Summary
Mitokondrie kontaktsteder er proteinkomplekser, der interagerer med mitokondrie indre og ydre membranproteiner. Disse steder er afgørende for kommunikationen mellem mitokondriemembranerne og dermed mellem cytosolen og mitokondriematrixen. Her beskriver vi en metode til at identificere kandidater, der kvalificerer sig til denne specifikke klasse af proteiner.
Abstract
Mitokondrier er til stede i stort set alle eukaryote celler og udfører væsentlige funktioner, der går langt ud over energiproduktion, for eksempel syntese af jern-svovlklynger, lipider eller proteiner, Ca2+ buffering og induktion af apoptose. Ligeledes resulterer mitokondriel dysfunktion i alvorlige menneskelige sygdomme som kræft, diabetes og neurodegeneration. For at udføre disse funktioner skal mitokondrier kommunikere med resten af cellen over deres konvolut, som består af to membraner. Derfor skal disse to membraner interagere konstant. Proteinholdige kontaktsteder mellem mitokondriets indre og ydre membraner er afgørende i denne henseende. Indtil videre er der identificeret flere kontaktsteder. I metoden beskrevet her anvendes Saccharomyces cerevisiae mitokondrier til at isolere kontaktsteder og dermed identificere kandidater, der kvalificerer sig til kontaktstedsproteiner. Vi brugte denne metode til at identificere mitokondriekontaktstedet og cristae organizing system (MICOS) komplekset, et af de største kontaktsteddannende komplekser i mitokondriets indre membran, som bevares fra gær til mennesker. For nylig forbedrede vi denne metode yderligere til at identificere et nyt kontaktsted bestående af Cqd1 og Por1-Om14-komplekset.
Introduction
Mitokondrier udfører en række forskellige funktioner i eukaryoter, hvor den mest kendte er produktionen af ATP gennem oxidativ fosforylering. Andre funktioner omfatter produktion af jern-svovlklynger, lipidsyntese og i højere eukaryoter, Ca 2+ signalering og induktion af apoptose 1,2,3,4. Disse funktioner er uadskilleligt forbundet med deres komplekse ultrastruktur.
Mitokondriel ultrastrukturen blev først beskrevet ved elektronmikroskopi5. Det blev vist, at mitokondrier er ret komplekse organeller bestående af to membraner: mitokondriel ydre membran og mitokondriel indre membran. Således dannes to vandige rum af disse membraner: intermembranrummet og matrixen. Mitokondriets indre membran kan opdeles yderligere i forskellige sektioner. Den indre grænsemembran forbliver tæt på den ydre membran, og cristae danner invaginationer. Såkaldte crista-kryds forbinder den indre grænsemembran og cristae (figur 1). Desuden afslører elektronmikrografier af osmotisk krympede mitokondrier, at der findes steder, hvor mitokondriemembranerne er tæt forbundet 6,7. Disse såkaldte kontaktsteder dannes af proteinkomplekser, der spænder over de to membraner (figur 1). Det menes, at disse interaktionssteder er afgørende for cellelevedygtighed på grund af deres betydning for reguleringen af mitokondriedynamik og arv samt overførsel af metabolitter og signaler mellem cytosolen og matrixen8.
MICOS-komplekset i mitokondriets indre membran er sandsynligvis det bedst karakteriserede og mest alsidige kontaktsteddannende kompleks. MICOS blev beskrevet i gær i 2011, og den består af seks underenheder 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 og Mic10. Disse danner et kompleks på ca. 1,5 MDa, der lokaliserer til crista-krydsene 9,10,11. Sletningen af en af kerneunderenhederne, Mic10 eller Mic60, fører til fraværet af denne komplekse 9,11, hvilket betyder, at disse to underenheder er afgørende for stabiliteten af MICOS. Interessant nok danner MICOS ikke kun et, men flere kontaktsteder med forskellige mitokondrie ydre membranproteiner og komplekser: TOM-komplekset 11,12, TOB/SAM-komplekset 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1-komplekset9, Por1 10, OM45 10 og Miro 17. Dette indikerer kraftigt, at MICOS-komplekset er involveret i forskellige mitokondrieprocesser, såsom proteinimport, phospholipidmetabolisme og generering af mitokondriel ultrastruktur18. Sidstnævnte funktion er sandsynligvis MICOS' vigtigste funktion, da fraværet af MICOS-komplekset induceret ved sletning af MIC10 eller MIC60 fører til en unormal mitokondriel ultrastruktur, der næsten helt mangler regelmæssig cristae. I stedet akkumuleres indre membranvesikler uden forbindelse til den indre grænsemembran19, 20. Det er vigtigt, at MICOS bevares i form og funktion fra gær til menneske21. Foreningen af mutationer i MICOS-underenheder med alvorlige menneskelige sygdomme understreger også dens betydning for højere eukaryoter22,23. Selvom MICOS er meget alsidig, skal der findes yderligere kontaktsteder (baseret på vores ikke-offentliggjorte observationer). Faktisk er flere andre kontaktsteder blevet identificeret, for eksempel mitokondriefusionsmaskinerne Mgm1-Ugo1 / Fzo1 24,25,26 eller Mdm31-Por1, som er involveret i biosyntesen af mitokondrie-specifik phospholipid cardiolipin 27. For nylig forbedrede vi metoden, der førte os til identifikation af MICOS for at identificere Cqd1 som en del af et nyt kontaktsted dannet med det ydre membrankompleks Por1-Om1428. Interessant nok synes dette kontaktsted også at være involveret i flere processer såsom mitokondriemembranhomeostase, phospholipidmetabolisme og distribution af coenzym Q28,29.
Her brugte vi en variation af den tidligere beskrevne fraktionering af mitokondrier 9,30,31,32,33. Osmotisk behandling af mitokondrier fører til forstyrrelse af mitokondriets ydre membran og til en krympning af matrixrummet, hvilket kun efterlader de to membraner i umiddelbar nærhed på kontaktsteder. Dette giver mulighed for generering af vesikler, der udelukkende består af mitokondriel ydre membran eller mitokondriel indre membran eller indeholder kontaktsteder for begge membraner gennem mild sonikering. På grund af mitokondriets indre membran, der har et meget højere protein-til-lipid-forhold, udviser mitokondrie indre membranvesikler en højere densitet sammenlignet med mitokondrie ydre membranvesikler. Forskellen i densitet kan bruges til at adskille membranvesiklerne gennem centrifugering af saccharoseflydedensitetsgradient. Således akkumuleres mitokondrie ydre membranvesikler ved lave saccharosekoncentrationer, mens mitokondrie indre membranvesikler beriges ved høje saccharosekoncentrationer. De vesikler, der indeholder kontaktsteder, koncentreres ved mellemliggende saccharosekoncentrationer (figur 2). Følgende protokol beskriver denne forbedrede metode, som kræver mindre specialiseret udstyr, tid og energi sammenlignet med vores tidligere etablerede32, i detaljer og giver et nyttigt værktøj til identifikation af mulige kontaktstedsproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffere og lageropløsninger
- Der fremstilles en 1 M 3-morpholinopropan-1-sulfonsyreopløsning (MOPS) i deioniseret vand, pH 7,4. Opbevares ved 4 °C.
- Der fremstilles 500 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i deioniseret vand, pH 8,0. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered 2,4 M sorbitol i deioniseret vand. Opbevares ved stuetemperatur efter autoklavering.
- Forbered 2,5 M saccharose i deioniseret vand. Opbevares ved stuetemperatur efter autoklavering.
- Der fremstilles 200 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) i isopropanol. Opbevares ved -20 °C.
FORSIGTIG: PMSF er giftigt ved indtagelse og forårsager alvorlige hudforbrændinger og øjenskader. Indånd ikke støvet, og brug beskyttelseshandsker og beskyttelsesbriller. - Forbered 72% trichloreddikesyre (TCA) i deioniseret vand. Opbevares ved 4 °C.
FORSIGTIG: TCA kan forårsage irritation af luftvejene, alvorlige hudforbrændinger og øjenskader. Indånd ikke støvet, og brug beskyttelseshandsker og beskyttelsesbriller. - Forbered SM-bufferen: 20 mM MOPS og 0,6 M sorbitol, pH 7,4.
- Forbered hævelsesbufferen: 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF og proteasehæmmercocktail, pH 7,4.
- Saccharosegradientbufferne fremstilles: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M og 1,3 M saccharose i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
BEMÆRK: Alle buffere kan opbevares ved 4 °C; Det anbefales dog at opbevare de saccharoseholdige buffere ved -20 °C for at undgå svampevækst. Proteasehæmmerne skal tilsættes frisk før brug.
2. Frembringelse af præsokondrievesikler
- Isoler rå gærmitokondrier frisk i henhold til etablerede protokoller34,35.
BEMÆRK: Til dette eksperiment blev mitokondrier isoleret fra Saccharomyces cerevisiae. Frembringelsen af gradient rene mitokondrier uden andre organeller er ikke nødvendig. - Resuspender 10 mg frisk isolerede mitokondrier i 1,6 ml SM-buffer (4 °C) ved pipettering (figur 2, trin 1).
- Mitokondriesuspensionen overføres til en forkølet 100 ml Erlenmeyerkolbe.
- Tilsæt langsomt 16 ml hævelsesbuffer ved hjælp af en 20 ml glaspipette. Påfør konstant mild omrøring på is under tilsætningen. Denne osmotiske behandling resulterer i vandoptagelse i matrixrummet. Hævelsen af mitokondriets indre membran vil forstyrre den ydre membran. Begge membraner forbliver dog i kontakt på kontaktstederne9 (figur 2, trin 2).
- Inkuber prøverne under konstant mild omrøring i 30 minutter på is.
- Der tilsættes langsomt 5 ml 2,5 M saccharoseopløsning med en 5 ml glaspipette for at øge saccharosekoncentrationen i prøverne til ca. 0,55 M. Denne osmotiske behandling resulterer i en vandudstrømning fra matrix36. Krympningen af den indre membran er beregnet til at maksimere dens afstand til de resterende fragmenter af den ydre membran. Dette reducerer sandsynligheden for at generere kunstige hybridvesikler af indre og ydre membraner gennem sonikering (figur 2, trin 3).
- Prøverne inkuberes under mild omrøring i 15 minutter på is.
- Udsæt mitokondrierne for sonikering for at generere submitochondriale membranvesikler (figur 2, trin 4).
- Overfør mitokondriesuspensionen til en forkølet rosetcelle.
- Sonikere mitokondriesuspensionen ved en 10% amplitude i 30 s, mens du afkøler rosetcellen i et isbad.
- Hvil suspensionen i 30 s i et isbad.
- Gentag trin 2.8.2 og trin 2.8.3 tre gange mere.
BEMÆRK: Sonikeringsbetingelserne varierer afhængigt af den anvendte sonikator. Optimering vil være nødvendig for individuelle maskiner. Sonikering, der er for hård, vil føre til kunstig dannelse af vesikler bestående af mitokondrie indre og ydre membraner.
3. Adskillelse af præsokondrie vesikler
- De genererede vesikler adskilles fra de resterende intakte mitokondrier ved centrifugering ved 20.000 x g i 20 minutter ved 4 °C. De intakte mitokondrier vil pelletere, mens vesiklerne forbliver i supernatanten.
- Koncentrer vesikelblandingen.
- Supernatanten overføres til friske ultracentrifugationsglas.
- Læg en pude på 0,3 ml 2,5 M saccharoseopløsning i bunden af røret ved hjælp af en 1 ml sprøjte udstyret med en 0,8 mm x 120 mm kanyle.
- Der centrifugeres ved 118.000 x g i 100 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Her blev der anvendt en svingende skovlrotor med en maksimal radius på 153,1 mm. Centrifugeringsbetingelserne afhænger stærkt af rotoren og skal tilpasses, når der anvendes en anden rotor.
- Vesiklerne vises som en skive på toppen af saccharosepuden efter centrifugeringen. Ca. 90 % af supernatanten kasseres. Høst nu de koncentrerede vesikler ved at resuspendere dem i den resterende buffer inklusive 2,5 M saccharose ved pipettering op og ned. Overfør suspensionen til en iskold Dounce homogenisator.
- Homogeniser suspensionen med mindst 10 slag ved hjælp af en polytetrafluorethylenpottemager.
- Forbered saccharosegradienten.
- For en tringradient på 11 ml med fem trin (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M og 0,8 M saccharose i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4) har hvert lag 2,2 ml saccharoseopløsning.
BEMÆRK: Et refraktometer anbefales til måling og justering af saccharosekoncentrationerne; Det er dog ikke afgørende. Der påføres 10 μL af bufferen på refraktometeret, og de respektive brydningsindeks detekteres. Beregningen af saccharosekoncentrationen er som følger:
1.3333 repræsenterer vandets brydningsindeks. 0,048403 er et saccharosespecifikt omregningsindeks opnået ved lineær skalering af molær brydning til saccharosekoncentration i vandige opløsninger 37. - Den højeste saccharosekoncentration tilsættes centrifugeringsglasset, og røret anbringes ved -20 °C. Vent, indtil laget er helt frosset, før du påfører det næste. Fortsæt derefter, indtil det sidste lag er tilsat, og opbevar gradienterne ved -20 °C.
BEMÆRK: Husk at overføre de frosne gradienter til 4 °C, når eksperimentet startes, så gradienterne kan tø op. Dette tager ca. 3 timer. Til centrifugeringen her blev der anvendt en svingende skovlrotor med en kapacitet på 13,2 ml. Når der anvendes en anden rotor, skal gradienttrinvolumenerne tilpasses i overensstemmelse hermed.
- For en tringradient på 11 ml med fem trin (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M og 0,8 M saccharose i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4) har hvert lag 2,2 ml saccharoseopløsning.
- Prøvernes saccharosekoncentration måles ved hjælp af et refraktometer. Hvis der ikke er adgang til et refraktometer, kan man alternativt antage, at saccharosekoncentrationen er 2 M. Denne formodede saccharosekoncentration vil så danne grundlag for det næste trin.
- Saccharosekoncentrationen justeres til 0,6 M ved tilsætning af en passende mængde 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF og proteasehæmmercocktail, pH 7,4. Hvis saccharosekoncentrationen anslås til 2 M i stedet for at blive målt, anbefales det at undersøge, om koncentrationen er lav nok efter justering. Der påføres en lille prøve af prøven (ca. 50 μL) oven på 200 μL 0,8 M saccharose i et reagensglas. Prøven skal forblive oven på 0,8 M saccharose.
- Læg prøverne (ca. 1 ml) oven på saccharosegradienten (gem 10% til senere reference). Omhyggelig pipettering er vigtig for at undgå forstyrrelse af gradienten (figur 2, trin 5).
- Vesiklerne adskilles ved centrifugering ved 200.000 x g og 4 °C i 12 timer. Indstil om muligt centrifugen til langsom acceleration og deceleration for at undgå forstyrrelse af gradienten (figur 2, trin 6).
BEMÆRK: Her blev der anvendt en svingende skovlrotor med en maksimal radius på 153,1 mm. Centrifugeringsbetingelserne afhænger stærkt af rotoren og skal tilpasses, når der anvendes en anden rotor. - Gradienten høstes fra top til bund i 700 μL fraktioner ved hjælp af en 1 ml pipette. Dette vil resultere i 17 fraktioner, hvilket giver mulighed for en tilstrækkelig opløsning.
4. Analyse af submitochondrie vesikler
- Koncentrer proteinerne ved at udsætte hver fraktion for to sekventielt udførte TCA-udfældninger38 for at forberede SDS-PAGE-prøverne.
- Der tilsættes 200 μL 72% TCA til de enkelte fraktioner, og blandes, indtil opløsningen er homogen. Inkuber fraktionerne i 30 minutter på is, og pellet de udfældede proteiner ved centrifugering ved 20.000 x g og 4 °C i 20 minutter. Supernatanten kasseres, der tilsættes 500 μl 28 % TCA-opløsning, blandes godt, og centrifugeringstrinnet gentages.
- Pellets vaskes med 1 ml acetone (-20 °C), og centrifugeres i 10 minutter ved 20.000 x g og 4 °C. Supernatanten kasseres, og pellets lufttørres. Pellets resuspenderes i 60 μL SDS-prøvebuffer, og prøverne inkuberes i 5 minutter ved 95 °C.
BEMÆRK: Der vil være en stor mængde saccharose tilbage, især i fraktionerne med høj densitet, efter den første TCA-nedbør. Dette vil blive fjernet gennem den ekstra TCA-nedbør.
- Der analyseres 20 μL af hver fraktion ved hjælp af SDS-SIDE39 og immunblotting40,41,42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er relativt let at adskille mitokondrie indre og ydre membraner. Imidlertid er generering og adskillelse af kontaktstedsholdige vesikler meget vanskeligere. Efter vores mening er to trin kritiske og væsentlige: sonikeringsbetingelserne og den anvendte gradient.
Normalt menes lineære gradienter at have en bedre opløsning sammenlignet med tringradienter. Imidlertid er deres reproducerbare produktion kedelig og kræver specielt udstyr. Derfor etablerede vi en metode til at generere en tringradient med relativt små forskelle mellem de enkelte trin (se trin 3.5). Vi spekulerede på, at tringradienten ville blive afbalanceret ved centrifugering, hvilket resulterede i en næsten lineær gradient. Det er påfaldende, at bestemmelsen af saccharosekoncentrationerne af de enkelte fraktioner efter centrifugering ved hjælp af et refraktometer viste, at tringradienten faktisk blev praktisk talt lineær efter 12 timers centrifugering ved 200.000 x g (figur 3).
Betydningen af mild sonikering er tydelig i disse repræsentative resultater. Under milde sonikeringsbetingelser (figur 4A) blev mitokondriets ydre membranmarkør Tom40 beriget i de tidlige lavdensitetsfraktioner (fraktion nr. 4) og var næsten fraværende i de senere. Mitokondriets indre membranmarkør Tim17 var koncentreret i fraktioner med høj densitet (fraktion nr. 17). I modsætning hertil akkumulerede kontaktstedsproteinet Mic60 i fraktioner af mellemliggende saccharosekoncentration (fraktion nr. 12-14), hvilket indikerer den vellykkede generering og efterfølgende adskillelse af de forskellige membranvesikler. I modsætning hertil kunne mitokondrie ydre membranmarkør Tom40 med hårdere sonikeringsbetingelser detekteres i lavere fraktioner af gradienten (fraktion nr. 14 og fraktion nr. 17, figur 4B). Derudover var der en signifikant mængde Tim17 i fraktioner af mellemdensitet (fraktion nr. 13 og fraktion nr. 14, figur 4B). Den uspecifikke akkumulering af ydre og indre membranmarkører i fraktioner af mellemdensitet indikerer den kunstige dannelse af blandede membraner, hvilket hæmmer identifikationen af kandidatproteiner.
Figur 1: Skematisk repræsentation af mitokondriel ultrastruktur. En skematisk repræsentation af et mitokondrie for at vise de forskellige rum, membraner og proteinplaceringer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Arbejdsgang for mitokondriel fraktionering for at isolere kontaktstedsproteiner. En skematisk oversigt over processen beskrevet i protokollen. De (1) nyligt isolerede mitokondrier var (2) osmotisk hævede (3) og derefter krympet. (4) De krympede mitokondrier blev protesteret mod mild sonikering for at generere submitochondrie vesikler. (5) Vesikelblandingen blev koncentreret og påfyldt en saccharosetringradient. (6) Ved centrifugering blev mitokondriernes ydre membranvesikler beriget med en lav saccharosekoncentration, mitokondrieblærerne i den indre membran med en høj saccharosekoncentration og de vesikler, der indeholdt på kontaktstedet, med en mellemliggende saccharosekoncentration. Forkortelser: MIM, mitokondriel indre membran; MOM, mitokondriel ydre membran. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Frembringelse af en lineær gradient ved centrifugering. To tringradienter (1,3 M, 1,13 M, derefter 1,02 M, 0,96 M og 0,8 M i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4) blev fremstillet parallelt, og 1 ml 0,6 M saccharose i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4, blev indlæst på begge gradienter. Gradienterne blev udsat for centrifugering ved 200.000 x g og 4 °C i 12 timer og høstet i 17 fraktioner hver. Metodens reproducerbarhed blev testet ved bestemmelse af saccharosekoncentrationen af de enkelte fraktioner af de enkelte gradienter ved hjælp af et refraktometer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Isolering af kontaktstedsproteiner med en veldefineret ultralydspuls. (A,B) Frisk isolerede gærmitokondrier blev udsat for osmotisk behandling og udsat for sonikering. De genererede vesikler blev separeret ved hjælp af centrifugering af saccharoseflydedensitetsgradienten. Gradienten blev fraktioneret, og proteinerne i de forskellige fraktioner blev udsat for TCA-udfældning. Fordelingen af markørproteinerne til mitokondriets ydre membran (Tom40), mitokondriets indre membran (Tim17) og kontaktsteder (Mic60) blev analyseret ved immunoblotting under anvendelse af de indikerede antistoffer. (A) Mild sonikering (4 x 30 s, 10% amplitude) resulterede i en klar adskillelse af de ydre membranproteiner (fraktioner med lav densitet) og indre membranproteiner (fraktioner med høj densitet). Derudover blev kontaktstedsproteinet Mic60 med succes beriget i fraktioner af mellemdensitet. (B) Hårdere sonikering (4 x 30 s, 20% amplitude) resulterede i dannelsen af hybridvesikler og tillod således ikke en klar adskillelse af kontaktsteder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondriel subfraktionering er et kompliceret eksperiment med flere meget komplekse trin. Derfor sigtede vi mod yderligere at forbedre og til en vis grad forenkle vores etablerede metode32. Her var udfordringerne kravet om kompliceret og højt specialiseret udstyr, som ofte er individuelle konstruktioner, og det enorme tids- og energiforbrug. Til dette formål forsøgte vi at fjerne pumperne og individuelle konstruktioner, der blev brugt til støbning og høst af den lineære gradient og ændrede til en tringradient. Det er vigtigt, at vi indså, at gradienten, i det mindste når den er forberedt som beskrevet her, bliver lineær under centrifugering, hvilket gør dette til en gyldig erstatning. Denne metode (i) eliminerer behovet for en gradientblander og reducerer dermed det krævede udstyr; — sparer tid på forsøgsdagen, da gradienten kan forberedes på forhånd og (iii) er meget reproducerbar (figur 3), når den fremstilles i henhold til den beskrevne metode, hvilket indebærer frysning af de enkelte trin, før det næste lægges ovenpå. Disse gradienter kan også opbevares på ubestemt tid ved -20 °C. Derudover er belastningen af den her foreslåede sedimenteringsgradient også lettere end at skulle lægge vesikelblandingen under gradienten, som beskrevet i lignende metoder 9,32. Ilægning af en flydegradient kræver en sprøjte med en lang kanyle for at passere den allerede støbte gradient. Dette trin var altid problematisk på grund af risikoen for at ødelægge gradienten. En anden fordel ved denne metode er den lavere centrifugeringstid på 12 timer sammenlignet med 24 timer32, hvilket i høj grad reducerer den tid og energi, der kræves til denne metode. Gennemførligheden og reproducerbarheden af den forbedrede procedure, der er beskrevet her, understreges af den nylige identifikation af det MICOS-uafhængige kontaktsted, der er dannet af Cqd1 og Por1-Om1428.
Dette eksperiment er dog stadig meget komplekst. For at opnå optimale resultater er der flere væsentlige kriterier, der skal tages i betragtning ved anvendelsen af denne protokol.
Et af de vigtigste aspekter er mitokondriernes kvalitet. Disse skal være nyisolerede. Derfor skal dyrkning af gær samt isolering af mitokondrier tages i betragtning ved planlægningen af proceduren. Skånsom behandling af mitokondrierne under isoleringen vil forhindre forstyrrelse af membranerne, mens det også er kritisk at hæmme proteaser med en passende koncentration af PMSF eller alternativt kommercielt tilgængelige proteasehæmmercocktails34.
Et andet vigtigt skridt, og et af de mest kritiske aspekter af proceduren, er sonikeringen. Det er vigtigt at estimere den korrekte intensitet af ultralydspulsen ved lyden genereret gennem suspensionens hvirvling (se video). De optimale betingelser skal dog bestemmes eksperimentelt for hver eksperimentel opsætning, ikke kun baseret på forskellige mærker og modeller, men også forskellige maskiner af samme model. Især påvirker demontering og rengøring af spidsen også intensiteten af sonikeringen, hvilket gør en justering af betingelserne nødvendig. Anbefalingen i protokollen er også at bruge en rosetcelle til højere effektivitet, men andre fartøjer kan også fungere. Sonikering, der er for hård, vil føre til dannelse af kunstigt blandede vesikler. Dette vil resultere i en stærk akkumulering af indre og ydre membranproteiner i fraktioner af mellemdensitet, som kan være endnu stærkere, som i det viste eksempel (figur 4B). Hvis dette sker, bør man reducere amplituden eller tidspunktet for sonikeringen. Imidlertid kan der også opstå problemer, når sonikeringen ikke er intens nok. I dette tilfælde kan udbyttet af de genererede vesikler være for lavt til at detektere proteiner ved immunoblotting, og dermed skal man øge amplitude, tid eller cyklusser af sonikering.
Endelig er gradienten vigtig for adskillelsen af de forskellige vesikelarter, der genereres. Det optimale maksimum og minimum af saccharosegradienten samt antallet af trin kan dog også variere afhængigt af den enkelte opsætning. Her var en femtrinsgradient med højst 1,3 M saccharose og mindst 0,8 M saccharose tilstrækkelig til en synlig og reproducerbar adskillelse af de vesikler, der indeholder kontaktstedet, fra mitokondriets indre og ydre membranvesikler. I begyndelsen er det vigtigt at vælge forhold, der efterlader tomme fraktioner over mitokondriernes ydre membranvesikler og under mitokondriets indre membranvesikler for at sikre korrekt adskillelse. Komprimering af enten de øverste eller nederste fraktioner kan føre til artefakter. På senere trin, når den nøjagtige molaritet af saccharose, hvor de indre og ydre membranvesikler akkumuleres, er kendt, kan gradienten optimeres ved at øge eller mindske de maksimale og minimale saccharosekoncentrationer for at forbedre opløsningen blandt den indre membran, ydre membran og kontaktsteder. Bemærk, at gærens vækstbetingelser kan påvirke opførelsen af de genererede vesikler ved densitetscentrifugering. Her blev gæren dyrket på rig YP-medium (1% [w / v] gærekstrakt, 2% [w / v] pepton, pH 5,5) indeholdende glycerol (3% [v / v]) som kulstofkilde ved 30 ° C34,44. Andre vækstbetingelser kan ændre mitokondriernes protein- og lipidsammensætning og dermed densiteten af de genererede vesikler.
Den beskrevne metode giver en pålidelig og reproducerbar måde at isolere kontaktsteder på. Identifikationen af proteinsammensætningen på det respektive kontaktsted (indre og ydre membrankomponenter) kræver imidlertid yderligere assays såsom immunudfældning, eventuelt i kombination med massespektrometri. Til dette er specifikke antistoffer og modelorganismer, der udtrykker mærkede versioner af proteinkandidaterne, nødvendige. Når man bruger gær som modelorganisme, kan proteinkandidater let opnås på grund af de mange forskellige tilgængelige genetiske modifikationsmetoder og eksistensen af mærkede biblioteker45,46,47. Derfor besluttede vi at etablere og optimere denne protokol for gærmitokondrier. Selvom det skulle være muligt at tilpasse metoden til mitokondrier isoleret fra andre organismer, har gær den fordel, at det er muligt at opnå store mængder mitokondrier på en billig og hurtig måde. Desuden er brug af gær som modelorganisme til indsamling af de første resultater en velprøvet måde at identificere proteinkomplekser og processer, der bevares i højere eukaryoter op til mennesker. Som tidligere nævnt blev det efter identifikation og karakterisering af MICOS i gær 9,10,11 vist, at MICOS bevares i form og funktion i højere eukaryoter 21. Cqd1 og Por1, komponenter i det nyligt opdagede MICOS-uafhængige kontaktsted28, bevares også, hvilket indikerer, at dette kontaktsted også er til stede i højere eukaryoter.
Betydningen af fortsat forskning på disse kontaktsteder understreges af MICOS' forbindelser til forskellige neurodegenerative sygdomme 18,48,49,50,51,52,53,54. Den korrekte fosforylering af Mic60 af PINK1 har været forbundet med vedligeholdelsen af crista-kryds i Drosophilia, og derfor kan denne vej, som bevares for mennesker, være forbundet med Parkinsons sygdom48. Desuden resulterer en punktmutation i den humane MICOS-underenhed Mic14 i destabilisering af MICOS og den efterfølgende ændring af mitokondrie-ultrastrukturen, som er fundet hos patienter, der lider af frontotemporal demens og amyotrofisk lateral sklerose 50,51,52,53,54. Da Mic14 konserveres fra gær til mennesker, kan yderligere undersøgelser af dette protein udføres ved hjælp af gær som modelorganisme. Denne grundforskning kan føre til en bedre forståelse af de underliggende mekanismer bag disse sygdomme, hvilket kan fremskynde udviklingen af effektiv behandling og behandling af dem. Desuden viser de seneste opdagelser af yderligere MICOS-uafhængige kontaktsteder27,28, at dette felt stadig vokser. Derfor kan den her præsenterede protokol bidrage til at fremme denne lovende og fascinerende forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
M.E.H. anerkender Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projektnummer 413985647, for økonomisk støtte. Forfatterne takker Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians University, München, for hans generøse og omfattende støtte. Vi er taknemmelige for Walter Neupert for hans videnskabelige input, nyttige diskussioner og løbende inspiration. J.F. takker Graduate School Life Science München (LSM) for støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any Abbe refractometer can be used |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
References
- Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
- Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
- Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
- Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
- Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
- Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
- Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
- Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
- Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
- vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
- Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
- Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
- Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
- Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
- Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
- Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
- Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
- John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
- Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
- Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
- Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
- Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
- Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
- Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
- Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
- Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
- Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
- Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
- Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
- Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
- Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
- Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
- Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
- Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
- Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
- Koontz, L.
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Al-Tubuly, A. A.
- Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Sherman, F.
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
- Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
- Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
- Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
- Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
