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Biochemistry

माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क साइटों को अलग करने के लिए एक बेहतर तरीका

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65444
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
* These authors contributed equally

Summary

माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क स्थल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स होते हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक और बाहरी झिल्ली प्रोटीन के साथ बातचीत करते हैं। ये साइटें माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के बीच संचार के लिए आवश्यक हैं और इस प्रकार, साइटोसोल और माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के बीच। यहां, हम प्रोटीन के इस विशिष्ट वर्ग के लिए अर्हता प्राप्त करने वाले उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया लगभग सभी यूकेरियोटिक कोशिकाओं में मौजूद होते हैं और आवश्यक कार्य करते हैं जो ऊर्जा उत्पादन से बहुत आगे जाते हैं, उदाहरण के लिए, लौह-सल्फर समूहों, लिपिड, या प्रोटीन का संश्लेषण, सीए2+ बफरिंग, और एपोप्टोसिस का प्रेरण। इसी तरह, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के परिणामस्वरूप कैंसर, मधुमेह और न्यूरोडीजेनेरेशन जैसे गंभीर मानव रोग होते हैं। इन कार्यों को करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया को अपने लिफाफे में बाकी सेल के साथ संवाद करना पड़ता है, जिसमें दो झिल्ली होते हैं। इसलिए, इन दो झिल्लियों को लगातार बातचीत करनी पड़ती है। इस संबंध में माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक और बाहरी झिल्ली के बीच प्रोटीनयुक्त संपर्क स्थल आवश्यक हैं। अब तक, कई संपर्क स्थलों की पहचान की गई है। यहाँ वर्णित विधि में, Saccharomyces cerevisiae mitochondria संपर्क साइटों को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है और इस प्रकार, उम्मीदवारों है कि संपर्क साइट प्रोटीन के लिए अर्हता प्राप्त की पहचान. हमने माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क स्थल और क्रिस्टे आयोजन प्रणाली (एमआईसीओएस) परिसर की पहचान करने के लिए इस पद्धति का उपयोग किया, जो माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में प्रमुख संपर्क साइट बनाने वाले परिसरों में से एक है, जो खमीर से मनुष्यों तक संरक्षित है। हाल ही में, हमने Cqd1 और Por1-Om14 कॉम्प्लेक्स से मिलकर एक उपन्यास संपर्क साइट की पहचान करने के लिए इस पद्धति में और सुधार किया।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया यूकेरियोट्स में विभिन्न प्रकार के विभिन्न कार्य करते हैं, जिनमें सबसे प्रसिद्ध ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के माध्यम से एटीपी का उत्पादन होता है। अन्य कार्यों में लौह-सल्फर समूहों, लिपिड संश्लेषण, और उच्च यूकेरियोट्स में, सीए2+ सिग्नलिंग, और एपोप्टोसिस 1,2,3,4 का प्रेरण शामिल है। ये कार्य उनके जटिल अल्ट्रास्ट्रक्चर से अविभाज्य रूप से जुड़े हुए हैं।

माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर को पहली बार इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी5 द्वारा वर्णित किया गया था। यह दिखाया गया था कि माइटोकॉन्ड्रिया दो झिल्ली से मिलकर जटिल अंग हैं: माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली और माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली। इस प्रकार, इन झिल्लियों द्वारा दो जलीय डिब्बों का निर्माण होता है: इंटरमेम्ब्रेन स्पेस और मैट्रिक्स। माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली को और भी विभिन्न वर्गों में विभाजित किया जा सकता है। आंतरिक सीमा झिल्ली बाहरी झिल्ली के करीब निकटता में रहती है, और क्रिस्टे आक्रमण का निर्माण करती है। तथाकथित क्रिस्टा जंक्शन आंतरिक सीमा झिल्ली और क्रिस्टे (चित्र 1) को जोड़ते हैं। इसके अलावा, ऑस्मोटिक रूप से सिकुड़े हुए माइटोकॉन्ड्रिया के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ से पता चलता है कि साइटें मौजूद हैं जिन पर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली कसकर 6,7 जुड़े हुए हैं। ये तथाकथित संपर्क साइटें दो झिल्लियों (चित्रा 1) में फैले प्रोटीन परिसरों द्वारा बनाई जाती हैं। यह सोचा जाता है कि इन बातचीत साइटों माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और विरासत के नियमन के लिए उनके महत्व के कारण सेल व्यवहार्यता के लिए आवश्यक हैं, साथ ही साथ साइटोसोल और मैट्रिक्स8 के बीच चयापचयों और संकेतों के हस्तांतरण के कारण.

माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में MICOS कॉम्प्लेक्स शायद सबसे अच्छी विशेषता और सबसे बहुमुखी संपर्क साइट बनाने वाला परिसर है। MICOS को 2011 में खमीर में वर्णित किया गया था, और इसमें छह सबयूनिट 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 और Mic10 शामिल हैं। ये लगभग 1.5 एमडीए का एक परिसर बनाते हैं जो क्रिस्टा जंक्शनों 9,10,11 को स्थानीयकृत करता है। कोर सबयूनिट, Mic10 या Mic60 को हटाने से इस जटिल 9,11 की अनुपस्थिति होती है, जिसका अर्थ है कि ये दो सबयूनिट MICOS की स्थिरता के लिए आवश्यक हैं। दिलचस्प बात यह है कि MICOS विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली प्रोटीन और परिसरों के साथ न केवल एक बल्कि कई संपर्क स्थल बनाता है: TOM कॉम्प्लेक्स 11,12, TOB/SAM कॉम्प्लेक्स 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1 कॉम्प्लेक्स9, Por1 10, OM45 10, और Miro 17. यह दृढ़ता से इंगित करता है कि MICOS कॉम्प्लेक्स विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं में शामिल है, जैसे प्रोटीन आयात, फॉस्फोलिपिड चयापचय, और माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर18 की पीढ़ी। उत्तरार्द्ध कार्य संभवतः MICOS का प्रमुख कार्य है, क्योंकि MIC10 या MIC60 के विलोपन के माध्यम से प्रेरित MICOS कॉम्प्लेक्स की अनुपस्थिति एक असामान्य माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर की ओर ले जाती है जिसमें लगभग पूरी तरह से नियमित क्रिस्टे का अभाव होता है। इसके बजाय, आंतरिक सीमा झिल्ली से संबंध के बिना आंतरिक झिल्ली पुटिका19, 20 जमा होती है। महत्वपूर्ण रूप से, MICOS खमीर से मानव21 तक रूप और कार्य में संरक्षित है। गंभीर मानव रोगों के साथ MICOS सबयूनिट्स में उत्परिवर्तन का जुड़ाव भी उच्च यूकेरियोट्स22,23 के लिए इसके महत्व पर जोर देता है। हालांकि MICOS अत्यधिक बहुमुखी है, अतिरिक्त संपर्क साइटें मौजूद होनी चाहिए (हमारे अप्रकाशित अवलोकनों के आधार पर)। दरअसल, कई अन्य संपर्क साइटों की पहचान की गई है, उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन मशीनरी Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 या Mdm31-Por1, जो माइटोकॉन्ड्रियल-विशिष्ट फॉस्फोलिपिड कार्डियोलिपिन 27 के जैवसंश्लेषण में शामिल है। हाल ही में, हमने उस विधि में सुधार किया जिसने हमें बाहरी झिल्ली परिसर पोर1-ओएम 1428 के साथ गठित एक उपन्यास संपर्क साइट के हिस्से के रूप में सीक्यूडी 1 की पहचान करने के लिए एमआईसीओएस की पहचान करने के लिए प्रेरित किया। दिलचस्प बात यह है कि यह संपर्क साइट माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली होमियोस्टेसिस, फॉस्फोलिपिड चयापचय और कोएंजाइम क्यू28,29 के वितरण जैसी कई प्रक्रियाओं में भी शामिल लगती है।

यहां, हमने माइटोकॉन्ड्रिया 9,30,31,32,33 के पहले वर्णित अंश की भिन्नता का उपयोग किया। माइटोकॉन्ड्रिया का आसमाटिक उपचार माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली के विघटन और मैट्रिक्स स्पेस के संकोचन की ओर जाता है, जिससे दो झिल्ली केवल संपर्क स्थलों पर निकटता में रह जाती हैं। यह पुटिकाओं की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है जिसमें विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली या माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली होती है या हल्के सोनिकेशन के माध्यम से दोनों झिल्ली के संपर्क स्थल होते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली के कारण बहुत अधिक प्रोटीन-से-लिपिड अनुपात होता है, माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली पुटिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली पुटिकाओं की तुलना में उच्च घनत्व प्रदर्शित होता है। घनत्व में अंतर का उपयोग सुक्रोज उत्प्लावक घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से झिल्ली पुटिकाओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली पुटिकाओं कम सुक्रोज सांद्रता पर जमा होते हैं, जबकि माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली पुटिकाओं को उच्च सुक्रोज सांद्रता में समृद्ध किया जाता है। संपर्क साइटों युक्त पुटिकाओं मध्यवर्ती सुक्रोज सांद्रता (चित्रा 2) पर ध्यान केंद्रित. निम्नलिखित प्रोटोकॉल इस बेहतर विधि का वर्णन करता है, जिसके लिए हमारे पहले से स्थापित एक32 की तुलना में कम विशिष्ट उपकरण, समय और ऊर्जा की आवश्यकता होती है, विस्तार से और संभावित संपर्क साइट प्रोटीन की पहचान के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है।

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Protocol

1. बफ़र्स और स्टॉक समाधान

  1. विआयनीकृत पानी, पीएच 7.4 में 1 एम 3-मॉर्फोलिनोप्रोपेन-1-सल्फोनिक एसिड (एमओपीएस) समाधान बनाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. विआयनीकृत पानी, पीएच 8.0 में 500 मिमी एथिलीनमाइनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) तैयार करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  3. विआयनीकृत पानी में 2.4 एम सोर्बिटोल तैयार करें। आटोक्लेविंग के बाद कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  4. विआयनीकृत पानी में 2.5 एम सुक्रोज तैयार करें. आटोक्लेविंग के बाद कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  5. आइसोप्रोपेनॉल में 200 एमएम फेनिलमिथाइलसल्फोनील फ्लोराइड (पीएमएसएफ) तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: पीएमएसएफ विषाक्त है अगर निगल लिया जाता है और गंभीर त्वचा की जलन और आंखों की क्षति का कारण बनता है। धूल में सांस न लें, और सुरक्षात्मक दस्ताने और काले चश्मे पहनें।
  6. विआयनीकृत पानी में 72% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए) तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: टीसीए श्वसन जलन, गंभीर त्वचा जलता है, और आंखों की क्षति का कारण बन सकता है। धूल में सांस न लें, और सुरक्षात्मक दस्ताने और काले चश्मे पहनें।
  7. एसएम बफर तैयार करें: 20 एमएम एमओपीएस और 0.6 एम सोर्बिटोल, पीएच 7.4।
  8. सूजन बफर तैयार करें: 20 एमएम एमओपीएस, 0.5 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम पीएमएसएफ, और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल, पीएच 7.4।
  9. सुक्रोज ढाल बफ़र्स तैयार करें: 0.8 मीटर, 0.96 मीटर, 1.02 मीटर, 1.13 मीटर, और 20 मिमी एमओपीएस में 1.3 मीटर सुक्रोज, और 0.5 मिमी ईडीटीए, पीएच 7.4।
    नोट: सभी बफ़र्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; हालांकि, फंगल विकास से बचने के लिए सुक्रोज युक्त बफ़र्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। प्रोटीज अवरोधकों को उपयोग करने से पहले नए सिरे से जोड़ा जाना चाहिए।

2. सबमिटोकॉन्ड्रियल पुटिकाओं का निर्माण

  1. कच्चे खमीर माइटोकॉन्ड्रिया को स्थापित प्रोटोकॉल34,35 के अनुसार ताजा अलग करें।
    नोट: इस प्रयोग के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया Saccharomyces cerevisiae से अलग थे। अन्य जीवों से रहित ढाल शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया की पीढ़ी आवश्यक नहीं है।
  2. पाइपिंग (चित्रा 2, चरण 1) द्वारा 1.6 एमएल एसएम बफर (4 डिग्री सेल्सियस) में ताजा पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के 10 मिलीग्राम को फिर से निलंबित करें।
  3. माइटोकॉन्ड्रियल सस्पेंशन को प्री-कूल्ड 100 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में ट्रांसफर करें।
  4. धीरे-धीरे 20 एमएल ग्लास विंदुक का उपयोग करके सूजन बफर के 16 एमएल जोड़ें। जोड़ के दौरान बर्फ पर लगातार हल्के सरगर्मी लागू करें। इस आसमाटिक उपचार के परिणामस्वरूप मैट्रिक्स स्पेस में पानी का उत्थान होता है। माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली की सूजन बाहरी झिल्ली को बाधित करेगी। हालांकि, दोनों झिल्ली संपर्क साइटों9 (चित्रा 2, चरण 2) पर संपर्क में रहना होगा.
  5. बर्फ पर 30 मिनट के लिए लगातार हल्के सरगर्मी के तहत नमूने सेते हैं.
  6. धीरे-धीरे नमूनों में सुक्रोज एकाग्रता को लगभग 0.55 एम तक बढ़ाने के लिए 5 एमएल ग्लास विंदुक का उपयोग करके 2.5 एम सुक्रोज समाधान के 5 एमएल जोड़ें। इस आसमाटिक उपचार के परिणामस्वरूप मैट्रिक्स36 से पानी का प्रवाह होता है। आंतरिक झिल्ली के संकोचन का उद्देश्य बाहरी झिल्ली के अवशिष्ट टुकड़ों तक इसकी दूरी को अधिकतम करना है। यह sonication (चित्रा 2, चरण 3) के माध्यम से आंतरिक और बाहरी झिल्ली के कृत्रिम संकर पुटिकाओं को उत्पन्न करने की संभावना कम हो जाती है।
  7. बर्फ पर 15 मिनट के लिए हल्के सरगर्मी के तहत नमूने सेते हैं.
  8. माइटोकॉन्ड्रिया को सोनिकेशन के अधीन करें ताकि सबमिटोकॉन्ड्रियल झिल्ली पुटिकाओं को उत्पन्न किया जा सके (चित्र 2, चरण 4)।
    1. माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को प्री-कूल्ड रोसेट सेल में स्थानांतरित करें।
    2. एक बर्फ स्नान में रोसेट सेल को ठंडा करते हुए 30 एस के लिए 10% आयाम पर माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को सोनिकेट करें।
    3. बर्फ के स्नान में 30 एस के लिए निलंबन को आराम दें।
    4. दोहराएँ कदम 2.8.2 और चरण 2.8.3 तीन बार अधिक.
      नोट: सोनिकेशन की स्थिति उपयोग किए गए सोनिकेटर के अनुसार अलग-अलग होगी। व्यक्तिगत मशीनों के लिए अनुकूलन आवश्यक होगा। सोनिकेशन जो बहुत कठोर है, माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक और बाहरी झिल्ली से युक्त पुटिकाओं के कृत्रिम गठन को जन्म देगा।

3. सबमिटोकॉन्ड्रियल पुटिकाओं का पृथक्करण

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शेष बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया से उत्पन्न पुटिकाओं को अलग करें। बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया गोली मार देगा जबकि पुटिकाएं सतह पर तैरनेवाला में रहेंगी।
  2. पुटिका मिश्रण को केंद्रित करें।
    1. सतह पर तैरनेवाला ताजा ultracentrifugation ट्यूबों के लिए स्थानांतरण.
    2. 0.8 मिमी x 120 मिमी प्रवेशनी से सुसज्जित 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके ट्यूब के तल पर 2.5 एम सुक्रोज समाधान के 0.3 एमएल का एक कुशन लोड करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिनट के लिए 118,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
      नोट: यहां, 153.1 मिमी की अधिकतम त्रिज्या के साथ एक स्विंगिंग बाल्टी रोटर का उपयोग किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन की स्थिति दृढ़ता से रोटर पर निर्भर करती है और जब किसी अन्य रोटर का उपयोग किया जाता है तो उसे अनुकूलित करना होगा।
  3. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पुटिका सुक्रोज कुशन के शीर्ष पर एक डिस्क के रूप में दिखाई देगी। सतह पर तैरनेवाला के लगभग 90% त्यागें. अब, ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा 2.5 एम सुक्रोज सहित शेष बफर में उन्हें पुन: निलंबित करके केंद्रित पुटिकाओं की कटाई करें। निलंबन को बर्फ-ठंडे डाउंस होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित करें।
  4. एक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन कुम्हार का उपयोग करके कम से कम 10 स्ट्रोक के साथ निलंबन को समरूप करें।
  5. सुक्रोज ढाल तैयार करें।
    1. पांच चरणों (1.3 मीटर, 1.13 मीटर, 1.02 मीटर, 0.96 मीटर, और 20 मिमी एमओपीएस और 0.5 मिमी ईडीटीए, पीएच 7.4 में 0.8 एम सुक्रोज) के साथ 11 एमएल चरण ढाल के लिए, प्रत्येक परत में 2.2 एमएल सुक्रोज समाधान होता है।
      नोट: सुक्रोज सांद्रता को मापने और समायोजित करने के लिए एक रेफ्रेक्टोमीटर की सिफारिश की जाती है; हालाँकि, यह आवश्यक नहीं है। बफर के 10 माइक्रोन को रेफ्रेक्टोमीटर पर लागू करें, और संबंधित अपवर्तक सूचकांकों का पता लगाएं। सुक्रोज एकाग्रता की गणना इस प्रकार है:
      Equation 1
      1.3333 पानी के अपवर्तनांक का प्रतिनिधित्व करता है। 0.048403 एक सुक्रोज विशिष्ट रूपांतरण सूचकांक है जो जलीय घोल 37 में सुक्रोज एकाग्रता के लिए दाढ़ अपवर्तकता के रैखिक स्केलिंग से प्राप्त होता है।
    2. सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में उच्चतम सुक्रोज एकाग्रता जोड़ें, और ट्यूब को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। अगले एक को लागू करने से पहले परत पूरी तरह से जमने तक प्रतीक्षा करें। तदनुसार आगे बढ़ें जब तक कि अंतिम परत नहीं जुड़ जाती है, और ग्रेडिएंट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: जमे हुए ढाल को 4 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करना याद रखें जब प्रयोग शुरू करने के लिए ढाल को पिघलना अनुमति दें। इसमें लगभग 3 घंटे लगेंगे। यहां सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए, 13.2 एमएल की क्षमता वाले एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग किया गया था। जब एक अलग रोटर का उपयोग किया जाता है, तो ढाल चरण संस्करणों को तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  6. एक refractometer का उपयोग नमूनों की सुक्रोज एकाग्रता को मापने. यदि रेफ्रेक्टोमीटर तक पहुंच नहीं है, तो कोई वैकल्पिक रूप से मान सकता है कि सुक्रोज एकाग्रता 2 एम है। यह माना जाता है कि सुक्रोज एकाग्रता तब अगले चरण का आधार होगी।
  7. 20 मिमी MOPS, 0.5 मिमी EDTA, 1 मिमी PMSF, और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल, पीएच 7.4 की उचित मात्रा के अलावा 0.6 एम के लिए सुक्रोज एकाग्रता को समायोजित करें। यदि सुक्रोज एकाग्रता को मापा जाने के बजाय 2 एम के रूप में अनुमानित किया जाता है, तो यह परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है कि समायोजन के बाद एकाग्रता काफी कम है या नहीं। एक टेस्ट ट्यूब में 0.8 एम सुक्रोज के 200 माइक्रोन के शीर्ष पर नमूना (सीए 50 माइक्रोन) का एक छोटा सा विभाज्य लागू करें। नमूना 0.8 एम सुक्रोज के शीर्ष पर रहना चाहिए।
  8. सुक्रोज ढाल के शीर्ष पर नमूने (लगभग 1 एमएल) लोड करें (बाद में संदर्भ के लिए 10% रखें)। ढाल की गड़बड़ी से बचने के लिए सावधानीपूर्वक पाइपिंग महत्वपूर्ण है (चित्र 2, चरण 5)।
  9. 12 घंटे के लिए 200,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पुटिकाओं को अलग करें। यदि संभव हो तो, ढाल (चित्रा 2, चरण 6) की गड़बड़ी से बचने के लिए त्वरण और मंदी को धीमा करने के लिए अपकेंद्रित्र सेट करें।
    नोट: यहां, 153.1 मिमी की अधिकतम त्रिज्या के साथ एक स्विंगिंग बाल्टी रोटर का उपयोग किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन की स्थिति दृढ़ता से रोटर पर निर्भर करती है और जब किसी अन्य रोटर का उपयोग किया जाता है तो उसे अनुकूलित करना होगा।
  10. एक 1 एमएल विंदुक का उपयोग कर 700 माइक्रोन अंशों में ऊपर से नीचे करने के लिए ढाल फसल. इसके परिणामस्वरूप 17 अंश होंगे, जो पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देता है।

4. सबमिटोकॉन्ड्रियल पुटिकाओं का विश्लेषण

  1. एसडीएस-पेज नमूने तैयार करने के लिए प्रत्येक अंश को दो क्रमिक रूप से प्रदर्शन किए गए टीसीए वर्षा38 के अधीन करके प्रोटीन को ध्यान में रखें।
    1. व्यक्तिगत अंशों में 72% टीसीए के 200 माइक्रोन जोड़ें, और समाधान सजातीय होने तक मिश्रण करें। बर्फ पर 30 मिनट के लिए अंशों को इनक्यूबेट करें, और 20,000 x ग्राम और 20 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अवक्षेपित प्रोटीन को गोली दें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 28% टीसीए समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, और अपकेंद्रित्र चरण दोहराएं।
    2. एसीटोन (-20 डिग्री सेल्सियस) के 1 एमएल के साथ छर्रों को धो लें, और 20,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और छर्रों हवा सूखी चलो. एसडीएस नमूना बफर के 60 माइक्रोन में छर्रों को फिर से निलंबित करें, और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: सुक्रोज की एक बड़ी मात्रा बनी रहेगी, विशेष रूप से उच्च घनत्व अंशों में, पहली टीसीए वर्षा के बाद। इसे अतिरिक्त टीसीए वर्षा के माध्यम से हटा दिया जाएगा।
  2. एसडीएस-पेज39 और इम्यूनोब्लोटिंग 40,41,42,43 द्वारा प्रत्येक अंश के 20 माइक्रोन का विश्लेषण करें।

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Representative Results

माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक और बाहरी झिल्ली को अलग करना अपेक्षाकृत आसान है। हालांकि, संपर्क साइट युक्त पुटिकाओं की पीढ़ी और पृथक्करण अधिक कठिन है। हमारी राय में, दो चरण महत्वपूर्ण और आवश्यक हैं: सोनिकेशन की स्थिति और उपयोग किए जाने वाले ढाल।

आमतौर पर, रैखिक ग्रेडिएंट को चरण ग्रेडिएंट की तुलना में बेहतर रिज़ॉल्यूशन माना जाता है। हालांकि, उनका प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उत्पादन थकाऊ है और इसके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसलिए, हम व्यक्तिगत चरणों के बीच अपेक्षाकृत छोटे अंतर के साथ एक कदम ढाल उत्पन्न करने के लिए एक विधि की स्थापना की (3.5 कदम देखें). हमने अनुमान लगाया कि चरण ढाल को सेंट्रीफ्यूजेशन पर संतुलित किया जाएगा, जिसके परिणामस्वरूप लगभग रैखिक ढाल होगा। हड़ताली रूप से, एक अपवर्तनामापी का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद व्यक्तिगत अंशों के सुक्रोज सांद्रता के निर्धारण से पता चला कि चरण ढाल वास्तव में 200,000 x ग्राम (चित्रा 3) पर सेंट्रीफ्यूजेशन के 12 घंटे के बाद लगभग रैखिक हो गया।

इन प्रतिनिधि परिणामों में हल्के sonication का महत्व स्पष्ट है। हल्के sonication शर्तों (चित्रा 4A) में, mitochondrial बाहरी झिल्ली मार्कर टॉम 40 प्रारंभिक कम घनत्व अंशों(अंश संख्या 4) में समृद्ध किया गया था और बाद वाले में लगभग अनुपस्थित था. माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली मार्कर Tim17 उच्च घनत्व अंशों (अंश संख्या 17) में केंद्रित था। इसके विपरीत, संपर्क साइट प्रोटीन mic60 मध्यवर्ती सुक्रोज एकाग्रता (अंश संख्या 12-14) के अंशों में संचित, सफल पीढ़ी और विभिन्न झिल्ली पुटिकाओं के बाद जुदाई का संकेत. इसके विपरीत, कठोर sonication शर्तों के साथ, mitochondrial बाहरी झिल्ली मार्कर टॉम 40 ढाल (अंश संख्या 14 और अंश संख्या 17, चित्रा 4 बी) के निचले अंशों में पता लगाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, मध्यवर्ती घनत्व (अंश संख्या 13 और अंश संख्या 14, चित्रा 4 बी) के अंशों में टिम17 की एक महत्वपूर्ण राशि थी। मध्यवर्ती घनत्व के अंशों में बाहरी और आंतरिक झिल्ली मार्करों का अनिर्दिष्ट संचय मिश्रित झिल्ली के कृत्रिम गठन को इंगित करता है, जो उम्मीदवार प्रोटीन की पहचान को रोकता है।

Figure 1
चित्रा 1: माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। विभिन्न डिब्बों, झिल्ली और प्रोटीन स्थानों को दिखाने के लिए एक माइटोकॉन्ड्रियन का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: संपर्क साइट प्रोटीन को अलग करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल अंश का कार्यप्रवाह। प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध अवलोकन। (1) ताजा पृथक माइटोकॉन्ड्रिया थे (2) ऑस्मोटिक रूप से सूजन (3) और फिर सिकुड़ गए। (4) सिकुड़े हुए माइटोकॉन्ड्रिया को सबमिटोकॉन्ड्रियल पुटिकाओं को उत्पन्न करने के लिए हल्के सोनिकेशन पर आपत्ति जताई गई थी। (5) पुटिका मिश्रण केंद्रित था और एक सुक्रोज चरण ढाल पर लोड किया गया था। (6) सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली पुटिकाओं को कम सुक्रोज एकाग्रता, एक उच्च सुक्रोज एकाग्रता में माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली पुटिकाओं और एक मध्यवर्ती सुक्रोज एकाग्रता में संपर्क स्थल युक्त पुटिकाओं को समृद्ध किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: एमआईएम, माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली; माँ, माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एक रैखिक ढाल की पीढ़ी। दो कदम ढाल (1.3 मीटर, 1.13 मीटर, फिर 1.02 मीटर, 0.96 मीटर, और 20 मिमी एमओपीएस में 0.8 मीटर और 0.5 मिमी ईडीटीए, पीएच 7.4) समानांतर में तैयार किए गए थे, और 20 मिमी एमओपीएस और 0.5 एमएम ईडीटीए, पीएच 7.4 में 0.6 एम सुक्रोज के 1 एमएल, दोनों ग्रेडिएंट पर लोड किया गया था। ग्रेडिएंट को 12 घंटे के लिए 200,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया गया था और प्रत्येक 17 अंशों में काटा गया था। विधि की प्रजनन क्षमता का परीक्षण एक अपहरणमापी का उपयोग करके व्यक्तिगत ग्रेडिएंट के एकल अंशों के सुक्रोज एकाग्रता के निर्धारण द्वारा किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक अच्छी तरह से परिभाषित अल्ट्रासोनिक नाड़ी के साथ संपर्क साइट प्रोटीन का अलगाव। (ए, बी) हौसले से पृथक खमीर माइटोकॉन्ड्रिया को आसमाटिक उपचार के अधीन किया गया और सोनिकेशन के संपर्क में लाया गया। उत्पन्न पुटिकाओं को सुक्रोज उत्प्लावक घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके अलग किया गया था। ढाल को विभाजित किया गया था, और विभिन्न अंशों में प्रोटीन टीसीए वर्षा के अधीन थे। माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली (टॉम 40), माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली (टिम17), और संपर्क साइटों (माइक 60) के लिए मार्कर प्रोटीन के वितरण का विश्लेषण संकेतित एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा किया गया था। (ए) हल्के सोनिकेशन (4 x 30 एस, 10% आयाम) के परिणामस्वरूप बाहरी झिल्ली प्रोटीन (कम घनत्व वाले अंश) और आंतरिक झिल्ली प्रोटीन (उच्च घनत्व अंश) का स्पष्ट पृथक्करण हुआ। इसके अतिरिक्त, संपर्क साइट प्रोटीन Mic60 सफलतापूर्वक मध्यवर्ती घनत्व के अंशों में समृद्ध किया गया था. (बी) कठोर sonication (4 x 30 एस, 20% आयाम) संकर पुटिकाओं की पीढ़ी में हुई और इस प्रकार, संपर्क साइटों के स्पष्ट पृथक्करण के लिए अनुमति नहीं दी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माइटोकॉन्ड्रियल सबफ्रैक्शन कई अत्यधिक जटिल चरणों के साथ एक जटिल प्रयोग है। इसलिए, हमने आगे सुधार करने का लक्ष्य रखा और, कुछ हद तक, हमारी स्थापित विधि32 को सरल बनाया। यहां, चुनौतियां जटिल और अत्यधिक विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता थीं, जो अक्सर व्यक्तिगत निर्माण होते हैं, और भारी समय और ऊर्जा की खपत होती है। यह अंत करने के लिए, हमने रैखिक ढाल की कास्टिंग और कटाई के लिए उपयोग किए जाने वाले पंपों और व्यक्तिगत निर्माणों को हटाने की कोशिश की और एक कदम ढाल में बदल दिया। महत्वपूर्ण रूप से, हमने महसूस किया कि, कम से कम जब यहां वर्णित के रूप में तैयार किया जाता है, तो सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान ढाल रैखिक हो जाता है, जिससे यह एक वैध प्रतिस्थापन बन जाता है। यह विधि (i) एक ढाल मिक्सर की आवश्यकता को समाप्त करती है, इसलिए आवश्यक उपकरण कम हो जाती है; (ii) प्रयोग के दिन समय बचाता है, क्योंकि ढाल पहले से तैयार किया जा सकता है; और (iii) अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (चित्रा 3) जब वर्णित विधि के अनुसार तैयार किया जाता है, जिसमें शीर्ष पर अगले लेयरिंग से पहले व्यक्तिगत चरणों को फ्रीज करना शामिल है। इन ग्रेडिएंट को अनिश्चित काल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भी संग्रहीत किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यहाँ सुझाए गए अवसादन ढाल की लोडिंग भी ढाल के नीचे पुटिका मिश्रण को परत करने की तुलना में आसान है, जैसा कि समान तरीकों 9,32में वर्णित है। एक फ्लोटेशन ग्रेडिएंट लोड करने के लिए पहले से ही कास्ट ग्रेडिएंट को पास करने के लिए एक लंबी प्रवेशनी के साथ एक सिरिंज की आवश्यकता होती है। ढाल को नष्ट करने के जोखिम के कारण यह कदम हमेशा समस्याग्रस्त था। इस विधि का एक अन्य लाभ 24 घंटे 32 की तुलना में12 घंटे का कम सेंट्रीफ्यूजेशन समय है, जो इस विधि के लिए आवश्यक समय और ऊर्जा को बहुत कम कर देता है। यहां वर्णित बेहतर प्रक्रिया की व्यवहार्यता और प्रजनन क्षमता को Cqd1 और Por1-Om1428 द्वारा गठित MICOS-स्वतंत्र संपर्क साइट की हालिया पहचान द्वारा हाइलाइट किया गया है।

हालांकि, यह प्रयोग अभी भी अत्यधिक जटिल है। इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल को लागू करते समय कई आवश्यक मानदंड हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए।

सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक माइटोकॉन्ड्रिया की गुणवत्ता है। इन्हें नए सिरे से अलग करना होगा। इसलिए, प्रक्रिया की योजना बनाते समय खमीर की खेती के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव को ध्यान में रखा जाना चाहिए। अलगाव के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया का कोमल उपचार झिल्ली के विघटन को रोक देगा, जबकि पीएमएसएफ की उचित एकाग्रता के साथ प्रोटीज को रोकना भी महत्वपूर्ण है या, वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल34.

एक और महत्वपूर्ण कदम, और प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक, सोनिकेशन है। महत्वपूर्ण रूप से, निलंबन के घूमने के माध्यम से उत्पन्न ध्वनि द्वारा अल्ट्रासोनिक पल्स की सही तीव्रता का अनुमान लगाना संभव है (वीडियो देखें)। हालांकि, इष्टतम शर्तों प्रयोगात्मक सेटअप के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना है, न केवल विभिन्न ब्रांडों और मॉडलों पर आधारित है, लेकिन यह भी एक ही मॉडल के विभिन्न मशीनों के आधार पर. विशेष रूप से, टिप की डिस्सेप्लर और सफाई भी सोनिकेशन की तीव्रता को प्रभावित करती है, इस प्रकार आवश्यक शर्तों का पुन: समायोजन करती है। प्रोटोकॉल में सिफारिश भी उच्च दक्षता के लिए एक रोसेट सेल का उपयोग करने के लिए है, लेकिन अन्य जहाजों के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं. सोनिकेशन जो बहुत कठोर है, कृत्रिम रूप से मिश्रित पुटिकाओं के गठन की ओर ले जाएगा। इसके परिणामस्वरूप मध्यवर्ती घनत्व के अंशों में आंतरिक और बाहरी झिल्ली प्रोटीन का एक मजबूत संचय होगा, जो दिखाया गया उदाहरण (चित्रा 4बी)के रूप में और भी मजबूत हो सकता है। यदि ऐसा होता है, तो किसी को सोनिकेशन के आयाम या समय को कम करना चाहिए। हालांकि, समस्याएं तब भी उत्पन्न हो सकती हैं जब सोनिकेशन पर्याप्त तीव्र नहीं होता है। इस मामले में, उत्पन्न पुटिकाओं की उपज इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा प्रोटीन का पता लगाने के लिए बहुत कम हो सकती है, और इस प्रकार, किसी को आयाम, समय या सोनिकेशन के चक्र को बढ़ाना होगा।

अंत में, उत्पन्न विभिन्न पुटिका प्रजातियों के पृथक्करण के लिए ढाल महत्वपूर्ण है। हालांकि, सुक्रोज ढाल का इष्टतम अधिकतम और न्यूनतम, साथ ही चरणों की संख्या, व्यक्तिगत सेटअप के आधार पर भी भिन्न हो सकती है। यहां, अधिकतम 1.3 एम सुक्रोज और न्यूनतम 0.8 एम सुक्रोज के साथ पांच-चरण ढाल माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक और बाहरी झिल्ली पुटिकाओं से संपर्क साइट युक्त पुटिकाओं के दृश्य और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पृथक्करण के लिए पर्याप्त है। शुरुआत में, उन स्थितियों को चुनना आवश्यक है जो सही पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली पुटिकाओं के ऊपर और माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली पुटिकाओं के नीचे खाली अंश छोड़ दें। ऊपर या नीचे के अंशों को संपीड़ित करने से कलाकृतियां हो सकती हैं। बाद के चरणों में, जब सुक्रोज की सटीक दाढ़ जिस पर आंतरिक और बाहरी झिल्ली पुटिकाओं को जमा किया जाएगा, ज्ञात है, ढाल को आंतरिक झिल्ली, बाहरी झिल्ली और संपर्क साइटों के बीच संकल्प को बढ़ाने के लिए अधिकतम और न्यूनतम सुक्रोज सांद्रता को बढ़ाकर या घटाकर अनुकूलित किया जा सकता है। ध्यान दें, खमीर की वृद्धि की स्थिति घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन पर उत्पन्न पुटिकाओं के व्यवहार को प्रभावित कर सकती है। यहां, खमीर समृद्ध वाईपी माध्यम (1% [डब्ल्यू/वी] खमीर निकालने, 2% [डब्ल्यू/वी] पेप्टोन, पीएच 5.5) पर उगाया गया था जिसमें ग्लिसरॉल (3% [वी/वी]) 30 डिग्री सेल्सियस34,44 पर कार्बन स्रोत के रूप में था। अन्य विकास की स्थिति माइटोकॉन्ड्रिया की प्रोटीन और लिपिड संरचना को बदल सकती है और इस प्रकार, उत्पन्न पुटिकाओं का घनत्व।

वर्णित विधि संपर्क साइटों को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीका प्रदान करती है। हालांकि, संबंधित संपर्क साइट (आंतरिक और बाहरी झिल्ली घटकों) की प्रोटीन संरचना की पहचान के लिए अतिरिक्त परख की आवश्यकता होती है जैसे कि इम्यूनोप्रिपिटेशन, संभवतः मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में। इसके लिए, प्रोटीन उम्मीदवारों के टैग किए गए संस्करणों को व्यक्त करने वाले विशिष्ट एंटीबॉडी और मॉडल जीव आवश्यक हैं। एक मॉडल जीव के रूप में खमीर का उपयोग करते समय, प्रोटीन उम्मीदवारों को आसानी से उपलब्ध आनुवंशिक संशोधन विधियों की विविधता और टैग किए गए पुस्तकालयों 45,46,47के अस्तित्व के कारण प्राप्त किया जा सकता है। इसलिए, हमने खमीर माइटोकॉन्ड्रिया के लिए इस प्रोटोकॉल को स्थापित और अनुकूलित करने का निर्णय लिया। यद्यपि अन्य जीवों से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के लिए विधि को अनुकूलित करना संभव होना चाहिए, खमीर को उच्च मात्रा में माइटोकॉन्ड्रिया को सस्ते और तेज़ तरीके से प्राप्त करने की अनुमति देने का लाभ है। इसके अलावा, प्रारंभिक परिणामों को इकट्ठा करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में खमीर का उपयोग प्रोटीन परिसरों और प्रक्रियाओं की पहचान करने का एक अच्छी तरह से सिद्ध तरीका है जो मनुष्यों तक उच्च यूकेरियोट्स में संरक्षित हैं। जैसा कि पहले कहा गया है, खमीर 9,10,11 में MICOS की पहचान और लक्षण वर्णन के बाद, यह दिखाया गया था कि MICOS उच्च यूकेरियोट्स21 में रूप और कार्य में संरक्षित है। Cqd1 और Por1, हाल ही में खोजे गए MICOS-स्वतंत्र संपर्क साइट28 के घटक भी संरक्षित हैं, यह दर्शाता है कि यह संपर्क साइट उच्च यूकेरियोट्स में भी मौजूद है।

इन संपर्क साइटों पर निरंतर शोध के महत्व को विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों 18,48,49,50,51,52,53,54 के लिए एमआईसीओएस के लिंक द्वारा रेखांकित किया गया है। PINK60 द्वारा Mic1 के सही फॉस्फोराइलेशन को ड्रोसोफिलिया में क्रिस्टा जंक्शनों के रखरखाव से जोड़ा गया है, और इस प्रकार, यह मार्ग, जो मनुष्यों के लिए संरक्षित है, पार्किंसंस रोग48 से जुड़ा हो सकता है। इसके अलावा, मानव MICOS सबयूनिट Mic14 में एक बिंदु उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप MICOS की अस्थिरता और माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर के बाद के परिवर्तन होते हैं, जो फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया और एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस50,51,52,53,54 से पीड़ित रोगियों में पाए गए हैं. चूंकि माइक 14 खमीर से मनुष्यों तक संरक्षित है, इसलिए इस प्रोटीन पर आगे के अध्ययन एक मॉडल जीव के रूप में खमीर का उपयोग करके आयोजित किए जा सकते हैं। इस बुनियादी शोध से इन बीमारियों के अंतर्निहित तंत्र की बेहतर समझ हो सकती है, जो उनके लिए कुशल उपचार और उपचार के विकास को गति दे सकती है। इसके अलावा, अतिरिक्त MICOS-स्वतंत्र संपर्क साइटों27,28 की हाल की खोजों से संकेत मिलता है कि यह क्षेत्र अभी भी बढ़ रहा है। इसलिए, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल इस आशाजनक और आकर्षक शोध को आगे बढ़ाने में मदद कर सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एमईएच वित्तीय सहायता के लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG), परियोजना संख्या 413985647 को स्वीकार करता है। माइकल किबलर, लुडविग-मैक्सिमिलियंस विश्वविद्यालय, म्यूनिख, उनके उदार और व्यापक समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। हम वाल्टर न्यूपर्ट के वैज्ञानिक इनपुट, सहायक चर्चाओं और चल रही प्रेरणा के लिए आभारी हैं। जेएफ समर्थन के लिए ग्रेजुएट स्कूल लाइफ साइंस म्यूनिख (एलएसएम) को धन्यवाद देता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm Beckman Instruments, Germany 344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm Beckman Instruments, Germany 363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g Beckman Instruments, Germany 363055
Abbe refractometer Zeiss, Germany discontinued,
any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller Brandtech, USA BR26320 discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL DWK Life Science, Germany C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D Branson Ultrasonics, USA FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP Branson Ultrasonics, USA 101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell Branson Ultrasonics, USA 15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26 Beckman Instruments, Germany B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra Beckman Instruments, Germany 8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail Roche, Switzerland 11697498001
D-Sorbit Roth, Germany 6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) Roth, Germany 8043
Erlenmeyer flask, 100 mL Roth, Germany X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 Hirschmann, Germany 1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 Hirschmann, Germany 1180153
ice bath neoLab, Germany  S12651
Magnetic stirrer RCT basic IKA-Werke GmbH, Germany Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) Gerbu, Germany 1081
MyPipetman Select P1000 Gilson, USA FP10006S
MyPipetman Select P20 Gilson, USA FP10003S
MyPipetman Select P200 Gilson, USA FP10005S
Omnifix 1 mL Braun, Germany 4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Serva, Germany 32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm Braun, Germany 4022495052414
stirring bar, 15 mm VWR, USA 442-0366
Sucrose Merck, Germany S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Instruments, Germany 331362
Test tubes Eppendorf, Germany 3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel VWR, USA 432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip VWR, USA 432-0212
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma Aldrich, Germany 33731 discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS Roth, Germany 4855

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माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क स्थल माइटोकॉन्ड्रिया यूकेरियोटिक कोशिकाएं ऊर्जा उत्पादन लौह-सल्फर क्लस्टर लिपिड प्रोटीन सीए 2 + बफरिंग एपोप्टोसिस माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन मानव रोग कैंसर मधुमेह न्यूरोडीजेनेरेशन माइटोकॉन्ड्रियल लिफाफा दो झिल्ली प्रोटीनयुक्त संपर्क स्थल आंतरिक झिल्ली बाहरी झिल्ली सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया माइटोकॉन्ड्रिया संपर्क साइट प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क साइट और क्रिस्टे आयोजन प्रणाली (एमआईसीओएस) परिसर मनुष्यों के लिए खमीर Cqd1 और पोर 1-ओएम 14 कॉम्प्लेक्स
माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क साइटों को अलग करने के लिए एक बेहतर तरीका
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Khosravi, S., Frickel, J., Harner,… More

Khosravi, S., Frickel, J., Harner, M. E. An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites. J. Vis. Exp. (196), e65444, doi:10.3791/65444 (2023).

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