Summary
ミトコンドリアコンタクトサイトは、ミトコンドリアの内膜および外膜タンパク質と相互作用するタンパク質複合体です。これらの部位は、ミトコンドリア膜間のコミュニケーション、したがって細胞質とミトコンドリアマトリックスの間のコミュニケーションに不可欠です。ここでは、この特定のクラスのタンパク質に適格な候補を同定する方法について説明します。
Abstract
ミトコンドリアは、事実上すべての真核細胞に存在し、例えば、鉄硫黄クラスター、脂質、またはタンパク質の合成、Ca2+ 緩衝、およびアポトーシスの誘導など、エネルギー生産をはるかに超える重要な機能を果たします。同様に、ミトコンドリアの機能不全は、癌、糖尿病、神経変性などの重篤な人間の病気を引き起こします。これらの機能を実行するために、ミトコンドリアは、2つの膜からなるエンベロープを介して細胞の残りの部分と通信する必要があります。したがって、これら2つの膜は常に相互作用する必要があります。ミトコンドリアの内膜と外膜の間のタンパク質接触部位は、この点で不可欠です。これまでのところ、いくつかの接触サイトが特定されています。本明細書に記載の方法では、 出芽酵母ミトコンドリア(Saccharomyces cerevisiae mitochondria)を用いて接触部位を単離し、したがって、接触部位タンパク質に適格な候補を同定する。この手法を用いて、酵母からヒトまで保存されているミトコンドリア内膜における主要なコンタクトサイト形成複合体の1つであるミトコンドリアコンタクトサイトとクリステ組織システム(MICOS)複合体を同定しました。最近では、この手法をさらに改良し、Cqd1とPor1-Om14複合体からなる新規コンタクトサイトを同定しました。
Introduction
ミトコンドリアは真核生物においてさまざまな機能を果たしており、最もよく知られているのは酸化的リン酸化によるATPの産生です。その他の機能には、鉄-硫黄クラスターの生成、脂質合成、および高等真核生物ではCa2+シグナル伝達、およびアポトーシスの誘導が含まれます1,2,3,4。これらの機能は、その複雑な超微細構造と不可分に結びついています。
ミトコンドリアの超微細構造は、電子顕微鏡5によって最初に記述された。ミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜とミトコンドリア内膜の2つの膜からなるかなり複雑な細胞小器官であることが示されました。したがって、2つの水性区画がこれらの膜によって形成される:膜間空間およびマトリックス。ミトコンドリアの内膜は、さらに異なるセクションに分けることができます。内側の境界膜は外側の膜に近接しており、クリステは陥入を形成します。いわゆるクリスタ接合部は、内側の境界膜とクリステをつなぎます(図1)。さらに、浸透圧的に縮小したミトコンドリアの電子顕微鏡写真は、ミトコンドリア膜が緊密に結合している部位が存在することを明らかにした6,7。これらのいわゆるコンタクトサイトは、2つの膜にまたがるタンパク質複合体によって形成されます(図1)。これらの相互作用部位は、ミトコンドリアの動態と遺伝の調節、ならびに細胞質とマトリックスの間の代謝産物とシグナルの伝達にとって重要であるため、細胞の生存に不可欠であると考えられている8。
ミトコンドリア内膜のMICOS複合体は、おそらく最もよく特徴付けられ、最も用途の広いコンタクトサイト形成複合体です。MICOSは2011年に酵母で記載され、Mic60、Mic27、Mic26、Mic19、Mic12、Mic10の6つのサブユニット9,10,1で構成されています。これらは約1.5MDaの複合体を形成し、クリスタ接合部9,10,11に局在する。Mic10またはMic60のいずれかのコアサブユニットが欠失すると、この複合体が欠損する9,11ため、これら2つのサブユニットがMICOSの安定性に不可欠である。興味深いことに、MICOSは、TOM複合体11,12、TOB/SAM複合体9,12,13,14,15,16、Fzo1-Ugo1複合体9、Por1 10、OM45 10、Miro 17など、様々なミトコンドリア外膜タンパク質および複合体と1つだけでなく複数の接触部位を形成します.このことは、MICOS複合体が、タンパク質の取り込み、リン脂質代謝、ミトコンドリアの超微細構造の生成など、様々なミトコンドリアプロセスに関与していることを強く示唆している18。後者の機能は、MIC10またはMIC60の欠失によって誘導されるMICOS複合体の欠如が、事実上完全に規則的なクリステを欠く異常なミトコンドリアの超微細構造をもたらすため、おそらくMICOSの主要な機能である。その代わりに、内界膜と接続していない内膜小胞が蓄積する19、20。重要なことに、MICOSは酵母からヒトまで形態と機能が保存されています21。MICOSサブユニットの変異と重篤なヒト疾患との関連は、高等真核生物にとっての重要性も強調している22,23。MICOSは非常に用途が広いですが、追加の接触サイトが存在する必要があります(未発表の観察に基づく)。実際、ミトコンドリア特異的リン脂質カルジオリピンの生合成に関与するミトコンドリア融合機構Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26またはMdm31-Por1など、他のいくつかの接触部位が同定されている27。最近、我々はMICOSの同定に至った手法を改良し、外膜複合体Por1-Om14と形成される新規接触部位の一部としてCqd1を同定した28。興味深いことに、この接触部位は、ミトコンドリア膜の恒常性、リン脂質代謝、コエンザイムQ28,29の分布などの複数のプロセスにも関与しているようです。
ここでは、先に述べたミトコンドリア9,30,31,32,33の分画の変形を用いた。ミトコンドリアの浸透圧処理は、ミトコンドリア外膜の破壊とマトリックス空間の収縮をもたらし、2つの膜は接触部位でのみ近接した状態になります。これにより、ミトコンドリア外膜またはミトコンドリア内膜のみからなる、または軽度の超音波処理による両方の膜の接触部位を含む小胞の生成が可能になります。ミトコンドリア内膜はタンパク質と脂質の比率がはるかに高いため、ミトコンドリア内膜小胞はミトコンドリア外膜小胞と比較してより高い密度を示します。密度の差を利用して、スクロース浮力密度勾配遠心分離により膜小胞を分離することができます。したがって、ミトコンドリア外膜小胞は低スクロース濃度で蓄積し、ミトコンドリア内膜小胞は高スクロース濃度で濃縮されます。接触部位を含む小胞は、中程度のスクロース濃度で濃縮されます(図2)。以下のプロトコルは、以前に確立されたもの32と比較して、より少ない専門機器、時間、およびエネルギーを必要とするこの改良された方法を詳細に説明し、可能な接触部位タンパク質の同定のための有用なツールを提供します。
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Protocol
1. バッファーとストック溶液
- 1 M 3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)溶液を脱イオン水(pH 7.4)で調製します。4°Cで保存してください。
- 500 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を脱イオン水、pH 8.0 で調製します。室温で保存してください。
- 脱イオン水に2.4 Mソルビトールを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。
- 脱イオン水で2.5Mスクロースを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。
- イソプロパノール中に 200 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を調製します。-20°Cで保存してください。
注意: PMSFは飲み込むと有毒であり、重度の皮膚火傷や眼の損傷を引き起こします。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。 - 脱イオン水で72%トリクロロ酢酸(TCA)を調製します。4°Cで保存してください。
注意: TCAは、呼吸器への刺激、重度の皮膚の火傷、および目の損傷を引き起こす可能性があります。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。 - SMバッファー(20 mM MOPSおよび0.6 Mソルビトール、pH 7.4)を調製します。
- 膨潤バッファー(20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4))を調製します。
- スクロースグラジエントバッファー(0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M、1.3 M スクロース)を 20 mM MOPS で調製し、0.5 mM EDTA、pH 7.4 で溶液を調製します。
注:すべてのバッファーは4°Cで保存できます。ただし、真菌の増殖を防ぐために、スクロース含有バッファーを-20°Cで保存することを推奨します。プロテアーゼ阻害剤は、使用前に新たに添加する必要があります。
2. 服従軟骨小胞の生成
- 粗酵母ミトコンドリアを確立されたプロトコルに従って新たに分離します34,35。
注:この実験では、ミトコンドリアを 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)から単離しました。他の細胞小器官を欠いた勾配の純粋なミトコンドリアの生成は必要ありません。 - 単離したばかりのミトコンドリア10 mgを1.6 mLのSMバッファー(4°C)にピペッティングで再懸濁します(図2、ステップ1)。
- ミトコンドリア懸濁液を予冷した100 mL三角フラスコに移します。
- 20 mLのガラスピペットを使用して、16 mLの膨潤緩衝液をゆっくりと加えます。添加中は、氷上で絶えず穏やかに攪拌します。この浸透圧処理により、マトリックス空間に水分が取り込まれます。ミトコンドリアの内膜の腫れは外膜を破壊します。ただし、両方の膜は接触部位9で接触したままになります(図2、ステップ2)。
- 氷上で30分間、一定の穏やかな攪拌下でサンプルをインキュベートします。
- 5 mLのガラスピペットを使用して、5 mLの2.5 Mショ糖溶液をゆっくりと加え、サンプル中のスクロース濃度を約0.55 Mに上げます。この浸透圧処理は、マトリックス36からの水の流出をもたらす。内膜の収縮は、外膜の残留断片までの距離を最大化することを目的としています。これにより、超音波処理によって内膜と外膜の人工ハイブリッド小胞が生成される可能性が低下します(図2、ステップ3)。
- 氷上で15分間穏やかに撹拌しながらサンプルをインキュベートします。
- ミトコンドリアを超音波処理して、提出軟骨膜小胞を生成します(図2、ステップ4)。
- ミトコンドリア懸濁液を予冷したロゼットセルに移します。
- ミトコンドリア懸濁液を10%の振幅で30秒間超音波処理し、ロゼットセルを氷浴で冷却します。
- 懸濁液を氷浴で30秒間休ませます。.
- 手順2.8.2と手順2.8.3をさらに3回繰り返します。
注:超音波処理条件は、使用する超音波処理装置によって異なります。個々のマシンに対して最適化が必要になります。過酷すぎる超音波処理は、ミトコンドリアの内膜と外膜からなる小胞の人工的な形成につながります。
3. 服従軟骨小胞の分離
- 生成された小胞を、20,000 x g で4°Cで20分間遠心分離することにより、残りの無傷のミトコンドリアから分離します。 無傷のミトコンドリアはペレット化し、小胞は上清にとどまります。
- 小胞混合物を濃縮します。
- 上清を新しい超遠心分離チューブに移します。
- 0.8 mm x 120 mmのカニューレを装備した1 mLのシリンジを使用して、チューブの底部に0.3 mLの2.5 Mショ糖溶液のクッションをロードします。
- 118,000 x g で4°Cで100分間遠心分離します。
注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。
- 小胞は、遠心分離後、スクロースクッションの上部にディスクとして現れます。上澄み液の約90%を捨てる。次に、ピペッティングで上下に動かし、2.5 Mスクロースを含む残りのバッファーに再懸濁することにより、濃縮小胞を回収します。懸濁液を氷冷したDounceホモジナイザーに移します。
- ポリテトラフルオロエチレンポッターを使用して、少なくとも10回のストロークで懸濁液を均質化します。
- スクロースグラジエントを準備します。
- 5 ステップ(20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA、pH 7.4 中の 1.3 M、1.13 M、1.02 M、0.96 M、0.8 M スクロース)を含む 11 mL のステップグラジエントの場合、各層には 2.2 mL のスクロース溶液があります。
注意: スクロース濃度を測定および調整するには、屈折計をお勧めします。ただし、必須ではありません。10 μLの緩衝液を屈折計に塗布し、それぞれの屈折率を検出します。ショ糖濃度の計算は次のとおりです。
1.3333は水の屈折率を表します。0.048403は、水溶液中のモル屈折率からスクロース濃度への線形スケーリングから得られるスクロース特異的変換指数 である37。 - 遠心分離チューブに最高濃度のショ糖を加え、チューブを-20°Cに保ちます。 レイヤーが完全にフリーズするまで待ってから、次のレイヤーを適用します。最後の層が追加されるまで適宜進み、グラジエントを-20°Cで保存します。
注:実験を開始するときは、グラジエントを融解するために、凍結グラジエントを 4 °C に移すことを忘れないでください。これには約3時間かかります。ここでの遠心分離には、容量13.2 mLのスイングバケットローターを使用しました。別のローターを使用する場合は、グラジエントステップボリュームをそれに応じて調整する必要があります。
- 5 ステップ(20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA、pH 7.4 中の 1.3 M、1.13 M、1.02 M、0.96 M、0.8 M スクロース)を含む 11 mL のステップグラジエントの場合、各層には 2.2 mL のスクロース溶液があります。
- 屈折計を使用してサンプルのスクロース濃度を測定します。屈折計にアクセスできない場合は、スクロース濃度が2 Mであると仮定することもできます。この想定されるスクロース濃度は、次のステップの基礎となります。
- 適切な量の 20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4)を添加して、スクロース濃度を 0.6 M に調整します。スクロース濃度が測定されずに2 Mと推定される場合は、調整後に濃度が十分に低いかどうかをテストすることをお勧めします。試験管内の200 μLの0.8 Mスクロースの上に、サンプルの少量のアリコート(約50 μL)を塗布します。サンプルは 0.8 M スクロースの上に留まる必要があります。
- サンプル(約 1 mL)をスクロースグラジエントの上にロードします(後で参照できるように 10% を保持します)。グラジエントの乱れを避けるためには、慎重なピペッティングが重要です(図2、ステップ5)。
- 200,000 x g 、4°Cで12時間遠心分離して小胞を分離します。可能であれば、遠心分離機をゆっくりと加速および減速に設定して、グラジエントの乱れを回避します(図2、ステップ6)。
注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。 - 1 mLのピペットを使用して、上から下へのグラジエントを700 μLのフラクションで回収します。これにより、17 のフラクションが得られ、十分な分離能が得られます。
4. 服従軟骨小胞の解析
- 各画分を2回連続して実施されたTCA沈殿38に供することにより、タンパク質を濃縮し、SDS-PAGEサンプルを調製する。
- 200 μL の 72% TCA を個々のフラクションに加え、溶液が均一になるまで混合します。フラクションを氷上で30分間インキュベートし、沈殿したタンパク質を20,000 x g および4°Cで20分間遠心分離してペレット化します。上清を廃棄し、500 μLの28%TCA溶液を加え、よく混合し、遠心分離ステップを繰り返します。
- ペレットを1 mLのアセトン(-20°C)で洗浄し、20,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 上澄みを捨て、ペレットを自然乾燥させます。ペレットを60 μLのSDSサンプルバッファーに再懸濁し、サンプルを95°Cで5分間インキュベートします。
注:最初のTCA沈殿後、特に高密度画分に大量のスクロースが残ります。これは、追加のTCA降水によって除去されます。
- 各画分20 μLをSDS-PAGE39およびイムノブロッティング40、41、42、43で分析します。
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Representative Results
ミトコンドリアの内膜と外膜を分離することは比較的簡単です。しかし、接触部位を含む小胞の生成と分離ははるかに困難です。私たちの意見では、超音波処理条件と使用される勾配の2つのステップが重要かつ不可欠です。
通常、線形グラデーションは、ステップグラデーションと比較して解像度が高いと考えられています。しかし、再現性のある生産は面倒で、特別な機器が必要です。そこで、個々のステップ間の差が比較的小さいステップ勾配を生成する方法を確立しました(ステップ3.5参照)。遠心分離時にステップグラジエントのバランスが取れ、ほぼ直線的なグラジエントになるのではないかと推測しました。驚くべきことに、屈折計を使用して遠心分離後の個々のフラクションのスクロース濃度を測定したところ、200,000 x g で12時間の遠心分離後にステップグラジエントが実際にほぼ直線的になることが明らかになりました(図3)。
軽度の超音波処理の重要性は、これらの代表的な結果で明らかです。穏やかな超音波処理条件(図4A)では、ミトコンドリア外膜マーカーTom40は、初期の低密度画分(フラクションNo.4)で濃縮され、後期のフラクションでは事実上存在しなかった。ミトコンドリア内膜マーカーTim17は、高密度画分に濃縮された(画分番号17)。対照的に、接触部位タンパク質Mic60は、中間スクロース濃度の画分に蓄積し(画分番号12-14)、種々の膜小胞の生成とその後の分離に成功したことを示している。対照的に、より厳しい超音波処理条件では、ミトコンドリア外膜マーカーTom40は、グラジエントのより低い画分で検出され得る(フラクションNo.14およびフラクションNo.17、 図4B)。さらに、中間密度の画分にはかなりの量のTim17が含まれていました(フラクションNo.13およびフラクションNo.14、 図4B)。中間密度の画分に外膜マーカーと内膜マーカーが非特異的に蓄積していることは、混合膜の人工的な形成を示しており、候補タンパク質の同定を阻害します。
図1:ミトコンドリアの超微細構造の模式図。 ミトコンドリアのさまざまなコンパートメント、膜、およびタンパク質の位置を示すための概略図。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:接触部位タンパク質を単離するためのミトコンドリア分画のワークフロー。 プロトコルに記述されているプロセスの概略図。(1)単離したばかりのミトコンドリアは、(2)浸透圧的に腫れ、(3)その後縮小した。(4)収縮したミトコンドリアは、サブレドコンドリア小胞を生成するための軽度の超音波処理に反対した。(5)小胞混合物を濃縮し、スクロースステップグラジエントにロードした。(6)遠心分離により、ミトコンドリア外膜小胞は低ショ糖濃度で、ミトコンドリア内膜小胞は高ショ糖濃度で、接触部位含有小胞は中濃度のショ糖濃度で濃縮された。略語:MIM、ミトコンドリア内膜;MOM、ミトコンドリア外膜。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:遠心分離による線形グラジエントの生成。 2 段階のグラジエント(1.3 M、1.13 M、次に 1.02 M、0.96 M、0.8 M、20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA、pH 7.4)を並行して調製し、1 mL の 0.6 M スクロースを 20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA(pH 7.4)で両方のグラジエントにロードしました。グラジエントを 200,000 x g および 4°C で 12 時間遠心分離し、それぞれ 17 分割で回収しました。この方法の再現性は、屈折計を用いて個々のグラジエントの単一画分のスクロース濃度を測定することによって試験した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:明確に定義された超音波パルスによる接触部位タンパク質の単離。 (A,B)新たに単離された酵母ミトコンドリアを浸透圧処理に供し、超音波処理に曝露した。生成された小胞は、ショ糖浮力密度勾配遠心分離を使用して分離されました。グラジエントを分画し、さまざまなフラクション中のタンパク質をTCA沈殿に供しました。ミトコンドリア外膜(Tom40)、ミトコンドリア内膜(Tim17)、および接触部位(Mic60)のマーカータンパク質の分布を、示された抗体を用いたイムノブロッティングにより分析しました。(A)軽度の超音波処理(4 x 30秒、振幅10%)により、外膜タンパク質(低密度画分)および内膜タンパク質(高密度画分)が明確に分離された。さらに、接触部位タンパク質Mic60は、中間密度の画分で濃縮することに成功しました。(B)より厳しい超音波処理(4 x 30秒、振幅20%)は、ハイブリッド小胞の生成をもたらし、したがって、接触部位の明確な分離を可能にしなかった。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ミトコンドリアの分画は、いくつかの非常に複雑なステップからなる複雑な実験です。したがって、確立された方法32をさらに改善し、ある程度簡素化することを目指しました。ここでの課題は、複雑で高度に専門化された機器が必要であり、多くの場合、個別の構造であり、膨大な時間とエネルギーを消費することでした。そのために、線状勾配の鋳造と収穫に用いたポンプや個々の構造物を撤去し、段階勾配に変更しました。重要なことは、少なくともここで説明したように調製した場合、遠心分離中にグラジエントが線形になり、これが有効な代替品になることに気づいたことです。この方法では、(i)グラジエントミキサーが不要になり、必要な機器が削減されます。(ii)グラジエントを事前に準備できるため、実験当日の時間を節約できます。(iii)は、記載されている方法に従って調製した場合に再現性が高く(図3)、次のステップを上に重ねる前に個々のステップを凍結します。これらの勾配は、−20°Cで無期限に保存することもできます。 さらに、ここで提案された沈降勾配の負荷は、同様の方法9,32で説明されているように、勾配の下に小胞混合物を層状にするよりも簡単です。浮遊グラジエントをロードするには、すでにキャストされたグラジエントを通過するために、長いカニューレを備えたシリンジが必要です。このステップは、勾配を破壊するリスクがあるため、常に問題がありました。この方法の別の利点は、遠心分離時間が24時間32時間に比べて12時間と短いため、この方法に必要な時間とエネルギーが大幅に削減されることです。ここで説明する改良された手順の実現可能性と再現性は、Cqd1およびPor1-Om14によって形成されるMICOS非依存性接触部位の最近の同定によって強調されている28。
しかし、この実験は依然として非常に複雑です。最適な結果を得るためには、このプロトコルを適用する際に考慮しなければならないいくつかの重要な基準があります。
最も重要な側面の1つは、ミトコンドリアの質です。これらは新たに分離する必要があります。したがって、酵母の培養およびミトコンドリアの単離は、手順を計画する際に考慮に入れなければならない。単離中のミトコンドリアの穏やかな処理は、膜の破壊を防ぐが、適切な濃度のPMSFまたはあるいは市販のプロテアーゼ阻害剤カクテルでプロテアーゼを阻害することも重要である34。
もう一つの重要なステップ、そして手順の最も重要な側面の1つは、超音波処理です。重要なのは、懸濁液の旋回によって発生する音によって超音波パルスの正しい強度を推定できることです(ビデオを参照)。ただし、最適な条件は、異なるブランドやモデルだけでなく、同じモデルの異なるマシンに基づいて、実験セットアップごとに実験的に決定する必要があります。特に、先端の分解と洗浄も超音波処理の強度に影響を与えるため、条件の再調整が必要になります。プロトコルでは、効率を高めるためにロゼットセルを使用することも推奨されていますが、他の容器も同様に機能する可能性があります。過酷すぎる超音波処理は、人工的に混合された小胞の形成につながります。これにより、内膜タンパク質と外膜タンパク質が中間密度の画分に強く蓄積し、図4Bに示すように、さらに強くなる可能性があります。これが発生した場合は、超音波処理の振幅または時間を短くする必要があります。ただし、超音波処理が十分に激しくない場合にも問題が発生する可能性があります。この場合、生成された小胞の収量は、イムノブロッティングによってタンパク質を検出するには低すぎる可能性があり、したがって、超音波処理の振幅、時間、またはサイクルを増やす必要があります。
最後に、勾配は、生成されたさまざまな小胞種の分離に重要です。ただし、スクロースグラジエントの最適な最大値と最小値、およびステップ数も、個々のセットアップによって異なる場合があります。ここでは、最大1.3 Mのスクロースと最小0.8 Mのスクロースによる5段階のグラジエントで、ミトコンドリアの内膜および外膜小胞から接触部位含有小胞を目に見えて再現性よく分離するのに十分でした。最初のうちは、ミトコンドリア外膜小胞の上とミトコンドリア内膜小胞の下に空の画分を残す条件を選択して、正しい分離を確実にすることが不可欠です。上部または下部の分数を圧縮すると、アーティファクトが発生する可能性があります。後のステップで、内膜小胞と外膜小胞が蓄積するスクロースの正確なモル濃度がわかっている場合、スクロースの最大濃度と最小濃度を増減することで勾配を最適化し、内膜、外膜、および接触部位間の分離能を高めることができます。注目すべきは、酵母の増殖条件が、密度遠心分離時に生成された小胞の挙動に影響を与える可能性があることです。ここで、酵母は、炭素源としてグリセロール(3%[v/v])を含むリッチなYP培地(1%[w/v]酵母抽出物、2%[w/v]ペプトン、pH5.5)で30°Cで増殖した34,44。他の増殖条件は、ミトコンドリアのタンパク質と脂質の組成を変化させ、その結果、生成された小胞の密度を変化させる可能性があります。
記載された方法は、接触部位を分離するための信頼性と再現性のある方法を提供する。しかし、それぞれの接触部位(内膜成分および外膜成分)のタンパク質組成の同定には、おそらく質量分析と組み合わせた免疫沈降などの追加のアッセイが必要です。このためには、タンパク質候補のタグ付きバージョンを発現する特異的抗体およびモデル生物が必要です。酵母をモデル生物として使用する場合、利用可能な多様な遺伝子改変方法およびタグ付きライブラリの存在により、タンパク質候補を容易に得ることができる45,46,47。そこで、酵母ミトコンドリアに対してこのプロトコールを確立し、最適化することにしました。他の生物から単離されたミトコンドリアの方法を適応させることは可能なはずですが、酵母には大量のミトコンドリアを安価かつ迅速に得ることができるという利点があります。さらに、酵母をモデル生物として使用して初期結果を収集することは、ヒトまでの高等真核生物に保存されているタンパク質複合体とプロセスを同定するための十分に証明された方法です。前述したように、酵母9,10,11におけるMICOSの同定と特性評価の後、MICOSは高等真核生物21において形態と機能において保存されていることが示された。最近発見されたMICOS非依存性接触部位28の成分であるCqd1およびPor1も保存されており、この接触部位が高等真核生物にも存在することを示している。
これらの接触部位に関する継続的な研究の重要性は、MICOSとさまざまな神経変性疾患との関連性によって強調されています18,48,49,50,51,52,53,54。PINK1によるMic60の正しいリン酸化は、ショウジョウバエにおけるクリスタ接合部の維持と関連しており、したがって、ヒトに保存されているこの経路は、パーキンソン病と関連している可能性がある48。さらに、ヒトMICOSサブユニットMic14の点変異は、MICOSの不安定化とそれに続くミトコンドリアの超微細構造の変化をもたらし、前頭側頭型認知症および筋萎縮性側索硬化症に罹患している患者に見られます50,51,52,53,54.Mic14は酵母からヒトまで保存されているため、酵母をモデル生物として、このタンパク質のさらなる研究を行うことができるでしょう。この基礎研究は、これらの疾患の根本的なメカニズムの理解につながり、効率的な治療法の開発を加速する可能性があります。さらに、MICOSに依存しない接触部位の最近の発見27,28は、この分野がまだ成長していることを示しています。したがって、ここで提示されたプロトコルは、この有望で魅力的な研究を前進させるのに役立つ可能性があります。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
M.E.H.は、Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)プロジェクト番号413985647の資金援助に感謝します。著者らは、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学のミヒャエル・キーブラー博士の寛大で広範な支援に感謝します。ウォルター・ノイペルト氏の科学的なインプット、有益な議論、そして継続的なインスピレーションに感謝します。J.F.は、ミュンヘン生命科学大学院(LSM)の支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any Abbe refractometer can be used |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
References
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