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Biology

Perfil de polímero de microarray (MAPP) para análise de glicanos de alto rendimento

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65443
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1
1Department of Biology, School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Institute of Microbiology and Infection, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3Department of Plant and Soil Sciences, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University

Summary

Microarray polymer profiling (MAPP) é uma técnica de alto rendimento para análise composicional de glicanos em amostras biológicas.

Abstract

Microarray polymer profiling (MAPP) é uma abordagem robusta e reprodutível para determinar sistematicamente a composição e abundância relativa de glicanos e glicoconjugados dentro de uma variedade de amostras biológicas, incluindo tecidos vegetais e algais, materiais alimentares e amostras humanas, animais e microbianas. A tecnologia de microarrays sustenta a eficácia deste método fornecendo uma plataforma de triagem miniaturizada e de alto rendimento, permitindo que milhares de interações entre glicanos e sondas moleculares direcionadas a glicanos altamente específicas sejam caracterizadas concomitantemente, usando apenas pequenas quantidades de analitos. Os glicanos constituintes são fracionados química e enzimaticamente, antes de serem extraídos sequencialmente da amostra e imobilizados diretamente em membranas de nitrocelulose. A composição do glicano é determinada pela ligação de sondas moleculares específicas que reconhecem glicanos às moléculas extorquidas e impressas. O MAPP é complementar às técnicas convencionais de análise de glicanos, como análise de monossacarídeos e ligações e espectrometria de massas. No entanto, sondas moleculares que reconhecem glicanos fornecem informações sobre as configurações estruturais dos glicanos, o que pode ajudar a elucidar interações biológicas e papéis funcionais.

Introduction

Os glicanos são onipresentes em todos os domínios da vida e exibem uma diversidade incomparável em estrutura e função em comparação com outras macromoléculas1. No entanto, devido à sua complexidade, variabilidade na biossíntese e ligações glicosídicas, e a escassez de métodos apropriados para dissecar estruturas glicânicas, nossa compreensão dessa diversidade em estruturas e funções é relativamente limitada2.

Muitas técnicas de análise de glicanos são destrutivas e requerem a decomposição dos glicanos em seus monossacarídeos constituintes, o que pode obscurecer contextos tridimensionais e biológicos relevantes3. Por outro lado, anticorpos monoclonais (mAbs), módulos de ligação a carboidratos (CBMs), lectinas, aglutininas virais e adenas microbianas, conhecidas coletivamente como sondas moleculares de reconhecimento de glicano (GRMPs)4, reconhecem e se ligam a epítopos específicos e podem ser usados como ferramentas para detectar e discriminar glicanos dentro de matrizes multiglicânicas complexas 5,6.

Aqui, apresentamos o perfil polimérico de microarranjos (MAPP), um método rápido, versátil e não destrutivo para análise de glicanos que é aplicável a um amplo espectro de amostras biológicas. O método visa fornecer uma tecnologia robusta e de alto rendimento para análise de glicanos de diversos sistemas biológicos e industriais/comerciais. O MAPP une a especificidade de reconhecimento de sondas moleculares direcionadas a glicanos com a tecnologia de triagem de microarrays reprodutível e de alto desempenho para permitir que milhares de interações moleculares sejam perfiladas em paralelo. O resultado dessa abordagem é a compreensão diagnóstica sobre a composição e abundância relativa de glicanos dentro de uma amostra ou tecido de interesse.

O MAPP pode ser utilizado como método independente, isolado ou em conjunto com outras técnicas bioquímicas, como a microscopia de imunofluorescência 7,8,9 e a análise de monossacarídeos ou ligações10,11. A técnica também pode ser usada para mapear especificidades de epítopos de novos GRMPs, usando matrizes impressas com padrões de oligossacarídeos puros e estruturalmente bemdefinidos12. Uma grande vantagem do MAPP sobre outros métodos, como o ensaio imunoenzimático (ELISA), é sua compatibilidade com pequenos volumes de amostra13,14. Além disso, o MAPP oferece análise de rendimento significativamente maior15 e fornece uma forma eficaz de preservação da amostra, pois as amostras impressas são secas e estáveis quando imobilizadas em nitrocelulose16.

A ligação de GRMPs é geralmente dependente da presença de um número de resíduos de açúcar contíguos que coletivamente formam um sítio de ligação (epítopo) que é exclusivo de uma classe particular de polissacarídeos (xilana, manana, xiloglucano, etc.) 17. Em contraste, os resíduos individuais de açúcar (xilose, manose, glicose) que são quantificados usando a maioria das técnicas bioquímicas, por exemplo, composição de monossacarídeos ou análise de metilação, podem ser componentes de múltiplas classes de polissacarídeos e, portanto, difíceis de atribuir18.

O MAPP foi desenvolvido em resposta a uma lacuna tecnológica, ou seja, a capacidade de analisar rapidamente múltiplos glicanos de uma variedade de fontes usando pequenas quantidades de material. O MAPP capitaliza o extenso repertório de GRMPs que vem sendo desenvolvido e caracterizado ao longo das últimas três décadas 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. O desenvolvimento do MAPP tem sido um processo iterativo, com a técnica sendo constantemente refinada e otimizada. Atualmente, existe uma vasta literatura descrevendo a aplicação do MAPP em vários sistemas naturais e industriais, onde os glicanos desempenham papéis centrais 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Aqui, descrevemos o estado atual da arte do MAPP.

Protocol

As principais etapas experimentais do método MAPP estão resumidas na Figura 1.

1. Preparação das amostras

NOTA: Aqui, o método é aplicado aos tecidos vegetais para fins ilustrativos. As plantas selecionadas foram Coffea arabica, Allium sativum var. As plantas foram selecionadas por sua importância comercial. Seu processamento para consumo humano gera resíduos agroindustriais atualmente subutilizados, que podem fornecer uma fonte de produtos de valor agregado, incluindo glicanos puros. Assim, o MAPP foi aplicado para caracterizar a composição glicânica da biomassa do resíduo vegetal para fins de bioprospecção.

  1. Separe o material vegetal em diferentes tecidos (por exemplo, raiz, caule e folhas).
  2. Secar os tecidos vegetais em estufa a 40 °C durante 12-24 h (diminuir/aumentar o tempo de acordo com a amostra). Alternativamente, congele rapidamente as amostras em nitrogênio líquido e, posteriormente, liofilize por ~4 dias.
  3. Homogeneizar as amostras para um pó fino utilizando um pilão e argamassa ou um lisador mecânico de tecidos (ver Tabela de Materiais) com um rolamento de esferas em cada tubo.
    NOTA: Para tecidos vegetais frescos, recomenda-se a secagem ou liofilização antes da homogeneização. Geralmente, a homogeneização com pilão e argamassa é suficiente para a maioria das amostras secas. Para amostras particularmente resistentes, como grãos, leguminosas e alimentos processados, como massas, o congelamento instantâneo em nitrogênio líquido pode aumentar a velocidade e a eficiência da homogeneização da amostra. Descobrimos que a homogeneização mecânica é compatível com quase todos os tipos de amostra, é consideravelmente mais rápida e menos trabalhosa, e efetivamente minimiza o risco de contaminação cruzada da amostra pelo uso repetido do mesmo equipamento (i.e., pilão e argamassa).

2. Preparação de resíduo insolúvel em álcool (AIR)

  1. Adicionar 1,5 mL de etanol a 70% (v/v) a 50-100 mg de material de amostra seco ao ar e homogeneizado.
  2. Vórtice completamente para misturar e, em seguida, centrifugar a 10.000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante resultante usando uma pipeta e retenha o pellet.
  3. Ao restante do pellet, adicionar 1,5 mL de metanol e clorofórmio (1:1 [v/v]). Vórtice, centrífuga e descarte o sobrenadante, conforme etapa 2.2.
  4. Ao restante do pellet, adicionar 1,5 mL de acetona a 100%. Vórtice, centrífuga e descarte o sobrenadante, conforme etapa 2.2.
  5. Coloque o pellet resultante durante a noite em um exaustor para permitir que a acetona residual evapore ou em uma centrífuga a vácuo até secar.
    NOTA: O material AIR pode ser armazenado à temperatura ambiente até que seja necessário.

3. Extração de glicanos

NOTA: Se possível, execute todas as etapas de extração em um lisador de tecido com um rolamento de esferas em cada tubo para ajudar na ressuspensão. Se um lisador de tecido não estiver disponível, as extrações podem ser realizadas com agitação ou agitação contínuas. Pode ser necessário estender o tempo de extração se isso não for possível.

  1. A 10 mg de material AIR, adicionar 30 μL/mg de ácido ciclohexanodiaminotetracético 50 mM (CDTA; ver Tabela de Materiais), pH 7,5.
  2. Agitar a 27 Hz por 2 min, seguido de 10 Hz por 2 h.
  3. Centrifugar a 10.000 x g por 10 min a 4 °C. Retenha o sobrenadante resultante, adicione-o a um tubo de microcentrífuga estéril e armazene-o a 4 °C num agitador rotativo.
  4. Ao pellet residual, adicionar 30 μL/mg de NaOH 4 M + NaBH a 0,1 % (p/v)4.
    CUIDADO: NaBH4 é tóxico se ingerido. Use equipamentos de proteção individual (EPIs). Alça sob um exaustor. Evite a formação de poeira. Evite respirar poeira. Não permita que o produto entre em contato com a água.
  5. Repita as etapas 3.2 a 3.3. Lavar o pellet residual duas ou três vezes com dH2O para remover o NaOH residual.
  6. Adicionar 30 μL/mg de celulase (de preferência GH5 endo-1,4-β-glucanase, em tampão enzimático adequado, conforme recomendado pelo fabricante; ver Tabela de Materiais) ao pellet e incubar à temperatura ótima da enzima por 16 h.
  7. Centrifugar as amostras a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Retenha o sobrenadante, transfira para tubos de microcentrífuga limpos e armazene a 4 °C em um agitador rotativo. Uma vez extraídas, as amostras devem ser impressas o mais rapidamente possível.
  8. Centrifugar novamente todos os extractos armazenados a 10 000 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: As amostras devem estar isentas de partículas e detritos. Passe por um filtro de spin de 0,2 μm antes da impressão do microarray, se necessário. Amostras particularmente viscosas são incompatíveis com a análise de microarrays, pois os capilares do microarrayer e a cabeça de impressão podem ficar facilmente entupidos. Regra geral, os utilizadores devem poder pipetar todas as amostras destinadas à impressão com uma pipeta padrão de baixo volume.

4. Elaboração de normas

  1. Preparar soluções de 1 mg/mL de padrões glicanos definidos (Tabela 1) em dH2O estéril. Se usar paquiman como padrão, dissolver em NaOH 4 M em vez disso e neutralizar com ácido acético glacial após solubilização.
  2. Conservar os padrões preparados durante a noite a 4 °C num agitador rotativo para permitir a solubilização completa.
  3. Centrifugar todos os padrões por 10 min a 10.000 x g a 4 °C para pellet quaisquer detritos. O sobrenadante resultante é usado para impressão subsequente.

5. Impressão de microarray

  1. Preparar uma diluição de 1:20 (v/v) de tinta indiana preta/tinta de desenho em tampão do sistema de glicerol (GSB; combinar 47% glicerol, 52,9% dH2O, 0,06% Triton X-100 e 0,04% biocida [0,15%-0,17% nitrato cúprico e 1,4%-2,0% nitrato de magnésio em água] e esterilizar o filtro) (ver Tabela de Materiais) e centrifugar por 10 min a 15.000 x g (temperatura ambiente).
    NOTA: A solução de tinta é necessária para criar uma borda superior e inferior ao redor das amostras impressas, para que os microarrays impressos possam ser detectados visualmente na membrana. No entanto, é provável que a solução de tinta contenha sedimentos. Todas as soluções devem estar isentas de partículas para impressão, por isso evite perturbar o sedimento durante a pipetagem. Descarte e prepare fresco quando isso não for mais possível. A solução não pode ser facilmente filtrada para remover partículas.
  2. Adicionar 40 μL de solução de tinta e GSB à primeira seção da primeira placa de 384 poços (Figura 2).
  3. Adicionar 25 μL de GSB a todos os poços de diluição 1 (D1). Adicionar 40 μL de GSB a todos os poços de diluição 2, 3 e 4 (D2-D4).
  4. Diluir as amostras de glicano extraídas e os substratos glicanos definidos 1:1 (v/v) com GSB adicionando 25 μL de amostra de glicano extraída aos poços D1 em ordem.
  5. Diluir serialmente cada amostra quatro vezes, retirando 10 μL da amostra do poço D1 e adicionando ao poço D2. Aspirar suavemente com uma pipeta para misturar.
  6. Repita o processo retirando 10 μL de amostra do poço D2 e adicionando-a ao poço D3.
  7. Repita bem para o D4. Após a mistura, descarte 10 μL do poço D4 para que cada poço contenha um volume final de 40 μL.
  8. Adicionar 40 μL de solução de tinta e GSB ao bloco final da placa final.
  9. Cubra as placas com uma tampa de placa adesiva e centrífuga por 10 min a 3.000 x g (temperatura ambiente). Certifique-se de que nenhuma bolha permaneça após a centrifugação e repita se necessário.
  10. Usando um robô de impressão de microarray piezoelétrico sem contato, imprima as amostras na membrana de nitrocelulose (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as etapas abaixo.
    NOTA: Abaixo estão as ações recomendadas para uma ótima qualidade de impressão; no entanto, os parâmetros específicos necessários dependerão, em última instância, do instrumento utilizado. Recomendamos que os usuários entrem em contato com o fabricante do instrumento para discutir as personalizações apropriadas e as configurações de impressão necessárias para seu dispositivo.
    1. Antes da impressão, esvazie o reservatório tampão de resíduos e encha o reservatório tampão limpo com GSB limpo, conforme necessário. Ligue o instrumento e deixe-o estabilizar por >10 min se tiver um sistema integrado de controle de umidade e temperatura. Ligue o microarrayer e inicialize o sistema.
      NOTA: Recomenda-se a execução de um teste para determinar a pressão interna do instrumento. Se a pressão for muito baixa, pode ser necessário realizar uma purga de alta pressão. Novamente, entre em contato com o fabricante do instrumento para discutir o funcionamento específico do instrumento específico.
    2. Limpe a cabeça de impressão e os capilares várias vezes com GSB para remover detritos e potenciais contaminantes. Execute uma execução de impressão de teste carregando uma placa de GSB sozinha ou configurando o instrumento para imprimir diretamente do reservatório de buffer limpo, ignorando a aspiração da amostra de uma placa carregada.
      OBS: Não é necessário realizar a impressão do teste utilizando membrana de nitrocelulose; Lâminas limpas de microscópio são suficientes e oferecem a vantagem de que o tamanho, a forma e a qualidade do ponto podem ser avaliados visualmente antes da impressão da amostra.
    3. Ao imprimir amostras de glicano extraídas, programe o sistema para lavar com GSB limpo entre cada amostra.
      NOTA: Normalmente, o volume de amostra por ponto impresso é de 100 pL a 10 nL, e o tamanho do spot varia de 20 μm a 100 μm, dependendo do volume de amostra selecionado. A impressão de 100 microarrays a partir de uma placa de 384 poços de fonte leva aproximadamente 40 minutos, incluindo a descarga do sistema. Os microarrays resultantes terão aproximadamente 1cm2 de tamanho. Placas adicionais aumentarão o comprimento da matriz em aproximadamente 1 cm por placa. Um esquema do projeto de microarray impresso é mostrado na Figura 3. Uma vez impressos, os microarrays estão prontos para uso imediato e podem ser armazenados por vários anos. Se o trabalho de impressão precisar ser repetido por qualquer motivo, devido à potencial evaporação das amostras durante a impressão, recomenda-se que uma nova placa de amostra seja carregada e a placa original descartada.
    4. Uma vez por semana, limpe bem a cabeça de impressão e os capilares. Faça isso carregando um poço de 384 contendo uma diluição de 1:20 de NaOH concentrado em GSB e execute uma impressão de 40 min a 1 h em lâminas de microscópio. Os utilizadores devem certificar-se de que esta solução de limpeza é compatível com o seu instrumento antes de prosseguir.
  11. Salve o arquivo de grade exclusivo (arquivo .gal) produzido para o microarray impresso pronto para análise downstream.

6. Sondagem de microarrays

  1. Recorte microarrays impressos individuais e idênticos da membrana de nitrocelulose e coloque-os em um recipiente de tamanho apropriado para sondagem (por exemplo, uma placa de microtitulação de 12 ou 24 poços) (consulte a Tabela de Materiais). A matriz deve ficar plana na base do vaso. Um microarray é necessário por teste e representa uma réplica técnica.
  2. Para reduzir a ligação inespecífica, incubar os microarrays por 1 h em tampão de bloqueio MP-TBST (1x solução salina tamponada com Tris, pH 7,5, + 0,1% [v/v] TWEEN 20 [TBST] e suplementado com 5% [p/v] de leite em pó desnatado; ver Tabela de Materiais) em um agitador rotativo/balanço. Certifique-se de que o volume seja suficiente para submergir todo o array.
  3. Após a incubação, remova o MP-TBST e substitua-o por um novo volume de MP-TBST.
  4. Incubar as matrizes com anticorpos monoclonais (mAbs) ou CBMs marcados com His, ou outros GRMPs (por exemplo, lectinas), diluídos 1:10-1:1.000 (conforme especificado pelo fabricante; ver Tabela de Materiais) em MP-TBST por 2 h em um agitador rotativo/de balanço.
  5. Após a incubação, remova a solução de sonda molecular e cubra as matrizes em TBST limpo, garantindo que as matrizes estejam totalmente submersas. Para remover a solução de sonda residual, remova imediatamente o TBST e substitua por um volume fresco. Coloque as matrizes em um agitador giratório/oscilante por 5 min. Após 5 min, retire o TBST, substitua por um volume fresco e coloque em um agitador giratório/balanciador por 5 min.
    NOTA: Este processo deve ser repetido três vezes, não incluindo a adição inicial e remoção imediata de TBST.
  6. Incubar as matrizes com anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina (anti-rato, anti-rato, anti-coelho, anti-His, conforme apropriado; ver Tabela de Materiais) diluídos 1:1.000 em MP-TBST por 2 h em um agitador de balanço/rotação.
    NOTA: Anticorpos secundários conjugados à peroxidase de raiz forte também são adequados, usados em conjunto com substrato tetrametilbenzidina (TMB)/peróxido de hidrogênio para o desenvolvimento de cores.
  7. Após a incubação, repetir o procedimento de lavagem, de acordo com o passo 6.5, para remover anticorpos secundários não especificamente ligados.
  8. Cubra as matrizes em solução de desenvolvimento de cor de tetrazólio nitro-azul (NBT)/5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) (ver Tabela de Materiais) para a detecção cromogênica da ligação de anticorpos. Deixe até que manchas de precipitação roxas se desenvolvam nos locais de ligação ao antígeno (tipicamente 5-30 min, no entanto, as matrizes devem ser monitoradas de perto para evitar a saturação excessiva, pois a reação pode ocorrer rapidamente).
    CUIDADO: O BCIP é prejudicial quando em contato com a pele e pode causar irritação respiratória. Use EPI. Evite a formação de poeira. Evite respirar poeira.
  9. Para terminar a reação, submerja as matrizes em água limpa da torneira e lave extensivamente.
  10. Coloque as matrizes entre o papel manchado durante a noite à temperatura ambiente para secar.
  11. Descarte as matrizes com defeitos óbvios e repita o protocolo de sondagem nessas instâncias (Figura 4).

7. Análise e quantificação

  1. Digitalize os arrays desenvolvidos em uma resolução de 2.400 pontos por polegada (dpi) usando um scanner de mesa. Converta as imagens em arquivos TIFF e, em seguida, em negativos.
  2. Usando software de análise de microarray (consulte Tabela de Materiais), sobreponha o arquivo de grade .gal exclusivo em cada imagem de microarray para calcular a intensidade de cor do ponto produzido em cada local de ligação de antígeno e subtrair o plano de fundo local.
  3. Exporte os dados da grade como um arquivo .txt. Eles podem então ser importados manualmente para uma planilha do Excel para análise.
  4. Gere um valor médio de intensidade de sinal pontual para cada amostra calculando a média da intensidade pontual primeiro em cada diluição da amostra e, em seguida, em todas as réplicas biológicas incluídas.
  5. Atribua um valor de 100 à maior intensidade média de sinal de ponto e normalize os dados restantes de acordo.
    NOTA: As intensidades médias normalizadas do sinal do ponto podem então ser apresentadas como um mapa de calor da abundância relativa de epítopos glicanos usando a função de formatação condicional no Excel33 ou usando a função geom_tile no pacote R ggplot240,41.

Representative Results

O MAPP foi aplicado para determinar a composição glicânica de resíduos de biomassa agrícola, compreendendo cascas de manga de várias variedades do norte da Tailândia, polpa de cereja de Coffea arabica e resíduos do processamento de grãos de café, e tecidos de raiz, caule e folha de alho preto tailandês, Allium sativum var. Vários polissacarídeos de origem vegetal são utilizados na indústria de alimentos como ingredientes funcionais 42,43. Assim, o objetivo deste experimento foi deduzir se esses resíduos agroindustriais, abundantes e atualmente subutilizados, podem fornecer uma fonte de polissacarídeos puros de valor agregado.

O material AIR é rotineiramente empregado na preparação de amostras destinadas à análise glicana44. Existem várias vantagens em usar o AIR; o tratamento com solventes remove efetivamente CAZymes endógenos, metabólitos, pequenos sacarídeos, lipídios e pigmentos, resultando em amostras enriquecidas com polissacarídeos e proteínas estruturais34. Além disso, a produção de AIR é uma maneira rápida e eficaz de aumentar a longevidade da amostra, pois é termoestável e pode ser armazenada por vários anos.

Três frações mistas de glicanos constituintes foram sequencialmente extraídas do material AIR vegetal usando CDTA, NaOH e celulase. CDTA quelatos Ca2+ íons, que permitem a remoção de Ca2+ reticulado pectinas desesterificadas da parede celular vegetal45. Condições alcalinas permitem que predominantemente hemiceluloses, como manana, xilana e β-glucano, sejam liberadas devido à ruptura da ligação de hidrogênio e saponificação de ligações ésteres entre microfibrilas de celulose e hemicelulose, e lignina e hemicelulose, respectivamente46. Uma endo-1,4-β-glucanase recombinante de Bacillus spp foi utilizada para degradar regiões amorfas das microfibrilas estruturais de celulose, liberando glicanos residuais ligados à celulose dentro das paredes celulares47. Embora este método efetivamente separe os glicanos nesses três grandes grupos, deve-se notar que as amostras não são puras; Pela própria natureza do método de extração, a hemicelulose, se presente na amostra, será inevitavelmente extraída e subsequentemente detectada em graus variados nas frações CDTA e celulase. Da mesma forma, alguma pectina será detectada na extração de NaOH se presente na amostra.

Um robô de impressão de microarrays piezoelétricos sem contato foi usado para imobilizar as frações glicânicas extraídas em nitrocelulose via acessório não covalente11, formando 300 microarrays idênticos. Os padrões glicanos definidos (Tabela 1) também foram incluídos nos microarrays impressos como controles positivos (Figura 5). O perfil de ligação do MAPP obtido para os padrões glicanos selecionados corresponde às especificidades de epítopos previamente relatadas. Por exemplo, LM21 exibiu forte ligação a múltiplos mananpolissacarídeos (galactomanana e glucomanana), enquanto LM22 exibiu apenas ligação fraca a galactomanana25. Da mesma forma, LM19 preferencialmente ligado a homogalacturonano48 desesterificado e LM15 ligado a xiloglucano de semente de tamarindo23.

A abundância relativa de 16 epítopos, diagnósticos de polissacarídeos não celulósicos da parede celular vegetal, foi detectada pela ligação de anticorpos monoclonais dirigidos ao glicano (Tabela 2) aos extratos impressos (Figura 6). A maioria dos glicanos extraídos foi detectada dentro da fração alcalina de NaOH. Fortes sinais de ligação foram registrados para mAbs LM10 e LM11, representando xilana/arabinoxilano, dentro das cascas de todas as variedades de manga testadas. Dentro das amostras de alho, LM10 e LM11 ligaram-se preferencialmente ao extrato de tecido radicular (Alho R) e exibiram apenas fraca ligação ao extrato de tecido foliar (Alho L). LM19, representando homogalacturonan parcialmente metil-esterificado ou não-esterificado, ligado fortemente a alguns extratos de variedades de manga (Aokrong e Talabnak), mas ligado apenas fracamente, ou sua ligação foi indetectável, em outras variedades (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok e Nga). Além disso, o LM19 ligou-se apenas às frações da polpa do café e não se ligou ao resíduo do processamento do grão, anteriormente considerado composto de pectina de café semipurificada (dados não publicados).

Figure 1
Figura 1: Principais etapas experimentais do método MAPP. (A) As amostras são homogeneizadas para formar pós finos. (B) As amostras homogeneizadas são processadas para isolar seus AIRs. (C) Os glicanos constituintes são extraídos sequencialmente usando um regime de extração personalizado. (D) As frações glicânicas extraídas, tinta e GSB são transferidas para placas de 384 poços, de acordo com o layout da placa, para impressão em nitrocelulose. (E) Os microarrays impressos são sondados com GRMPs selecionados. (F) A ligação do GRMP às frações de glicano impressas é quantificada e analisada antes que os dados sejam apresentados como um mapa de calor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Exemplo de um layout de placa de 384 poços para carregamento de amostra, tinta e GSB com quatro diluições por amostra/padrão de glicano extraído. Cores diferentes denotam amostras provenientes de diferentes reagentes de extração, enquanto diferentes tonalidades representam diluições seriadas. O primeiro número do código representa o número da amostra, enquanto o número final representa o número de diluição (D1 denota diluição um, D2 denota diluição dois, e assim por diante). Por exemplo, um bem rotulado '12D3' representa a amostra de glicano 12, diluição três. As placas de poço devem ser divididas em oito seções idênticas, compostas por seis colunas e oito linhas. A primeira seção da primeira placa deve conter apenas tinta e tampão e se assemelhar ao layout da placa de exemplo. As amostras de glicano extraídas podem então ser carregadas em seções de placa subsequentes de acordo com o layout da placa. Reagentes de extração diferentes não devem ser carregados na mesma seção da placa. Se não houver amostras suficientes para preencher uma seção inteira, preencha todos os poços restantes nessa seção com tampão; Não deixe nenhum poço vazio. Se forem necessárias várias chapas, a próxima secção após o carregamento de todas as amostras deve conter três colunas alternadas de tinta e GSB - esta pode não ser a secção oito, dependendo do número de amostras que estão a ser impressas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Representação esquemática do projeto de microarray impresso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Microarrays representativos. (A) Sem vinculação. (B) O sinal de ligação é obscurecido por um sinal de fundo elevado. (C) Coloração generalizada azul/roxa por supersaturação com NBT/BCIP. (D) Sondagem defeituosa devido à alta concentração de substrato. (E) Impressão defeituosa devido à cabeça de impressão suja. (F) Forte ligação a poucas amostras. (G) Forte ligação a muitas amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Ligação de anticorpos monoclonais aos padrões glicanos definidos, incluídos para validar o processo de impressão e sondagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: MAPP de glicanos extraídos de resíduos de biomassa agrícola. As amostras incluem resíduos de polpa de café (polpa de café e pectina de café), cascas de manga de várias variedades tailandesas (AO, Aokrong; KO, Márcia; Ribeiro, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; Ribeiro, Adriano; MH, Mahachanok; NG, Nga) e folhas de alho preto (Alho L), caule (Alho S), bulbo (Alho BG) e raízes (Alho R), utilizando CDTA, NaOH e celulase (Bacillus spp. cellulase 5A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Padrões de polissacarídeos comerciais definidos usados na análise MAPP como controles positivos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Anticorpos monoclonais direcionados ao glicano selecionados para a interrogação de microarrays de glicanos vegetais extraídos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

A técnica MAPP aqui descrita é atualmente um método bem estabelecido para análise glicana. Os princípios básicos foram descritos pela primeira vez em 200711, mas a técnica tem passado por um desenvolvimento contínuo, a fim de capitalizar as mais recentes inovações em tecnologia de microarrays, desenvolvimento de sondas moleculares e avanços em nosso entendimento da bioquímica glicana. Em geral, os glicanos, especialmente os polissacarídeos, são mais difíceis de analisar do que proteínas e nucleotídeos devido à sua complexidade estrutural e heterogeneidade45, bem como ao fato de não poderem ser facilmente sequenciados ou sintetizados1. Em muitos casos, nenhuma técnica única pode decifrar a complexidade glicana conclusivamente; assim, o MAPP é frequentemente usado com outros métodos. Essa é uma das razões pelas quais a preparação do AIR é geralmente escolhida como ponto de partida para a MAPP, uma vez que a AR é compatível com a maioria dos outros métodos de análise glicânica34, facilitando a comparação subsequente de conjuntos de dados.

Devido à homogeneização da amostra antes da preparação do AIR, algumas informações espaciais são invariavelmente perdidas. Entretanto, como os polissacarídeos são liberados sequencialmente das amostras, a presença de epítopos nas frações obtidas fornece informações sobre a arquitetura molecular e a composição dessa amostra17. Assim, a seleção de um regime de extração adequado é fundamental para o sucesso do método. Múltiplos parâmetros determinam a adequação do método de extração: estrutura celular, tempo, temperatura, pH, pressão, força iônica do solvente e finura da amostra sólida de partículas49. Recomenda-se que uma gama de solventes cada vez mais agressivos seja usada para maximizar a probabilidade de extrair com sucesso os glicanos constituintes e construir uma imagem composicional representativa da amostra. Para a maioria das amostras, CDTA, NaOH e celulase são suficientes para remover polissacarídeos de armazenamento e de parede celular derivados de plantas 33,50,51,52. Para algumas amostras de tecido, um regime de extração híbrido que também inclui CaCl2, HCl e Na2CO3 demonstrou ser bem-sucedido53, enquanto amostras de microalgas marinhas podem exigir a adição de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)10.

Os microarrays devem incluir uma gama de padrões de glicanos puros e definidos para serem usados como controles positivos5. As normas incluídas devem ser modificadas de acordo com a natureza da amostra. Uma vez impressos, os GRMPs apropriados precisam ser selecionados. A geração de mAbs de hibridomas para estruturas polissacarídicas é desafiadora54; Os anticorpos ligantes de glicanos são difíceis de aumentar e podem ter baixa afinidade55. Felizmente, informações de sequência gênica para CBMs podem ser obtidas com relativa facilidade para expressão recombinante4 e engenharia de suas especificidades de ligação56,57. Embora tenha sido desenvolvido um impressionante catálogo de GRMPs, com a maioria agora disponível a partir de fontes comerciais, em relação à diversidade de estruturas glicânicas existentes na natureza, apenas uma pequena proporção foi produzida e caracterizada com sucesso58. Isso pode limitar a capacidade de detectar e discriminar entre certas estruturas. É aconselhável realizar um experimento inicial de sondagem usando uma ou duas sondas representativas de cada estrutura glicana principal prevista para estar presente, para as quais a especificidade de ligação é bem caracterizada. Em experimentos de sondagem subsequentes, a lista de sondas pode ser expandida para cobrir uma gama mais ampla de glicanos e aprofundar estruturas finas.

Apesar de mundano, garantir que os microarrays sejam lavados completamente após cada etapa de incubação é fundamental para o sucesso do procedimento de sondagem. A remoção ineficaz de sondas não especificamente ligadas provavelmente obscurecerá o resultado, causando um alto sinal de fundo após o desenvolvimento da cor. Neste caso, é necessário repetir o procedimento de sondagem, começando com um novo microarray. Além disso, as matrizes devem ser tocadas com moderação e apenas segurando as bordas com pinças; A membrana de nitrocelulose é quebradiça e facilmente danificada. A solução de revelação de cores se acumula em trincas e vincos, causando saturação excessiva, o que impede a análise da matriz.

O MAPP é rápido, adaptável e conveniente. Este método é compatível com glicanos animais, microbianos ou vegetais derivados de qualquer sistema biológico ou industrial, desde que possam ser extraídos e imobilizados em nitrocelulose, e para os quais se tenha sondas moleculares apropriadas. Os dados gerados fornecem informações composicionais detalhadas, semiquantitativas, que não podem ser facilmente obtidas por meio de outros métodos de análise glicana.

Disclosures

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer à ArrayJet por seus conselhos especializados em relação à robótica de microarrays. SS e JS gostariam de agradecer o apoio do Fundo Fundamental 2022 (FF65/004), Universidade de Chiang Mai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) Megazyme P-LICHN
1,4-β-D-Mannan Megazyme P-MANCB
384-well microtiter plate Greiner Bio-One M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) Melford B74100-1.0
Acetone Sigma 270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag Jackson ImmunoResearch 300-055-240
Arabinoxylan (wheat) Megazyme P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software Media Cybernetics Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) NZYTech CZ0564
BAM antibodies SeaProbes Various
Black drawing ink (indian ink) Winsor & Newton GWD030
Carbohydrate binding modules NZYTech Various
CCRC antibodies CarboSource Various
CDTA Sigma 319945
Chloroform Sigma PHR1552
Ethanol Sigma 1.11727
Galactan (potato) Megazyme P-GALPOT
Galactomannan (carob) Megazyme P-GALML
Glycerol solution Sigma 49781-5L
Gum tragacanth (legumes) Sigma-Aldrich G1128
INCh antibodies INRA Various
LM and JIM antibodies PlantProbes Various
Marathon Argus Microarray Printer ArrayJet
Methanol Sigma  34860
Monoclonal antibodies Biosupplies Australia Various
NaBH4 Sigma 452882
NaOH Sigma S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT) Melford N66000-1.0
Nitrocellulose membrane Thermo Fisher Scientific 88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%) Danisco NA
ProClin 200 Sigma 48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) Megazyme P-RHAGN
Rotating mixer Fisher Scientific 88-861-050
Rotating/rocking Shaker Cole-Parmer
Skimmed milk powder Marvel
Spin filter Costar Spin-X 8160
Stainless steel beads Qiagen 69989
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris Sigma 93362
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Xylan (beechwood) Megazyme P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind) Megazyme P-XYGLN
β-Glucan (oat) Megazyme P-BGOM

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Bakshani, C. R., Sangta, J., Sommano, S., Willats, W. G. T. Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis. J. Vis. Exp. (199), e65443, doi:10.3791/65443 (2023).

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