Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En förbättrad metod för att isolera mitokondriella kontaktställen

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65444
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
* These authors contributed equally

Summary

Mitokondriella kontaktställen är proteinkomplex som interagerar med mitokondriella inre och yttre membranproteiner. Dessa platser är viktiga för kommunikationen mellan mitokondriella membran och därmed mellan cytosolen och mitokondriematrisen. Här beskriver vi en metod för att identifiera kandidater som kvalificerar sig för denna specifika klass av proteiner.

Abstract

Mitokondrier finns i praktiskt taget alla eukaryota celler och utför viktiga funktioner som går långt utöver energiproduktion, till exempel syntes av järn-svavelkluster, lipider eller proteiner, Ca2+ -buffring och induktion av apoptos. På samma sätt resulterar mitokondriell dysfunktion i allvarliga mänskliga sjukdomar som cancer, diabetes och neurodegeneration. För att kunna utföra dessa funktioner måste mitokondrierna kommunicera med resten av cellen över sitt hölje, som består av två membran. Därför måste dessa två membran interagera hela tiden. Proteinhaltiga kontaktställen mellan mitokondriernas inre och yttre membran är viktiga i detta avseende. Hittills har flera kontaktplatser identifierats. I den metod som beskrivs här används mitokondrier av Saccharomyces cerevisiae för att isolera kontaktställen och på så sätt identifiera kandidater som kvalificerar sig för proteiner på kontaktställen. Vi använde denna metod för att identifiera MICOS-komplexet (mitokondriellt kontaktställe och cristae organizing system), ett av de viktigaste kontaktplatsbildande komplexen i mitokondriernas inre membran, som bevaras från jäst till människa. Nyligen förbättrade vi denna metod ytterligare för att identifiera ett nytt kontaktställe bestående av Cqd1 och Por1-Om14-komplexet.

Introduction

Mitokondrier utför en mängd olika funktioner i eukaryoter, där den mest kända är produktionen av ATP genom oxidativ fosforylering. Andra funktioner inkluderar produktion av järn-svavelkluster, lipidsyntes och i högre eukaryoter, Ca2+-signalering och induktion av apoptos 1,2,3,4. Dessa funktioner är oskiljaktigt kopplade till deras komplexa ultrastruktur.

Den mitokondriella ultrastrukturen beskrevs först med elektronmikroskopi5. Det visade sig att mitokondrier är ganska komplexa organeller som består av två membran: det mitokondriella yttre membranet och det mitokondriella inre membranet. Således bildas två vattenhaltiga fack av dessa membran: intermembranutrymmet och matrisen. Det mitokondriella inre membranet kan delas upp ytterligare i olika sektioner. Det inre gränsmembranet stannar i närheten av det yttre membranet, och cristae bildar invaginationer. Så kallade crista-övergångar förbinder det inre gränsmembranet och cristae (figur 1). Dessutom avslöjar elektronmikroskop av osmotiskt krympta mitokondrier att det finns platser där mitokondriemembranen är tätt sammankopplade 6,7. Dessa så kallade kontaktställen bildas av proteinkomplex som spänner över de två membranen (Figur 1). Man tror att dessa interaktionsställen är viktiga för cellviabilitet på grund av deras betydelse för regleringen av mitokondriell dynamik och arv, såväl som överföringen av metaboliter och signaler mellan cytosolen och matrisen8.

MICOS-komplexet i det mitokondriella inre membranet är förmodligen det bäst karakteriserade och mest mångsidiga kontaktplatsbildande komplexet. MICOS beskrevs i jäst 2011, och den består av sex underenheter 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 och Mic10. Dessa bildar ett komplex på cirka 1,5 MDa som lokaliseras till crista-korsningarna 9,10,11. Borttagandet av endera kärnsubenheten, Mic10 eller Mic60, leder till frånvaron av detta komplexa 9,11, vilket innebär att dessa två subenheter är väsentliga för stabiliteten hos MICOS. Intressant nog bildar MICOS inte bara en utan flera kontaktställen med olika mitokondriella yttermembranproteiner och komplex: TOM-komplexet 11,12, TOB/SAM-komplexet 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1-komplexet9, Por1 10, OM45 10 och Miro 17. Detta indikerar starkt att MICOS-komplexet är involverat i olika mitokondriella processer, såsom proteinimport, fosfolipidmetabolism och generering av den mitokondriella ultrastrukturen18. Den senare funktionen är troligen den huvudsakliga funktionen hos MICOS, eftersom frånvaron av MICOS-komplexet inducerat genom deletion av MIC10 eller MIC60 leder till en onormal mitokondriell ultrastruktur som praktiskt taget helt saknar regelbundna cristae. Istället ackumuleras inre membranvesiklar utan anslutning till det inre gränsmembranet19, 20. Viktigt är att MICOS bevaras i form och funktion från jäst till människa21. Sambandet mellan mutationer i MICOS-subenheter och allvarliga mänskliga sjukdomar understryker också dess betydelse för högre eukaryoter22,23. Även om MICOS är mycket mångsidigt måste det finnas ytterligare kontaktplatser (baserat på våra opublicerade observationer). Flera andra kontaktställen har identifierats, till exempel mitokondriefusionsmaskinerna Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 eller Mdm31-Por1, som är involverade i biosyntesen av den mitokondriespecifika fosfolipidkardiolipin 27. Nyligen förbättrade vi metoden som ledde oss till identifieringen av MICOS för att identifiera Cqd1 som en del av ett nytt kontaktställe bildat med det yttre membrankomplexet Por1-Om1428. Intressant nog verkar denna kontaktplats också vara involverad i flera processer såsom mitokondriell membranhomeostas, fosfolipidmetabolism och distributionen av koenzym Q28,29.

Här använde vi en variant av den tidigare beskrivna fraktioneringen av mitokondrier 9,30,31,32,33. Osmotisk behandling av mitokondrier leder till att det mitokondriella yttre membranet störs och till att matrisutrymmet krymper, vilket gör att de två membranen endast är nära varandra vid kontaktställena. Detta möjliggör generering av vesiklar som uteslutande består av mitokondriellt yttre membran eller mitokondriellt inre membran eller vid inneslutna kontaktställen för båda membranen genom mild ultraljudsbehandling. På grund av att det mitokondriella inre membranet har ett mycket högre protein-till-lipid-förhållande, uppvisar mitokondriella inre membranvesiklar en högre densitet jämfört med mitokondriella yttre membranvesiklar. Skillnaden i densitet kan användas för att separera membranvesiklarna genom sackarosflytande densitetsgradientcentrifugering. Således ackumuleras de mitokondriella yttre membranvesiklarna vid låga sackaroskoncentrationer, medan de mitokondriella inre membranvesiklarna anrikas vid höga sackaroskoncentrationer. De vesiklar som innehåller kontaktställen koncentreras till koncentrationer av sackaros som ligger mellan dessa (figur 2). Följande protokoll beskriver denna förbättrade metod, som kräver mindre specialiserad utrustning, tid och energi jämfört med vår tidigare etablerade metod32, i detalj och ger ett användbart verktyg för identifiering av möjliga proteiner på kontaktställen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Buffertar och stamlösningar

  1. Gör en 1 M 3-morfolinopropan-1-sulfonsyralösning (MOPS) i avjoniserat vatten, pH 7,4. Förvaras vid 4 °C.
  2. Bered 500 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i avjoniserat vatten, pH 8,0. Förvaras i rumstemperatur.
  3. Förbered 2,4 M sorbitol i avjoniserat vatten. Förvaras i rumstemperatur efter autoklavering.
  4. Förbered 2,5 M sackaros i avjoniserat vatten. Förvaras i rumstemperatur efter autoklavering.
  5. Bered 200 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) i isopropanol. Förvaras vid −20 °C.
    VARNING: PMSF är giftigt vid förtäring och orsakar allvarliga brännskador på huden och ögonen. Andas inte in dammet och använd skyddshandskar och skyddsglasögon.
  6. Förbered 72 % triklorättiksyra (TCA) i avjoniserat vatten. Förvaras vid 4 °C.
    VARNING: TCA kan orsaka irritation i luftvägarna, allvarliga brännskador på huden och ögonskador. Andas inte in dammet och använd skyddshandskar och skyddsglasögon.
  7. Förbered SM-bufferten: 20 mM MOPS och 0,6 M sorbitol, pH 7,4.
  8. Förbered svällningsbufferten: 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF och proteashämmarcocktail, pH 7,4.
  9. Förbered sackarosgradientbuffertarna: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M och 1,3 M sackaros i 20 mM MOPS och 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
    OBS: Alla buffertar kan förvaras vid 4 °C; Det rekommenderas dock att de sackaroshaltiga buffertarna förvaras vid −20 °C för att undvika svamptillväxt. Proteashämmarna måste tillsättas på nytt före användning.

2. Generering av submitokondriella vesiklar

  1. Isolera råa jästmitokondrier på nytt enligt fastställda protokoll34,35.
    OBS: För detta experiment isolerades mitokondrier från Saccharomyces cerevisiae. Det är inte nödvändigt att generera rena mitokondrier utan andra organeller.
  2. Återsuspendera 10 mg nyisolerade mitokondrier i 1,6 ml SM-buffert (4 °C) genom pipettering (figur 2, steg 1).
  3. Överför mitokondriesuspensionen till en förkyld 100 ml Erlenmeyerkolv.
  4. Tillsätt långsamt 16 ml svällningsbuffert med en 20 ml glaspipett. Applicera konstant lätt omrörning på is under tillsatsen. Denna osmotiska behandling resulterar i vattenupptag i matrisutrymmet. Svullnaden av det mitokondriella inre membranet kommer att störa det yttre membranet. Båda membranen kommer dock att förbli i kontakt vid kontaktställena9 (Figur 2, steg 2).
  5. Inkubera proverna under konstant lätt omrörning i 30 minuter på is.
  6. Tillsätt långsamt 5 ml 2,5 M sackaroslösning med en 5 ml glaspipett för att öka sackaroskoncentrationen i proverna till cirka 0,55 M. Denna osmotiska behandling resulterar i ett vattenutflöde från matrisen36. Krympningen av det inre membranet är avsett att maximera dess avstånd till de kvarvarande fragmenten av det yttre membranet. Detta minskar sannolikheten för att generera artificiella hybridvesiklar av inre och yttre membran genom ultraljudsbehandling (Figur 2, steg 3).
  7. Inkubera proverna under lätt omrörning i 15 minuter på is.
  8. Utsätt mitokondrierna för ultraljudsbehandling för att generera submitokondriella membranvesiklar (Figur 2, steg 4).
    1. Överför den mitokondriella suspensionen till en förkyld rosettcell.
    2. Ultraljudsbehandling av mitokondriell suspension med en amplitud på 10% i 30 s medan rosettcellen kyls i ett isbad.
    3. Låt suspensionen vila i 30 s i ett isbad.
    4. Upprepa steg 2.8.2 och steg 2.8.3 tre gånger till.
      OBS: Ultraljudsbehandlingen varierar beroende på vilken ultraljudsmätare som används. Optimering kommer att vara nödvändig för enskilda maskiner. Ultraljudsbehandling som är för hård kommer att leda till konstgjord bildning av vesiklar som består av mitokondriella inre och yttre membran.

3. Separering av submitokondriella vesiklar

  1. Separera de genererade vesiklarna från de återstående intakta mitokondrierna genom centrifugering vid 20 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. De intakta mitokondrierna kommer att pelletera medan vesiklarna kommer att stanna i supernatanten.
  2. Koncentrera vesikelblandningen.
    1. Överför supernatanten till färska ultracentrifugeringsrör.
    2. Ladda en kudde med 0,3 ml 2,5 M sackaroslösning i botten av röret med en 1 ml spruta utrustad med en 0,8 mm x 120 mm kanyl.
    3. Centrifugera vid 118 000 x g i 100 minuter vid 4 °C.
      OBS: Här användes en svängbar skoprotor med en maximal radie på 153,1 mm. Centrifugeringsförhållandena beror i hög grad på rotorn och måste anpassas när en annan rotor används.
  3. Vesiklarna kommer att synas som en skiva på toppen av sackaroskudden efter centrifugeringen. Kassera cirka 90 % av supernatanten. Skörda nu de koncentrerade vesiklarna genom att återsuspendera dem i den återstående bufferten, inklusive 2,5 M sackaros, genom att pipettera upp och ner. Överför suspensionen till en iskall Dounce homogenisator.
  4. Homogenisera suspensionen med minst 10 slag med hjälp av en polytetrafluoretenkrukmakare.
  5. Förbered sackarosgradienten.
    1. För en 11 ml steglutning med fem steg (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M och 0,8 M sackaros i 20 mM MOPS och 0,5 mM EDTA, pH 7,4) har varje lager 2,2 ml sackaroslösning.
      OBS: En refraktometer rekommenderas för att mäta och justera sackaroskoncentrationerna; Det är dock inte nödvändigt. Applicera 10 μL av bufferten på refraktometern och detektera respektive brytningsindex. Sackaroskoncentrationen beräknas på följande sätt:
      Equation 1
      1,3333 representerar vattnets brytningsindex. 0,048403 är ett sackarosspecifikt omvandlingsindex erhållet från den linjära skalningen av molär refraktion till sackaroskoncentration i vattenlösningar 37.
    2. Tillsätt den högsta sackaroskoncentrationen till centrifugeringsröret och ställ röret vid −20 °C. Vänta tills lagret är helt fruset innan du applicerar nästa. Fortsätt tills det sista lagret har lagts till och förvara gradienterna vid −20 °C.
      OBS: Kom ihåg att överföra de frusna gradienterna till 4 °C när du startar experimentet för att låta gradienterna tina. Detta tar cirka 3 timmar. För centrifugeringen här användes en svängbar skoprotor med en kapacitet på 13,2 ml. När en annan rotor används måste gradientstegsvolymerna anpassas därefter.
  6. Mät sackaroskoncentrationen i proverna med en refraktometer. Om det inte finns tillgång till refraktometer kan man alternativt anta att sackaroskoncentrationen är 2 M. Denna förmodade sackaroskoncentration kommer sedan att ligga till grund för nästa steg.
  7. Justera sackaroskoncentrationen till 0,6 M genom tillsats av en lämplig mängd 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF och proteashämmarcocktail, pH 7,4. Om sackaroskoncentrationen uppskattas till 2 M i stället för att mätas, rekommenderas att man testar om koncentrationen är tillräckligt låg efter justeringen. Applicera en liten delmängd av provet (ca 50 μL) ovanpå 200 μL 0,8 M sackaros i ett provrör. Provet måste ligga ovanpå 0,8 M sackaros.
  8. Ladda proverna (cirka 1 ml) ovanpå sackarosgradienten (behåll 10 % för senare referens). Det är viktigt att pipettera försiktigt för att undvika att gradienten störs (figur 2, steg 5).
  9. Blåsorna separeras genom centrifugering vid 200 000 x g och 4 °C i 12 timmar. Om möjligt, ställ in centrifugen på långsam acceleration och retardation för att undvika störningar av gradienten (Figur 2, steg 6).
    OBS: Här användes en svängbar skoprotor med en maximal radie på 153,1 mm. Centrifugeringsförhållandena beror i hög grad på rotorn och måste anpassas när en annan rotor används.
  10. Skörda gradienten uppifrån och ner i 700 μL-fraktioner med en 1 ml pipett. Detta kommer att resultera i 17 fraktioner, vilket möjliggör en tillräcklig upplösning.

4. Analys av submitokondriella vesiklar

  1. Koncentrera proteinerna genom att utsätta varje fraktion för två sekventiellt utförda TCA-utfällningar38 för att förbereda SDS-PAGE-proverna.
    1. Tillsätt 200 μl 72 % triklorisocyanursyra till de enskilda fraktionerna och blanda tills lösningen är homogen. Inkubera fraktionerna i 30 minuter på is och pelletera de utfällda proteinerna genom centrifugering vid 20 000 x g och 4 °C i 20 minuter. Kassera supernatanten, tillsätt 500 μl 28 % TCA-lösning, blanda väl och upprepa centrifugeringen.
    2. Tvätta pelletsen med 1 ml aceton (−20 °C) och centrifugera i 10 minuter vid 20 000 x g och 4 °C. Kassera supernatanten och låt pelletsen lufttorka. Återsuspendera pelletsen i 60 μl SDS-provbuffert och inkubera proverna i 5 minuter vid 95 °C.
      OBS: En stor mängd sackaros kommer att finnas kvar, särskilt i de täta fraktionerna, efter den första TCA-nederbörden. Detta kommer att avlägsnas genom den extra TCA-nederbörden.
  2. Analysera 20 μL av varje fraktion med SDS-PAGE39 och immunoblot40,41,42,43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det är relativt enkelt att separera mitokondriernas inre och yttre membran. Det är dock mycket svårare att bilda och separera vesiklar som innehåller blåsor som innehåller kontaktställen. Enligt vår mening är två steg kritiska och väsentliga: ultraljudsbehandling förhållanden och den gradient som används.

Vanligtvis anses linjära gradienter ha en bättre upplösning jämfört med steggradienter. Deras reproducerbara produktion är dock tråkig och kräver specialutrustning. Därför etablerade vi en metod för att generera en steggradient med relativt små skillnader mellan de enskilda stegen (se steg 3.5). Vi spekulerade i att steggradienten skulle balanseras vid centrifugering, vilket resulterade i en nästan linjär gradient. Bestämningen av sackaroskoncentrationerna i de enskilda fraktionerna efter centrifugering med hjälp av en refraktometer visade att steggradienten faktiskt blev praktiskt taget linjär efter 12 timmars centrifugering vid 200 000 x g (figur 3).

Vikten av mild ultraljudsbehandling är uppenbar i dessa representativa resultat. Under milda ultraljudsbehandlingsförhållanden (Figur 4A) var den mitokondriella yttre membranmarkören Tom40 anrikad i de tidiga lågdensitetsfraktionerna (Fraktion nr 4) och var praktiskt taget frånvarande i de senare. Den mitokondriella inre membranmarkören Tim17 var koncentrerad i högdensitetsfraktioner (fraktion nr 17). Däremot ackumulerades kontaktproteinet Mic60 i fraktioner av intermediär sackaroskoncentration (fraktion nr 12-14), vilket indikerar framgångsrik generering och efterföljande separation av de olika membranvesiklarna. Däremot, med hårdare ultraljudsbehandling, kunde den mitokondriella yttre membranmarkören Tom40 detekteras i lägre fraktioner av gradienten (Fraktion nr 14 och Fraktion nr 17, Figur 4B). Dessutom fanns det en signifikant mängd Tim17 i fraktioner av intermediär densitet (fraktion nr 13 och fraktion nr 14, figur 4B). Den ospecifika ackumuleringen av yttre och inre membranmarkörer i fraktioner av intermediär densitet indikerar konstgjord bildning av blandade membran, vilket hämmar identifieringen av kandidatproteiner.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av den mitokondriella ultrastrukturen. En schematisk representation av en mitokondrie för att visa de olika facken, membranen och proteinplatserna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Arbetsflöde för mitokondriell fraktionering för att isolera proteiner på kontaktställen. En schematisk översikt över processen som beskrivs i protokollet. De (1) nyligen isolerade mitokondrierna var (2) osmotiskt svullna (3) och krympte sedan. (4) De krympta mitokondrierna invändes mot mild ultraljudsbehandling för att generera submitokondriella vesiklar. (5) Vesikelblandningen koncentrerades och lagrades på en sackarosstegsgradient. (6) Genom centrifugering anrikades de mitokondriella yttre membranvesiklarna vid en låg sackaroskoncentration, de mitokondriella inre membranvesiklarna vid en hög sackaroskoncentration och vesiklarna som innehåller kontaktpunkter vid en medelhög sackaroskoncentration. Förkortningar: MIM, mitokondriellt inre membran; MOM, mitokondriellt yttermembran. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Generering av en linjär gradient genom centrifugering. Tvåstegsgradienter (1,3 M, 1,13 M, sedan 1,02 M, 0,96 M och 0,8 M i 20 mM MOPS och 0,5 mM EDTA, pH 7,4) bereddes parallellt, och 1 ml 0,6 M sackaros i 20 mM MOPS och 0,5 mM EDTA, pH 7,4, laddades på båda gradienterna. Gradienterna centrifugerades vid 200 000 x g och 4 °C i 12 timmar och skördades i 17 fraktioner vardera. Metodens reproducerbarhet testades genom bestämning av sackaroskoncentrationen av de enskilda fraktionerna av de enskilda gradienterna med hjälp av en refraktometer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Isolering av proteiner vid kontaktställen med en väldefinierad ultraljudspuls. (A,B) Nyisolerade jästmitokondrier utsattes för osmotisk behandling och utsattes för ultraljudsbehandling. De genererade vesiklarna separerades med sackarosflytande densitetsgradientcentrifugering. Gradienten fraktionerades och proteinerna i de olika fraktionerna utsattes för TCA-utfällning. Fördelningen av markörproteinerna för mitokondriernas yttermembran (Tom40), mitokondriernas inre membran (Tim17) och kontaktställen (Mic60) analyserades genom immunoblot med hjälp av de indikerade antikropparna. (A) Mild ultraljudsbehandling (4 x 30 s, 10% amplitud) resulterade i en tydlig separation av de yttre membranproteinerna (lågdensitetsfraktioner) och inre membranproteiner (högdensitetsfraktioner). Dessutom anrikades kontaktproteinet Mic60 framgångsrikt i fraktioner av intermediär densitet. (B) Hårdare ultraljudsbehandling (4 x 30 s, 20% amplitud) resulterade i generering av hybridvesiklar och tillät därför inte en tydlig separation av kontaktställena. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mitokondriell subfraktionering är ett komplicerat experiment med flera mycket komplexa steg. Därför strävade vi efter att ytterligare förbättra och i viss mån förenkla vår etablerade metod32. Här var utmaningarna kravet på komplicerad och mycket specialiserad utrustning, som ofta är individuella konstruktioner, och den enorma tids- och energiförbrukningen. För detta ändamål försökte vi ta bort pumparna och de enskilda konstruktionerna som användes för gjutning och skörd av den linjära gradienten och bytte till en steggradient. Viktigt är att vi insåg att, åtminstone när den bereds enligt beskrivningen här, blir gradienten linjär under centrifugeringen, vilket gör detta till en giltig ersättning. Denna metod (i) eliminerar behovet av en gradientblandare, vilket minskar den nödvändiga utrustningen; ii) sparar tid på dagen för experimentet, eftersom gradienten kan förberedas i förväg, och (iii) är mycket reproducerbart (figur 3) när det bereds enligt den beskrivna metoden, vilket innebär att de enskilda stegen fryses innan nästa skiktas ovanpå. Dessa gradienter kan också lagras på obestämd tid vid −20 °C. Dessutom är det lättare att ladda den här föreslagna sedimentationsgradienten än att behöva lägga vesikelblandningen under gradienten, som beskrivs i liknande metoder 9,32. För att ladda en flytgradient krävs en spruta med en lång kanyl för att passera den redan gjutna gradienten. Detta steg var alltid problematiskt på grund av risken att förstöra gradienten. En annan fördel med denna metod är den lägre centrifugeringstiden på 12 timmar jämfört med 24 timmar32, vilket avsevärt minskar den tid och energi som krävs för denna metod. Genomförbarheten och reproducerbarheten av det förbättrade förfarande som beskrivs här belyses av den nyligen genomförda identifieringen av den MICOS-oberoende kontaktplats som bildas av Cqd1 och Por1-Om1428.

Detta experiment är dock fortfarande mycket komplext. För att uppnå optimala resultat finns det flera viktiga kriterier som måste beaktas vid tillämpningen av detta protokoll.

En av de viktigaste aspekterna är kvaliteten på mitokondrierna. Dessa måste nyisoleras. Därför måste odling av jäst samt isolering av mitokondrier beaktas vid planering av proceduren. Skonsam behandling av mitokondrierna under isoleringen kommer att förhindra att membranen bryts, samtidigt som det också är viktigt att hämma proteaser med en lämplig koncentration av PMSF eller, alternativt, kommersiellt tillgängliga cocktails av proteashämmare34.

Ett annat viktigt steg, och en av de mest kritiska aspekterna av förfarandet, är ultraljudsbehandling. Viktigt är att det är möjligt att uppskatta den korrekta intensiteten av ultraljudspulsen genom ljudet som genereras genom virveln av suspensionen (se video). De optimala förhållandena måste dock bestämmas experimentellt för varje experimentell uppställning, inte bara baserat på olika märken och modeller utan också olika maskiner av samma modell. Noterbart, demontering och rengöring av spetsen påverkar också intensiteten av ultraljudsbehandling, vilket gör en justering av förhållandena nödvändig. Rekommendationen i protokollet är också att använda en rosettcell för högre effektivitet, men andra kärl kan också fungera. Ultraljudsbehandling som är för hård kommer att leda till bildandet av artificiellt blandade vesiklar. Detta kommer att resultera i en stark ackumulering av inre och yttre membranproteiner i fraktioner av mellanliggande densitet, som kan vara ännu starkare, som i det visade exemplet (Figur 4B). Om detta händer, bör man minska amplituden eller tiden för ultraljudsbehandling. Emellertid, problem kan också uppstå när ultraljudsbehandling inte är tillräckligt intensiv. I detta fall kan utbytet av de genererade vesiklarna vara för lågt för att detektera proteiner genom immunoblot, och därmed skulle man behöva öka amplituden, tiden eller cyklerna för ultraljudsbehandling.

Slutligen är gradienten viktig för separationen av de olika vesikelarter som genereras. Men det optimala max- och minimivärdet för sackarosgradienten, liksom antalet steg, kan också variera beroende på den individuella inställningen. Här räckte det med en femstegsgradient med högst 1,3 M sackaros och minst 0,8 M sackaros för en synlig och reproducerbar separation av vesiklar som innehåller kontaktstället från de mitokondriella inre och yttre membranvesiklarna. I början är det viktigt att välja förhållanden som lämnar tomma fraktioner ovanför de mitokondriella yttre membranvesiklarna och under de mitokondriella inre membranvesiklarna för att säkerställa korrekt separation. Om du komprimerar antingen de övre eller nedre fraktionerna kan det leda till artefakter. I senare steg, när den exakta molariteten hos sackaros vid vilken de inre och yttre membranvesiklarna kommer att ackumuleras är känd, kan gradienten optimeras genom att öka eller minska de maximala och lägsta sackaroskoncentrationerna för att förbättra upplösningen mellan det inre membranet, det yttre membranet och kontaktställena. Observera att tillväxtförhållandena för jäst kan påverka beteendet hos de genererade vesiklarna vid densitetscentrifugering. Här odlades jästen på rikt YP-medium (1 % [w/v] jästextrakt, 2 % [w/v] pepton, pH 5,5) innehållande glycerol (3 % [v/v]) som kolkälla vid 30 °C34,44. Andra tillväxtbetingelser kan förändra protein- och lipidsammansättningen i mitokondrierna och därmed densiteten hos de genererade vesiklarna.

Den beskrivna metoden ger ett tillförlitligt och reproducerbart sätt att isolera kontaktställen. Identifieringen av proteinsammansättningen på respektive kontaktställe (inre och yttre membrankomponenter) kräver dock ytterligare analyser såsom immunoprecipitering, eventuellt i kombination med masspektrometri. För detta krävs specifika antikroppar och modellorganismer som uttrycker märkta versioner av proteinkandidaterna. När man använder jäst som modellorganism kan proteinkandidater lätt erhållas på grund av de olika genetiska modifieringsmetoder som finns tillgängliga och förekomsten av märkta bibliotek45,46,47. Därför bestämde vi oss för att etablera och optimera detta protokoll för jästmitokondrier. Även om det borde vara möjligt att anpassa metoden för mitokondrier isolerade från andra organismer, har jäst fördelen att stora mängder mitokondrier kan erhållas på ett billigt och snabbt sätt. Att använda jäst som modellorganism för att samla in de första resultaten är dessutom ett väl beprövat sätt att identifiera proteinkomplex och processer som är bevarade i högre eukaryoter upp till människor. Som tidigare nämnts, efter identifiering och karakterisering av MICOS i jäst 9,10,11, visades det att MICOS bevaras i form och funktion i högre eukaryoter 21. Cqd1 och Por1, komponenter i det nyligen upptäckta MICOS-oberoende kontaktstället28, är också bevarade, vilket tyder på att detta kontaktställe också finns i högre eukaryoter.

Vikten av fortsatt forskning om dessa kontaktytor understryks av MICOS kopplingar till olika neurodegenerativa sjukdomar 18,48,49,50,51,52,53,54. Den korrekta fosforyleringen av Mic60 av PINK1 har kopplats till upprätthållandet av crista junctions i Drosophilia, och därmed kan denna väg, som är bevarad för människor, vara kopplad till Parkinsons sjukdom48. Dessutom resulterar en punktmutation i den humana MICOS-subenheten Mic14 i destabilisering av MICOS och den efterföljande förändringen av den mitokondriella ultrastrukturen, vilket har hittats hos patienter som lider av frontotemporal demens och amyotrofisk lateralskleros 50,51,52,53,54. Eftersom Mic14 bevaras från jäst till människa skulle ytterligare studier av detta protein kunna genomföras med jäst som modellorganism. Denna grundforskning kan leda till en bättre förståelse av de bakomliggande mekanismerna för dessa sjukdomar, vilket skulle kunna påskynda utvecklingen av effektiva behandlingar och terapier för dem. Dessutom tyder de senaste upptäckterna av ytterligare MICOS-oberoende kontaktplatser27,28 på att detta område fortfarande växer. Därför kan det här presenterade protokollet hjälpa till att utveckla denna lovande och fascinerande forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte föreligger några intressekonflikter.

Acknowledgments

M.E.H. tackar Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projektnummer 413985647, för finansiellt stöd. Författarna tackar Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians University, München, för hans generösa och omfattande stöd. Vi är tacksamma mot Walter Neupert för hans vetenskapliga bidrag, hjälpsamma diskussioner och pågående inspiration. J.F. tackar Graduate School Life Science Munich (LSM) för stödet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm Beckman Instruments, Germany 344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm Beckman Instruments, Germany 363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g Beckman Instruments, Germany 363055
Abbe refractometer Zeiss, Germany discontinued,
any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller Brandtech, USA BR26320 discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL DWK Life Science, Germany C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D Branson Ultrasonics, USA FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP Branson Ultrasonics, USA 101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell Branson Ultrasonics, USA 15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26 Beckman Instruments, Germany B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra Beckman Instruments, Germany 8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail Roche, Switzerland 11697498001
D-Sorbit Roth, Germany 6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) Roth, Germany 8043
Erlenmeyer flask, 100 mL Roth, Germany X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 Hirschmann, Germany 1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 Hirschmann, Germany 1180153
ice bath neoLab, Germany  S12651
Magnetic stirrer RCT basic IKA-Werke GmbH, Germany Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) Gerbu, Germany 1081
MyPipetman Select P1000 Gilson, USA FP10006S
MyPipetman Select P20 Gilson, USA FP10003S
MyPipetman Select P200 Gilson, USA FP10005S
Omnifix 1 mL Braun, Germany 4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Serva, Germany 32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm Braun, Germany 4022495052414
stirring bar, 15 mm VWR, USA 442-0366
Sucrose Merck, Germany S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Instruments, Germany 331362
Test tubes Eppendorf, Germany 3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel VWR, USA 432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip VWR, USA 432-0212
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma Aldrich, Germany 33731 discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS Roth, Germany 4855

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

Tags

Mitokondriella kontaktställen mitokondrier eukaryota celler energiproduktion järn-svavelkluster lipider proteiner Ca2+-buffring apoptos mitokondriell dysfunktion mänskliga sjukdomar cancer diabetes neurodegeneration mitokondriellt hölje två membran proteinhaltiga kontaktställen inre membran yttermembran saccharomyces cerevisiae mitokondrier kontaktproteinproteiner mitokondriellt kontaktställe och Cristae Organizing System (MICOS) komplex jäst till människor Cqd1 och Por1-OM14 Komplex
En förbättrad metod för att isolera mitokondriella kontaktställen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khosravi, S., Frickel, J., Harner,… More

Khosravi, S., Frickel, J., Harner, M. E. An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites. J. Vis. Exp. (196), e65444, doi:10.3791/65444 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter