Summary
Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.
Abstract
Mitochondriën zijn aanwezig in vrijwel alle eukaryote cellen en vervullen essentiële functies die veel verder gaan dan energieproductie, bijvoorbeeld de synthese van ijzer-zwavelclusters, lipiden of eiwitten, Ca2+ -buffering en de inductie van apoptose. Evenzo resulteert mitochondriale disfunctie in ernstige ziekten bij de mens, zoals kanker, diabetes en neurodegeneratie. Om deze functies uit te voeren, moeten mitochondriën communiceren met de rest van de cel over hun omhulsel, dat uit twee membranen bestaat. Daarom moeten deze twee membranen constant op elkaar inwerken. Eiwitachtige contactplaatsen tussen de mitochondriale binnen- en buitenmembranen zijn in dit opzicht essentieel. Tot nu toe zijn er verschillende contactlocaties geïdentificeerd. In de hier beschreven methode worden Saccharomyces cerevisiae-mitochondriën gebruikt om contactplaatsen te isoleren en zo kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor contactplaatseiwitten. We gebruikten deze methode om het mitochondriale contactplaats en cristae organizing system (MICOS) -complex te identificeren, een van de belangrijkste contactplaatsvormende complexen in het mitochondriale binnenmembraan, dat wordt geconserveerd van gist tot mens. Onlangs hebben we deze methode verder verbeterd om een nieuwe contactplaats te identificeren die bestaat uit Cqd1 en het Por1-Om14-complex.
Introduction
Mitochondriën vervullen verschillende functies in eukaryoten, waarvan de meest bekende de productie van ATP door oxidatieve fosforylering is. Andere functies zijn onder meer de productie van ijzer-zwavelclusters, lipidensynthese en in hogere eukaryoten, Ca2+-signalering en de inductie van apoptose 1,2,3,4. Deze functies zijn onlosmakelijk verbonden met hun complexe ultrastructuur.
De mitochondriale ultrastructuur werd voor het eerst beschreven door elektronenmicroscopie5. Er werd aangetoond dat mitochondriën vrij complexe organellen zijn die uit twee membranen bestaan: het mitochondriale buitenmembraan en het mitochondriale binnenmembraan. Door deze membranen worden dus twee waterige compartimenten gevormd: de intermembraanruimte en de matrix. Het mitochondriale binnenmembraan kan nog verder worden onderverdeeld in verschillende secties. Het binnenste grensmembraan blijft in de nabijheid van het buitenste membraan en de cristae vormen invaginaties. Zogenaamde crista-juncties verbinden het binnenste grensmembraan en de cristae (Figuur 1). Bovendien onthullen elektronenmicrofoto's van osmotisch gekrompen mitochondriën dat er plaatsen bestaan waar de mitochondriale membranen nauw met elkaar verbonden zijn 6,7. Deze zogenaamde contactplaatsen worden gevormd door eiwitcomplexen die de twee membranen overspannen (Figuur 1). Er wordt gedacht dat deze interactieplaatsen essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van cellen vanwege hun belang voor de regulatie van mitochondriale dynamiek en overerving, evenals de overdracht van metabolieten en signalen tussen het cytosol en de matrix8.
Het MICOS-complex in het mitochondriale binnenmembraan is waarschijnlijk het best gekarakteriseerde en het meest veelzijdige contactplaatsvormende complex. MICOS werd in 2011 beschreven in gist en bestaat uit zes subeenheden 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 en Mic10. Deze vormen een complex van ongeveer 1,5 MDa dat zich lokaliseert op de crista-knooppunten 9,10,11. Het verwijderen van een van beide kernsubeenheden, Mic10 of Mic60, leidt tot de afwezigheid van dit complex 9,11, wat betekent dat deze twee subeenheden essentieel zijn voor de stabiliteit van MICOS. Interessant is dat MICOS niet slechts één, maar meerdere contactplaatsen vormt met verschillende mitochondriale buitenmembraaneiwitten en -complexen: het TOM-complex 11,12, het TOB/SAM-complex 9,12,13,14,15,16, het Fzo1-Ugo1-complex9,Por1 10, OM45 10 en Miro 17. Dit wijst er sterk op dat het MICOS-complex betrokken is bij verschillende mitochondriale processen, zoals eiwitimport, fosfolipidenmetabolisme en de vorming van de mitochondriale ultrastructuur18. De laatste functie is waarschijnlijk de belangrijkste functie van MICOS, aangezien de afwezigheid van het MICOS-complex geïnduceerd door de deletie van MIC10 of MIC60 leidt tot een abnormale mitochondriale ultrastructuur die vrijwel volledig geen regelmatige cristae heeft. In plaats daarvan hopen interne membraanblaasjes zonder verbinding met het binnenste grensmembraanzich op 19, 20. Belangrijk is dat MICOS in vorm en functie geconserveerd blijft van gist tot mens21. De associatie van mutaties in MICOS-subeenheden met ernstige ziekten bij de mens benadrukt ook het belang ervan voor hogere eukaryoten22,23. Hoewel MICOS zeer veelzijdig is, moeten er extra contactsites zijn (op basis van onze niet-gepubliceerde observaties). Er zijn inderdaad verschillende andere contactplaatsen geïdentificeerd, bijvoorbeeld de mitochondriale fusiemachines Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 of Mdm31-Por1, die betrokken zijn bij de biosynthese van het mitochondriaal-specifieke fosfolipide cardiolipine 27. Onlangs hebben we de methode verbeterd die ons heeft geleid tot de identificatie van MICOS om Cqd1 te identificeren als onderdeel van een nieuwe contactplaats gevormd met het buitenste membraancomplex Por1-Om1428. Interessant is dat deze contactplaats ook betrokken lijkt te zijn bij meerdere processen, zoals de homeostase van het mitochondriale membraan, het fosfolipidenmetabolisme en de distributie van co-enzym Q28,29.
Hier gebruikten we een variatie op de eerder beschreven fractionering van mitochondriën 9,30,31,32,33. Osmotische behandeling van mitochondriën leidt tot de verstoring van het mitochondriale buitenmembraan en tot een krimp van de matrixruimte, waardoor de twee membranen alleen dicht bij elkaar blijven op contactplaatsen. Dit maakt het mogelijk om blaasjes te genereren die uitsluitend bestaan uit mitochondriaal buitenmembraan of mitochondriaal binnenmembraan of op contactplaatsen van beide membranen door middel van milde sonicatie. Omdat het mitochondriale binnenmembraan een veel hogere eiwit-lipideverhouding heeft, vertonen mitochondriale binnenmembraanblaasjes een hogere dichtheid in vergelijking met mitochondriale buitenmembraanblaasjes. Het verschil in dichtheid kan worden gebruikt om de membraanblaasjes te scheiden door middel van sucrose opwaartse dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Zo hopen de mitochondriale buitenste membraanblaasjes zich op bij lage sucroseconcentraties, terwijl de mitochondriale binnenmembraanblaasjes worden verrijkt bij hoge sucroseconcentraties. De blaasjes die contactplaatsen bevatten, concentreren zich op intermediaire sacharoseconcentraties (figuur 2). Het volgende protocol beschrijft deze verbeterde methode, die minder gespecialiseerde apparatuur, tijd en energie vereist in vergelijking met onze eerder vastgestelde32, in detail en biedt een nuttig hulpmiddel voor de identificatie van mogelijke contactplaatseiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffers en voorraadoplossingen
- Maak een oplossing van 1 M 3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS) in gedeïoniseerd water, pH 7,4. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid 500 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in gedeïoniseerd water, pH 8.0. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid 2,4 M sorbitol in gedeïoniseerd water. Na het autoclaveren bij kamertemperatuur bewaren.
- Bereid 2,5 M sacharose in gedeïoniseerd water. Na het autoclaveren bij kamertemperatuur bewaren.
- Bereid 200 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) in isopropanol. Bewaren bij -20 °C.
LET OP: PMSF is giftig bij inslikken en veroorzaakt ernstige brandwonden en oogletsel. Adem het stof niet in en draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril. - Bereid 72% trichloorazijnzuur (TCA) in gedeïoniseerd water. Bewaren bij 4 °C.
LET OP: TCA kan irritatie van de luchtwegen, ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken. Adem het stof niet in en draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril. - Bereid de SM-buffer voor: 20 mM MOPS en 0,6 M sorbitol, pH 7,4.
- Bereid de zwellingsbuffer voor: 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF en proteaseremmercocktail, pH 7,4.
- Bereid de sucrosegradiëntbuffers voor: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M en 1,3 M sucrose in 20 mM MOPS en 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
OPMERKING: Alle buffers kunnen worden opgeslagen bij 4 °C; het wordt echter aanbevolen om de sucrosehoudende buffers op te slaan bij -20 °C om schimmelgroei te voorkomen. De proteaseremmers moeten voor gebruik vers worden toegevoegd.
2. Generatie van submitochondriale blaasjes
- Isoleer ruwe gistmitochondriën vers volgens vastgestelde protocollen34,35.
OPMERKING: Voor dit experiment werden mitochondriën geïsoleerd uit Saccharomyces cerevisiae. Het genereren van gradiëntzuivere mitochondriën zonder andere organellen is niet nodig. - Resuspendeer 10 mg vers geïsoleerde mitochondriën in 1,6 ml SM-buffer (4 °C) door te pipetteren (Figuur 2, stap 1).
- Breng de mitochondriale suspensie over in een voorgekoelde erlenmeyer van 100 ml.
- Voeg langzaam 16 ml zwelbuffer toe met behulp van een glazen pipet van 20 ml. Breng tijdens de toevoeging constant mild roeren op ijs aan. Deze osmotische behandeling resulteert in wateropname in de matrixruimte. De zwelling van het mitochondriale binnenmembraan zal het buitenmembraan verstoren. Beide membranen blijven echter in contact op de contactplaatsen9 (Figuur 2, stap 2).
- Incubeer de monsters onder constant mild roeren gedurende 30 minuten op ijs.
- Voeg langzaam 5 ml 2,5 M sucrose-oplossing toe met behulp van een glazen pipet van 5 ml om de sacharoseconcentratie in de monsters te verhogen tot ongeveer 0,55 M. Deze osmotische behandeling resulteert in een wateruitvloeiing uit de matrix36. De krimp van het binnenmembraan is bedoeld om de afstand tot de resterende fragmenten van het buitenmembraan te maximaliseren. Dit verkleint de kans op het genereren van kunstmatige hybride blaasjes van binnen- en buitenmembranen door middel van sonicatie (Figuur 2, stap 3).
- Incubeer de monsters onder licht roeren gedurende 15 minuten op ijs.
- Onderwerp de mitochondriën aan sonicatie om submitochondriale membraanblaasjes te genereren (Figuur 2, stap 4).
- Breng de mitochondriale suspensie over naar een voorgekoelde rozetcel.
- Sonificeer de mitochondriale suspensie met een amplitude van 10% gedurende 30 s terwijl de rozetcel wordt gekoeld in een ijsbad.
- Laat de suspensie 30 s rusten in een ijsbad.
- Herhaal stap 2.8.2 en stap 2.8.3 nog drie keer.
NOTITIE: De sonicatiecondities zijn afhankelijk van de gebruikte sonicator. Optimalisatie zal nodig zijn voor individuele machines. Sonicatie die te hard is, zal leiden tot de kunstmatige vorming van blaasjes die bestaan uit mitochondriale binnen- en buitenmembranen.
3. Scheiding van submitochondriale blaasjes
- Scheid de gegenereerde blaasjes van de resterende intacte mitochondriën door centrifugatie bij 20.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. De intacte mitochondriën zullen pelleteren terwijl de blaasjes in het bovenliggende blijven.
- Concentreer het blaasjesmengsel.
- Breng het supernatans over in verse ultracentrifugatiebuizen.
- Plaats een kussen van 0,3 ml 2,5 M sucroseoplossing op de bodem van de tube met behulp van een spuit van 1 ml die is uitgerust met een canule van 0,8 mm x 120 mm.
- Centrifugeer bij 118.000 x g gedurende 100 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Hier werd een zwenkbare bakrotor met een maximale radius van 153,1 mm gebruikt. De centrifugatieomstandigheden zijn sterk afhankelijk van de rotor en zullen moeten worden aangepast wanneer een andere rotor wordt gebruikt.
- De blaasjes verschijnen na het centrifugeren als een schijf op de bovenkant van het sacharosekussen. Gooi ongeveer 90% van het supernatant weg. Oogst nu de geconcentreerde blaasjes door ze opnieuw te suspenderen in de resterende buffer, inclusief de 2,5 M sucrose, door op en neer te pipetteren. Breng de suspensie over naar een ijskoude Dounce-homogenisator.
- Homogeniseer de suspensie met minimaal 10 slagen met behulp van een polytetrafluorethyleen pottenbakker.
- Bereid de sucrosegradiënt voor.
- Voor een stapgradiënt van 11 ml met vijf stappen (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M en 0,8 M sucrose in 20 mM MOPS en 0,5 mM EDTA, pH 7,4), heeft elke laag 2,2 ml sucrose-oplossing.
OPMERKING: Een refractometer wordt aanbevolen om de sucroseconcentraties te meten en aan te passen; Het is echter niet essentieel. Breng 10 μL van de buffer aan op de refractometer en detecteer de respectievelijke brekingsindices. De berekening van de sacharoseconcentratie is als volgt:
1,3333 vertegenwoordigt de brekingsindex van water. 0,048403 is een sucrose-specifieke conversie-index die wordt verkregen uit de lineaire schaling van de molaire brekingscoquiviteit ten opzichte van de sucroseconcentratie in waterige oplossingen 37. - Voeg de hoogste sacharoseconcentratie toe aan de centrifugatiebuis en zet de buis op -20 °C. Wacht tot de laag volledig bevroren is voordat u de volgende aanbrengt. Ga dienovereenkomstig te werk totdat de laatste laag is toegevoegd en bewaar de gradiënten bij -20 °C.
OPMERKING: Vergeet niet om de bevroren gradiënten over te brengen naar 4 °C bij het starten van het experiment om de gradiënten te laten ontdooien. Dit duurt ongeveer 3 uur. Voor het centrifugeren hier werd een zwenkbare emmerrotor met een capaciteit van 13,2 ml gebruikt. Wanneer een andere rotor wordt gebruikt, moeten de volumes van de hellingsstappen dienovereenkomstig worden aangepast.
- Voor een stapgradiënt van 11 ml met vijf stappen (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M en 0,8 M sucrose in 20 mM MOPS en 0,5 mM EDTA, pH 7,4), heeft elke laag 2,2 ml sucrose-oplossing.
- Meet de sacharoseconcentratie van de monsters met behulp van een refractometer. Als er geen toegang is tot een refractometer, kan men ook aannemen dat de sacharoseconcentratie 2 M is. Deze veronderstelde sucroseconcentratie zal dan de basis vormen voor de volgende stap.
- Pas de sucroseconcentratie aan op 0,6 M door toevoeging van een geschikte hoeveelheid 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF en proteaseremmercocktail, pH 7,4. Als de sacharoseconcentratie wordt geschat op 2 M in plaats van te worden gemeten, wordt aanbevolen om te testen of de concentratie na aanpassing laag genoeg is. Breng een kleine hoeveelheid van het monster (ca. 50 μl) aan op 200 μl 0,8 M sacharose in een reageerbuis. Het monster moet bovenop de 0,8 M sacharose blijven.
- Laad de monsters (ongeveer 1 ml) bovenop de sucrosegradiënt (bewaar 10% voor later gebruik). Zorgvuldig pipetteren is belangrijk om verstoring van de gradiënt te voorkomen (Figuur 2, stap 5).
- Scheid de blaasjes door centrifugeren bij 200.000 x g en 4 °C gedurende 12 uur. Stel de centrifuge indien mogelijk in op langzame versnelling en vertraging om verstoring van de helling te voorkomen (Figuur 2, stap 6).
OPMERKING: Hier werd een zwenkbare bakrotor met een maximale radius van 153,1 mm gebruikt. De centrifugatieomstandigheden zijn sterk afhankelijk van de rotor en zullen moeten worden aangepast wanneer een andere rotor wordt gebruikt. - Oogst de gradiënt van boven naar beneden in fracties van 700 μL met behulp van een pipet van 1 ml. Dit resulteert in 17 breuken, wat een voldoende resolutie mogelijk maakt.
4. Analyse van submitochondriale blaasjes
- Concentreer de eiwitten door elke fractie te onderwerpen aan twee achtereenvolgens uitgevoerde TCA-precipitaties38 om de SDS-PAGE-monsters voor te bereiden.
- Voeg 200 μL 72% TCA toe aan de afzonderlijke fracties en meng tot de oplossing homogeen is. Incubeer de fracties gedurende 30 minuten op ijs en pelleteer de neergeslagen eiwitten door centrifugatie bij 20.000 x g en 4 °C gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg, voeg 500 μl 28 % TCA-oplossing toe, meng goed en herhaal de centrifugatiestap.
- Was de pellets met 1 ml aceton (-20°C) en centrifugeer gedurende 10 minuten op 20.000 x g en 4 °C. Gooi het supernatant weg en laat de pellets aan de lucht drogen. Resuspendeer de pellets in 60 μL SDS-monsterbuffer en incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C.
OPMERKING: Er zal een grote hoeveelheid sacharose achterblijven, vooral in de fracties met een hoge dichtheid, na de eerste TCA-precipitatie. Dit wordt verwijderd door de extra TCA-neerslag.
- Analyseer 20 μL van elke fractie met SDS-PAGE39 en immunoblotting40,41,42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het is relatief eenvoudig om mitochondriale binnen- en buitenmembranen te scheiden. Het genereren en scheiden van blaasjes die de contactplaats bevatten, is echter veel moeilijker. Naar onze mening zijn twee stappen cruciaal en essentieel: de sonicatiecondities en de gebruikte gradiënt.
Gewoonlijk wordt aangenomen dat lineaire gradiënten een betere resolutie hebben in vergelijking met stapsgewijze gradiënten. Hun reproduceerbare productie is echter vervelend en vereist speciale apparatuur. Daarom hebben we een methode ontwikkeld om een stapverloop te genereren met relatief kleine verschillen tussen de afzonderlijke stappen (zie stap 3.5). We speculeerden dat de stapgradiënt in evenwicht zou zijn bij het centrifugeren, wat zou resulteren in een bijna lineaire gradiënt. Opvallend is dat de bepaling van de sacharoseconcentraties van de afzonderlijke fracties na centrifugeren met behulp van een refractometer aantoonde dat de stapgradiënt inderdaad vrijwel lineair werd na 12 uur centrifugeren bij 200.000 x g (figuur 3).
Het belang van milde sonicatie blijkt duidelijk uit deze representatieve resultaten. In milde sonicatieomstandigheden (Figuur 4A) was de mitochondriale buitenmembraanmarker Tom40 verrijkt in de vroege fracties met lage dichtheid (fractie nr. 4) en was vrijwel afwezig in de latere. De mitochondriale binnenmembraanmarker Tim17 was geconcentreerd in fracties met een hoge dichtheid (breuk nr. 17). Daarentegen accumuleerde het contactplaatseiwit Mic60 zich in fracties van intermediaire sucroseconcentratie (fractie nr. 12-14), wat wijst op de succesvolle generatie en daaropvolgende scheiding van de verschillende membraanblaasjes. Daarentegen kon bij zwaardere sonicatieomstandigheden de mitochondriale buitenmembraanmarker Tom40 worden gedetecteerd in lagere fracties van de gradiënt (breuk nr. 14 en fractie nr. 17, figuur 4B). Bovendien was er een aanzienlijke hoeveelheid Tim17 in fracties van intermediaire dichtheid (breuk nr. 13 en breuk nr. 14, figuur 4B). De niet-specifieke accumulatie van buiten- en binnenmembraanmarkers in fracties van intermediaire dichtheid wijst op de kunstmatige vorming van gemengde membranen, wat de identificatie van kandidaat-eiwitten remt.
Figuur 1: Schematische weergave van de mitochondriale ultrastructuur. Een schematische weergave van een mitochondrion om de verschillende compartimenten, membranen en eiwitlocaties te laten zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflow van mitochondriale fractionering om eiwitten op de contactplaats te isoleren. Een schematisch overzicht van het proces dat in het protocol wordt beschreven. De (1) vers geïsoleerde mitochondriën waren (2) osmotisch gezwollen (3) en vervolgens gekrompen. (4) De gekrompen mitochondriën werden geobjectiveerd tegen milde sonicatie om submitochondriale blaasjes te genereren. (5) Het blaasjesmengsel werd geconcentreerd en op een sucrose-trapgradiënt geladen. (6) Door centrifugatie werden de mitochondriale blaasjes van het buitenmembraan verrijkt met een lage sacharoseconcentratie, de mitochondriale blaasjes van het binnenmembraan met een hoge sacharoseconcentratie en de blaasjes die de contactplaats bevatten met een intermediaire sacharoseconcentratie. Afkortingen: MIM, mitochondriaal binnenmembraan; MOM, mitochondriaal buitenmembraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Genereren van een lineaire gradiënt door centrifugeren. Twee stapgradiënten (1,3 M, 1,13 M, vervolgens 1,02 M, 0,96 M en 0,8 M in 20 mM MOPS en 0,5 mM EDTA, pH 7,4) werden parallel bereid en 1 ml 0,6 M sucrose in 20 mM MOPS en 0,5 mM EDTA, pH 7,4, werd op beide gradiënten geladen. De gradiënten werden gedurende 12 uur gecentrifugeerd bij 200.000 x g en 4°C en geoogst in elk 17 fracties. De reproduceerbaarheid van de methode werd getest door bepaling van de sacharoseconcentratie van de afzonderlijke fracties van de afzonderlijke gradiënten met behulp van een refractometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Isolatie van contactplaatseiwitten met een goed gedefinieerde ultrasone puls. (A,B) Pas geïsoleerde gistmitochondriën werden onderworpen aan osmotische behandeling en blootgesteld aan sonicatie. De gegenereerde blaasjes werden gescheiden met behulp van sucrose opwaartse dichtheidsgradiëntcentrifugatie. De gradiënt werd gefractioneerd en de eiwitten in de verschillende fracties werden onderworpen aan TCA-precipitatie. De verdeling van de markereiwitten voor het mitochondriale buitenmembraan (Tom40), het mitochondriale binnenmembraan (Tim17) en contactplaatsen (Mic60) werd geanalyseerd door immunoblotting met behulp van de aangegeven antilichamen. (A) Milde sonicatie (4 x 30 s, 10% amplitude) resulteerde in een duidelijke scheiding van de buitenste membraaneiwitten (fracties met lage dichtheid) en de eiwitten van het binnenste membraan (fracties met hoge dichtheid). Bovendien werd het contactplaatseiwit Mic60 met succes verrijkt in fracties van intermediaire dichtheid. (B) Hardere sonicatie (4 x 30 s, 20% amplitude) resulteerde in het genereren van hybride blaasjes en liet dus geen duidelijke scheiding van contactplaatsen toe. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitochondriale subfractionering is een ingewikkeld experiment met verschillende zeer complexe stappen. Daarom hebben we ernaar gestreefd om onze gevestigde methode verder te verbeteren en, tot op zekere hoogte, te vereenvoudigen32. Hier waren de uitdagingen de behoefte aan gecompliceerde en zeer gespecialiseerde apparatuur, die vaak individuele constructies zijn, en het enorme tijd- en energieverbruik. Daartoe hebben we geprobeerd de pompen en individuele constructies die worden gebruikt voor het gieten en oogsten van de lineaire gradiënt te verwijderen en zijn we overgestapt op een stapsgewijs verloop. Belangrijk is dat we ons realiseerden dat, althans wanneer voorbereid zoals hier beschreven, de gradiënt lineair wordt tijdens het centrifugeren, waardoor dit een geldige vervanging is. Deze methode (i) elimineert de noodzaak van een gradiëntmixer, waardoor de benodigde apparatuur afneemt; ii) tijdwinst op de dag van het experiment, omdat de helling van tevoren kan worden voorbereid; en iii) in hoge mate reproduceerbaar is (figuur 3) wanneer het wordt bereid volgens de beschreven methode, waarbij de afzonderlijke stappen worden bevroren voordat de volgende erop wordt gelegd. Deze gradiënten kunnen ook onbeperkt worden opgeslagen bij -20°C. Bovendien is het laden van de hier voorgestelde sedimentatiegradiënt ook gemakkelijker dan het moeten aanbrengen van het blaasjesmengsel onder de gradiënt, zoals beschreven in vergelijkbare methoden 9,32. Voor het laden van een drijfgradiënt is een spuit met een lange canule nodig om de reeds gegoten gradiënt te passeren. Deze stap was altijd problematisch vanwege het risico van vernietiging van de helling. Een ander voordeel van deze methode is de kortere centrifugatietijd van 12 uur in vergelijking met 24 uur32, waardoor de tijd en energie die nodig is voor deze methode aanzienlijk wordt verminderd. De haalbaarheid en reproduceerbaarheid van de hier beschreven verbeterde procedure worden benadrukt door de recente identificatie van de MICOS-onafhankelijke contactplaats gevormd door Cqd1 en Por1-Om1428.
Dit experiment is echter nog steeds zeer complex. Om optimale resultaten te verkrijgen, zijn er verschillende essentiële criteria waarmee rekening moet worden gehouden bij de toepassing van dit protocol.
Een van de belangrijkste aspecten is de kwaliteit van de mitochondriën. Deze moeten vers geïsoleerd worden. Daarom moet bij het plannen van de procedure rekening worden gehouden met de teelt van gist en de isolatie van mitochondriën. Een zachte behandeling van de mitochondriën tijdens de isolatie zal de verstoring van de membranen voorkomen, terwijl het ook van cruciaal belang is om proteasen te remmen met een geschikte concentratie PMSF of, als alternatief, in de handel verkrijgbare proteaseremmercocktails34.
Een andere belangrijke stap, en een van de meest kritische aspecten van de procedure, is de sonicatie. Belangrijk is dat het mogelijk is om de juiste intensiteit van de ultrasone puls te schatten aan de hand van het geluid dat wordt gegenereerd door de werveling van de suspensie (zie video). De optimale omstandigheden moeten echter voor elke experimentele opstelling experimenteel worden bepaald, niet alleen op basis van verschillende merken en modellen, maar ook op basis van verschillende machines van hetzelfde model. Met name de demontage en reiniging van de tip hebben ook invloed op de intensiteit van de sonicatie, waardoor een aanpassing van de omstandigheden noodzakelijk is. De aanbeveling in het protocol is ook om een rozetcel te gebruiken voor een hogere efficiëntie, maar andere vaten kunnen ook werken. Te harde sonificatie zal leiden tot de vorming van kunstmatig gemengde blaasjes. Dit zal resulteren in een sterke accumulatie van binnen- en buitenmembraaneiwitten in fracties van intermediaire dichtheid, die zelfs sterker kunnen zijn, zoals in het getoonde voorbeeld (Figuur 4B). Als dit gebeurt, moet men de amplitude of tijd van de sonicatie verminderen. Er kunnen echter ook problemen ontstaan wanneer de sonicatie niet intens genoeg is. In dit geval zou de opbrengst van de gegenereerde blaasjes te laag kunnen zijn om eiwitten te detecteren door immunoblotting, en dus zou men de amplitude, tijd of cycli van sonicatie moeten verhogen.
Ten slotte is de gradiënt belangrijk voor de scheiding van de verschillende gegenereerde blaasjessoorten. Het optimale maximum en minimum van de sucrosegradiënt, evenals het aantal stappen, kunnen echter ook variëren, afhankelijk van de individuele opstelling. Hier volstond een vijfstapsgradiënt met een maximum van 1,3 M sacharose en een minimum van 0,8 M sacharose voor een zichtbare en reproduceerbare scheiding van de contactplaatsbevattende blaasjes van de mitochondriale binnen- en buitenmembraanblaasjes. In het begin is het essentieel om omstandigheden te kiezen die lege fracties achterlaten boven de mitochondriale buitenste membraanblaasjes en onder de mitochondriale binnenmembraanblaasjes om een correcte scheiding te garanderen. Het comprimeren van de bovenste of onderste fracties kan leiden tot artefacten. Bij latere stappen, wanneer de precieze molariteit van sucrose bekend is waarbij de binnenste en buitenste membraanblaasjes zich zullen ophopen, kan de gradiënt worden geoptimaliseerd door de maximale en minimale sucroseconcentraties te verhogen of te verlagen om de resolutie tussen het binnenmembraan, het buitenmembraan en de contactplaatsen te verbeteren. Merk op dat de groeiomstandigheden van gist het gedrag van de gegenereerde blaasjes kunnen beïnvloeden bij dichtheidscentrifugatie. Hier werd de gist gekweekt op een rijk YP-medium (1% [w/v] gistextract, 2% [w/v] pepton, pH 5,5) met glycerol (3 % [v/v]) als koolstofbron bij 30 °C34,44. Andere groeiomstandigheden kunnen de eiwit- en lipidensamenstelling van de mitochondriën veranderen en dus de dichtheid van de gegenereerde blaasjes.
De beschreven methode biedt een betrouwbare en reproduceerbare manier om contactplaatsen te isoleren. Voor de identificatie van de eiwitsamenstelling van de respectieve contactplaats (binnen- en buitenmembraancomponenten) zijn echter aanvullende tests nodig, zoals immunoprecipitatie, eventueel in combinatie met massaspectrometrie. Hiervoor zijn specifieke antilichamen en modelorganismen nodig die gelabelde versies van de eiwitkandidaten tot expressie brengen. Bij het gebruik van gist als modelorganisme kunnen eiwitkandidaten gemakkelijk worden verkregen vanwege de verscheidenheid aan beschikbare genetische modificatiemethoden en het bestaan van getagde bibliotheken45,46,47. Daarom hebben we besloten om dit protocol voor gistmitochondriën op te stellen en te optimaliseren. Hoewel het mogelijk zou moeten zijn om de methode aan te passen voor mitochondriën geïsoleerd uit andere organismen, heeft gist het voordeel dat grote hoeveelheden mitochondriën op een goedkope en snelle manier kunnen worden verkregen. Bovendien is het gebruik van gist als modelorganisme voor het verzamelen van de eerste resultaten een beproefde manier om eiwitcomplexen en -processen te identificeren die tot aan de mens in hogere eukaryoten worden bewaard. Zoals eerder vermeld, werd na de identificatie en karakterisering van MICOS in gist 9,10,11 aangetoond dat MICOS in vorm en functie geconserveerd is in hogere eukaryoten 21. Cqd1 en Por1, componenten van de recent ontdekte MICOS-onafhankelijke contactplaats28, zijn ook geconserveerd, wat aangeeft dat deze contactplaats ook aanwezig is in hogere eukaryoten.
Het belang van voortgezet onderzoek op deze contactplaatsen wordt onderstreept door de verbanden van MICOS met verschillende neurodegeneratieve ziekten 18,48,49,50,51,52,53,54. De juiste fosforylering van Mic60 door PINK1 is in verband gebracht met het behoud van crista-juncties bij drosophilia, en dus kan deze route, die voor mensen behouden blijft, verband houden met de ziekte van Parkinson48. Bovendien resulteert een puntmutatie in de menselijke MICOS-subeenheid Mic14 in destabilisatie van MICOS en de daaropvolgende wijziging van de mitochondriale ultrastructuur, die zijn gevonden bij patiënten die lijden aan frontotemporale dementie en amyotrofische laterale sclerose 50,51,52,53,54. Aangezien Mic14 wordt geconserveerd van gist tot mens, kan verder onderzoek naar dit eiwit worden uitgevoerd met gist als modelorganisme. Dit fundamenteel onderzoek kan leiden tot een beter begrip van de onderliggende mechanismen van deze ziekten, wat de ontwikkeling van efficiënte behandelingen en therapieën voor deze ziekten zou kunnen versnellen. Bovendien geven de recente ontdekkingen van aanvullende MICOS-onafhankelijke contactsites27,28 aan dat dit veld nog steeds groeit. Daarom kan het hier gepresenteerde protocol helpen om dit veelbelovende en fascinerende onderzoek vooruit te helpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.
Acknowledgments
M.E.H. erkent de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projectnummer 413985647, voor financiële steun. De auteurs danken Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians Universiteit, München, voor zijn genereuze en uitgebreide steun. We zijn Walter Neupert dankbaar voor zijn wetenschappelijke inbreng, nuttige discussies en voortdurende inspiratie. J.F. bedankt de Graduate School Life Science Munich (LSM) voor de steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any Abbe refractometer can be used |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
References
- Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
- Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
- Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
- Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
- Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
- Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
- Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
- Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
- Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
- vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
- Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
- Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
- Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
- Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
- Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
- Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
- Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
- John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
- Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
- Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
- Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
- Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
- Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
- Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
- Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
- Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
- Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
- Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
- Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
- Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
- Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
- Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
- Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
- Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
- Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
- Koontz, L.
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Al-Tubuly, A. A.
- Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Sherman, F.
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
- Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
- Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
- Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
- Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
