Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65444
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
* These authors contributed equally

Summary

مواقع ملامسة الميتوكوندريا هي مجمعات بروتينية تتفاعل مع بروتينات الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا. هذه المواقع ضرورية للتواصل بين أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي بين السيتوسول ومصفوفة الميتوكوندريا. نصف هنا طريقة لتحديد المرشحين المؤهلين لهذه الفئة المحددة من البروتينات.

Abstract

توجد الميتوكوندريا في جميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا وتؤدي وظائف أساسية تتجاوز إنتاج الطاقة ، على سبيل المثال ، تخليق مجموعات الحديد والكبريت أو الدهون أو البروتينات ، والتخزين المؤقت Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج. وبالمثل ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى أمراض بشرية حادة مثل السرطان والسكري والتنكس العصبي. من أجل أداء هذه الوظائف ، يجب على الميتوكوندريا التواصل مع بقية الخلية عبر غلافها ، والذي يتكون من غشاءين. لذلك ، يجب أن يتفاعل هذان الغشاءان باستمرار. مواقع الاتصال البروتينية بين الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا ضرورية في هذا الصدد. حتى الآن ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال. في الطريقة الموضحة هنا ، تستخدم Saccharomyces cerevisiae mitochondria لعزل مواقع الاتصال ، وبالتالي تحديد المرشحين المؤهلين للحصول على بروتينات موقع الاتصال. استخدمنا هذه الطريقة لتحديد موقع ملامسة الميتوكوندريا ومجمع نظام تنظيم cristae (MICOS) ، وهو أحد مجمعات تكوين موقع التلامس الرئيسية في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم حفظه من الخميرة إلى البشر. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين هذه الطريقة لتحديد موقع اتصال جديد يتكون من Cqd1 ومجمع Por1-Om14.

Introduction

تؤدي الميتوكوندريا مجموعة متنوعة من الوظائف المختلفة في حقيقيات النوى، وأكثرها شهرة إنتاج الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفسفرة التأكسدية. تشمل الوظائف الأخرى إنتاج مجموعات الحديد والكبريت ، وتخليق الدهون ، وفي حقيقيات النوى العليا ، وإشارات Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج1،2،3،4. ترتبط هذه الوظائف ارتباطا لا ينفصم ببنيتها الفائقة المعقدة.

تم وصف البنية الفوقية للميتوكوندريا لأول مرة بواسطة المجهر الإلكتروني5. وقد تبين أن الميتوكوندريا هي عضيات معقدة إلى حد ما تتكون من غشاءين: الغشاء الخارجي للميتوكوندريا والغشاء الداخلي للميتوكوندريا. وبالتالي ، يتم تشكيل مقصورتين مائيتين بواسطة هذه الأغشية: الفضاء بين الغشاء والمصفوفة. يمكن تقسيم الغشاء الداخلي للميتوكوندريا إلى أقسام مختلفة. يبقى الغشاء الحدودي الداخلي على مقربة من الغشاء الخارجي ، ويشكل cristae غزوات. ما يسمى تقاطعات crista تربط الغشاء الحدودي الداخلي و cristae (الشكل 1). علاوة على ذلك ، تكشف الصور المجهرية الإلكترونية للميتوكوندريا المنكمشة تناضحيا عن وجود مواقع ترتبط فيها أغشية الميتوكوندريا بإحكام 6,7. تتشكل مواقع الاتصال المزعومة هذه بواسطة مجمعات بروتينية تمتد على الغشاءين (الشكل 1). يعتقد أن مواقع التفاعل هذه ضرورية لصلاحية الخلية نظرا لأهميتها لتنظيم ديناميكيات الميتوكوندريا والوراثة ، وكذلك نقل المستقلبات والإشارات بين السيتوسول والمصفوفة8.

من المحتمل أن يكون مجمع MICOS في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا هو أفضل مركب مميز وأكثر تنوعا لتشكيل موقع الاتصال. تم وصف MICOS في الخميرة في عام 2011 ، ويتكون من ست وحدات فرعية9،10،1 1: Mic60 و Mic27 و Mic26 و Mic19 و Mic12 و Mic10. هذه تشكل مجمعا من حوالي 1.5 MDa الذي يتمركز إلى تقاطعات crista9،10،11. يؤدي حذف أي من الوحدات الفرعية الأساسية ، Mic10 أو Mic60 ، إلى عدم وجود هذا المجمع 9,11 ، مما يعني أن هاتين الوحدتين الفرعيتين ضروريتان لاستقرار MICOS. ومن المثير للاهتمام ، أن MICOS لا يشكل موقعا واحدا فحسب ، بل مواقع اتصال متعددة مع بروتينات ومجمعات غشاء خارجي مختلفة من الميتوكوندريا: مجمع TOM 11,12 ، مركب TOB / SAM 9,12,13,14,15,16 ، مجمع Fzo1-Ugo1 9 ، Por1 10 ، OM45 10 ، و Miro 17. يشير هذا بقوة إلى أن مجمع MICOS يشارك في عمليات الميتوكوندريا المختلفة ، مثل استيراد البروتين ، واستقلاب الفوسفوليبيد ، وتوليد البنية الفوقية للميتوكوندريا18. من المحتمل أن تكون الوظيفة الأخيرة هي الوظيفة الرئيسية ل MICOS ، حيث أن غياب مركب MICOS الناجم عن حذف MIC10 أو MIC60 يؤدي إلى بنية فائقة غير طبيعية للميتوكوندريا تفتقر تماما إلى cristae منتظم. بدلا من ذلك ، تتراكم حويصلات الغشاء الداخلي دون اتصال بغشاء الحدود الداخلية19 ، 20. الأهم من ذلك ، يتم الحفاظ على MICOS في الشكل والوظيفة من الخميرة إلىالإنسان 21. يؤكد ارتباط الطفرات في الوحدات الفرعية MICOS بالأمراض البشرية الشديدة أيضا على أهميتها لحقيقيات النوى الأعلى22,23. على الرغم من أن MICOS متعدد الاستخدامات للغاية ، يجب أن توجد مواقع اتصال إضافية (بناء على ملاحظاتنا غير المنشورة). في الواقع ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال الأخرى ، على سبيل المثال ، آلات اندماج الميتوكوندريا Mgm1-Ugo1 / Fzo124،25،26 أو Mdm31-Por1 ، والتي تشارك في التخليق الحيوي للفوسفوليبيد الكارديوليبين27 الخاص بالميتوكوندريا. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين الطريقة التي قادتنا إلى تحديد MICOS لتحديد Cqd1 كجزء من موقع اتصال جديد تم تشكيله مع مجمع الغشاء الخارجي Por1-Om1428. ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن موقع الاتصال هذا يشارك أيضا في عمليات متعددة مثل توازن غشاء الميتوكوندريا ، واستقلاب الفوسفوليبيد ، وتوزيع الإنزيم المساعد Q28,29.

هنا ، استخدمنا اختلافا في التجزئة الموصوفة سابقا للميتوكوندريا9،30،31،32،33. تؤدي المعالجة الاسموزية للميتوكوندريا إلى تعطيل الغشاء الخارجي للميتوكوندريا وانكماش مساحة المصفوفة ، تاركة الغشاءين على مقربة فقط في مواقع الاتصال. وهذا يسمح لتوليد الحويصلات التي تتكون حصرا من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا أو الغشاء الداخلي الميتوكوندريا أو في تحتوي على مواقع الاتصال من كلا الغشاء من خلال صوتنة خفيفة. نظرا لأن الغشاء الداخلي للميتوكوندريا يحتوي على نسبة بروتين إلى دهون أعلى بكثير ، فإن حويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا تظهر كثافة أعلى مقارنة بحويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. يمكن استخدام الفرق في الكثافة لفصل الحويصلات الغشائية من خلال الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز الطافية. وهكذا ، تتراكم حويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا بتركيزات منخفضة من السكروز ، بينما يتم إثراء حويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا بتركيزات عالية من السكروز. تتركز الحويصلات التي تحتوي على مواقع التلامس بتركيزات السكروز المتوسطة (الشكل 2). يصف البروتوكول التالي هذه الطريقة المحسنة ، والتي تتطلب معدات ووقتا وطاقة أقل تخصصا مقارنة ببروتوكولنا الذي أنشأناهسابقا 32 ، بالتفصيل ويوفر أداة مفيدة لتحديد بروتينات موقع الاتصال المحتملة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المخازن المؤقتة وحلول المخزون

  1. اصنع محلول 1 M 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 7.4. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  2. تحضير 500 mM حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 8.0. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير 2.4 متر السوربيتول في الماء منزوع الأيونات. تخزينها في درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم.
  4. تحضير 2.5 متر السكروز في الماء منزوع الأيونات. تخزينها في درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم.
  5. تحضير 200 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) في الأيزوبروبانول. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    تنبيه: PMSF سام إذا تم ابتلاعه ويسبب حروقا شديدة في الجلد وتلفا في العين. لا تتنفس الغبار ، وارتداء القفازات والنظارات الواقية.
  6. تحضير 72٪ حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) في الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    تنبيه: قد يسبب TCA تهيج الجهاز التنفسي وحروق الجلد الشديدة وتلف العين. لا تتنفس الغبار ، وارتداء القفازات والنظارات الواقية.
  7. تحضير المخزن المؤقت SM: 20 mM MOPS و 0.6 M السوربيتول ، درجة الحموضة 7.4.
  8. تحضير المخزن المؤقت للتورم: 20 مللي متر MOPS ، 0.5 mM EDTA ، 1 mM PMSF ، وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، درجة الحموضة 7.4.
  9. تحضير مخازن تدرج السكروز: 0.8 م ، 0.96 م ، 1.02 م ، 1.13 م ، و 1.3 م سكروز في 20 مللي مول مماسح ، و 0.5 مللي مول EDTA ، درجة الحموضة 7.4.
    ملاحظة: يمكن تخزين جميع المخازن المؤقتة عند 4 درجات مئوية ؛ ومع ذلك ، يوصى بتخزين المخازن المؤقتة المحتوية على السكروز عند -20 درجة مئوية لتجنب نمو الفطريات. يجب إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني طازجة قبل الاستخدام.

2. توليد الحويصلات تحت الميتوكوندريا

  1. عزل الميتوكوندريا الخميرة الخام طازجة وفقا للبروتوكولات المعمول بها34,35.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، تم عزل الميتوكوندريا من Saccharomyces cerevisiae. توليد الميتوكوندريا النقية المتدرجة الخالية من العضيات الأخرى ليست ضرورية.
  2. أعد تعليق 10 ملغ من الميتوكوندريا المعزولة حديثا في مخزن مؤقت 1.6 مل SM (4 درجات مئوية) عن طريق السحب (الشكل 2 ، الخطوة 1).
  3. انقل معلق الميتوكوندريا إلى دورق Erlenmeyer المبرد مسبقا سعة 100 مل.
  4. أضف ببطء 16 مل من المخزن المؤقت للتورم باستخدام ماصة زجاجية سعة 20 مل. ضع تقليبا خفيفا ثابتا على الثلج أثناء الإضافة. ينتج عن هذه المعالجة التناضحية امتصاص الماء في مساحة المصفوفة. سيؤدي تورم الغشاء الداخلي للميتوكوندريا إلى تعطيل الغشاء الخارجي. ومع ذلك ، سيبقى كلا الغشاءين على اتصال في مواقع الاتصال9 (الشكل 2 ، الخطوة 2).
  5. احتضان العينات تحت التحريك الخفيف المستمر لمدة 30 دقيقة على الثلج.
  6. أضف ببطء 5 مل من محلول السكروز 2.5 M باستخدام ماصة زجاجية 5 مل لزيادة تركيز السكروز في العينات إلى 0.55 M تقريبا. ينتج عن هذه المعالجة التناضحية تدفق المياه من المصفوفة36. يهدف انكماش الغشاء الداخلي إلى زيادة المسافة إلى الأجزاء المتبقية من الغشاء الخارجي. هذا يقلل من احتمال توليد حويصلات هجينة اصطناعية من الأغشية الداخلية والخارجية من خلال صوتنة (الشكل 2 ، الخطوة 3).
  7. احتضان العينات تحت التحريك الخفيف لمدة 15 دقيقة على الثلج.
  8. إخضاع الميتوكوندريا للصوتنة لتوليد حويصلات غشاء تحت الميتوكوندريا (الشكل 2 ، الخطوة 4).
    1. انقل تعليق الميتوكوندريا إلى خلية وردة مبردة مسبقا.
    2. قم بتنشيط تعليق الميتوكوندريا بسعة 10٪ لمدة 30 ثانية أثناء تبريد خلية الوردة في حمام جليدي.
    3. ضع التعليق لمدة 30 ثانية في حمام جليدي.
    4. كرر الخطوة 2.8.2 والخطوة 2.8.3 ثلاث مرات أخرى.
      ملاحظة: ستختلف شروط الصوتنة وفقا للصوتنة المستخدمة. سيكون التحسين ضروريا للأجهزة الفردية. سيؤدي Sonication القاسي للغاية إلى تكوين حويصلات اصطناعية تتكون من أغشية داخلية وخارجية للميتوكوندريا.

3. فصل الحويصلات تحت الميتوكوندريا

  1. افصل الحويصلات المتولدة عن الميتوكوندريا السليمة المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سوف الميتوكوندريا السليمة بيليت بينما ستبقى الحويصلات في المادة الطافية.
  2. تركيز خليط الحويصلة.
    1. نقل طاف إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة.
    2. قم بتحميل وسادة سعة 0.3 مل من محلول السكروز 2.5 متر في قاع الأنبوب باستخدام حقنة سعة 1 مل مزودة بقنية 0.8 مم × 120 مم.
    3. أجهزة الطرد المركزي عند 118000 × جم لمدة 100 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام دوار دلو متأرجح بنصف قطر أقصى يبلغ 153.1 مم. تعتمد ظروف الطرد المركزي بشدة على الدوار وسيتعين تكييفها عند استخدام دوار آخر.
  3. ستظهر الحويصلات كقرص في الجزء العلوي من وسادة السكروز بعد الطرد المركزي. تخلص من حوالي 90٪ من المادة الطافية. الآن ، احصد الحويصلات المركزة عن طريق تعليقها في المخزن المؤقت المتبقي بما في ذلك السكروز 2.5 متر عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. انقل التعليق إلى خالط Dounce المثلج.
  4. تجانس التعليق مع ما لا يقل عن 10 ضربات باستخدام الخزاف polytetrafluoroethylene.
  5. تحضير التدرج السكروز.
    1. بالنسبة لتدرج خطوة 11 مل مع خمس خطوات (1.3 م ، 1.13 م ، 1.02 م ، 0.96 م ، و 0.8 م سكروز في 20 مللي مول ممسحة و 0.5 مللي مول EDTA ، درجة حموضة 7.4) ، تحتوي كل طبقة على 2.2 مل من محلول السكروز.
      ملاحظة: يوصى باستخدام مقياس إنكسار لقياس وضبط تركيزات السكروز. ومع ذلك ، فإنه ليس ضروريا. ضع 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت على مقياس الانكسار ، واكتشف مؤشرات الانكسار ذات الصلة. حساب تركيز السكروز على النحو التالي:
      Equation 1
      1.3333 يمثل معامل الانكسار للماء. 0.048403 هو مؤشر تحويل خاص بالسكروز تم الحصول عليه من القياس الخطي للانكسار المولي إلى تركيز السكروز في المحاليل المائية 37.
    2. أضف أعلى تركيز للسكروز إلى أنبوب الطرد المركزي ، وضع الأنبوب عند -20 درجة مئوية. انتظر حتى يتم تجميد الطبقة تماما قبل تطبيق الطبقة التالية. استمر وفقا لذلك حتى تتم إضافة الطبقة الأخيرة ، وقم بتخزين التدرجات عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: تذكر نقل التدرجات المجمدة إلى 4 درجات مئوية عند بدء التجربة للسماح بالتدرجات بالذوبان. سيستغرق هذا حوالي 3 ساعات. بالنسبة للطرد المركزي هنا ، تم استخدام دوار دلو متأرجح بسعة 13.2 مل. عند استخدام دوار مختلف ، يجب تكييف أحجام خطوة التدرج وفقا لذلك.
  6. قم بقياس تركيز السكروز للعينات باستخدام مقياس الانكسار. إذا لم يكن هناك وصول إلى مقياس الانكسار ، فيمكن للمرء أن يفترض بدلا من ذلك أن تركيز السكروز هو 2 M. سيكون تركيز السكروز المفترض هذا هو الأساس للخطوة التالية.
  7. اضبط تركيز السكروز على 0.6 متر عن طريق إضافة كمية مناسبة من 20 مللي مول MOPS ، 0.5 mM EDTA ، 1 mM PMSF ، وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، درجة الحموضة 7.4. إذا تم تقدير تركيز السكروز ب 2 متر بدلا من قياسه ، فمن المستحسن اختبار ما إذا كان التركيز منخفضا بدرجة كافية بعد التعديل. ضع حصة صغيرة من العينة (حوالي 50 ميكرولتر) فوق 200 ميكرولتر من السكروز 0.8 M في أنبوب اختبار. يجب أن تظل العينة فوق السكروز 0.8 M.
  8. قم بتحميل العينات (حوالي 1 مل) أعلى تدرج السكروز (احتفظ بنسبة 10٪ للرجوع إليها لاحقا). يعد السحب الدقيق أمرا مهما لتجنب اضطراب التدرج (الشكل 2 ، الخطوة 5).
  9. افصل الحويصلات عن طريق الطرد المركزي عند 200000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة. إذا أمكن ، اضبط جهاز الطرد المركزي على إبطاء التسارع والتباطؤ لتجنب اضطراب التدرج (الشكل 2 ، الخطوة 6).
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام دوار دلو متأرجح بنصف قطر أقصى يبلغ 153.1 مم. تعتمد ظروف الطرد المركزي بشدة على الدوار وسيتعين تكييفها عند استخدام دوار آخر.
  10. احصد التدرج من أعلى إلى أسفل في أجزاء 700 ميكرولتر باستخدام ماصة 1 مل. سيؤدي ذلك إلى 17 كسرا ، مما يسمح بدقة كافية.

4. تحليل الحويصلات تحت الميتوكوندريا

  1. تركيز البروتينات عن طريق إخضاع كل جزء لاثنين من ترسبات TCA التي يتم إجراؤها بالتتابع38 لإعداد عينات SDS-PAGE.
    1. أضف 200 ميكرولتر من 72٪ TCA إلى الكسور الفردية ، واخلطها حتى يصبح المحلول متجانسا. احتضان الكسور لمدة 30 دقيقة على الجليد ، وحبيبات البروتينات المترسبة عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول TCA بنسبة 28٪ ، واخلطها جيدا ، وكرر خطوة الطرد المركزي.
    2. اغسل الكريات ب 1 مل من الأسيتون (-20 درجة مئوية) ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 20000 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية, واترك الكريات تجف في الهواء. أعد تعليق الكريات في 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS ، واحتضان العينات لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.
      ملاحظة: ستبقى كمية كبيرة من السكروز ، خاصة في الأجزاء عالية الكثافة ، بعد هطول الأمطار TCA الأول. ستتم إزالة هذا من خلال هطول الأمطار TCA الإضافي.
  2. قم بتحليل 20 ميكرولتر من كل كسر بواسطة SDS-PAGE39 وimmunoblotting 40،41،42،43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من السهل نسبيا فصل الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن توليد وفصل الحويصلات المحتوية على موقع الاتصال أكثر صعوبة. في رأينا ، هناك خطوتان حاسمتان وضروريتان: شروط الصوتنة والتدرج المستخدم.

عادة ، يعتقد أن التدرجات الخطية لها دقة أفضل مقارنة بتدرجات الخطوات. ومع ذلك ، فإن إنتاجها القابل للتكرار ممل ويتطلب معدات خاصة. لذلك ، أنشأنا طريقة لإنشاء تدرج خطوة مع اختلافات صغيرة نسبيا بين الخطوات الفردية (انظر الخطوة 3.5). لقد تكهننا بأن تدرج الخطوة سيكون متوازنا عند الطرد المركزي ، مما يؤدي إلى تدرج خطي تقريبا. ومن اللافت للنظر أن تحديد تركيزات السكروز للكسور الفردية بعد الطرد المركزي باستخدام مقياس إنكسار كشف أن تدرج الخطوة تحول بالفعل إلى خطي تقريبا بعد 12 ساعة من الطرد المركزي عند 200000 × جم (الشكل 3).

تتجلى أهمية الصوتنة الخفيفة في هذه النتائج التمثيلية. في ظروف الصوتنة المعتدلة (الشكل 4 أ) ، تم إثراء علامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا Tom40 في الكسور المبكرة منخفضة الكثافة (الكسر رقم 4) وكانت غائبة تقريبا في الأجزاء اللاحقة. تركزت علامة الغشاء الداخلي للميتوكوندريا Tim17 في كسور عالية الكثافة (الكسر رقم 17). في المقابل ، تراكم بروتين موقع التلامس Mic60 في أجزاء من تركيز السكروز الوسيط (الكسر رقم 12-14) ، مما يشير إلى التوليد الناجح والفصل اللاحق للحويصلات الغشائية المختلفة. في المقابل ، مع ظروف صوتنة أكثر قسوة ، يمكن اكتشاف علامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا Tom40 في الأجزاء السفلية من التدرج (الكسر رقم 14 والكسر رقم 17 ، الشكل 4 ب). بالإضافة إلى ذلك ، كان هناك كمية كبيرة من Tim17 في كسور الكثافة المتوسطة (الكسر رقم 13 والكسر رقم 14 ، الشكل 4 ب). يشير التراكم غير المحدد لعلامات الغشاء الخارجي والداخلي في كسور الكثافة المتوسطة إلى التكوين الاصطناعي للأغشية المختلطة ، مما يمنع تحديد البروتينات المرشحة.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبنية الفوقية للميتوكوندريا. تمثيل تخطيطي للميتوكوندريا لإظهار الأجزاء والأغشية ومواقع البروتين المختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: سير عمل تجزئة الميتوكوندريا لعزل بروتينات موقع التماس. نظرة عامة تخطيطية للعملية الموضحة في البروتوكول. كانت الميتوكوندريا (1) المعزولة حديثا (2) منتفخة تناضحيا (3) ثم تقلصت. (4) تم الاعتراض على الميتوكوندريا المنكمشة على صوتنة خفيفة لتوليد حويصلات تحت الميتوكوندريا. (5) تم تركيز خليط الحويصلة وتحميله على تدرج خطوة السكروز. (6) من خلال الطرد المركزي ، تم إثراء حويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا بتركيز منخفض من السكروز ، وحويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا بتركيز عال من السكروز ، والحويصلات المحتوية على موقع التلامس بتركيز سكروز متوسط. الاختصارات: MIM ، الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. MOM ، الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توليد تدرج خطي عن طريق الطرد المركزي. تم تحضير تدرجين خطويين (1.3 م ، 1.13 م ، ثم 1.02 م ، 0.96 م ، و 0.8 م في 20 ملي مول MOPS و 0.5 mM EDTA ، الرقم الهيدروجيني 7.4) على التوازي ، وتم تحميل 1 مل من السكروز 0.6 M في 20 mM MOPS و 0.5 mM EDTA ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، على كلا التدرجين. تعرضت التدرجات للطرد المركزي عند 200000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة وتم حصادها في 17 جزءا لكل منها. تم اختبار استنساخ الطريقة عن طريق تحديد تركيز السكروز للكسور المفردة من التدرجات الفردية باستخدام مقياس الانكسار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: عزل بروتينات موقع التلامس بنبضة فوق صوتية محددة جيدا. (أ، ب) تعرضت الميتوكوندريا الخميرة المعزولة حديثا للعلاج التناضحي وتعرضت للصوتنة. تم فصل الحويصلات المتولدة باستخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز الطافية. تم تجزئة التدرج ، وتعرضت البروتينات في الكسور المختلفة لهطول TCA. تم تحليل توزيع بروتينات الواسمات للغشاء الخارجي للميتوكوندريا (Tom40) والغشاء الداخلي للميتوكوندريا (Tim17) ومواقع الاتصال (Mic60) عن طريق النشاف المناعي باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها. (أ) صوتنة خفيفة (4 × 30 ثانية ، سعة 10٪) أدت إلى فصل واضح لبروتينات الغشاء الخارجي (الكسور منخفضة الكثافة) وبروتينات الغشاء الداخلي (الكسور عالية الكثافة). بالإضافة إلى ذلك ، تم إثراء بروتين موقع الاتصال Mic60 بنجاح في أجزاء من الكثافة المتوسطة. (ب) صوتنة أقسى (4 × 30 ثانية ، سعة 20٪) أدت إلى توليد حويصلات هجينة ، وبالتالي لم تسمح بفصل واضح لمواقع الاتصال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تجزئة الميتوكوندريا هي تجربة معقدة مع عدة خطوات معقدة للغاية. لذلك ، كنا نهدف إلى زيادة تحسين ، وإلى حد ما ، تبسيط طريقتنا32 المعمول بها. هنا ، كانت التحديات هي الحاجة إلى معدات معقدة ومتخصصة للغاية ، والتي غالبا ما تكون إنشاءات فردية ، والوقت الهائل واستهلاك الطاقة. تحقيقا لهذه الغاية ، حاولنا إزالة المضخات والإنشاءات الفردية المستخدمة في صب وحصاد التدرج الخطي وتغييرها إلى تدرج متدرج. الأهم من ذلك ، أدركنا أنه ، على الأقل عند تحضيره كما هو موضح هنا ، يصبح التدرج خطيا أثناء الطرد المركزي ، مما يجعل هذا بديلا صالحا. هذه الطريقة (i) تلغي الحاجة إلى خلاط متدرج ، وبالتالي تقليل المعدات المطلوبة ؛ (ii) يوفر الوقت في يوم التجربة ، حيث يمكن تحضير التدرج مسبقا ؛ و (iii) قابلة للتكرار بدرجة كبيرة (الشكل 3) عند تحضيرها وفقا للطريقة الموصوفة ، والتي تتضمن تجميد الخطوات الفردية قبل وضع الطبقة التالية في الأعلى. يمكن أيضا تخزين هذه التدرجات إلى أجل غير مسمى عند -20 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تحميل تدرج الترسيب المقترح هنا أسهل أيضا من الاضطرار إلى وضع طبقة من خليط الحويصلة تحت التدرج ، كما هو موضح في طرق مماثلة 9,32. يتطلب تحميل تدرج الطفو حقنة ذات قنية طويلة لتمرير التدرج المصبوب بالفعل. كانت هذه الخطوة دائما إشكالية بسبب خطر تدمير التدرج. ميزة أخرى لهذه الطريقة هي انخفاض وقت الطرد المركزي من 12 ساعة مقارنة ب 24 ساعة32 ، مما يقلل بشكل كبير من الوقت والطاقة اللازمة لهذه الطريقة. تم تسليط الضوء على جدوى وقابلية تكرار الإجراء المحسن الموصوف هنا من خلال التحديد الأخير لموقع الاتصال المستقل MICOS الذي تم تشكيله بواسطة Cqd1 و Por1-Om1428.

ومع ذلك ، لا تزال هذه التجربة معقدة للغاية. من أجل الحصول على أفضل النتائج ، هناك العديد من المعايير الأساسية التي يجب أخذها في الاعتبار عند تطبيق هذا البروتوكول.

واحدة من أهم الجوانب هي نوعية الميتوكوندريا. يجب أن تكون هذه معزولة حديثا. لذلك ، يجب أن تؤخذ زراعة الخميرة وكذلك عزل الميتوكوندريا في الاعتبار أثناء التخطيط للإجراء. العلاج اللطيف للميتوكوندريا أثناء العزل سيمنع تعطيل الأغشية ، في حين أنه من الأهمية بمكان أيضا تثبيط البروتياز بتركيز مناسب من PMSF أو ، بدلا من ذلك ، كوكتيلات مثبطات الأنزيم البروتيني المتاحة تجاريا34.

خطوة أخرى مهمة ، واحدة من أهم جوانب الإجراء ، هي صوتنة. الأهم من ذلك ، من الممكن تقدير الكثافة الصحيحة للنبضة فوق الصوتية من خلال الصوت المتولد من خلال دوامة التعليق (انظر الفيديو). ومع ذلك ، يجب تحديد الظروف المثلى تجريبيا لكل إعداد تجريبي ، ليس فقط بناء على العلامات التجارية والنماذج المختلفة ولكن أيضا على آلات مختلفة من نفس الطراز. والجدير بالذكر أن تفكيك وتنظيف الطرف يؤثر أيضا على شدة الصوتنة ، مما يجعل إعادة ضبط الظروف اللازمة. التوصية الواردة في البروتوكول هي أيضا استخدام خلية وردة لتحقيق كفاءة أعلى ، ولكن قد تعمل السفن الأخرى أيضا. Sonication التي هي قاسية جدا سيؤدي إلى تشكيل حويصلات مختلطة بشكل مصطنع. سيؤدي ذلك إلى تراكم قوي لبروتينات الغشاء الداخلي والخارجي في أجزاء من الكثافة المتوسطة ، والتي يمكن أن تكون أقوى ، كما في المثال الموضح (الشكل 4 ب). إذا حدث هذا ، ينبغي للمرء أن يقلل من سعة أو وقت صوتنة. ومع ذلك ، يمكن أن تنشأ مشكلات أيضا عندما لا تكون الصوتنة شديدة بما فيه الكفاية. في هذه الحالة ، قد يكون عائد الحويصلات المتولدة منخفضا جدا بحيث لا يمكن اكتشاف البروتينات عن طريق النشاف المناعي ، وبالتالي ، سيتعين على المرء زيادة السعة أو الوقت أو دورات الصوتنة.

أخيرا ، يعد التدرج مهما لفصل أنواع الحويصلات المختلفة المتولدة. ومع ذلك ، يمكن أن يختلف الحد الأقصى والحد الأدنى الأمثل لتدرج السكروز ، وكذلك عدد الخطوات ، اعتمادا على الإعداد الفردي. هنا ، يكفي تدرج من خمس خطوات بحد أقصى 1.3 مليون سكروز و 0.8 متر سكروز كحد أدنى لفصل مرئي وقابل للتكرار للحويصلات المحتوية على موقع التلامس من حويصلات الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا. في البداية ، من الضروري اختيار الظروف التي تترك كسور فارغة فوق حويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا وتحت حويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا لضمان الفصل الصحيح. قد يؤدي ضغط الكسور العلوية أو السفلية إلى ظهور قطع أثرية. في خطوات لاحقة ، عندما تكون المولارية الدقيقة للسكروز التي تتراكم عندها حويصلات الغشاء الداخلي والخارجي معروفة ، يمكن تحسين التدرج عن طريق زيادة أو تقليل الحد الأقصى والحد الأدنى لتركيزات السكروز لتعزيز الدقة بين الغشاء الداخلي والغشاء الخارجي ومواقع الاتصال. تجدر الإشارة إلى أن ظروف نمو الخميرة يمكن أن تؤثر على سلوك الحويصلات المتولدة عند الطرد المركزي الكثافة. هنا ، نمت الخميرة على وسط YP غني (1٪ [w / v] مستخلص الخميرة ، 2٪ [w / v] الببتون ، درجة الحموضة 5.5) التي تحتوي على الجلسرين (3٪ [v / v]) كمصدر للكربون عند 30 درجة مئوية34,44. قد تغير ظروف النمو الأخرى تكوين البروتين والدهون في الميتوكوندريا ، وبالتالي كثافة الحويصلات المتولدة.

توفر الطريقة الموصوفة طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لعزل مواقع الاتصال. ومع ذلك ، فإن تحديد تكوين البروتين لموقع الاتصال المعني (مكونات الغشاء الداخلي والخارجي) يحتاج إلى فحوصات إضافية مثل الترسيب المناعي ، ربما بالاشتراك مع قياس الطيف الكتلي. لهذا ، من الضروري وجود أجسام مضادة محددة وكائنات نموذجية تعبر عن إصدارات موسومة من البروتين المرشح. عند استخدام الخميرة ككائن نموذجي ، يمكن الحصول على البروتين المرشحة بسهولة بسبب تنوع طرق التعديل الوراثي المتاحة ووجود مكتبات موسومة45،46،47. لذلك ، قررنا إنشاء وتحسين هذا البروتوكول لميتوكوندريا الخميرة. على الرغم من أنه يجب أن يكون من الممكن تكييف طريقة الميتوكوندريا المعزولة عن الكائنات الحية الأخرى ، إلا أن الخميرة تتمتع بميزة السماح بالحصول على كميات كبيرة من الميتوكوندريا بطريقة رخيصة وسريعة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الخميرة ككائن نموذجي لجمع النتائج الأولية هو طريقة مثبتة جيدا لتحديد مجمعات البروتين والعمليات المحفوظة في حقيقيات النوى الأعلى حتى البشر. كما ذكرنا من قبل ، بعد تحديد وتوصيف MICOS في الخميرة9،10،11 ، تبين أن MICOS محفوظ في الشكل والوظيفة في حقيقيات النوىالعليا 21. كما يتم الحفاظ على Cqd1 و Por1 ، مكونات موقع الاتصال المستقل عن MICOS المكتشف مؤخرا28 ، مما يشير إلى أن موقع الاتصال هذا موجود أيضا في حقيقيات النوى الأعلى.

يتم التأكيد على أهمية البحث المستمر في مواقع الاتصال هذه من خلال روابط MICOS لمختلف الأمراض التنكسية العصبية18،48،49،50،51،52،53،54. تم ربط الفسفرة الصحيحة ل Mic60 بواسطة PINK1 بالحفاظ على تقاطعات crista في ذبابة الفاكهة ، وبالتالي ، قد يكون هذا المسار ، المحفوظ للبشر ، مرتبطا بمرض باركنسون48. علاوة على ذلك ، تؤدي طفرة نقطية في الوحدة الفرعية MICOS البشرية Mic14 إلى زعزعة استقرار MICOS والتغيير اللاحق للبنية التحتية للميتوكوندريا ، والتي تم العثور عليها في المرضى الذين يعانون من الخرف الجبهي الصدغي والتصلب الجانبي الضموري50،51،52،53،54. نظرا لأن Mic14 محفوظ من الخميرة إلى البشر ، يمكن إجراء مزيد من الدراسات حول هذا البروتين باستخدام الخميرة ككائن نموذجي. قد يؤدي هذا البحث الأساسي إلى فهم أفضل للآليات الأساسية لهذه الأمراض ، والتي يمكن أن تسرع من تطوير العلاج الفعال والعلاجات لهم. علاوة على ذلك ، تشير الاكتشافات الأخيرة لمواقع الاتصال الإضافية المستقلة عن MICOS27,28 إلى أن هذا المجال لا يزال ينمو. لذلك ، قد يساعد البروتوكول المقدم هنا في تقدم هذا البحث الواعد والرائع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تعترف M.E.H. بالدعم المالي للمؤسسة الألمانية (DFG) ، المشروع رقم 413985647. يشكر المؤلفون الدكتور مايكل كيبلر ، جامعة لودفيغ ماكسيميليان ، ميونيخ ، على دعمه السخي والواسع. نحن ممتنون لوالتر نيوبرت على مدخلاته العلمية ومناقشاته المفيدة وإلهامه المستمر. JF يشكر كلية الدراسات العليا لعلوم الحياة في ميونيخ (LSM) على الدعم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm Beckman Instruments, Germany 344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm Beckman Instruments, Germany 363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g Beckman Instruments, Germany 363055
Abbe refractometer Zeiss, Germany discontinued,
any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller Brandtech, USA BR26320 discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL DWK Life Science, Germany C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D Branson Ultrasonics, USA FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP Branson Ultrasonics, USA 101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell Branson Ultrasonics, USA 15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26 Beckman Instruments, Germany B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra Beckman Instruments, Germany 8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail Roche, Switzerland 11697498001
D-Sorbit Roth, Germany 6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) Roth, Germany 8043
Erlenmeyer flask, 100 mL Roth, Germany X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 Hirschmann, Germany 1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 Hirschmann, Germany 1180153
ice bath neoLab, Germany  S12651
Magnetic stirrer RCT basic IKA-Werke GmbH, Germany Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) Gerbu, Germany 1081
MyPipetman Select P1000 Gilson, USA FP10006S
MyPipetman Select P20 Gilson, USA FP10003S
MyPipetman Select P200 Gilson, USA FP10005S
Omnifix 1 mL Braun, Germany 4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Serva, Germany 32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm Braun, Germany 4022495052414
stirring bar, 15 mm VWR, USA 442-0366
Sucrose Merck, Germany S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Instruments, Germany 331362
Test tubes Eppendorf, Germany 3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel VWR, USA 432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip VWR, USA 432-0212
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma Aldrich, Germany 33731 discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS Roth, Germany 4855

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

Tags

مواقع ملامسة الميتوكوندريا ، الميتوكوندريا ، الخلايا حقيقية النواة ، إنتاج الطاقة ، مجموعات الحديد والكبريت ، الدهون ، البروتينات ، التخزين المؤقت Ca2 + ، موت الخلايا المبرمج ، خلل الميتوكوندريا ، الأمراض البشرية ، السرطان ، السكري ، التنكس العصبي ، غلاف الميتوكوندريا ، غشاءان ، مواقع الاتصال البروتينية ، الغشاء الداخلي ، الغشاء الخارجي ، Saccharomyces Cerevisiae Mitochondria ، بروتينات موقع الاتصال ، موقع اتصال الميتوكوندريا ونظام تنظيم Cristae (MICOS) مجمع ، الخميرة للبشر ، Cqd1 و مجمع Por1-OM14
طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khosravi, S., Frickel, J., Harner,… More

Khosravi, S., Frickel, J., Harner, M. E. An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites. J. Vis. Exp. (196), e65444, doi:10.3791/65444 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter