करें और तदनुसार शेष डेटा को सामान्य करें।
    नोट: सामान्यीकृत माध्य स्पॉट सिग्नल तीव्रता को तब Excel33 में सशर्त स्वरूपण फ़ंक्शन का उपयोग करके या R ggplot2 पैकेज40,41 में geom_tile फ़ंक्शन का उपयोग करके सापेक्ष ग्लाइकन एपिटोप बहुतायत के हीटमैप के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है।

Representative Results

एमएपीपी को कृषि बायोमास कचरे की ग्लाइकन संरचना को निर्धारित करने के लिए लागू किया गया था, जिसमें कई उत्तरी थाई किस्मों से आम के छिलके, कॉफ़ी अरेबिका चेरी पल्प और कॉफी बीन प्रसंस्करण अपशिष्ट, और थाई काले लहसुन से जड़, तना और पत्ती के ऊतक, एलियम सैटिवम वर ओफियोस्कोरोडन शामिल थे। कई पौधे व्युत्पन्न polysaccharides कार्यात्मक सामग्री42,43 के रूप में खाद्य उद्योग में उपयोग किया जाता है. इस प्रकार, इस प्रयोग का उद्देश्य यह पता लगाना था कि क्या ये प्रचुर मात्रा में और वर्तमान में कम उपयोग किए जाने वाले कृषि-औद्योगिक अपशिष्ट पदार्थ मूल्य वर्धित शुद्ध पॉलीसेकेराइड का स्रोत प्रदान कर सकते हैं।

आकाशवाणी सामग्री नियमित रूप से glycan विश्लेषण44 के लिए इरादा नमूने तैयार करने के लिए नियोजित किया जाता है. आकाशवाणी का उपयोग करने के कई फायदे हैं; सॉल्वैंट्स के साथ उपचार प्रभावी ढंग से अंतर्जात CAZymes, चयापचयों, छोटे saccharides, लिपिड, और पिगमेंट को हटा देता है, जिसके परिणामस्वरूप नमूने पॉलीसेकेराइड और संरचनात्मक प्रोटीन34 से समृद्ध होते हैं। इसके अलावा, एआईआर का उत्पादन नमूना दीर्घायु बढ़ाने का एक तेज़ और प्रभावी तरीका है, क्योंकि यह थर्मोस्टेबल है और इसे कई वर्षों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

घटक ग्लाइकान के तीन मिश्रित अंशों को क्रमिक रूप से सीडीटीए, एनएओएच और सेल्यूलस का उपयोग करके प्लांट एयर सामग्री से निकाला गया था। सीडीटीए सीए2+ आयनों को चेलेट्स करता है, जो प्लांट सेल की दीवारों से सीए2+ क्रॉसलिंक्ड डी-एस्टरिफाइड पेक्टिन को हटाने की अनुमति देता है45. क्षारीय स्थितियां मुख्य रूप से हेमिकेलुलोज, जैसे कि मन्नान, ज़ाइलान और β-ग्लूकन को हाइड्रोजन बॉन्डिंग के विघटन और सेल्यूलोज माइक्रोफाइब्रिल्स और हेमिकेलुलोज, और लिग्निन और हेमिकेलुलोज के बीच एस्टर लिंकेज के सैपोनिफिकेशन के कारण जारी करने की अनुमति देती हैं, क्रमशः46. बैसिलस एसपीपी से एक पुनः संयोजक एंडो-1,4-β-ग्लूकेनेज का उपयोग संरचनात्मक सेलूलोज़ माइक्रोफिब्रिल के अनाकार क्षेत्रों को नीचा दिखाने के लिए किया गया था, सेल की दीवारों के भीतर सेलूलोज़ से बंधे अवशिष्ट ग्लाइकान जारी करते हैं47. यद्यपि यह विधि प्रभावी रूप से ग्लाइकान को इन तीन व्यापक समूहों में अलग करती है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नमूने शुद्ध नहीं हैं; निष्कर्षण विधि की प्रकृति से, हेमिकेलुलोज, यदि नमूने में मौजूद है, तो अनिवार्य रूप से निकाला जाएगा और बाद में सीडीटीए और सेल्यूलस अंशों में अलग-अलग डिग्री का पता लगाया जाएगा। इसी तरह, नमूने में मौजूद होने पर NaOH निष्कर्षण में कुछ पेक्टिन का पता लगाया जाएगा।

एक गैर-संपर्क, पीजोइलेक्ट्रिक माइक्रोएरे प्रिंटिंग रोबोट का उपयोग गैर-सहसंयोजक लगाव11 के माध्यम से नाइट्रोसेल्यूलोज पर निकाले गए ग्लाइकन अंशों को स्थिर करने के लिए किया गया था, जिससे 300 समान माइक्रोएरे बन गए। परिभाषित ग्लाइकन मानकों (तालिका 1) को मुद्रित माइक्रोएरे में सकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 5)के रूप में भी शामिल किया गया था। चयनित ग्लाइकन मानकों के लिए प्राप्त एमएपीपी बाध्यकारी प्रोफ़ाइल पहले रिपोर्ट किए गए एपिटोप विशिष्टताओं से मेल खाती है। उदाहरण के लिए, LM21 ने कई मन्नान पॉलीसेकेराइड (गैलेक्टोमैनन और ग्लूकोमानन) के लिए मजबूत बंधन का प्रदर्शन किया, जबकि LM22 ने गैलेक्टोमैनन25 के लिए केवल कमजोर बंधन का प्रदर्शन किया। इसी तरह, LM19 अधिमानतः डी-एस्टरिफाइड homogalacturonan48 और LM15 इमली के बीज xyloglucan23 के लिए बाध्य है।

16 एपिटोप्स की सापेक्ष बहुतायत, गैर-सेल्यूलोसिक प्लांट सेल वॉल पॉलीसेकेराइड का निदान, ग्लाइकन-निर्देशित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (तालिका 2) के मुद्रित अर्क(चित्रा 6)के लगाव द्वारा पता लगाया गया था। निकाले गए ग्लाइकान के बहुमत का पता क्षारीय NaOH अंश के भीतर लगाया गया था। mAbs LM10 और LM11 के लिए मजबूत बाध्यकारी संकेत दर्ज किए गए थे, जो परीक्षण की गई सभी आम किस्मों के छिलकों के भीतर ज़ाइलान/अरबीनोक्सिलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। लहसुन के नमूनों के भीतर, LM10 और LM11 अधिमानतः रूट ऊतक निकालने (लहसुन आर) के लिए बाध्य होते हैं और पत्ती ऊतक निकालने (लहसुन L) के लिए केवल कमजोर बंधन का प्रदर्शन करते हैं। LM19, आंशिक रूप से मिथाइल-एस्टरिफाइड या अन-एस्टरिफाइड होमोगैलेक्टुरोनन का प्रतिनिधित्व करता है, जो कुछ आम किस्म के अर्क (आओक्रोंग और तालाबनाक) से दृढ़ता से बंधा हुआ है, लेकिन केवल कमजोर रूप से बाध्य है, या इसका बंधन अन्य किस्मों (चोकानन, ममकमडांग, महाचानोक और नगा) में अवांछनीय था। इसके अलावा, LM19 केवल कॉफी पल्प अंशों से बंधा हुआ है और कॉफी बीन प्रसंस्करण अपशिष्ट सामग्री से बंधा नहीं है, जिसे पहले अर्ध-शुद्ध कॉफी पेक्टिन (अप्रकाशित डेटा) से बना माना जाता था।

Figure 1
चित्रा 1: एमएपीपी विधि में प्रमुख प्रयोगात्मक कदम। (ए) नमूने ठीक पाउडर बनाने के लिए समरूप हैं। (बी) समरूप नमूनों को उनके एआईआर को अलग करने के लिए संसाधित किया जाता है। (सी) घटक ग्लाइकान क्रमिक रूप से एक अनुरूप निष्कर्षण व्यवस्था का उपयोग करके निकाले जाते हैं। (डी) निकाले गए ग्लाइकन अंश, स्याही, और जीएसबी को नाइट्रोसेल्यूलोज पर मुद्रण के लिए, प्लेट लेआउट के अनुसार, 384-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित किया जाता है। (ई) मुद्रित माइक्रोएरे चयनित जीआरएमपी के साथ जांच की जाती है। (एफ) जीआरएमपी मुद्रित ग्लाइकन अंशों के लिए बाध्यकारी मात्रा निर्धारित की है और डेटा को हीटमैप के रूप में प्रस्तुत करने से पहले विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: नमूना के लिए एक 384 अच्छी तरह से प्लेट लेआउट का उदाहरण, स्याही, और निकाले glycan नमूना / मानक प्रति चार dilutions के साथ जीएसबी लोड हो रहा है. विभिन्न रंग विभिन्न निष्कर्षण अभिकर्मकों से उत्पन्न होने वाले नमूनों को दर्शाते हैं, जबकि विभिन्न रंग धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोड में पहली संख्या नमूना संख्या का प्रतिनिधित्व करती है, जबकि अंतिम संख्या कमजोर पड़ने की संख्या का प्रतिनिधित्व करती है (D1 कमजोर पड़ने वाले एक को दर्शाती है, D2 कमजोर पड़ने वाले दो को दर्शाती है, और इसी तरह)। उदाहरण के लिए, एक अच्छी तरह से लेबल '12D3' glycan नमूना 12, कमजोर पड़ने तीन का प्रतिनिधित्व करता है. अच्छी तरह से प्लेटों को आठ समान वर्गों में विभाजित किया जाना चाहिए जिसमें छह कॉलम और आठ पंक्तियां शामिल हैं। पहली थाली के पहले खंड केवल स्याही और बफर शामिल हैं और उदाहरण प्लेट लेआउट जैसा दिखता है. निकाले glycan नमूने तो प्लेट लेआउट के अनुसार बाद की प्लेट वर्गों में लोड किया जा सकता है. विभिन्न निष्कर्षण अभिकर्मकों को एक ही प्लेट अनुभाग में लोड नहीं किया जाना चाहिए। यदि पूरे खंड को भरने के लिए अपर्याप्त नमूने हैं, तो उस अनुभाग में सभी शेष कुओं को बफर से भरें; किसी भी कुएं को खाली न छोड़ें। यदि कई प्लेटों की आवश्यकता होती है, तो सभी नमूनों को लोड करने के बाद अगले खंड में स्याही के तीन वैकल्पिक कॉलम होने चाहिए और जीएसबी-यह मुद्रित किए जा रहे नमूनों की संख्या के आधार पर धारा आठ नहीं हो सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मुद्रित माइक्रोएरे डिजाइन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि माइक्रोएरे। (ए) कोई बंधन नहीं। (बी) बाध्यकारी संकेत उच्च पृष्ठभूमि संकेत द्वारा अस्पष्ट है। (सी) एनबीटी/बीसीआईपी के साथ ओवरसैचुरेशन के कारण सामान्यीकृत नीला/बैंगनी धुंधलापन। (डी) उच्च सब्सट्रेट एकाग्रता के कारण दोषपूर्ण जांच। (ई) अशुद्ध प्रिंट हेड के कारण दोषपूर्ण मुद्रण। (एफ) कुछ नमूनों के लिए मजबूत बाध्यकारी। (जी) कई नमूनों के लिए मजबूत बाध्यकारी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: परिभाषित ग्लाइकन मानकों के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी बाध्यकारी, मुद्रण और जांच प्रक्रिया को मान्य करने के लिए शामिल है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कृषि बायोमास कचरे से निकाले गए ग्लाइकान का एमएपीपी। नमूनों में कॉफी पल्प वेस्ट (कॉफी पल्प और कॉफी पेक्टिन), कई थाई किस्मों (एओ, आओक्रोंग) से आम के छिलके शामिल हैं। केओ, काम; आरडी, रेड; सीएच, चोकानन; एमए, ममकामडांग; टीएल, तलबनाक; एमएच, महाचनोक; NG, Nga) और काले लहसुन के पत्ते (लहसुन L), स्टेम (लहसुन S), बल्ब (लहसुन BG), और जड़ें (लहसुन R), CDTA, NaOH और सेल्युलस (Bacillus spp. सेल्युलस 5A) का उपयोग करके। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एमएपीपी विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले परिभाषित वाणिज्यिक पॉलीसेकेराइड मानक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: निकाले गए पौधे ग्लाइकन माइक्रोएरे की पूछताछ के लिए चुने गए ग्लाइकन-निर्देशित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ वर्णित एमएपीपी तकनीक अब ग्लाइकन विश्लेषण के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। बुनियादी सिद्धांतों को पहली बार 200711 में वर्णित किया गया था, लेकिन माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी, आणविक जांच विकास और ग्लाइकन जैव रसायन की हमारी समझ में प्रगति में नवीनतम नवाचारों को भुनाने के लिए तकनीक का निरंतर विकास हुआ है। सामान्य तौर पर, ग्लाइकान, विशेष रूप से पॉलीसेकेराइड, प्रोटीन और न्यूक्लियोटाइड की तुलना में उनकी संरचनात्मक जटिलता और विषमता45 के कारण विश्लेषण करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण होते हैं, साथ ही तथ्य यह है कि उन्हें आसानी से अनुक्रमित या संश्लेषित नहीं किया जा सकताहै 1. कई मामलों में, कोई भी तकनीक ग्लाइकन जटिलता को निर्णायक रूप से नहीं समझ सकती है; इस प्रकार, एमएपीपी का उपयोग अक्सर अन्य तरीकों से किया जाता है। यह एक कारण है कि एआईआर तैयारी को आमतौर पर एमएपीपी के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में चुना जाता है, क्योंकि एआईआर अधिकांश अन्य ग्लाइकन विश्लेषण विधियों34 के साथ संगत है, जिससे डेटासेट की बाद की तुलना की सुविधा मिलती है।

आकाशवाणी की तैयारी से पहले नमूने के समरूपीकरण के कारण, कुछ स्थानिक जानकारी हमेशा खो जाती है। हालांकि, के रूप में polysaccharides क्रमिक नमूने से जारी कर रहे हैं, प्राप्त अंशों में epitopes की उपस्थिति आणविक वास्तुकला और उस नमूना17 की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करता है. इस प्रकार, एक उपयुक्त निष्कर्षण शासन का चयन विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. एकाधिक पैरामीटर निष्कर्षण विधि की उपयुक्तता निर्धारित करते हैं: सेलुलर संरचना, समय, तापमान, पीएच, दबाव, विलायक की आयनिक शक्ति, और ठोस कण नमूना49 की सुंदरता। यह अनुशंसा की जाती है कि तेजी से अधिक आक्रामक सॉल्वैंट्स की एक श्रृंखला का उपयोग घटक ग्लाइकान को सफलतापूर्वक निकालने और नमूने की प्रतिनिधि रचनात्मक तस्वीर बनाने की संभावना को अधिकतम करने के लिए किया जाता है। अधिकांश नमूनों के लिए, सीडीटीए, एनएओएच, और सेल्यूलस पौधे से व्युत्पन्न भंडारण और सेल दीवार पॉलीसेकेराइड 33,50,51,52 को हटाने के लिए पर्याप्त हैं। कुछ ऊतक नमूनों के लिए, एक हाइब्रिड निष्कर्षण शासन जिसमें CaCl2, HCl, और Na2CO3 भी शामिल हैं, को सफल53 दिखाया गया है, जबकि समुद्री माइक्रोलेगल नमूनों को एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (EDTA)10के अतिरिक्त की आवश्यकता हो सकती है।

माइक्रोएरे में सकारात्मक नियंत्रण5 के रूप में उपयोग किए जाने वाले शुद्ध, परिभाषित ग्लाइकन मानकों की एक श्रृंखला शामिल होनी चाहिए। शामिल मानकों को नमूने की प्रकृति के अनुसार संशोधित किया जाना चाहिए। एक बार मुद्रित होने के बाद, उपयुक्त जीआरएमपी का चयन करने की आवश्यकता होती है। पॉलीसेकेराइड संरचनाओं के लिए हाइब्रिडोमा एमएबी की पीढ़ीचुनौतीपूर्ण 54 है; ग्लाइकन-बाइंडिंग एंटीबॉडी को उठाना मुश्किल होता है और कम आत्मीयता55 हो सकती है। सौभाग्य से, सीबीएम के लिए जीन अनुक्रम जानकारी पुनः संयोजक अभिव्यक्ति4 और इंजीनियरिंग उनके बाध्यकारी विशिष्टताओं56,57 के लिए सापेक्ष आसानी के साथ प्राप्त किया जा सकता है. जबकि जीआरएमपी की एक प्रभावशाली सूची विकसित की गई है, जिसमें अब वाणिज्यिक स्रोतों से उपलब्ध है, प्रकृति में मौजूद ग्लाइकन संरचनाओं की विविधता के सापेक्ष, केवल एक छोटा सा अनुपात उत्पादित किया गया है और सफलतापूर्वक58 की विशेषता है। यह कुछ संरचनाओं के बीच पता लगाने और भेदभाव करने की क्षमता को सीमित कर सकता है। यह प्रत्येक प्रमुख glycan संरचना के एक या दो जांच प्रतिनिधि मौजूद होने के लिए प्रत्याशित, जिसके लिए बाध्यकारी विशिष्टता अच्छी तरह से विशेषता है का उपयोग कर एक प्रारंभिक जांच प्रयोग प्रदर्शन करने के लिए सलाह दी जाती है. बाद के जांच प्रयोगों में, जांच सूची glycans की एक विस्तृत रेंज को कवर करने और ठीक संरचनाओं में गहराई से तल्लीन करने के लिए विस्तार किया जा सकता है.

हालांकि सांसारिक, यह सुनिश्चित करना कि प्रत्येक इनक्यूबेशन चरण के बाद माइक्रोएरे को अच्छी तरह से धोया जाता है, जांच प्रक्रिया की सफलता के लिए मौलिक है। गैर-विशेष रूप से बाध्य जांच के अप्रभावी हटाने से रंग विकास के बाद एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत पैदा करके परिणाम को अस्पष्ट करने की संभावना है। इस मामले में, एक नए माइक्रोएरे से शुरू होने वाली जांच प्रक्रिया को दोहराना आवश्यक है। इसके अलावा, सरणियों संयम से छुआ जाना चाहिए और केवल संदंश के साथ किनारों पकड़कर; नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली भंगुर और आसानी से क्षतिग्रस्त होती है। रंग विकास समाधान दरारें और क्रीज में इकट्ठा होता है, जिससे अतिसंतृप्ति होती है, जो सरणी विश्लेषण को बाधित करती है।

एमएपीपी त्वरित, अनुकूलनीय और सुविधाजनक है। यह विधि किसी भी जैविक या औद्योगिक प्रणाली से प्राप्त पशु, माइक्रोबियल, या पौधे ग्लाइकान के साथ संगत है, जब तक कि उन्हें नाइट्रोसेल्यूलोज पर निकाला और स्थिर किया जा सकता है, और जिसके लिए किसी के पास उपयुक्त आणविक जांच है। उत्पन्न डेटा विस्तृत, अर्ध-मात्रात्मक, रचनात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जिसे अन्य ग्लाइकन विश्लेषण विधियों के माध्यम से आसानी से प्राप्त नहीं किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक माइक्रोएरे रोबोटिक्स के बारे में उनकी विशेषज्ञ सलाह के लिए ArrayJet को स्वीकार करना चाहते हैं। एसएस और जेएस फंडामेंटल फंड 2022 (एफएफ 65/004), चियांग माई विश्वविद्यालय से समर्थन को स्वीकार करना चाहेंगे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) Megazyme P-LICHN
1,4-β-D-Mannan Megazyme P-MANCB
384-well microtiter plate Greiner Bio-One M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) Melford B74100-1.0
Acetone Sigma 270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag Jackson ImmunoResearch 300-055-240
Arabinoxylan (wheat) Megazyme P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software Media Cybernetics Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) NZYTech CZ0564
BAM antibodies SeaProbes Various
Black drawing ink (indian ink) Winsor & Newton GWD030
Carbohydrate binding modules NZYTech Various
CCRC antibodies CarboSource Various
CDTA Sigma 319945
Chloroform Sigma PHR1552
Ethanol Sigma 1.11727
Galactan (potato) Megazyme P-GALPOT
Galactomannan (carob) Megazyme P-GALML
Glycerol solution Sigma 49781-5L
Gum tragacanth (legumes) Sigma-Aldrich G1128
INCh antibodies INRA Various
LM and JIM antibodies PlantProbes Various
Marathon Argus Microarray Printer ArrayJet
Methanol Sigma  34860
Monoclonal antibodies Biosupplies Australia Various
NaBH4 Sigma 452882
NaOH Sigma S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT) Melford N66000-1.0
Nitrocellulose membrane Thermo Fisher Scientific 88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%) Danisco NA
ProClin 200 Sigma 48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) Megazyme P-RHAGN
Rotating mixer Fisher Scientific 88-861-050
Rotating/rocking Shaker Cole-Parmer
Skimmed milk powder Marvel
Spin filter Costar Spin-X 8160
Stainless steel beads Qiagen 69989
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris Sigma 93362
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Xylan (beechwood) Megazyme P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind) Megazyme P-XYGLN
β-Glucan (oat) Megazyme P-BGOM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amicucci, M. J., et al. A nonenzymatic method for cleaving polysaccharides to yield oligosaccharides for structural analysis. Nature Communications. 11 (1), 3963 (2020).
  2. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Evolution of glycan diversity. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  3. Willats, W. G. T., McCartney, L., Knox, J. P. Pectin cell biology: complexity in context. Advances in Pectin and Pectinase Research. , Springer. Netherlands. 147-157 (2003).
  4. Cummings, R. D., et al. Glycan-recognizing probes as tools. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  5. Bakshani, C. R., et al. Analysis of glycans in a Burnt-on/Baked-on (BoBo) model food soil using Microarray Polymer Profiling (MAPP) and immunofluorescence microscopy. Food Chemistry. 410, 135379 (2023).
  6. Salmeán, A. A., Willats, W. G. T., Ribeiro, S., Andersen, T. J., Ellegaard, M. Over 100-year preservation and temporal fluctuations of cell wall polysaccharides in marine sediments. Frontiers in Plant Science. 13, 785902 (2022).
  7. Cid, M., et al. Recognition of the helical structure of β-1,4-galactan by a new family of carbohydrate-binding modules. Journal of Biological Chemistry. 285 (46), 35999-36009 (2010).
  8. Runavot, J. -L., et al. Non-cellulosic polysaccharides from cotton fibre are differently impacted by textile processing. PLoS One. 9 (12), e115150 (2014).
  9. Ahl, L. I., et al. Analyses of aloe polysaccharides using carbohydrate microarray profiling. Journal of AOAC International. 101 (6), 1720-1728 (2018).
  10. Vidal-Melgosa, S., et al. Diatom fucan polysaccharide precipitates carbon during algal blooms. Nature Communications. 12 (1), 1150 (2021).
  11. Moller, I., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant Journal. 50 (6), 1118-1128 (2007).
  12. Ruprecht, C., et al. A synthetic glycan microarray enables epitope mapping of plant cell wall glycan-directed antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  13. Cummings, R. D., et al. Principles of glycan recognition. Essentials of Glycobiology [Internet]. 4th edition. , (2022).
  14. Gao, C., et al. Glycan microarrays as chemical tools for identifying glycan recognition by immune proteins. Frontiers in Chemistry. 7, 833 (2019).
  15. Vidal-Melgosa, S., et al. A new versatile microarray-based method for high throughput screening of carbohydrate-active enzymes. Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9020-9036 (2015).
  16. Willats, W. G. T., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: A novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  17. Sørensen, I., et al. The charophycean green algae provide insights into the early origins of plant cell walls. The Plant Journal. 68 (2), 201-211 (2011).
  18. Liu, D., Tang, W., Yin, J. -Y., Nie, S. -P., Xie, M. -Y. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development. Food Hydrocolloids. 116, 106641 (2021).
  19. Pattathil, S., et al. A comprehensive toolkit of plant cell wall glycan-directed monoclonal antibodies. Plant Physiology. 153 (2), 514-525 (2010).
  20. Verhertbruggen, Y., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. The Plant Journal. 59 (3), 413-425 (2009).
  21. Rydahl, M. G., et al. Development of novel monoclonal antibodies against starch and ulvan - implications for antibody production against polysaccharides with limited immunogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 9326 (2017).
  22. McCartney, L., Marcus, S. E., Knox, J. P. Monoclonal antibodies to plant cell wall xylans and arabinoxylans. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (4), 543-546 (2005).
  23. Marcus, S. E., et al. Pectic homogalacturonan masks abundant sets of xyloglucan epitopes in plant cell walls. BMC Plant Biology. 8, 60 (2008).
  24. Pedersen, H. L., et al. Versatile high resolution oligosaccharide microarrays for plant glycobiology and cell wall research. The Journal of Biological Chemistry. 287 (47), 39429-39438 (2012).
  25. Marcus, S. E., et al. Restricted access of proteins to mannan polysaccharides in intact plant cell walls. The Plant Journal. 64 (2), 191-203 (2010).
  26. Smallwood, M., Martin, H., Knox, J. P. An epitope of rice threonine-and hydroxyproline-rich glycoprotein is common to cell wall and hydrophobic plasma-membrane glycoproteins. Planta. 196 (3), 510-522 (1995).
  27. Smallwood, M., Yates, E. A., Willats, W. G. T., Martin, H., Knox, J. P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabinogalactan-proteins in rice and carrot. Planta. 198 (3), 452-459 (1996).
  28. Wisniewski, J. P., Rathbun, E. A., Knox, J. P., Brewin, N. J. Involvement of diamine oxidase and peroxidase in insolubilization of the extracellular matrix: implications for pea nodule initiation by Rhizobium leguminosarum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13 (4), 413-420 (2000).
  29. Jones, L., Seymour, G. B., Knox, J. P. Localization of pectic galactan in tomato cell walls using a monoclonal antibody specific to (1[->]4)-β-D-galactan. Plant Physiology. 113 (4), 1405-1412 (1997).
  30. Willats, W. G., Marcus, S. E., Knox, J. P. Generation of a monoclonal antibody specific to (1→5)-α-L-arabinan. Carbohydrate Research. 308 (15), 149-152 (1998).
  31. Cornuault, V., et al. LM6-M: a high avidity rat monoclonal antibody to pectic α-1, 5-L-arabinan. BioRxiv. , 161604 (2017).
  32. Sutherland, P., Hallett, I., Jones, M. Probing cell wall structure and development by the use of antibodies: a personal perspective. New Zealand Journal of Forestry Science. 39, 197-205 (2009).
  33. Mikkelsen, M. D., et al. Ancient origin of fucosylated xyloglucan in charophycean green algae. Communications Biology. 4 (1), 754 (2021).
  34. Fangel, J. U., Jones, C. Y., Ulvskov, P., Harholt, J., Willats, W. G. T. Analytical implications of different methods for preparing plant cell wall material. Carbohydrate Polymers. 261, 117866 (2021).
  35. Moore, J. P., et al. Analysis of plant cell walls using high-throughput profiling techniques with multivariate methods. The Plant Cell Wall: Methods and Protocols. , Springer. New York. 327-337 (2020).
  36. Gao, Y., Fangel, J. U., Willats, W. G. T., Moore, J. P. Tracking polysaccharides during white winemaking using glycan microarrays reveals glycoprotein-rich sediments. Food Research International. 123, 662-673 (2019).
  37. Solden, L. M., et al. Interspecies cross-feeding orchestrates carbon degradation in the rumen ecosystem. Nature Microbiology. 3 (11), 1274-1284 (2018).
  38. Fangel, J. U., et al. Tracking polysaccharides through the brewing process. Carbohydrate Polymers. 196, 465-473 (2018).
  39. Mravec, J., et al. Pea border cell maturation and release involve complex cell wall structural dynamics. Plant Physiology. 174 (2), 1051-1066 (2017).
  40. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. New York. NY. (2009).
  41. Gu, Z. Complex heatmap visualization. iMeta. 1 (3), 43 (2022).
  42. Nasrollahzadeh, M., Nezafat, Z., Shafiei, N., Soleimani, F. Polysaccharides in Food Industry. , Elsevier. Iran. (2021).
  43. Shao, P., et al. Recent advances in improving stability of food emulsion by plant polysaccharides. Food Research International. 137, 109376 (2020).
  44. Sanz, M. L., Martínez-Castro, I. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates. Journal of Chromatography. A. 1153 (1-2), 74-89 (2007).
  45. Bethke, G., Glazebrook, J. Cyclohexane diamine tetraacetic acid (CDTA) extraction of plant cell wall pectin. Bio-Protocol. 4 (24), e1357 (2014).
  46. Lu, Y., He, Q., Fan, G., Cheng, Q., Song, G. Extraction and modification of hemicellulose from lignocellulosic biomass: A review. Green Processing and Synthesis. 10 (1), 779-804 (2021).
  47. Jayasekara, S., Ratnayake, R. Microbial cellulases: an overview and applications. Cellulose. 22, 92 (2019).
  48. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., Ordaz-Ortiz, J. J., Knox, J. P. An extended set of monoclonal antibodies to pectic homogalacturonan. Carbohydrate Research. 344 (14), 1858-1862 (2009).
  49. Villares, A., Mateo-Vivaracho, L., Guillamón, E. Structural features and healthy properties of polysaccharides occurring in mushrooms. Agriculture. 2 (4), 452-471 (2012).
  50. Kračun, S. K., et al. Carbohydrate microarray technology applied to high-throughput mapping of plant cell wall glycans using comprehensive microarray polymer profiling (CoMPP). Methods in Molecular Biology. 1503, 147-165 (2017).
  51. Rajasundaram, D., et al. Understanding the relationship between cotton fiber properties and non-cellulosic cell wall polysaccharides. PLoS One. 9 (11), e112168 (2014).
  52. Michalak, L., et al. Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut. Nature Communications. 11 (1), 5773 (2020).
  53. Salmeán, A. A., Hervé, C., Jørgensen, B., Willats, W. G., Mravec, J. Microarray glycan profiling reveals algal fucoidan epitopes in diverse marine metazoans. Frontiers in Marine Science. 4, 293 (2017).
  54. Knox, J. P. Revealing the structural and functional diversity of plant cell walls. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 308-313 (2008).
  55. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17-23 (2007).
  56. Stephen, P., Tseng, K. -L., Liu, Y. -N., Lyu, P. -C. Circular permutation of the starch-binding domain: inversion of ligand selectivity with increased affinity. Chemical Communications. 48 (20), 2612-2614 (2012).
  57. Gunnarsson, L. C., Dexlin, L., Karlsson, E. N., Holst, O., Ohlin, M. Evolution of a carbohydrate binding module into a protein-specific binder. Biomolecular Engineering. 23 (2-3), 111-117 (2006).
  58. Moller, I., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchical clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25 (1), 37-48 (2008).

Tags

माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (एमएपीपी) उच्च-थ्रूपुट ग्लाइकन विश्लेषण ग्लाइकान ग्लाइकोकोनजुगेट्स जैविक नमूने पौधे के ऊतक अल्गल ऊतक खाद्य सामग्री मानव नमूने पशु नमूने माइक्रोबियल नमूने माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म ग्लाइकन-निर्देशित आणविक जांच विश्लेषण रासायनिक अंश एंजाइमी अंश नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली ग्लाइकन संरचना ग्लाइकन-पहचानने वाले आणविक जांच पारंपरिक ग्लाइकन विश्लेषण तकनीक मोनोसैकराइड विश्लेषण लिंकेज विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री
उच्च-थ्रूपुट ग्लाइकन विश्लेषण के लिए माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (एमएपीपी)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bakshani, C. R., Sangta, J.,… More

Bakshani, C. R., Sangta, J., Sommano, S., Willats, W. G. T. Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis. J. Vis. Exp. (199), e65443, doi:10.3791/65443 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter