Summary
Mitochondriale Kontaktstellen sind Proteinkomplexe, die mit mitochondrialen inneren und äußeren Membranproteinen interagieren. Diese Stellen sind essentiell für die Kommunikation zwischen den mitochondrialen Membranen und damit zwischen dem Zytosol und der mitochondrialen Matrix. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von Kandidaten, die sich für diese spezifische Klasse von Proteinen qualifizieren.
Abstract
Mitochondrien sind in praktisch allen eukaryotischen Zellen vorhanden und erfüllen essentielle Funktionen, die weit über die Energiegewinnung hinausgehen, z. B. die Synthese von Eisen-Schwefel-Clustern, Lipiden oder Proteinen, die Ca2+ -Pufferung und die Induktion von Apoptose. Ebenso führt eine mitochondriale Dysfunktion zu schweren menschlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Neurodegeneration. Um diese Funktionen erfüllen zu können, müssen die Mitochondrien über ihre Hülle, die aus zwei Membranen besteht, mit dem Rest der Zelle kommunizieren. Daher müssen diese beiden Membranen ständig miteinander interagieren. Proteinhaltige Kontaktstellen zwischen der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien sind dabei essentiell. Bisher wurden mehrere Kontaktstellen identifiziert. Bei der hier beschriebenen Methode werden die Mitochondrien von Saccharomyces cerevisiae verwendet, um Kontaktstellen zu isolieren und so Kandidaten zu identifizieren, die für Kontaktstellenproteine in Frage kommen. Wir haben diese Methode verwendet, um den mitochondrialen Kontaktstellen- und Cristae-Organisierungssystem-Komplex (MICOS) zu identifizieren, einen der wichtigsten kontaktstellenbildenden Komplexe in der mitochondrialen Innenmembran, der von der Hefe bis zum Menschen konserviert ist. Kürzlich haben wir diese Methode weiter verbessert, um eine neue Kontaktstelle zu identifizieren, die aus Cqd1 und dem Por1-Om14-Komplex besteht.
Introduction
Mitochondrien erfüllen in Eukaryoten eine Vielzahl unterschiedlicher Funktionen, wobei die bekannteste die Produktion von ATP durch oxidative Phosphorylierung ist. Weitere Funktionen sind die Produktion von Eisen-Schwefel-Clustern, die Lipidsynthese und in höheren Eukaryoten die Ca2+-Signalgebung und die Induktion der Apoptose 1,2,3,4. Diese Funktionen sind untrennbar mit ihrer komplexen Ultrastruktur verbunden.
Die mitochondriale Ultrastruktur wurde erstmals mittels Elektronenmikroskopie5 beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass Mitochondrien ziemlich komplexe Organellen sind, die aus zwei Membranen bestehen: der mitochondrialen Außenmembran und der mitochondrialen Innenmembran. Somit werden von diesen Membranen zwei wässrige Kompartimente gebildet: der Intermembranraum und die Matrix. Die mitochondriale Innenmembran kann noch weiter in verschiedene Abschnitte unterteilt werden. Die innere Grenzmembran bleibt in unmittelbarer Nähe zur äußeren Membran, und die Cristae bilden Einstülpungen. Sogenannte Crista Junctions verbinden die innere Grenzmembran mit den Cristae (Abbildung 1). Darüber hinaus zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen osmotisch geschrumpfter Mitochondrien, dass es Stellen gibt, an denen die Mitochondrienmembranen fest miteinander verbunden sind 6,7. Diese sogenannten Kontaktstellen werden von Proteinkomplexen gebildet, die die beiden Membranen überspannen (Abbildung 1). Es wird angenommen, dass diese Interaktionsstellen aufgrund ihrer Bedeutung für die Regulierung der mitochondrialen Dynamik und Vererbung sowie für den Transfer von Metaboliten und Signalen zwischen dem Zytosol und der Matrix für die Lebensfähigkeit von Zellen unerlässlich sind8.
Der MICOS-Komplex in der mitochondrialen Innenmembran ist wahrscheinlich der am besten charakterisierte und vielseitigste kontaktstellenbildende Komplex. MICOS wurde 2011 in Hefe beschrieben und besteht aus sechs Untereinheiten 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 und Mic10. Diese bilden einen Komplex von ca. 1,5 MDa, der an den Crista-Kontakten 9,10,11 lokalisiert ist. Die Deletion einer der beiden Kernuntereinheiten, Mic10 oder Mic60, führt zum Fehlen dieses Komplexes 9,11, was bedeutet, dass diese beiden Untereinheiten für die Stabilität von MICOS essentiell sind. Interessanterweise bildet MICOS nicht nur eine, sondern mehrere Kontaktstellen mit verschiedenen mitochondrialen äußeren Membranproteinen und -komplexen: dem TOM-Komplex 11,12, dem TOB/SAM-Komplex 9,12,13,14,15,16, dem Fzo1-Ugo1-Komplex9,Por1 10, OM45 10 und Miro 17. Dies deutet stark darauf hin, dass der MICOS-Komplex an verschiedenen mitochondrialen Prozessen beteiligt ist, wie z. B. dem Proteinimport, dem Phospholipidstoffwechsel und der Bildung der mitochondrialen Ultrastruktur18. Die letztgenannte Funktion ist wahrscheinlich die Hauptfunktion von MICOS, da das Fehlen des MICOS-Komplexes, der durch die Deletion von MIC10 oder MIC60 induziert wird, zu einer abnormen mitochondrialen Ultrastruktur führt, der es praktisch vollständig an regelmäßigen Cristae mangelt. Stattdessen akkumulieren interne Membranvesikel ohne Verbindung zur inneren Grenzmembran19, 20. Wichtig ist, dass MICOS in Form und Funktion von der Hefe bis zum Menschen konserviert ist21. Die Assoziation von Mutationen in MICOS-Untereinheiten mit schweren menschlichen Erkrankungen unterstreicht auch seine Bedeutung für höhere Eukaryoten22,23. Obwohl MICOS sehr vielseitig ist, müssen zusätzliche Kontaktstellen vorhanden sein (basierend auf unseren unveröffentlichten Beobachtungen). In der Tat wurden mehrere andere Kontaktstellen identifiziert, zum Beispiel die mitochondrialen Fusionsmaschinen Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 oder Mdm31-Por1, das an der Biosynthese des mitochondrial-spezifischen Phospholipids Cardiolipin beteiligt ist 27. Kürzlich haben wir die Methode, die uns zur Identifizierung von MICOS führte, verbessert, um Cqd1 als Teil einer neuartigen Kontaktstelle zu identifizieren, die mit dem äußeren Membrankomplex Por1-Om1428 gebildet wurde. Interessanterweise scheint diese Kontaktstelle auch an mehreren Prozessen wie der Homöostase der mitochondrialen Membran, dem Phospholipidstoffwechsel und der Verteilung von Coenzym Q28,29 beteiligt zu sein.
Hier haben wir eine Variation der zuvor beschriebenen Fraktionierung der Mitochondrien 9,30,31,32,33 verwendet. Die osmotische Behandlung von Mitochondrien führt zur Störung der mitochondrialen Außenmembran und zu einer Schrumpfung des Matrixraums, so dass die beiden Membranen nur noch an Kontaktstellen in unmittelbarer Nähe sind. Dies ermöglicht die Erzeugung von Vesikel, die ausschließlich aus der mitochondrialen Außenmembran oder der mitochondrialen Innenmembran bestehen oder an Kontaktstellen beider Membranen durch milde Beschallung enthalten. Da die mitochondriale Innenmembran ein viel höheres Protein-zu-Lipid-Verhältnis aufweist, weisen mitochondriale Innenmembranvesikel im Vergleich zu mitochondrialen Außenmembranvesikeln eine höhere Dichte auf. Der Dichteunterschied kann genutzt werden, um die Membranvesikel durch Saccharose-Auftriebsdichtegradientenzentrifugation zu trennen. So akkumulieren die mitochondrialen äußeren Membranvesikel bei niedrigen Saccharosekonzentrationen, während die mitochondrialen inneren Membranvesikel bei hohen Saccharosekonzentrationen angereichert sind. Die Vesikel, die Kontaktstellen enthalten, konzentrieren sich bei mittleren Saccharosekonzentrationen (Abbildung 2). Das folgende Protokoll beschreibt diese verbesserte Methode, die im Vergleich zu unserer zuvor etablierten Methode32 weniger spezialisierte Ausrüstung, Zeit und Energie erfordert, im Detail und bietet ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung möglicher Proteine an der Kontaktstelle.
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Protocol
1. Puffer und Vorratslösungen
- Stellen Sie eine 1 M große 3-Morpholinopropan-1-sulfonsäure (MOPS)-Lösung in deionisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 7,4 her. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in deionisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 8,0 vor. Bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie 2,4 M Sorbit in deionisiertem Wasser vor. Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur lagern.
- 2,5 M Saccharose in entionisiertem Wasser zubereiten. Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie 200 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in Isopropanol vor. Bei −20 °C lagern.
VORSICHT: PMSF ist beim Verschlucken giftig und verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden. Atmen Sie den Staub nicht ein und tragen Sie Schutzhandschuhe und Schutzbrille. - Bereiten Sie 72%ige Trichloressigsäure (TCA) in deionisiertem Wasser vor. Bei 4 °C lagern.
VORSICHT: TCA kann Atemwegsreizungen, schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Atmen Sie den Staub nicht ein und tragen Sie Schutzhandschuhe und Schutzbrille. - Bereiten Sie den SM-Puffer vor: 20 mM MOPS und 0,6 M Sorbit, pH 7,4.
- Bereiten Sie den Quellpuffer vor: 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF und Proteaseinhibitor-Cocktail, pH 7,4.
- Bereiten Sie die Saccharose-Gradientenpuffer vor: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M und 1,3 M Saccharose in 20 mM MOPS und 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
HINWEIS: Alle Puffer können bei 4 °C gelagert werden. Es wird jedoch empfohlen, die saccharosehaltigen Puffer bei −20 °C zu lagern, um Pilzwachstum zu vermeiden. Die Proteasehemmer müssen vor der Anwendung frisch zugegeben werden.
2. Generierung von submitochondrialen Vesikeln
- Isolieren Sie rohe Hefe-Mitochondrien frisch gemäß den festgelegten Protokollen34,35.
HINWEIS: Für dieses Experiment wurden Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae isoliert. Die Erzeugung von gradientenreinen Mitochondrien ohne andere Organellen ist nicht notwendig. - Resuspendieren Sie 10 mg frisch isolierte Mitochondrien in 1,6 ml SM-Puffer (4 °C) durch Pipettieren (Abbildung 2, Schritt 1).
- Die mitochondriale Suspension wird in einen vorgekühlten 100-ml-Erlenmeyerkolben überführt.
- Fügen Sie langsam 16 ml Quellpuffer mit einer 20-ml-Glaspipette hinzu. Während der Zugabe auf dem Eis ständig leicht umrühren. Diese osmotische Behandlung führt zu einer Wasseraufnahme in den Matrixraum. Die Schwellung der mitochondrialen Innenmembran stört die Außenmembran. Beide Membranen bleiben jedoch an den Kontaktstellen9 in Kontakt (Abbildung 2, Schritt 2).
- Die Proben werden unter konstantem leichtem Rühren 30 min auf Eis inkubiert.
- Langsam 5 ml 2,5 M Saccharoselösung mit einer 5 ml Glaspipette zugeben, um die Saccharosekonzentration in den Proben auf ca. 0,55 M zu erhöhen. Diese osmotische Behandlung führt zu einem Wasseraustritt aus der Matrix36. Durch die Schrumpfung der inneren Membran soll der Abstand zu den verbleibenden Fragmenten der äußeren Membran maximiert werden. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, künstliche Hybridvesikel aus inneren und äußeren Membranen durch Beschallung zu erzeugen (Abbildung 2, Schritt 3).
- Die Proben werden unter leichtem Rühren 15 min auf Eis inkubiert.
- Unterziehen Sie die Mitochondrien einer Beschallung, um submitochondriale Membranvesikel zu erzeugen (Abbildung 2, Schritt 4).
- Die mitochondriale Suspension wird in eine vorgekühlte Rosettenzelle überführt.
- Die mitochondriale Suspension wird 30 s lang mit einer Amplitude von 10 % beschallt, während die Rosettenzelle in einem Eisbad gekühlt wird.
- Lassen Sie die Suspension 30 s in einem Eisbad ruhen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.8.2 und Schritt 2.8.3 noch dreimal.
HINWEIS: Die Beschallungsbedingungen variieren je nach verwendetem Beschallungsgerät. Für einzelne Maschinen wird eine Optimierung notwendig sein. Eine zu harte Beschallung führt zur künstlichen Bildung von Vesikel, die aus mitochondrialen inneren und äußeren Membranen bestehen.
3. Trennung der submitochondrialen Vesikel
- Trennen Sie die erzeugten Vesikel von den verbleibenden intakten Mitochondrien durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 20 min bei 4 °C. Die intakten Mitochondrien werden pelletiert, während die Vesikel im Überstand bleiben.
- Konzentrieren Sie die Vesikelmischung.
- Den Überstand in frische Ultrazentrifugationsröhrchen überführen.
- Geben Sie ein Kissen von 0,3 ml 2,5 M Saccharoselösung mit einer 1-ml-Spritze mit einer Kanüle von 0,8 mm x 120 mm auf den Boden des Röhrchens.
- Bei 118.000 x g für 100 min bei 4 °C zentrifugieren.
HINWEIS: Hier wurde ein Ausschwingrotor mit einem maximalen Radius von 153,1 mm verwendet. Die Zentrifugationsbedingungen hängen stark vom Rotor ab und müssen angepasst werden, wenn ein anderer Rotor verwendet wird.
- Die Vesikel erscheinen nach der Zentrifugation als Scheibe auf der Oberseite des Saccharosekissens. Verwerfen Sie ca. 90 % des Überstandes. Ernten Sie nun die konzentrierten Vesikel, indem Sie sie in den verbleibenden Puffer einschließlich der 2,5 M Saccharose resuspendieren, indem Sie sie auf und ab pipettieren. Die Suspension in einen eiskalten Dounce-Homogenisator überführen.
- Homogenisieren Sie die Suspension mit mindestens 10 Hüben unter Verwendung eines Polytetrafluorethylen-Töpfers.
- Bereiten Sie den Saccharosegradienten vor.
- Für einen 11-ml-Stufengradienten mit fünf Stufen (1,3 m, 1,13 m, 1,02 m, 0,96 m und 0,8 M Saccharose in 20 mM MOPS und 0,5 mM EDTA, pH 7,4) enthält jede Schicht 2,2 ml Saccharoselösung.
HINWEIS: Ein Refraktometer wird empfohlen, um die Saccharosekonzentrationen zu messen und einzustellen. Es ist jedoch nicht unbedingt erforderlich. Tragen Sie 10 μl des Puffers auf das Refraktometer auf und erfassen Sie die entsprechenden Brechungsindizes. Die Berechnung der Saccharosekonzentration erfolgt wie folgt:
1,3333 steht für den Brechungsindex von Wasser. 0,048403 ist ein saccharosespezifischer Umrechnungsindex, der aus der linearen Skalierung der molaren Brechung zur Saccharosekonzentration in wässrigen Lösungen 37 erhalten wird. - Geben Sie die höchste Saccharosekonzentration in das Zentrifugationsröhrchen und stellen Sie das Röhrchen auf −20 °C. Warten Sie, bis die Schicht vollständig gefroren ist, bevor Sie die nächste auftragen. Gehen Sie entsprechend vor, bis die letzte Schicht hinzugefügt ist, und lagern Sie die Farbverläufe bei −20 °C.
HINWEIS: Denken Sie daran, die eingefrorenen Farbverläufe beim Starten des Experiments auf 4 °C zu übertragen, damit die Farbverläufe auftauen können. Dies dauert ca. 3 Stunden. Für die Zentrifugation wurde hier ein Ausschwingrotor mit einem Fassungsvermögen von 13,2 mL verwendet. Bei Verwendung eines anderen Rotors müssen die Gradientenstufenvolumina entsprechend angepasst werden.
- Für einen 11-ml-Stufengradienten mit fünf Stufen (1,3 m, 1,13 m, 1,02 m, 0,96 m und 0,8 M Saccharose in 20 mM MOPS und 0,5 mM EDTA, pH 7,4) enthält jede Schicht 2,2 ml Saccharoselösung.
- Messen Sie die Saccharosekonzentration der Proben mit einem Refraktometer. Wenn kein Zugang zu einem Refraktometer vorhanden ist, könnte man alternativ davon ausgehen, dass die Saccharosekonzentration 2 M beträgt. Diese vermeintliche Saccharosekonzentration wird dann die Grundlage für den nächsten Schritt sein.
- Stellen Sie die Saccharosekonzentration auf 0,6 M ein, indem Sie eine geeignete Menge von 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF und Protease-Inhibitor-Cocktail mit einem pH-Wert von 7,4 hinzufügen. Wenn die Saccharosekonzentration nicht gemessen, sondern mit 2 M geschätzt wird, empfiehlt es sich zu prüfen, ob die Konzentration nach der Einstellung niedrig genug ist. Ein kleines Aliquot der Probe (ca. 50 μl) wird auf 200 μl 0,8 M Saccharose in ein Reagenzglas gegeben. Die Probe muss auf der 0,8 M Saccharose bleiben.
- Laden Sie die Proben (ca. 1 ml) auf den Saccharosegradienten (bewahren Sie 10 % für eine spätere Referenz auf). Sorgfältiges Pipettieren ist wichtig, um eine Störung des Gradienten zu vermeiden (Abbildung 2, Schritt 5).
- Die Vesikel werden durch Zentrifugation bei 200.000 x g und 4 °C für 12 h getrennt. Stellen Sie die Zentrifuge nach Möglichkeit auf langsame Beschleunigung und Verzögerung ein, um die Störung des Gefälles zu vermeiden (Abbildung 2, Schritt 6).
HINWEIS: Hier wurde ein Ausschwingrotor mit einem maximalen Radius von 153,1 mm verwendet. Die Zentrifugationsbedingungen hängen stark vom Rotor ab und müssen angepasst werden, wenn ein anderer Rotor verwendet wird. - Ernten Sie den Gradienten von oben nach unten in 700-μl-Fraktionen mit einer 1-ml-Pipette. Dies führt zu 17 Brüchen, was eine ausreichende Auflösung ermöglicht.
4. Analyse der submitochondrialen Vesikel
- Konzentrieren Sie die Proteine, indem Sie jede Fraktion zwei sequentiell durchgeführten TCA-Fällungen38 unterziehen, um die SDS-PAGE-Proben vorzubereiten.
- 200 μl 72%ige TCA zu den einzelnen Fraktionen geben und mischen, bis die Lösung homogen ist. Die Fraktionen werden 30 min auf Eis inkubiert und die gefällten Proteine durch Zentrifugation bei 20.000 x g und 4 °C für 20 min pelletiert. Den Überstand verwerfen, 500 μl 28 %ige TCA-Lösung hinzufügen, gut mischen und den Zentrifugationsschritt wiederholen.
- Die Pellets werden mit 1 ml Aceton (−20 °C) gewaschen und 10 Minuten lang bei 20.000 x g und 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie die Pellets in 60 μl SDS-Probenpuffer und inkubieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei 95 °C.
HINWEIS: Nach dem ersten TCA-Niederschlag verbleibt eine große Menge an Saccharose, insbesondere in den Fraktionen mit hoher Dichte. Diese wird durch den zusätzlichen TCA-Niederschlag entfernt.
- Analysieren Sie 20 μl jeder Fraktion mittels SDS-PAGE39 und Immunoblotting40,41,42,43.
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Representative Results
Es ist relativ einfach, die innere und äußere Membran der Mitochondrien zu trennen. Die Erzeugung und Trennung von Vesikeln, die Kontaktstellen enthalten, ist jedoch wesentlich schwieriger. Unserer Meinung nach sind zwei Schritte entscheidend und wesentlich: die Beschallungsbedingungen und der verwendete Gradient.
In der Regel wird angenommen, dass lineare Farbverläufe im Vergleich zu Stufengradienten eine bessere Auflösung haben. Ihre reproduzierbare Herstellung ist jedoch langwierig und erfordert spezielles Equipment. Daher haben wir eine Methode entwickelt, um einen Stufengradienten mit relativ kleinen Unterschieden zwischen den einzelnen Schritten zu erzeugen (siehe Schritt 3.5). Wir spekulierten, dass sich der Stufengradient beim Zentrifugieren ausgleichen würde, was zu einem nahezu linearen Gradienten führen würde. Auffallend war, dass die Bestimmung der Saccharosekonzentrationen der einzelnen Fraktionen nach der Zentrifugation mit einem Refraktometer zeigte, dass der Stufengradient nach 12 h Zentrifugation bei 200.000 x g tatsächlich nahezu linear wurde (Abbildung 3).
Die Bedeutung einer milden Beschallung wird in diesen repräsentativen Ergebnissen deutlich. Unter milden Beschallungsbedingungen (Abbildung 4A) war der mitochondriale Außenmembranmarker Tom40 in den frühen Fraktionen mit geringer Dichte (Fraktion Nr. 4) angereichert und fehlte in den späteren Fraktionen praktisch nicht. Der mitochondriale innere Membranmarker Tim17 war in hochdichten Fraktionen konzentriert (Fraktion Nr. 17). Im Gegensatz dazu akkumulierte das Kontaktstellenprotein Mic60 in Fraktionen mittlerer Saccharosekonzentration (Fraktion Nr. 12-14), was auf die erfolgreiche Erzeugung und anschließende Trennung der verschiedenen Membranvesikel hinweist. Im Gegensatz dazu konnte bei härteren Beschallungsbedingungen der mitochondriale Außenmembranmarker Tom40 in den unteren Fraktionen des Gradienten nachgewiesen werden (Fraktion Nr. 14 und Fraktion Nr. 17, Abbildung 4B). Darüber hinaus gab es eine signifikante Menge an Tim17 in Fraktionen mittlerer Dichte (Fraktion Nr. 13 und Fraktion Nr. 14, Abbildung 4B). Die unspezifische Anhäufung von äußeren und inneren Membranmarkern in Fraktionen mittlerer Dichte deutet auf die künstliche Bildung von Mischmembranen hin, die die Identifizierung von Kandidatenproteinen hemmen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der mitochondrialen Ultrastruktur. Eine schematische Darstellung eines Mitochondriums, um die verschiedenen Kompartimente, Membranen und Proteinpositionen zu zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Arbeitsablauf der mitochondrialen Fraktionierung zur Isolierung von Proteinen an der Kontaktstelle. Eine schematische Übersicht über den im Protokoll beschriebenen Prozess. Die (1) frisch isolierten Mitochondrien waren (2) osmotisch geschwollen (3) und dann geschrumpft. (4) Die geschrumpften Mitochondrien wurden gegen eine milde Beschallung zur Erzeugung submitochondrialer Vesikel beanstandet. (5) Das Vesikelgemisch wurde konzentriert und auf einen Saccharose-Stufengradienten geladen. (6) Durch Zentrifugation wurden die mitochondrialen äußeren Membranvesikel mit einer niedrigen Saccharosekonzentration, die mitochondrialen inneren Membranvesikel mit einer hohen Saccharosekonzentration und die Kontaktstellen-haltigen Vesikel mit einer mittleren Saccharosekonzentration angereichert. Abkürzungen: MIM, mitochondriale Innenmembran; MOM, mitochondriale äußere Membran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Erzeugung eines linearen Gradienten durch Zentrifugation. Zwei Stufengradienten (1,3 M, 1,13 M, dann 1,02 M, 0,96 M und 0,8 M in 20 mM MOPS und 0,5 mM EDTA, pH 7,4) wurden parallel hergestellt, und 1 ml 0,6 M Saccharose in 20 mM MOPS und 0,5 mM EDTA, pH 7,4, wurde auf beide Gradienten geladen. Die Gradienten wurden 12 h lang bei 200.000 x g und 4 °C zentrifugiert und in jeweils 17 Fraktionen geerntet. Die Reproduzierbarkeit der Methode wurde durch Bestimmung der Saccharosekonzentration der einzelnen Fraktionen der einzelnen Gradienten mit einem Refraktometer überprüft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Isolierung von Proteinen an der Kontaktstelle mit einem wohldefinierten Ultraschallpuls. (A,B) Frisch isolierte Hefe-Mitochondrien wurden einer osmotischen Behandlung unterzogen und einer Beschallung ausgesetzt. Die erzeugten Vesikel wurden mittels Saccharose-Auftriebs-Dichtegradientenzentrifugation getrennt. Der Gradient wurde fraktioniert, und die Proteine in den verschiedenen Fraktionen wurden einer TCA-Fällung unterzogen. Die Verteilung der Markerproteine für die mitochondriale Außenmembran (Tom40), die mitochondriale Innenmembran (Tim17) und die Kontaktstellen (Mic60) wurde mittels Immunoblotting mit den angegebenen Antikörpern analysiert. (A) Milde Beschallung (4 x 30 s, 10% Amplitude) führte zu einer klaren Trennung der äußeren Membranproteine (Low-Density-Fraktionen) und der inneren Membranproteine (High-Density-Fraktionen). Zusätzlich wurde das Kontaktstellenprotein Mic60 erfolgreich in Fraktionen mittlerer Dichte angereichert. (B) Eine härtere Beschallung (4 x 30 s, 20% Amplitude) führte zur Erzeugung von Hybridvesikeln und ermöglichte somit keine klare Trennung der Kontaktstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die mitochondriale Subfraktionierung ist ein kompliziertes Experiment mit mehreren hochkomplexen Schritten. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, unsere etablierte Methode32 weiter zu verbessern und bis zu einem gewissen Grad zu vereinfachen. Die Herausforderungen lagen hier in der Anforderung an komplizierten und hochspezialisierten Geräten, bei denen es sich oft um Einzelkonstruktionen handelt, sowie dem enormen Zeit- und Energieverbrauch. Zu diesem Zweck haben wir versucht, die Pumpen und Einzelkonstruktionen, die für das Gießen und Ernten des linearen Gradienten verwendet wurden, zu entfernen und auf einen Stufengradienten umzustellen. Wichtig ist, dass wir festgestellt haben, dass der Gradient, zumindest wenn er wie hier beschrieben präpariert wird, während der Zentrifugation linear wird, was dies zu einem gültigen Ersatz macht. Diese Methode (i) macht einen Gradientenmischer überflüssig und verringert somit die erforderliche Ausrüstung; (ii) spart Zeit am Tag des Versuchs, da der Gradient im Voraus vorbereitet werden kann; und (iii) in hohem Maße reproduzierbar ist (Abbildung 3), wenn sie gemäß dem beschriebenen Verfahren hergestellt wird, bei dem die einzelnen Schritte eingefroren werden, bevor der nächste darüber geschichtet wird. Diese Gradienten können auch unbegrenzt bei −20°C gespeichert werden. Darüber hinaus ist das Laden des hier vorgeschlagenen Sedimentationsgradienten auch einfacher, als das Vesikelgemisch unter dem Gradienten schichten zu müssen, wie in ähnlichen Verfahren 9,32 beschrieben. Das Laden eines Flotationsgradienten erfordert eine Spritze mit einer langen Kanüle, um den bereits gegossenen Gradienten zu passieren. Dieser Schritt war immer problematisch, da die Gefahr bestand, dass der Gradient zerstört wurde. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die kürzere Zentrifugationszeit von 12 h im Vergleich zu 24 h32, was den Zeit- und Energieaufwand für diese Methode stark reduziert. Die Machbarkeit und Reproduzierbarkeit des hier beschriebenen verbesserten Verfahrens wird durch die kürzlich erfolgte Identifizierung der MICOS-unabhängigen Kontaktstelle unterstrichen, die von Cqd1 und Por1-Om14 gebildet wird28.
Dieses Experiment ist jedoch noch sehr komplex. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, gibt es mehrere wesentliche Kriterien, die bei der Anwendung dieses Protokolls berücksichtigt werden müssen.
Einer der wichtigsten Aspekte ist die Qualität der Mitochondrien. Diese müssen frisch isoliert werden. Daher müssen sowohl die Kultivierung von Hefen als auch die Isolierung von Mitochondrien bei der Planung des Eingriffs berücksichtigt werden. Eine schonende Behandlung der Mitochondrien während der Isolierung verhindert die Störung der Membranen, während es auch wichtig ist, Proteasen mit einer angemessenen Konzentration von PMSF oder alternativ kommerziell erhältlichen Protease-Inhibitor-Cocktails zu hemmen34.
Ein weiterer wichtiger Schritt und einer der kritischsten Aspekte des Eingriffs ist die Beschallung. Wichtig ist, dass es möglich ist, die richtige Intensität des Ultraschallimpulses anhand des Schalls abzuschätzen, der durch die Verwirbelung der Aufhängung erzeugt wird (siehe Video). Die optimalen Bedingungen müssen jedoch für jeden Versuchsaufbau experimentell ermittelt werden, und zwar nicht nur anhand verschiedener Marken und Modelle, sondern auch anhand verschiedener Maschinen desselben Modells. Insbesondere die Demontage und Reinigung der Spitze wirkt sich auch auf die Intensität der Beschallung aus, so dass eine Neujustierung der Bedingungen erforderlich ist. Die Empfehlung im Protokoll ist auch, eine Rosettenzelle für eine höhere Effizienz zu verwenden, aber auch andere Gefäße können funktionieren. Eine zu harte Beschallung führt zur Bildung künstlich gemischter Bläschen. Dies führt zu einer starken Akkumulation von inneren und äußeren Membranproteinen in Fraktionen mittlerer Dichte, die noch stärker sein können, wie im gezeigten Beispiel (Abbildung 4B). In diesem Fall sollte man die Amplitude oder den Zeitpunkt der Beschallung reduzieren. Probleme können jedoch auch auftreten, wenn die Beschallung nicht intensiv genug ist. In diesem Fall könnte die Ausbeute der erzeugten Vesikel zu gering sein, um Proteine durch Immunoblotting zu detektieren, und daher müsste man die Amplitude, die Zeit oder die Zyklen der Beschallung erhöhen.
Schließlich ist der Gradient wichtig für die Trennung der verschiedenen erzeugten Vesikelarten. Das optimale Maximum und Minimum des Saccharosegradienten sowie die Anzahl der Schritte können jedoch auch je nach individuellem Setup variieren. Hier genügte ein fünfstufiger Gradient mit maximal 1,3 M Saccharose und minimal 0,8 M Saccharose für eine sichtbare und reproduzierbare Trennung der Kontaktstellen-haltigen Vesikel von den mitochondrialen inneren und äußeren Membranvesikeln. Zu Beginn ist es wichtig, Bedingungen zu wählen, die leere Fraktionen oberhalb der mitochondrialen äußeren Membranvesikel und unterhalb der mitochondrialen inneren Membranvesikel hinterlassen, um eine korrekte Trennung zu gewährleisten. Das Komprimieren der oberen oder unteren Fraktionen kann zu Artefakten führen. In späteren Schritten, wenn die genaue Molarität von Saccharose bekannt ist, bei der sich die inneren und äußeren Membranvesikel ansammeln, kann der Gradient optimiert werden, indem die maximalen und minimalen Saccharosekonzentrationen erhöht oder verringert werden, um die Auflösung zwischen der inneren Membran, der äußeren Membran und den Kontaktstellen zu verbessern. Bemerkenswert ist, dass die Wachstumsbedingungen der Hefe das Verhalten der erzeugten Vesikel bei der Dichtezentrifugation beeinflussen können. Hier wurde die Hefe auf reichhaltigem YP-Medium (1 % [w/v] Hefeextrakt, 2 % [w/v] Pepton, pH 5,5) gezüchtet, das Glycerin (3 % [v/v]) als Kohlenstoffquelle bei 30 °Centhielt 34,44. Andere Wachstumsbedingungen können die Protein- und Lipidzusammensetzung der Mitochondrien und damit die Dichte der erzeugten Vesikel verändern.
Die beschriebene Methode bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Möglichkeit, Kontaktstellen zu isolieren. Die Identifizierung der Proteinzusammensetzung der jeweiligen Kontaktstelle (innere und äußere Membrankomponenten) erfordert jedoch zusätzliche Assays wie Immunpräzipitation, ggf. in Kombination mit Massenspektrometrie. Hierfür sind spezifische Antikörper und Modellorganismen notwendig, die markierte Versionen der Proteinkandidaten exprimieren. Wenn Hefe als Modellorganismus verwendet wird, können Proteinkandidaten aufgrund der Vielfalt der verfügbaren genetischen Modifikationsmethoden und der Existenz markierter Bibliotheken leicht gewonnen werden45,46,47. Daher haben wir uns entschlossen, dieses Protokoll für Hefe-Mitochondrien zu etablieren und zu optimieren. Obwohl es möglich sein sollte, die Methode für aus anderen Organismen isolierte Mitochondrien anzupassen, hat Hefe den Vorteil, dass große Mengen an Mitochondrien kostengünstig und schnell gewonnen werden können. Darüber hinaus ist die Verwendung von Hefe als Modellorganismus für die Erfassung der ersten Ergebnisse ein bewährter Weg, um Proteinkomplexe und -prozesse zu identifizieren, die in höheren Eukaryoten bis hin zum Menschen konserviert sind. Wie bereits erwähnt, konnte nach der Identifizierung und Charakterisierung von MICOS in Hefe 9,10,11 gezeigt werden, dass MICOS in Form und Funktion in höheren Eukaryoten konserviert ist 21. Cqd1 und Por1, Komponenten der kürzlich entdeckten MICOS-unabhängigen Kontaktstelle28, sind ebenfalls konserviert, was darauf hindeutet, dass diese Kontaktstelle auch in höheren Eukaryoten vorhanden ist.
Die Bedeutung der kontinuierlichen Erforschung dieser Kontaktstellen wird durch die Verbindungen von MICOS zu verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen unterstrichen 18,48,49,50,51,52,53,54. Die korrekte Phosphorylierung von Mic60 durch PINK1 wurde mit der Aufrechterhaltung von Crista-Verbindungen bei Drosophilie in Verbindung gebracht, und daher könnte dieser Signalweg, der für den Menschen konserviert ist, mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht werden48. Darüber hinaus führt eine Punktmutation in der humanen MICOS-Untereinheit Mic14 zu einer Destabilisierung von MICOS und der anschließenden Veränderung der mitochondrialen Ultrastruktur, die bei Patienten mit frontotemporaler Demenz und amyotropher Lateralsklerose gefunden wurden 50,51,52,53,54. Da Mic14 von der Hefe bis zum Menschen konserviert wird, könnten weitere Studien an diesem Protein mit Hefe als Modellorganismus durchgeführt werden. Diese Grundlagenforschung könnte zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen dieser Krankheiten führen, was die Entwicklung effizienter Behandlungen und Therapien für sie beschleunigen könnte. Darüber hinaus deuten die jüngsten Entdeckungen weiterer MICOS-unabhängiger Kontaktstellen27,28 darauf hin, dass dieses Feld weiter wächst. Daher könnte das hier vorgestellte Protokoll dazu beitragen, diese vielversprechende und faszinierende Forschung voranzubringen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Das M.E.H. bedankt sich bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), Projektnummer 413985647, für die finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians-Universität München, für seine großzügige und umfangreiche Unterstützung. Wir danken Walter Neupert für seinen wissenschaftlichen Input, seine hilfreichen Diskussionen und seine kontinuierliche Inspiration. J.F. bedankt sich bei der Graduate School Life Science Munich (LSM) für die Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any Abbe refractometer can be used |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
References
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