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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Une méthode améliorée pour isoler les sites de contact mitochondrial

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65444
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
* These authors contributed equally

Summary

Les sites de contact mitochondrial sont des complexes protéiques qui interagissent avec les protéines membranaires internes et externes mitochondriales. Ces sites sont essentiels pour la communication entre les membranes mitochondriales et, par conséquent, entre le cytosol et la matrice mitochondriale. Nous décrivons ici une méthode permettant d’identifier les candidats éligibles à cette classe spécifique de protéines.

Abstract

Les mitochondries sont présentes dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes et remplissent des fonctions essentielles qui vont bien au-delà de la production d’énergie, par exemple, la synthèse d’amas fer-soufre, de lipides ou de protéines, le tampon Ca2+ et l’induction de l’apoptose. De même, le dysfonctionnement mitochondrial entraîne des maladies humaines graves telles que le cancer, le diabète et la neurodégénérescence. Afin de remplir ces fonctions, les mitochondries doivent communiquer avec le reste de la cellule à travers leur enveloppe, qui se compose de deux membranes. Par conséquent, ces deux membranes doivent interagir constamment. Les sites de contact protéique entre les membranes interne et externe mitochondriales sont essentiels à cet égard. Jusqu’à présent, plusieurs sites de contact ont été identifiés. Dans la méthode décrite ici, les mitochondries de Saccharomyces cerevisiae sont utilisées pour isoler les sites de contact et, ainsi, identifier les candidats qui se qualifient pour les protéines de site de contact. Nous avons utilisé cette méthode pour identifier le complexe MICOS (MICOS) qui forme le site de contact mitochondrial et le système d’organisation des crêtes, l’un des principaux complexes formant des sites de contact dans la membrane interne mitochondriale, qui est conservé de la levure à l’homme. Récemment, nous avons encore amélioré cette méthode pour identifier un nouveau site de contact composé de Cqd1 et du complexe Por1-Om14.

Introduction

Les mitochondries remplissent une variété de fonctions différentes chez les eucaryotes, la plus connue étant la production d’ATP par phosphorylation oxydative. D’autres fonctions incluent la production d’amas fer-soufre, la synthèse des lipides et, chez les eucaryotes supérieurs, la signalisation Ca2+ et l’induction de l’apoptose 1,2,3,4. Ces fonctions sont indissociablement liées à leur ultrastructure complexe.

L’ultrastructure mitochondriale a été décrite pour la première fois par microscopie électronique5. Il a été montré que les mitochondries sont des organites assez complexes constitués de deux membranes : la membrane externe mitochondriale et la membrane interne mitochondriale. Ainsi, deux compartiments aqueux sont formés par ces membranes : l’espace intermembranaire et la matrice. La membrane interne mitochondriale peut être encore plus divisée en différentes sections. La membrane limite interne reste à proximité de la membrane externe et les crêtes forment des invaginations. Ce que l’on appelle des jonctions de crêtes relient la membrane limite interne et les crêtes (Figure 1). De plus, les micrographies électroniques de mitochondries osmotiquement rétrécies révèlent qu’il existe des sites où les membranes mitochondriales sont étroitement connectées 6,7. Ces sites dits de contact sont formés par des complexes protéiques qui s’étendent sur les deux membranes (Figure 1). On pense que ces sites d’interaction sont essentiels à la viabilité cellulaire en raison de leur importance pour la régulation de la dynamique et de l’hérédité mitochondriales, ainsi que pour le transfert de métabolites et de signaux entre le cytosol et la matrice8.

Le complexe MICOS dans la membrane interne mitochondriale est probablement le complexe de formation de site de contact le mieux caractérisé et le plus polyvalent. MICOS a été décrit dans la levure en 2011 et se compose de six sous-unités 9,10,1 1 : Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 et Mic10. Ceux-ci forment un complexe d’environ 1,5 MDa qui se localise aux jonctionsde crista 9,10,11. La délétion de l’une ou l’autre des sous-unités centrales, Mic10 ou Mic60, conduit à l’absence de ce complexe 9,11, ce qui signifie que ces deux sous-unités sont essentielles à la stabilité de MICOS. Il est intéressant de noter que MICOS forme non pas un, mais plusieurs sites de contact avec diverses protéines et complexes de la membrane externe mitochondriale : le complexe TOM 11,12, le complexe TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, le complexe Fzo1-Ugo19,Por1 10, OM45 10 et Miro 17. Cela indique fortement que le complexe MICOS est impliqué dans divers processus mitochondriaux, tels que l’importation de protéines, le métabolisme des phospholipides et la génération de l’ultrastructure mitochondriale18. Cette dernière fonction est probablement la fonction majeure de MICOS, car l’absence du complexe MICOS induite par la délétion de MIC10 ou MIC60 conduit à une ultrastructure mitochondriale anormale qui est pratiquement complètement dépourvue de crêtes régulières. Au lieu de cela, les vésicules membranaires internes sans connexion à la membrane limite interne s’accumulent19, 20. Il est important de noter que MICOS est conservé dans sa forme et sa fonction de la levure à l’homme21. L’association de mutations dans les sous-unités MICOS avec des maladies humaines graves souligne également son importance pour les eucaryotes supérieurs22,23. Bien que MICOS soit très polyvalent, il doit exister d’autres sites de contact (sur la base de nos observations non publiées). En effet, plusieurs autres sites de contact ont été identifiés, par exemple, les machineries de fusion mitochondriale Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 ou encore Mdm31-Por1, qui est impliquée dans la biosynthèse du phospholipide spécifique mitochondrial, cardiolipine 27. Récemment, nous avons amélioré la méthode qui nous a conduits à l’identification de MICOS pour identifier Cqd1 dans le cadre d’un nouveau site de contact formé avec le complexe membranaire externe Por1-Om1428. Il est intéressant de noter que ce site de contact semble également être impliqué dans de multiples processus tels que l’homéostasie de la membrane mitochondriale, le métabolisme des phospholipides et la distribution de la coenzyme Q28,29.

Ici, nous avons utilisé une variante du fractionnement des mitochondries 9,30,31,32,33 décrit précédemment. Le traitement osmotique des mitochondries conduit à la perturbation de la membrane externe mitochondriale et à un rétrécissement de l’espace matriciel, ne laissant les deux membranes qu’à proximité sur les sites de contact. Cela permet de générer des vésicules qui se composent exclusivement de la membrane externe mitochondriale ou de la membrane interne mitochondriale ou des sites de contact contenus des deux membranes par sonication douce. En raison de la membrane interne mitochondriale possédant un rapport protéines/lipides beaucoup plus élevé, les vésicules de la membrane interne mitochondriale présentent une densité plus élevée que les vésicules de la membrane externe mitochondriale. La différence de densité peut être utilisée pour séparer les vésicules membranaires par centrifugation à gradient de densité flottante de saccharose. Ainsi, les vésicules de la membrane externe mitochondriale s’accumulent à de faibles concentrations de saccharose, tandis que les vésicules de la membrane interne mitochondriale sont enrichies à des concentrations élevées de saccharose. Les vésicules contenant des sites de contact se concentrent à des concentrations intermédiaires de saccharose (figure 2). Le protocole suivant décrit en détail cette méthode améliorée, qui nécessite moins d’équipement spécialisé, de temps et d’énergie par rapport à notre méthode précédemment établie32, et fournit un outil utile pour l’identification d’éventuelles protéines du site de contact.

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Protocol

1. Tampons et solutions mères

  1. Préparez une solution d’acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS) de 1 M dans de l’eau déminéralisée, pH 7,4. Conserver à 4 °C.
  2. Préparer 500 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans de l’eau déminéralisée, pH 8,0. Conserver à température ambiante.
  3. Préparez 2,4 M de sorbitol dans de l’eau déminéralisée. Conserver à température ambiante après l’autoclavage.
  4. Préparer 2,5 M de saccharose dans de l’eau déminéralisée. Conserver à température ambiante après l’autoclavage.
  5. Préparer 200 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) dans de l’isopropanol. Conserver à −20 °C.
    ATTENTION : Le PMSF est toxique en cas d’ingestion et provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Ne respirez pas la poussière et portez des gants et des lunettes de protection.
  6. Préparez de l’acide trichloracétique (TCA) à 72 % dans de l’eau déminéralisée. Conserver à 4 °C.
    ATTENTION : Le TCA peut provoquer une irritation des voies respiratoires, de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Ne respirez pas la poussière et portez des gants et des lunettes de protection.
  7. Préparer le tampon SM : 20 mM MOPS et 0,6 M de sorbitol, pH 7,4.
  8. Préparez le tampon gonflant : 20 mM de MOPS, 0,5 mM d’EDTA, 1 mM de PMSF et un cocktail d’inhibiteurs de protéase, pH 7,4.
  9. Préparez les tampons de gradient de saccharose : 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M et 1,3 M de saccharose dans 20 mM de MOPS, et 0,5 mM d’EDTA, pH 7,4.
    REMARQUE : Tous les tampons peuvent être stockés à 4 °C ; cependant, il est recommandé de stocker les tampons contenant du saccharose à −20 °C pour éviter la croissance fongique. Les inhibiteurs de protéase doivent être ajoutés fraîchement avant utilisation.

2. Génération de vésicules soumissionnochondriales

  1. Isolez les mitochondries de levure brutes fraîchement selon les protocoles établis34,35.
    NOTE : Pour cette expérience, des mitochondries ont été isolées de Saccharomyces cerevisiae. La génération de mitochondries pures à gradient dépourvues d’autres organites n’est pas nécessaire.
  2. Remettre en suspension 10 mg de mitochondries fraîchement isolées dans 1,6 mL de tampon SM (4 °C) par pipetage (Figure 2, étape 1).
  3. Transvaser la suspension mitochondriale dans un erlenmeyer pré-refroidi de 100 ml.
  4. Ajouter lentement 16 mL de tampon gonflant à l’aide d’une pipette en verre de 20 mL. Appliquez en remuant doucement et constamment sur la glace pendant l’ajout. Ce traitement osmotique entraîne l’absorption d’eau dans l’espace matriciel. Le gonflement de la membrane interne mitochondriale va perturber la membrane externe. Cependant, les deux membranes resteront en contact aux sites de contact9 (Figure 2, étape 2).
  5. Incuber les échantillons en remuant doucement et constamment pendant 30 minutes sur de la glace.
  6. Ajouter lentement 5 mL de solution de saccharose à 2,5 M à l’aide d’une pipette en verre de 5 mL pour augmenter la concentration de saccharose dans les échantillons à environ 0,55 M. Ce traitement osmotique se traduit par un efflux d’eau de la matrice36. Le retrait de la membrane interne est destiné à maximiser sa distance par rapport aux fragments résiduels de la membrane externe. Cela diminue la probabilité de générer des vésicules hybrides artificielles de membranes internes et externes par sonication (Figure 2, étape 3).
  7. Incuber les échantillons en remuant doucement pendant 15 min sur de la glace.
  8. Soumettre les mitochondries à une sonication pour générer des vésicules membranaires soumisesochondriales (Figure 2, étape 4).
    1. Transférez la suspension mitochondriale dans une cellule de rosette pré-refroidie.
    2. Soniser la suspension mitochondriale à une amplitude de 10 % pendant 30 s tout en refroidissant la cellule de la rosette dans un bain de glace.
    3. Reposer la suspension pendant 30 s dans un bain de glace.
    4. Répétez les étapes 2.8.2 et 2.8.3 trois fois de plus.
      REMARQUE : Les conditions de sonication varient en fonction du sonicateur utilisé. L’optimisation sera nécessaire pour les machines individuelles. Une sonication trop dure conduira à la formation artificielle de vésicules constituées de membranes internes et externes mitochondriales.

3. Séparation des vésicules soumissionnochondriales

  1. Séparez les vésicules générées des mitochondries intactes restantes par centrifugation à 20 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Les mitochondries intactes se granuleront tandis que les vésicules resteront dans le surnageant.
  2. Concentrez le mélange de vésicules.
    1. Transférez le surnageant dans des tubes d’ultracentrifugation neufs.
    2. Charger un coussin de 0,3 mL de solution de saccharose 2,5 M au fond du tube à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une canule de 0,8 mm x 120 mm.
    3. Centrifuger à 118 000 x g pendant 100 min à 4 °C.
      REMARQUE : Ici, un rotor à godets oscillants d’un rayon maximal de 153,1 mm a été utilisé. Les conditions de centrifugation dépendent fortement du rotor et devront être adaptées lors de l’utilisation d’un autre rotor.
  3. Les vésicules apparaîtront sous la forme d’un disque sur le dessus du coussin de saccharose après la centrifugation. Jeter environ 90 % du surnageant. Maintenant, récoltez les vésicules concentrées en les remettant en suspension dans le tampon restant, y compris le saccharose de 2,5 M en pipetant de haut en bas. Transférez la suspension dans un homogénéisateur Dounce glacé.
  4. Homogénéiser la suspension avec au moins 10 coups à l’aide d’un potier en polytétrafluoroéthylène.
  5. Préparez le dégradé de saccharose.
    1. Pour un gradient de pas de 11 mL avec cinq étapes (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M et 0,8 M de saccharose dans 20 mM MOPS et 0,5 mM EDTA, pH 7,4), chaque couche contient 2,2 mL de solution de saccharose.
      REMARQUE : Un réfractomètre est recommandé pour mesurer et ajuster les concentrations de saccharose ; Cependant, ce n’est pas indispensable. Appliquez 10 μL du tampon sur le réfractomètre et détectez les indices de réfraction respectifs. Le calcul de la concentration en saccharose est le suivant :
      Equation 1
      1,3333 représente l’indice de réfraction de l’eau. 0,048403 est un indice de conversion spécifique du saccharose obtenu à partir de la mise à l’échelle linéaire de la réfraction molaire à la concentration de saccharose dans des solutions aqueuses 37.
    2. Ajoutez la concentration de saccharose la plus élevée dans le tube de centrifugation et placez le tube à −20 °C. Attendez que la couche soit complètement gelée avant d’appliquer la suivante. Procédez ainsi jusqu’à ce que la dernière couche soit ajoutée et stockez les dégradés à −20 °C.
      REMARQUE : N’oubliez pas de transférer les gradients gelés à 4 °C au début de l’expérience pour permettre aux gradients de dégeler. Cela prendra environ 3 h. Pour la centrifugation, un rotor à godets oscillants d’une capacité de 13,2 ml a été utilisé. Lorsqu’un rotor différent est utilisé, les volumes de pas de gradient doivent être adaptés en conséquence.
  6. Mesurer la concentration en saccharose des échantillons à l’aide d’un réfractomètre. S’il n’y a pas d’accès à un réfractomètre, on peut également supposer que la concentration de saccharose est de 2 M. Cette concentration supposée de saccharose servira ensuite de base à l’étape suivante.
  7. Ajustez la concentration de saccharose à 0,6 M par l’ajout d’une quantité appropriée de 20 mM de MOPS, 0,5 mM d’EDTA, 1 mM de PMSF et d’un cocktail d’inhibiteurs de protéase, pH 7,4. Si la concentration de saccharose est estimée à 2 M au lieu d’être mesurée, il est recommandé de vérifier si la concentration est suffisamment faible après ajustement. Appliquer une petite aliquote de l’échantillon (env. 50 μL) sur 200 μL de saccharose 0,8 M dans un tube à essai. L’échantillon doit rester au-dessus du saccharose de 0,8 M.
  8. Chargez les échantillons (environ 1 ml) au-dessus du gradient de saccharose (conservez 10 % pour référence ultérieure). Un pipetage minutieux est important pour éviter de perturber le gradient (Figure 2, étape 5).
  9. Séparer les vésicules par centrifugation à 200 000 x g et 4 °C pendant 12 h. Si possible, réglez la centrifugeuse sur une accélération et une décélération lentes pour éviter de perturber le gradient (Figure 2, étape 6).
    REMARQUE : Ici, un rotor à godets oscillants d’un rayon maximal de 153,1 mm a été utilisé. Les conditions de centrifugation dépendent fortement du rotor et devront être adaptées lors de l’utilisation d’un autre rotor.
  10. Prélever le gradient de haut en bas par fractions de 700 μL à l’aide d’une pipette de 1 mL. Cela se traduira par 17 fractions, ce qui permet une résolution suffisante.

4. Analyse des vésicules soumissionnochondriales

  1. Concentrer les protéines en soumettant chaque fraction à deux précipitations séquentielles de TCA38 pour préparer les échantillons SDS-PAGE.
    1. Ajouter 200 μL de TCA à 72 % aux fractions individuelles et mélanger jusqu’à ce que la solution soit homogène. Incuber les fractions pendant 30 min sur de la glace, et granuler les protéines précipitées par centrifugation à 20 000 x g et 4 °C pendant 20 min. Jeter le surnageant, ajouter 500 μL de solution de TCA à 28 %, bien mélanger et répéter l’étape de centrifugation.
    2. Lavez les granulés avec 1 mL d’acétone (−20 °C) et centrifugez pendant 10 min à 20 000 x g et 4 °C. Jetez le surnageant et laissez les granulés sécher à l’air libre. Remettre les pastilles en suspension dans 60 μL de tampon d’échantillon SDS et incuber les échantillons pendant 5 min à 95 °C.
      REMARQUE : Une grande quantité de saccharose restera, en particulier dans les fractions à haute densité, après les premières précipitations de TCA. Celle-ci sera éliminée par les précipitations supplémentaires de TCA.
  2. Analyser 20 μL de chaque fraction par SDS-PAGE39 et immunoblot40,41,42,43.

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Representative Results

Il est relativement facile de séparer les membranes internes et externes des mitochondries. Cependant, la génération et la séparation des vésicules contenant le site de contact sont beaucoup plus difficiles. À notre avis, deux étapes sont critiques et essentielles : les conditions de sonication et le gradient utilisé.

Habituellement, on pense que les dégradés linéaires ont une meilleure résolution que les dégradés par étapes. Cependant, leur production reproductible est fastidieuse et nécessite un équipement spécial. Par conséquent, nous avons établi une méthode pour générer un gradient de pas avec des différences relativement faibles entre les étapes individuelles (voir l’étape 3.5). Nous avons émis l’hypothèse que le gradient de pas serait équilibré lors de la centrifugation, ce qui donnerait un gradient presque linéaire. Il est frappant de constater que la détermination des concentrations de saccharose des différentes fractions après centrifugation à l’aide d’un réfractomètre a révélé que le gradient de pas devenait en effet pratiquement linéaire après 12 h de centrifugation à 200 000 x g (Figure 3).

L’importance d’une sonication douce est évidente dans ces résultats représentatifs. Dans des conditions de sonication modérées (Figure 4A), le marqueur de la membrane externe mitochondriale Tom40 a été enrichi dans les premières fractions de faible densité (fraction n° 4) et était pratiquement absent dans les fractions ultérieures. Le marqueur de la membrane interne mitochondriale Tim17 était concentré dans les fractions de haute densité (fraction n° 17). En revanche, la protéine Mic60 du site de contact s’est accumulée dans des fractions de concentration intermédiaire de saccharose (fraction n° 12-14), ce qui indique la génération réussie et la séparation ultérieure des différentes vésicules membranaires. En revanche, dans des conditions de sonication plus difficiles, le marqueur de membrane externe mitochondriale Tom40 a pu être détecté dans des fractions inférieures du gradient (fraction n° 14 et fraction n° 17, figure 4B). De plus, il y avait une quantité importante de Tim17 dans des fractions de densité intermédiaire (fraction n° 13 et fraction n° 14, figure 4B). L’accumulation non spécifique de marqueurs membranaires externes et internes dans des fractions de densité intermédiaire indique la formation artificielle de membranes mixtes, ce qui inhibe l’identification des protéines candidates.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de l’ultrastructure mitochondriale. Représentation schématique d’une mitochondrie pour montrer les différents compartiments, membranes et emplacements des protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Flux de travail du fractionnement mitochondrial pour isoler les protéines du site de contact. Une vue d’ensemble schématique du processus décrit dans le protocole. Les (1) mitochondries fraîchement isolées étaient (2) gonflées osmotiquement (3) puis rétrécies. (4) Les mitochondries rétrécies ont été objectées à une sonication légère pour générer des vésicules soumochondriales. (5) Le mélange de vésicules a été concentré et chargé sur un gradient de saccharose. (6) Par centrifugation, les vésicules de la membrane externe mitochondriale ont été enrichies à une faible concentration de saccharose, les vésicules de la membrane interne mitochondriale à une concentration élevée de saccharose et les vésicules contenant le site de contact à une concentration intermédiaire de saccharose. Abréviations : MIM, membrane interne mitochondriale ; MOM, membrane externe mitochondriale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Génération d’un gradient linéaire par centrifugation. Deux gradients (1,3 M, 1,13 M, puis 1,02 M, 0,96 M et 0,8 M dans 20 mM MOPS et 0,5 mM EDTA, pH 7,4) ont été préparés en parallèle, et 1 mL de saccharose 0,6 M dans 20 mM MOPS et 0,5 mM EDTA, pH 7,4, a été chargé sur les deux gradients. Les gradients ont été soumis à une centrifugation à 200 000 x g et 4 °C pendant 12 h et récoltés en 17 fractions chacun. La reproductibilité de la méthode a été testée en déterminant la concentration en saccharose des fractions individuelles des gradients individuels à l’aide d’un réfractomètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Isolement des protéines du site de contact avec une impulsion ultrasonique bien définie. (A,B) Des mitochondries de levure fraîchement isolées ont été soumises à un traitement osmotique et exposées à une sonication. Les vésicules générées ont été séparées à l’aide d’une centrifugation à gradient de densité flottante de saccharose. Le gradient a été fractionné et les protéines des différentes fractions ont été soumises à une précipitation de TCA. La distribution des protéines marqueurs de la membrane externe mitochondriale (Tom40), de la membrane interne mitochondriale (Tim17) et des sites de contact (Mic60) a été analysée par immunotransfert à l’aide des anticorps indiqués. (A) Une sonication légère (4 x 30 s, amplitude de 10 %) a permis une séparation nette des protéines membranaires externes (fractions de faible densité) et des protéines membranaires internes (fractions de haute densité). De plus, la protéine du site de contact Mic60 a été enrichie avec succès en fractions de densité intermédiaire. (B) Une sonication plus forte (4 x 30 s, 20 % d’amplitude) a entraîné la génération de vésicules hybrides et, par conséquent, n’a pas permis une séparation claire des sites de contact. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le subfractionnement mitochondrial est une expérience compliquée avec plusieurs étapes très complexes. C’est pourquoi nous avons cherché à améliorer et, dans une certaine mesure, à simplifier notre méthode établie32. Ici, les défis étaient la nécessité d’équipements compliqués et hautement spécialisés, qui sont souvent des constructions individuelles, et l’énorme consommation de temps et d’énergie. À cette fin, nous avons essayé de supprimer les pompes et les constructions individuelles utilisées pour la coulée et la récolte du gradient linéaire et de passer à un gradient par étapes. Il est important de noter que nous nous sommes rendu compte que, du moins lorsqu’il est préparé comme décrit ici, le gradient devient linéaire pendant la centrifugation, ce qui en fait un remplacement valable. Cette méthode (i) élimine le besoin d’un mélangeur à gradient, ce qui réduit l’équipement requis ; — permet de gagner du temps le jour de l’expérience, puisque le gradient peut être préparé à l’avance ; et (iii) est hautement reproductible (figure 3) lorsqu’il est préparé selon la méthode décrite, qui consiste à congeler les étapes individuelles avant de superposer la suivante. Ces gradients peuvent également être stockés indéfiniment à −20°C. De plus, la charge du gradient de sédimentation suggéré ici est également plus facile que d’avoir à superposer le mélange de vésicules sous le gradient, comme décrit dans des méthodes similaires 9,32. Le chargement d’un gradient de flottaison nécessite une seringue avec une longue canule pour passer le gradient déjà coulé. Cette étape a toujours été problématique en raison du risque de destruction du gradient. Un autre avantage de cette méthode est le temps de centrifugation plus faible de 12 h par rapport à 24 h32, ce qui réduit considérablement le temps et l’énergie nécessaires à cette méthode. La faisabilité et la reproductibilité de la procédure améliorée décrite ici sont mises en évidence par l’identification récente du site de contact indépendant de MICOS formé par Cqd1 et Por1-Om1428.

Cependant, cette expérience reste très complexe. Afin d’obtenir des résultats optimaux, il y a plusieurs critères essentiels qui doivent être pris en considération lors de l’application de ce protocole.

L’un des aspects les plus importants est la qualité des mitochondries. Ceux-ci doivent être fraîchement isolés. Par conséquent, la culture de levure ainsi que l’isolement des mitochondries doivent être pris en compte lors de la planification de la procédure. Un traitement doux des mitochondries pendant l’isolement empêchera la perturbation des membranes, tandis qu’il est également essentiel d’inhiber les protéases avec une concentration appropriée de PMSF ou, alternativement, des cocktails d’inhibiteurs de protéase disponibles dans le commerce34.

Une autre étape importante, et l’un des aspects les plus critiques de la procédure, est la sonication. Il est important de noter qu’il est possible d’estimer l’intensité correcte de l’impulsion ultrasonore par le son généré par le tourbillonnement de la suspension (voir vidéo). Cependant, les conditions optimales doivent être déterminées expérimentalement pour chaque installation expérimentale, non seulement en fonction de différentes marques et modèles, mais aussi de différentes machines d’un même modèle. Notamment, le démontage et le nettoyage de la pointe affectent également l’intensité de la sonication, rendant ainsi un réajustement des conditions nécessaires. La recommandation dans le protocole est également d’utiliser une cellule à rosette pour une plus grande efficacité, mais d’autres vaisseaux pourraient également fonctionner. Une sonication trop dure entraînera la formation de vésicules artificiellement mélangées. Cela se traduira par une forte accumulation de protéines membranaires internes et externes dans des fractions de densité intermédiaire, qui peuvent être encore plus fortes, comme dans l’exemple présenté (Figure 4B). Si cela se produit, il faut réduire l’amplitude ou le temps de la sonication. Cependant, des problèmes peuvent également survenir lorsque la sonication n’est pas assez intense. Dans ce cas, le rendement des vésicules générées pourrait être trop faible pour détecter les protéines par immunotransfert et, par conséquent, il faudrait augmenter l’amplitude, le temps ou les cycles de sonication.

Enfin, le gradient est important pour la séparation des différentes espèces de vésicules générées. Cependant, le maximum et le minimum optimaux du gradient de saccharose, ainsi que le nombre de pas, peuvent également varier en fonction de la configuration individuelle. Ici, un gradient en cinq étapes avec un maximum de 1,3 M de saccharose et un minimum de 0,8 M de saccharose a suffi pour une séparation visible et reproductible des vésicules contenant le site de contact des vésicules membranaires internes et externes mitochondriales. Au début, il est essentiel de choisir des conditions qui laissent des fractions vides au-dessus des vésicules de la membrane externe mitochondriale et en dessous des vésicules de la membrane interne mitochondriale pour assurer une séparation correcte. La compression des fractions supérieure ou inférieure peut entraîner la formation d’artefacts. Aux étapes ultérieures, lorsque la molarité précise du saccharose à laquelle les vésicules membranaires internes et externes s’accumuleront est connue, le gradient peut être optimisé en augmentant ou en diminuant les concentrations maximales et minimales de saccharose pour améliorer la résolution entre la membrane interne, la membrane externe et les sites de contact. Il convient de noter que les conditions de croissance de la levure peuvent affecter le comportement des vésicules générées lors de la centrifugation de densité. Ici, la levure a été cultivée sur un milieu riche en YP (extrait de levure à 1 % [p/v], peptonone à 2 % [p/v], pH 5,5) contenant du glycérol (3 % [v/v]) comme source de carbone à 30 °C34,44. D’autres conditions de croissance peuvent altérer la composition protéique et lipidique des mitochondries et, par conséquent, la densité des vésicules générées.

La méthode décrite fournit un moyen fiable et reproductible d’isoler les sites de contact. Cependant, l’identification de la composition protéique du site de contact respectif (composants membranaires internes et externes) nécessite des tests supplémentaires tels que l’immunoprécipitation, éventuellement en combinaison avec la spectrométrie de masse. Pour cela, des anticorps spécifiques et des organismes modèles exprimant des versions marquées des protéines candidates sont nécessaires. Lors de l’utilisation de la levure comme organisme modèle, les protéines candidates peuvent être facilement obtenues en raison de la variété des méthodes de modification génétique disponibles et de l’existence de banques marquées45,46,47. Par conséquent, nous avons décidé d’établir et d’optimiser ce protocole pour les mitochondries de levure. Bien qu’il soit possible d’adapter la méthode pour les mitochondries isolées d’autres organismes, la levure a l’avantage de permettre d’obtenir de grandes quantités de mitochondries de manière rapide et peu coûteuse. De plus, l’utilisation de la levure comme organisme modèle pour la collecte des premiers résultats est un moyen éprouvé d’identifier les complexes protéiques et les processus qui sont conservés chez les eucaryotes supérieurs jusqu’à l’homme. Comme indiqué précédemment, après l’identification et la caractérisation de MICOS chez la levure 9,10,11, il a été montré que MICOS est conservé dans sa forme et sa fonction chez les eucaryotes supérieurs 21. Cqd1 et Por1, composants du sitede contact 28 indépendant de MICOS récemment découvert, sont également conservés, ce qui indique que ce site de contact est également présent chez les eucaryotes supérieurs.

L’importance de poursuivre la recherche sur ces sites de contact est soulignée par les liens de MICOS avec diverses maladies neurodégénératives 18,48,49,50,51,52,53,54. La phosphorylation correcte de Mic60 par PINK1 a été liée au maintien des jonctions de la crête dans la drosophilia et, par conséquent, cette voie, qui est conservée chez l’homme, peut être liée à la maladie de Parkinson48. De plus, une mutation ponctuelle dans la sous-unité MICOS humaine Mic14 entraîne une déstabilisation de MICOS et l’altération subséquente de l’ultrastructure mitochondriale, qui ont été trouvées chez des patients souffrant de démence frontotemporale et de sclérose latérale amyotrophique 50,51,52,53,54. Étant donné que Mic14 est conservé de la levure à l’homme, d’autres études sur cette protéine pourraient être menées en utilisant la levure comme organisme modèle. Cette recherche fondamentale pourrait conduire à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents de ces maladies, ce qui pourrait accélérer le développement de traitements et de thérapies efficaces pour ces maladies. De plus, les découvertes récentes d’autres sites de contact indépendants de MICOS27,28 indiquent que ce champ est encore en croissance. Par conséquent, le protocole présenté ici pourrait aider à faire progresser cette recherche prometteuse et fascinante.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Acknowledgments

M.E.H. remercie la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projet numéro 413985647, pour son soutien financier. Les auteurs remercient le Dr Michael Kiebler, de l’Université Ludwig-Maximilians de Munich, pour son soutien généreux et étendu. Nous sommes reconnaissants à Walter Neupert pour sa contribution scientifique, ses discussions utiles et son inspiration continue. J.F. remercie la Graduate School Life Science Munich (LSM) pour son soutien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm Beckman Instruments, Germany 344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm Beckman Instruments, Germany 363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g Beckman Instruments, Germany 363055
Abbe refractometer Zeiss, Germany discontinued,
any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller Brandtech, USA BR26320 discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL DWK Life Science, Germany C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D Branson Ultrasonics, USA FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP Branson Ultrasonics, USA 101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell Branson Ultrasonics, USA 15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26 Beckman Instruments, Germany B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra Beckman Instruments, Germany 8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail Roche, Switzerland 11697498001
D-Sorbit Roth, Germany 6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) Roth, Germany 8043
Erlenmeyer flask, 100 mL Roth, Germany X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 Hirschmann, Germany 1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 Hirschmann, Germany 1180153
ice bath neoLab, Germany  S12651
Magnetic stirrer RCT basic IKA-Werke GmbH, Germany Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) Gerbu, Germany 1081
MyPipetman Select P1000 Gilson, USA FP10006S
MyPipetman Select P20 Gilson, USA FP10003S
MyPipetman Select P200 Gilson, USA FP10005S
Omnifix 1 mL Braun, Germany 4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Serva, Germany 32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm Braun, Germany 4022495052414
stirring bar, 15 mm VWR, USA 442-0366
Sucrose Merck, Germany S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Instruments, Germany 331362
Test tubes Eppendorf, Germany 3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel VWR, USA 432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip VWR, USA 432-0212
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma Aldrich, Germany 33731 discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS Roth, Germany 4855

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References

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

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Une méthode améliorée pour isoler les sites de contact mitochondrial
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Khosravi, S., Frickel, J., Harner,… More

Khosravi, S., Frickel, J., Harner, M. E. An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites. J. Vis. Exp. (196), e65444, doi:10.3791/65444 (2023).

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