Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65444
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
* These authors contributed equally

Summary

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

Abstract

מיטוכונדריה נמצאים כמעט בכל התאים האיקריוטים ומבצעים תפקידים חיוניים הרבה מעבר לייצור אנרגיה, למשל, סינתזה של צבירי ברזל-גופרית, שומנים או חלבונים, חציצה Ca2+ והשראת אפופטוזיס. כמו כן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה גורם למחלות אנושיות חמורות כמו סרטן, סוכרת וניוון עצבי. כדי לבצע את הפונקציות האלה, המיטוכונדריה צריכים לתקשר עם שאר התא דרך המעטפת שלהם, המורכבת משני קרומים. לכן, שני קרומים אלה צריכים לקיים אינטראקציה כל הזמן. אתרי מגע חלבוניים בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה חיוניים מבחינה זו. עד כה אותרו מספר אתרי קשר. בשיטה המתוארת כאן, משתמשים במיטוכונדריה של Saccharomyces cerevisiae כדי לבודד אתרי מגע, ובכך לזהות מועמדים המתאימים לחלבוני אתר מגע. השתמשנו בשיטה זו כדי לזהות את אתר המגע המיטוכונדריאלי ואת קומפלקס מערכת ארגון הקריסטות (MICOS), אחד הקומפלקסים העיקריים ליצירת אתרי מגע בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, אשר נשמר משמרים לבני אדם. לאחרונה, שיפרנו עוד יותר שיטה זו כדי לזהות אתר קשר חדשני המורכב מ- Cqd1 וממתחם Por1-Om14.

Introduction

מיטוכונדריה מבצעים מגוון תפקידים שונים באיקריוטים, כאשר הידוע ביותר הוא ייצור ATP באמצעות זרחן חמצוני. פונקציות אחרות כוללות ייצור של אשכולות ברזל-גופרית, סינתזת שומנים, ובאיקריוטים גבוהים יותר, איתות Ca2+, והשראת אפופטוזיס 1,2,3,4. פונקציות אלה קשורות באופן בלתי נפרד Ultrastructure מורכב שלהם.

מבנה העל המיטוכונדריאלי תואר לראשונה במיקרוסקופ אלקטרונים5. הוכח כי מיטוכונדריה הם אברונים מורכבים למדי המורכבים משני קרומים: הקרום החיצוני של המיטוכונדריה והקרום הפנימי של המיטוכונדריה. לפיכך, שני תאים מימיים נוצרים על ידי ממברנות אלה: החלל intermembrane ואת המטריצה. ניתן לחלק עוד יותר את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לחלקים שונים. קרום הגבול הפנימי נשאר בסמיכות לקרום החיצוני, והקריסטה יוצרת פלישות. מה שנקרא צמתי קריסטה מחברים בין קרום הגבול הפנימי לבין הקריסטה (איור 1). יתר על כן, מיקרוגרפים אלקטרוניים של מיטוכונדריה מכווצים אוסמוטית מגלים כי קיימים אתרים שבהם קרומי המיטוכונדריה מחוברים באופן הדוק 6,7. אתרי המגע האלה כביכול נוצרים על-ידי קומפלקסים חלבוניים המשתרעים על פני שני הממברנות (איור 1). נהוג לחשוב כי אתרי אינטראקציה אלה חיוניים לקיום התא בשל חשיבותם לוויסות הדינמיקה והתורשה של המיטוכונדריה, כמו גם להעברת מטבוליטים ואותות בין הציטוזול למטריצה8.

קומפלקס MICOS בקרום הפנימי של המיטוכונדריה הוא כנראה המאופיין ביותר והמורכב הרב-תכליתי ביותר ליצירת אתרי מגע. MICOS תואר בשמרים בשנת 2011, והוא מורכב משש תת-יחידות 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 ו-Mic10. אלה יוצרים קומפלקס של כ 1.5 MDa אשר מתמקם לצמתיםcrista 9,10,11. המחיקה של אחת מתת-יחידות הליבה, Mic10 או Mic60, מובילה להיעדרו של קומפלקס 9,11, כלומר שתי תת-יחידות אלה חיוניות ליציבות של MICOS. באופן מעניין, MICOS יוצר לא רק אתר מגע אחד אלא גם אתרי מגע מרובים עם חלבונים וקומפלקסים שונים של הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה: קומפלקס TOM 11,12, קומפלקס TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, קומפלקס Fzo1-Ugo19,Por1 10, OM4510 ומירו 17. זה מצביע מאוד על כך שקומפלקס MICOS מעורב בתהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כגון ייבוא חלבונים, מטבוליזם של פוספוליפידים ויצירת אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי18. הפונקציה האחרונה היא ככל הנראה הפונקציה העיקרית של MICOS, שכן היעדר קומפלקס MICOS המושרה באמצעות מחיקה של MIC10 או MIC60 מוביל לאולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי חריג שחסר כמעט לחלוטין קריסטה סדירה. במקום זאת, שלפוחיות קרום פנימיות ללא חיבור לקרום הגבול הפנימי מצטברות19, 20. חשוב לציין, MICOS נשמר בצורה ובתפקוד משמרים לבני אדם21. הקשר של מוטציות בתת-יחידות MICOS עם מחלות אנושיות קשות מדגיש גם את חשיבותו לאיקריוטים גבוהים יותר22,23. למרות ש-MICOS הוא רב-תכליתי ביותר, חייבים להתקיים אתרי קשר נוספים (בהתבסס על התצפיות שלנו שלא פורסמו). ואכן, זוהו מספר אתרי מגע אחרים, למשל, מכונות האיחוי המיטוכונדריאלי Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 או Mdm31-Por1, המעורבות בביוסינתזה של קרדיוליפין פוספוליפיד 27 ספציפי למיטוכונדריה. לאחרונה, שיפרנו את השיטה שהובילה אותנו לזיהוי MICOS לזיהוי Cqd1 כחלק מאתר קשר חדשני שנוצר עם קומפלקס הממברנה החיצונית Por1-Om1428. באופן מעניין, נראה כי אתר מגע זה מעורב גם בתהליכים מרובים כגון הומאוסטזיס של קרום המיטוכונדריה, מטבוליזם של פוספוליפידים והתפלגות קואנזים Q28,29.

כאן, השתמשנו בווריאציה של השבר שתואר קודם לכן של מיטוכונדריה 9,30,31,32,33. טיפול אוסמוטי במיטוכונדריה מוביל לשיבוש הקרום החיצוני של המיטוכונדריה ולהתכווצות חלל המטריצה, מה שמשאיר את שני הקרומים רק בסמיכות באתרי מגע. זה מאפשר יצירת שלפוחיות המורכבות אך ורק מהקרום החיצוני של המיטוכונדריה או מהקרום הפנימי של המיטוכונדריה או באתרי מגע של שני הממברנות באמצעות סוניקציה קלה. בשל היחס בין חלבון לשומנים בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, שלפוחיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה מציגות צפיפות גבוהה יותר בהשוואה לשלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה. ההבדל בצפיפות יכול לשמש להפרדת שלפוחיות הממברנה באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות ציפה סוכרוז. לפיכך, שלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה מצטברות בריכוזי סוכרוז נמוכים, בעוד שלפוחיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה מועשרות בריכוזי סוכרוז גבוהים. השלפוחיות שמכילות אתרי מגע מתרכזות בריכוזי סוכרוז בינוניים (איור 2). הפרוטוקול הבא מתאר בפירוט שיטה משופרת זו, הדורשת פחות ציוד, זמן ואנרגיה מיוחדים בהשוואה לשיטה32 שהוקמה בעבר, ומספק כלי שימושי לזיהוי חלבונים אפשריים באתר המגע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מאגרים ופתרונות מלאי

  1. הכינו תמיסת 1 M 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) במים שעברו דה-יוניזציה, pH 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  2. הכן 500 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) במים deionized, pH 8.0. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו סורביטול 2.4 מ 'במים נטולי יונים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלאבינג.
  4. מכינים סוכרוז 2.5 מ 'במים deionized. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלאבינג.
  5. הכינו 200 mM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) באיזופרופנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
    אזהרה: PMSF רעיל בבליעה וגורם לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים. אין לנשום את האבק, וללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן.
  6. הכינו 72% חומצה טריכלורואצטית (TCA) במים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
    אזהרה: TCA עלול לגרום לגירוי נשימתי, כוויות עור חמורות ונזק לעיניים. אין לנשום את האבק, וללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן.
  7. הכן את מאגר SM: 20 mM MOPS ו 0.6 M סורביטול, pH 7.4.
  8. הכינו את מאגר הנפיחות: 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH 7.4.
  9. הכינו את מאגרי הסוכרוז ההדרגתיים: 0.8 M, 0.96 M, 1.02 M, 1.13 M ו-1.3 M סוכרוז ב-20 mM MOPS, ו-0.5 mM EDTA, pH 7.4.
    הערה: ניתן לאחסן את כל המאגרים ב- 4 °C; עם זאת, מומלץ לאחסן את המאגרים המכילים סוכרוז ב -20 מעלות צלזיוס כדי למנוע צמיחה פטרייתית. יש להוסיף את מעכבי הפרוטאז טריים לפני השימוש.

2. יצירת שלפוחיות הגשה

  1. בודדו את המיטוכונדריה של שמרים גולמיים טריים על פי פרוטוקולים 34,35 שנקבעו.
    הערה: עבור ניסוי זה, מיטוכונדריה בודדו מ Saccharomyces cerevisiae. אין צורך ביצירת מיטוכונדריה טהורה הדרגתית נטולת אברונים אחרים.
  2. השהה מחדש 10 מ"ג של מיטוכונדריה מבודדת טרייה במאגר SM של 1.6 מ"ל (4°C) על-ידי פיפטינג (איור 2, שלב 1).
  3. מעבירים את המתלה המיטוכונדריאלי לצלוחית Erlenmeyer מקוררת מראש בנפח 100 מ"ל.
  4. להוסיף לאט 16 מ"ל של חיץ נפיחות באמצעות פיפטה זכוכית 20 מ"ל. יש למרוח ערבוב עדין קבוע על קרח במהלך התוספת. טיפול אוסמוטי זה גורם לספיגת מים לחלל המטריצה. הנפיחות של הקרום הפנימי של המיטוכונדריה תשבש את הקרום החיצוני. אולם שני הקרומים יישארו בקשר באתרי הקשר9 (איור 2, שלב 2).
  5. יש לדגור על הדגימות תוך ערבוב עדין מתמיד במשך 30 דקות על קרח.
  6. הוסיפו באיטיות 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז 2.5 מ"ל באמצעות פיפטת זכוכית 5 מ"ל כדי להעלות את ריכוז הסוכרוז בדגימות לכ-0.55 מ'. טיפול אוסמוטי זה גורם לשטף מים מהמטריצה36. התכווצות הקרום הפנימי נועדה למקסם את מרחקו לשברים השיוריים של הקרום החיצוני. זה מקטין את ההסתברות ליצור בועיות היברידיות מלאכותיות של קרומים פנימיים וחיצוניים באמצעות סוניקציה (איור 2, שלב 3).
  7. יש לדגור על הדגימות תוך ערבוב עדין במשך 15 דקות על קרח.
  8. העבירו את המיטוכונדריה לסוניקציה כדי ליצור בועיות קרום כניעה (איור 2, שלב 4).
    1. מעבירים את התרחיף המיטוכונדריאלי לתא רוזטה מקורר מראש.
    2. הפעילו את המתלה המיטוכונדריאלי באמפליטודה של 10% למשך 30 שניות תוך קירור תא הרוזטה באמבט קרח.
    3. הניחו את המתלה למשך 30 שניות באמבט קרח.
    4. חזור על שלב 2.8.2 ושלב 2.8.3 שלוש פעמים נוספות.
      הערה: תנאי הסוניקציה ישתנו בהתאם לסוניק שבו נעשה שימוש. אופטימיזציה יהיה צורך עבור מכונות בודדות. סוניקציה קשה מדי תוביל להיווצרות מלאכותית של שלפוחיות המורכבות מממברנות פנימיות וחיצוניות של המיטוכונדריה.

3. הפרדת שלפוחיות submitochondrial

  1. יש להפריד את השלפוחיות שנוצרו מהמיטוכונדריה הנותרת על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4°C. המיטוכונדריה השלמים ייפלטו ואילו השלפוחיות יישארו בסופרנטנט.
  2. רכזים את תערובת השלפוחית.
    1. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגה טריים.
    2. טען כרית של 0.3 מ"ל של תמיסת סוכרוז 2.5 מ 'בתחתית הצינור באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד צינורית 0.8 מ"מ x 120 מ"מ.
    3. צנטריפוגה ב 118,000 x גרם במשך 100 דקות ב 4 ° C.
      הערה: כאן, רוטור דלי מתנדנד עם רדיוס מרבי של 153.1 מ"מ שימש. תנאי הצנטריפוגה תלויים מאוד ברוטור ויהיה צורך להתאים אותם כאשר נעשה שימוש ברוטור אחר.
  3. השלפוחיות יופיעו כדיסק בחלק העליון של כרית הסוכרוז לאחר הצנטריפוגה. השליכו כ-90% מהסופרנטנט. כעת, קצרו את הבועיות המרוכזות על ידי השעייתן מחדש במאגר שנותר כולל סוכרוז באורך 2.5 מ' על ידי פיפטציה מעלה ומטה. מעבירים את המתלה להומוגנייזר Dounce קר כקרח.
  4. הומוגניזציה של ההשעיה עם לפחות 10 שבץ באמצעות קדר polytetrafluoroethylene .
  5. מכינים את שיפוע הסוכרוז.
    1. עבור שיפוע מדרגות של 11 מ"ל עם חמישה שלבים (1.3 מ', 1.13 מ', 1.02 מ', 0.96 מ' וסוכרוז 0.8 מ' ב-20 מ"מ MOPS ו-0.5 מ"מ EDTA, pH 7.4), בכל שכבה יש 2.2 מ"ל של תמיסת סוכרוז.
      הערה: מומלץ להשתמש ברפרקטומטר כדי למדוד ולהתאים את ריכוזי הסוכרוז; עם זאת, זה לא חיוני. החל 10 μL של המאגר על הרפרקטומטר, וזהה את מדדי השבירה המתאימים. חישוב ריכוז הסוכרוז הוא כדלקמן:
      Equation 1
      1.3333 מייצג את מדד השבירה של המים. 0.048403 הוא מדד המרה ספציפי לסוכרוז המתקבל מקנה מידה ליניארי של שבירה מולרית לריכוז סוכרוז בתמיסות מימיות 37.
    2. הוסף את ריכוז הסוכרוז הגבוה ביותר לצינור הצנטריפוגה, ושים את הצינור ב -20 מעלות צלזיוס. המתינו עד שהשכבה תוקפא לחלוטין לפני החלת השכבה הבאה. המשיכו בהתאם עד להוספת השכבה האחרונה, ואחסנו את מעברי הצבע ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: זכור להעביר את מעברי הצבע הקפואים ל- 4 ° C בעת תחילת הניסוי כדי לאפשר למעברי הצבע להפשיר. זה ייקח בערך 3 שעות. עבור הצנטריפוגה כאן, רוטור דלי מתנדנד עם קיבולת של 13.2 מ"ל שימש. כאשר משתמשים ברוטור אחר, יש להתאים את נפחי מדרגות השיפוע בהתאם.
  6. למדוד את ריכוז הסוכרוז של הדגימות באמצעות רפרקטומטר. אם אין גישה לרפרקטומטר, אפשר לחילופין להניח שריכוז הסוכרוז הוא 2 מ'. ריכוז סוכרוז משוער זה יהיה הבסיס לשלב הבא.
  7. כוונן את ריכוז הסוכרוז ל 0.6 M על ידי תוספת של כמות מתאימה של 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH 7.4. אם ריכוז הסוכרוז מוערך כ-2 מ' במקום להימדד, מומלץ לבדוק האם הריכוז נמוך מספיק לאחר ההתאמה. החל aliquot קטן של הדגימה (כ 50 μL) על גבי 200 μL של 0.8 M סוכרוז במבחנה. הדגימה חייבת להישאר על גבי סוכרוז 0.8 M.
  8. טען את הדגימות (כ -1 מ"ל) על גבי שיפוע הסוכרוז (שמור 10% להתייחסות מאוחרת יותר). צנרת זהירה חשובה כדי למנוע הפרעה של שיפוע (איור 2, שלב 5).
  9. להפריד את שלפוחיות על ידי צנטריפוגה ב 200,000 x גרם ו 4 ° C במשך 12 שעות. במידת האפשר, כוונו את הצנטריפוגה להאטה ולהאטה כדי למנוע הפרעה של השיפוע (איור 2, שלב 6).
    הערה: כאן, רוטור דלי מתנדנד עם רדיוס מרבי של 153.1 מ"מ שימש. תנאי הצנטריפוגה תלויים מאוד ברוטור ויהיה צורך להתאים אותם כאשר נעשה שימוש ברוטור אחר.
  10. קצרו את השיפוע מלמעלה למטה בשברים של 700 מיקרוליטר באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. התוצאה תהיה 17 שברים, מה שמאפשר רזולוציה מספקת.

4. ניתוח שלפוחיות submitochondrial

  1. רכז את החלבונים על ידי חשיפת כל שבר לשני משקעי TCA38 המבוצעים ברצף כדי להכין את דגימות SDS-PAGE.
    1. הוסף 200 μL של 72% TCA לשברים בודדים, וערבב עד התמיסה הומוגנית. לדגור על השברים במשך 30 דקות על קרח, ולזרוק את החלבונים המושקעים על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x גרם ו 4 ° C במשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת TCA 28%, ערבבו היטב וחזרו על שלב הצנטריפוגה.
    2. שטפו את הכדוריות עם 1 מ"ל אצטון (-20°C), וצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20,000 x גרם ו-4°C. השליכו את הסופרנטנט, ותנו לכדוריות להתייבש. השהה מחדש את הכדוריות ב 60 μL של מאגר דגימת SDS, ודגר על הדגימות במשך 5 דקות ב 95 ° C.
      הערה: כמות גדולה של סוכרוז תישאר, במיוחד בשברים בעלי צפיפות גבוהה, לאחר משקעי TCA הראשונים. זה יוסר באמצעות משקעים TCA נוספים.
  2. נתח 20 μL של כל שבר על ידי SDS-PAGE39 ו immunoblotting40,41,42,43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קל יחסית להפריד בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה. עם זאת, הדור וההפרדה של שלפוחיות המכילות אתרי מגע הם הרבה יותר קשה. לדעתנו, שני שלבים הם קריטיים וחיוניים: תנאי הסוניקציה והשיפוע שבו נעשה שימוש.

בדרך כלל, מעברי צבע ליניאריים נחשבים כבעלי רזולוציה טובה יותר בהשוואה למעברי צבע של צעדים. עם זאת, הייצור שלהם לשחזור הוא מייגע דורש ציוד מיוחד. לכן, ביססנו שיטה ליצירת שיפוע צעדים עם הבדלים קטנים יחסית בין השלבים הבודדים (ראה שלב 3.5). שיערנו כי שיפוע המדרגות יאוזן בצנטריפוגה, וכתוצאה מכך ייווצר שיפוע כמעט ליניארי. באופן מדהים, קביעת ריכוזי הסוכרוז של השברים הבודדים לאחר צנטריפוגה באמצעות רפרקטומטר גילתה כי שיפוע הצעד אכן הפך כמעט ליניארי לאחר 12 שעות של צנטריפוגה במהירות של 200,000 x גרם (איור 3).

חשיבותה של סוניקציה קלה ניכרת בתוצאות מייצגות אלה. בתנאי סוניקציה מתונים (איור 4A), סמן הקרום החיצוני המיטוכונדריאלי Tom40 הועשר בשברים המוקדמים בעלי צפיפות נמוכה (שבר מס' 4) וכמעט ולא הועשר בשברים המאוחרים יותר. סמן הקרום הפנימי המיטוכונדריאלי Tim17 היה מרוכז בשברים בעלי צפיפות גבוהה (שבר מס' 17). לעומת זאת, חלבון אתר המגע Mic60 הצטבר בשברים של ריכוז סוכרוז ביניים (שבר מס' 12-14), דבר המעיד על יצירה מוצלחת והפרדה לאחר מכן של שלפוחיות הממברנה השונות. לעומת זאת, בתנאי סוניקציה קשים יותר, סמן הקרום החיצוני של המיטוכונדריה Tom40 יכול היה להתגלות בשברים נמוכים יותר של השיפוע (שבר מס' 14 ושבר מס' 17, איור 4B). נוסף על כך, נמצאה כמות משמעותית של Tim17 בשברים של צפיפות ביניים (שבר מס' 13 ושבר מס' 14, איור 4B). הצטברות לא ספציפית של סמני קרום חיצוניים ופנימיים בשברים של צפיפות ביניים מצביעה על היווצרות מלאכותית של ממברנות מעורבות, המעכבות את זיהוי החלבונים המועמדים.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי. ייצוג סכמטי של מיטוכונדריה כדי להראות את התאים, הממברנות ומיקומי החלבונים השונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זרימת עבודה של מקטע מיטוכונדריאלי כדי לבודד חלבונים באתר מגע. סקירה סכמטית של התהליך המתואר בפרוטוקול. (1) המיטוכונדריה שבודדו טריים היו (2) נפוחים אוסמוטית (3) ואז התכווצו. (4) המיטוכונדריה המכווצים התנגדו לסוניקציה קלה כדי ליצור שלפוחיות כניעה. (5) תערובת השלפוחית רוכזה והועמסה על שיפוע מדרג סוכרוז. (6) באמצעות צנטריפוגה הועשרו שלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה בריכוז סוכרוז נמוך, בועיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה בריכוז סוכרוז גבוה, ובועיות המגע המכילות בועיות בריכוז סוכרוז בינוני. קיצורים: MIM, קרום פנימי מיטוכונדריאלי; אמא, קרום חיצוני מיטוכונדריאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יצירת שיפוע ליניארי באמצעות צנטריפוגה. במקביל הוכנו שני שיפועים הדרגתיים (1.3 מטר, 1.13 מטר, לאחר מכן 1.02 מטר, 0.96 מטר ו-0.8 מטר ב-20 מ"מ MOPS ו-0.5 מ"מ EDTA, pH 7.4), ו-1 מ"ל של 0.6 מ"ל סוכרוז ב-20 מילימטר MOPS ו-0.5 מ"ל EDTA, pH 7.4, הועמס על שני השיפועים. השיפועים היו נתונים לצנטריפוגה במהירות של 200,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות ונקטפו ב-17 שברים כל אחד. יכולת השחזור של השיטה נבדקה על ידי קביעת ריכוז הסוכרוז של השברים הבודדים של שיפועים בודדים באמצעות רפרקטומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: בידוד חלבוני אתר מגע עם פולס על-קולי מוגדר היטב. (א,ב) מיטוכונדריית שמרים טריים שבודדו עברו טיפול אוסמוטי ונחשפו לסוניקציה. השלפוחיות שנוצרו הופרדו באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות ציפה סוכרוז. השיפוע היה מקוטע, והחלבונים בשברים השונים היו נתונים למשקעים TCA. התפלגות חלבוני הסמן עבור הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה (Tom40), הקרום הפנימי של המיטוכונדריה (Tim17) ואתרי המגע (Mic60) נותחו על ידי אימונובלוטציה באמצעות הנוגדנים שצוינו. (A) סוניקציה קלה (4 x 30 שניות, משרעת של 10%) הביאה להפרדה ברורה בין חלבוני הממברנה החיצונית (שברים בצפיפות נמוכה) וחלבוני הממברנה הפנימית (שברים בצפיפות גבוהה). בנוסף, חלבון אתר המגע Mic60 הועשר בהצלחה בשברים של צפיפות ביניים. (B) סוניקציה נוקשה יותר (4 x 30 שניות, 20% משרעת) הביאה ליצירת שלפוחיות היברידיות, ולכן לא אפשרה הפרדה ברורה של אתרי מגע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תת-שבירה מיטוכונדריאלית היא ניסוי מסובך עם מספר שלבים מורכבים ביותר. לכן, כיוונו לשפר עוד יותר, ובמידה מסוימת, לפשט את השיטה המבוססת שלנו32. כאן, האתגרים היו הדרישה לציוד מסובך ומיוחד מאוד, שהם לעתים קרובות מבנים בודדים, ואת צריכת הזמן והאנרגיה העצומה. לשם כך ניסינו להסיר את המשאבות והקונסטרוקציות הבודדות ששימשו ליציקה ולקציר של השיפוע הליניארי ושינינו לשיפוע מדרגה. חשוב לציין שהבנו שלפחות כאשר מכינים אותו כפי שמתואר כאן, השיפוע הופך ליניארי במהלך הצנטריפוגה, מה שהופך אותו לתחליף תקף. שיטה זו (i) מבטלת את הצורך במערבל שיפוע, ובכך מפחיתה את הציוד הנדרש; (2) חוסך זמן ביום הניסוי, שכן ניתן להכין את השיפוע מראש; ו-(iii) ניתן לשחזור גבוה (איור 3) כאשר מכינים אותו בהתאם לשיטה המתוארת, הכוללת הקפאת השלבים הבודדים לפני הנחת השכבה הבאה למעלה. מעברי צבע אלה ניתנים גם לאחסון ללא הגבלת זמן בטמפרטורה של -20°C. בנוסף, גם ההעמסה של שיפוע השקיעה המוצע כאן קלה יותר מאשר הצורך בשכבת תערובת השלפוחית מתחת לשיפוע, כמתואר בשיטות דומות 9,32. טעינת שיפוע צף דורשת מזרק עם צינורית ארוכה כדי לעבור את השיפוע שכבר יצוק. צעד זה היה תמיד בעייתי בגלל הסיכון להרוס את השיפוע. יתרון נוסף של שיטה זו הוא זמן הצנטריפוגה הנמוך יותר של 12 שעות לעומת 24 שעות32, מה שמקטין מאוד את הזמן והאנרגיה הנדרשים לשיטה זו. ההיתכנות והשחזור של ההליך המשופר המתואר כאן מודגשים על ידי הזיהוי האחרון של אתר הקשר הבלתי תלוי MICOS שנוצר על ידי Cqd1 ו- Por1-Om1428.

עם זאת, ניסוי זה עדיין מורכב מאוד. על מנת להשיג תוצאות אופטימליות, ישנם מספר קריטריונים חיוניים שיש לקחת בחשבון בעת יישום פרוטוקול זה.

אחד ההיבטים החשובים ביותר הוא איכות המיטוכונדריה. אלה צריכים להיות מבודדים טריים. לכן, טיפוח שמרים, כמו גם בידוד של מיטוכונדריה צריך להילקח בחשבון בעת תכנון ההליך. טיפול עדין במיטוכונדריה במהלך הבידוד ימנע את שיבוש הממברנות, כאשר חשוב גם לעכב פרוטאזות עם ריכוז מתאים של PMSF או לחילופין קוקטיילים מעכבי פרוטאז זמינים מסחרית34.

צעד חשוב נוסף, ואחד ההיבטים הקריטיים ביותר של ההליך, הוא הסוניקציה. חשוב לציין, ניתן להעריך את העוצמה הנכונה של הדופק העל-קולי על ידי הצליל שנוצר באמצעות מערבול המתלה (ראה וידאו). עם זאת, התנאים האופטימליים צריכים להיקבע באופן ניסיוני עבור כל מערך ניסיוני, לא רק על בסיס מותגים ודגמים שונים, אלא גם מכונות שונות של אותו דגם. יש לציין כי פירוק וניקוי החוד משפיעים גם על עוצמת הסוניקציה, ובכך מבצעים התאמה מחדש של התנאים הדרושים. ההמלצה בפרוטוקול היא גם להשתמש בתא רוזטה ליעילות גבוהה יותר, אך כלי שיט אחרים עשויים לעבוד גם כן. סוניקציה קשה מדי תוביל להיווצרות שלפוחיות מעורבות באופן מלאכותי. זה יגרום להצטברות חזקה של חלבוני קרום פנימיים וחיצוניים בשברים של צפיפות ביניים, שיכולה להיות אפילו חזקה יותר, כמו בדוגמה המוצגת (איור 4B). אם זה קורה, יש להפחית את המשרעת או הזמן של הסוניקציה. עם זאת, בעיות יכולות להתעורר גם כאשר הסוניקציה אינה אינטנסיבית מספיק. במקרה זה, התפוקה של השלפוחיות שנוצרו עשויה להיות נמוכה מכדי לזהות חלבונים על ידי אימונובלוטינג, ולכן יהיה צורך להגדיל את המשרעת, הזמן או מחזורי הסוניקציה.

לבסוף, השיפוע חשוב להפרדת מיני השלפוחית השונים שנוצרו. עם זאת, המקסימום והמינימום האופטימליים של שיפוע הסוכרוז, כמו גם מספר השלבים, יכולים להשתנות גם בהתאם להגדרה האישית. כאן, שיפוע בן חמישה שלבים עם מקסימום של 1.3 M סוכרוז ומינימום של 0.8 M סוכרוז הספיק להפרדה נראית לעין וניתנת לשחזור של שלפוחיות המכילות את אתר המגע משלפוחיות הקרום הפנימי והחיצוני של המיטוכונדריה. בהתחלה, חיוני לבחור תנאים שמשאירים שברים ריקים מעל שלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה ומתחת לשלפוחיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה כדי להבטיח הפרדה נכונה. דחיסת השברים העליונים או התחתונים עלולה להוביל לחפצים. בשלבים מאוחרים יותר, כאשר ידועה הטוחנת המדויקת של הסוכרוז שבה יצטברו שלפוחיות הקרום הפנימי והחיצוני, ניתן לייעל את השיפוע על ידי הגדלה או הקטנה של ריכוזי הסוכרוז המרביים והמינימליים כדי לשפר את הרזולוציה בין הממברנה הפנימית, הקרום החיצוני ואתרי המגע. יש לציין כי תנאי הגידול של שמרים יכולים להשפיע על התנהגות השלפוחיות הנוצרות בצנטריפוגות צפיפות. כאן, השמרים גודלו על מדיום YP עשיר (1% [w/v] תמצית שמרים, 2% [w/v] פפטון, pH 5.5) המכיל גליצרול (3% [v/v]) כמקור פחמן ב 30 ° C34,44. תנאי גדילה אחרים עשויים לשנות את הרכב החלבונים והשומנים של המיטוכונדריה, ובכך את צפיפות השלפוחיות שנוצרו.

השיטה המתוארת מספקת דרך אמינה וניתנת לשחזור לבידוד אתרי קשר. עם זאת, זיהוי הרכב החלבונים של אתר המגע המתאים (רכיבי הממברנה הפנימית והחיצונית) דורש בדיקות נוספות כגון משקעים חיסוניים, אולי בשילוב עם ספקטרומטריית מסות. לשם כך יש צורך בנוגדנים ספציפיים ובאורגניזמי מודל המבטאים גרסאות מתויגות של המועמדים לחלבון. בעת שימוש בשמרים כאורגניזם מודל, ניתן להשיג מועמדים לחלבון בקלות בשל מגוון שיטות השינוי הגנטי הזמינות וקיומן של ספריות מתויגות45,46,47. לכן, החלטנו לבסס ולמטב פרוטוקול זה עבור מיטוכונדריה שמרים. למרות שניתן יהיה להתאים את השיטה למיטוכונדריה המבודדת מאורגניזמים אחרים, לשמרים יש יתרון בכך שהם מאפשרים להשיג כמויות גבוהות של מיטוכונדריה בצורה זולה ומהירה. יתר על כן, שימוש בשמרים כאורגניזם מודל לאיסוף התוצאות הראשוניות הוא דרך מוכחת היטב לזהות קומפלקסים ותהליכים חלבוניים שנשמרים באיקריוטים גבוהים יותר עד לבני אדם. כאמור, לאחר זיהוי ואפיון MICOS בשמרים 9,10,11, הוכח כי MICOS נשמר בצורה ובתפקוד באיקריוטים גבוהים21. Cqd1 ו- Por1, רכיבים של אתר הקשר הבלתי תלוי MICOS28 שהתגלה לאחרונה, נשמרים גם הם, מה שמצביע על כך שאתר קשר זה קיים גם באיקריוטים גבוהים יותר.

החשיבות של מחקר מתמשך באתרי קשר אלה מודגשת על ידי הקשרים של MICOS למחלות נוירודגנרטיביות שונות 18,48,49,50,51,52,53,54. הזרחן הנכון של Mic60 על ידי PINK1 נקשר לתחזוקת צמתי קריסטה בדרוזופיליה, ולכן מסלול זה, הנשמר לבני אדם, עשוי להיות קשור למחלת פרקינסון48. יתר על כן, מוטציה נקודתית בתת-היחידה האנושית MICOS Mic14 גורמת לערעור היציבות של MICOS ולשינוי הבא של מבנה העל המיטוכונדריאלי, אשר נמצאו בחולים הסובלים מדמנציה פרונטוטמפורלית וטרשת אמיוטרופית צידית 50,51,52,53,54. מאחר ש-Mic14 נשמר משמרים לבני אדם, מחקרים נוספים על חלבון זה יכולים להתבצע באמצעות שמרים כאורגניזם מודל. מחקר בסיסי זה עשוי להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים של מחלות אלה, אשר יכול להאיץ את הפיתוח של טיפול יעיל וטיפולים עבורם. יתר על כן, התגליות האחרונות של אתרי קשר נוספים שאינם תלויים ב- MICOS27,28 מצביעים על כך שתחום זה עדיין צומח. לכן, הפרוטוקול המוצג כאן עשוי לסייע בקידום מחקר מבטיח ומרתק זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

M.E.H. מודה ל- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), פרויקט מספר 413985647, לתמיכה כספית. המחברים מודים לד"ר מיכאל קיבלר, אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן, מינכן, על תמיכתו הנדיבה והנרחבת. אנו אסירי תודה לוולטר נויפרט על תרומתו המדעית, הדיונים המועילים וההשראה המתמשכת שלו. J.F. מודה לבית הספר למוסמכים במדעי החיים במינכן (LSM) על התמיכה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm Beckman Instruments, Germany 344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm Beckman Instruments, Germany 363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g Beckman Instruments, Germany 363055
Abbe refractometer Zeiss, Germany discontinued,
any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller Brandtech, USA BR26320 discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL DWK Life Science, Germany C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D Branson Ultrasonics, USA FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP Branson Ultrasonics, USA 101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell Branson Ultrasonics, USA 15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26 Beckman Instruments, Germany B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra Beckman Instruments, Germany 8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail Roche, Switzerland 11697498001
D-Sorbit Roth, Germany 6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) Roth, Germany 8043
Erlenmeyer flask, 100 mL Roth, Germany X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 Hirschmann, Germany 1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 Hirschmann, Germany 1180153
ice bath neoLab, Germany  S12651
Magnetic stirrer RCT basic IKA-Werke GmbH, Germany Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) Gerbu, Germany 1081
MyPipetman Select P1000 Gilson, USA FP10006S
MyPipetman Select P20 Gilson, USA FP10003S
MyPipetman Select P200 Gilson, USA FP10005S
Omnifix 1 mL Braun, Germany 4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Serva, Germany 32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm Braun, Germany 4022495052414
stirring bar, 15 mm VWR, USA 442-0366
Sucrose Merck, Germany S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Instruments, Germany 331362
Test tubes Eppendorf, Germany 3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel VWR, USA 432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip VWR, USA 432-0212
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma Aldrich, Germany 33731 discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS Roth, Germany 4855

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

Tags

אתרי מגע מיטוכונדריאליים מיטוכונדריה תאים אאוקריוטים ייצור אנרגיה אשכולות ברזל-גופרית שומנים חלבונים חציצה Ca2+ אפופטוזיס תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מחלות אנושיות סרטן סוכרת ניוון עצבי מעטפת מיטוכונדריאלית שני קרומים אתרי מגע חלבוניים קרום פנימי קרום חיצוני מיטוכונדריה של סקרומיצס (Saccharomyces cerevisiae) חלבונים באתר מגע אתר מגע מיטוכונדריאלי וקומפלקס מערכת ארגון כריסטאה (MICOS) שמרים לבני אדם Cqd1 ו Por1-Om14 קומפלקס
שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khosravi, S., Frickel, J., Harner,… More

Khosravi, S., Frickel, J., Harner, M. E. An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites. J. Vis. Exp. (196), e65444, doi:10.3791/65444 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter