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Biochemistry

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65444
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
* These authors contributed equally

Summary

I siti di contatto mitocondriali sono complessi proteici che interagiscono con le proteine della membrana interna ed esterna mitocondriale. Questi siti sono essenziali per la comunicazione tra le membrane mitocondriali e, quindi, tra il citosol e la matrice mitocondriale. In questo articolo, descriviamo un metodo per identificare i candidati che si qualificano per questa specifica classe di proteine.

Abstract

I mitocondri sono presenti praticamente in tutte le cellule eucariotiche e svolgono funzioni essenziali che vanno ben oltre la produzione di energia, ad esempio la sintesi di cluster ferro-zolfo, lipidi o proteine, il tamponamento di Ca2+ e l'induzione dell'apoptosi. Allo stesso modo, la disfunzione mitocondriale provoca gravi malattie umane come il cancro, il diabete e la neurodegenerazione. Per svolgere queste funzioni, i mitocondri devono comunicare con il resto della cellula attraverso il loro involucro, che consiste di due membrane. Pertanto, queste due membrane devono interagire costantemente. I siti di contatto proteici tra la membrana mitocondriale interna ed esterna sono essenziali in questo senso. Finora sono stati identificati diversi siti di contatto. Nel metodo qui descritto, i mitocondri di Saccharomyces cerevisiae vengono utilizzati per isolare i siti di contatto e, quindi, identificare i candidati che si qualificano per le proteine del sito di contatto. Abbiamo usato questo metodo per identificare il complesso MICOS (Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System), uno dei principali complessi di formazione del sito di contatto nella membrana interna mitocondriale, che si conserva dal lievito all'uomo. Recentemente, abbiamo ulteriormente migliorato questo metodo per identificare un nuovo sito di contatto costituito da Cqd1 e dal complesso Por1-Om14.

Introduction

I mitocondri svolgono una varietà di funzioni diverse negli eucarioti, la più nota delle quali è la produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Altre funzioni includono la produzione di cluster ferro-zolfo, la sintesi lipidica e, negli eucarioti superiori, la segnalazione di Ca2+ e l'induzione dell'apoptosi 1,2,3,4. Queste funzioni sono indissolubilmente legate alla loro complessa ultrastruttura.

L'ultrastruttura mitocondriale è stata descritta per la prima volta al microscopio elettronico5. È stato dimostrato che i mitocondri sono organelli piuttosto complessi costituiti da due membrane: la membrana esterna mitocondriale e la membrana interna mitocondriale. Pertanto, da queste membrane si formano due compartimenti acquosi: lo spazio intermembrana e la matrice. La membrana interna mitocondriale può essere ulteriormente suddivisa in diverse sezioni. La membrana perimetrale interna rimane in prossimità della membrana esterna e le cristae formano invaginazioni. Le cosiddette giunzioni crista collegano la membrana perimetrale interna e le cristae (Figura 1). Inoltre, le micrografie elettroniche dei mitocondri osmoticamente ridotti rivelano che esistono siti in cui le membrane mitocondriali sono strettamente collegate 6,7. Questi cosiddetti siti di contatto sono formati da complessi proteici che attraversano le due membrane (Figura 1). Si ritiene che questi siti di interazione siano essenziali per la vitalità cellulare a causa della loro importanza per la regolazione della dinamica mitocondriale e dell'ereditarietà, nonché per il trasferimento di metaboliti e segnali tra il citosol e la matrice8.

Il complesso MICOS nella membrana interna mitocondriale è probabilmente il complesso di formazione del sito di contatto meglio caratterizzato e più versatile. MICOS è stato descritto nel lievito nel 2011 ed è costituito da sei subunità 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 e Mic10. Questi formano un complesso di circa 1,5 MDa che si localizza alle giunzionicrista 9,10,11. La delezione di una delle due subunità principali, Mic10 o Mic60, porta all'assenza di questo complesso 9,11, il che significa che queste due subunità sono essenziali per la stabilità di MICOS. È interessante notare che MICOS forma non solo uno, ma più siti di contatto con varie proteine e complessi della membrana esterna mitocondriale: il complesso TOM 11,12, il complesso TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, il complesso Fzo1-Ugo19, Por1 10, OM45 10 e Miro 17. Ciò indica fortemente che il complesso MICOS è coinvolto in vari processi mitocondriali, come l'importazione di proteine, il metabolismo dei fosfolipidi e la generazione dell'ultrastruttura mitocondriale18. Quest'ultima funzione è probabilmente la funzione principale di MICOS, in quanto l'assenza del complesso MICOS indotta attraverso la delezione di MIC10 o MIC60 porta ad un'ultrastruttura mitocondriale anomala che manca praticamente completamente di cristae regolari. Invece, le vescicole della membrana interna senza connessione alla membrana di confine interna si accumulano19, 20. È importante sottolineare che MICOS è conservato nella forma e nella funzione dal lievito all'uomo21. L'associazione delle mutazioni nelle subunità MICOS con gravi malattie umane sottolinea anche la sua importanza per gli eucarioti superiori22,23. Sebbene MICOS sia altamente versatile, devono esistere ulteriori siti di contatto (sulla base delle nostre osservazioni non pubblicate). Infatti, sono stati identificati diversi altri siti di contatto, ad esempio i meccanismi di fusione mitocondriale Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1, che è coinvolto nella biosintesi del fosfolipide mitocondriale specifico cardiolipina 27. Recentemente, abbiamo migliorato il metodo che ci ha portato all'identificazione di MICOS per identificare Cqd1 come parte di un nuovo sito di contatto formato con il complesso di membrana esterna Por1-Om1428. È interessante notare che questo sito di contatto sembra anche essere coinvolto in molteplici processi come l'omeostasi della membrana mitocondriale, il metabolismo dei fosfolipidi e la distribuzione del coenzima Q28,29.

Qui, abbiamo usato una variazione del frazionamento dei mitocondri 9,30,31,32,33 precedentemente descritto. Il trattamento osmotico dei mitocondri porta alla rottura della membrana esterna mitocondriale e ad un restringimento dello spazio della matrice, lasciando le due membrane solo in stretta vicinanza nei siti di contatto. Ciò consente la generazione di vescicole costituite esclusivamente da membrana esterna mitocondriale o membrana interna mitocondriale o in siti di contatto contenuti di entrambe le membrane attraverso una lieve sonicazione. A causa della membrana interna mitocondriale che possiede un rapporto proteine-lipidi molto più elevato, le vescicole della membrana interna mitocondriale presentano una densità maggiore rispetto alle vescicole della membrana esterna mitocondriale. La differenza di densità può essere utilizzata per separare le vescicole di membrana attraverso la centrifugazione a gradiente di densità galleggiante del saccarosio. Pertanto, le vescicole della membrana esterna mitocondriale si accumulano a basse concentrazioni di saccarosio, mentre le vescicole della membrana interna mitocondriale si arricchiscono ad alte concentrazioni di saccarosio. Le vescicole contenenti i siti di contatto si concentrano a concentrazioni intermedie di saccarosio (Figura 2). Il seguente protocollo descrive in dettaglio questo metodo migliorato, che richiede attrezzature, tempo ed energia meno specializzate rispetto al nostroprecedente 32, e fornisce uno strumento utile per l'identificazione di possibili proteine del sito di contatto.

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Protocol

1. Tamponi e soluzioni madre

  1. Preparare una soluzione di acido 1 M di acido 3-morfolinopropano-1-solfonico (MOPS) in acqua deionizzata, pH 7,4. Conservare a 4 °C.
  2. Preparare 500 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in acqua deionizzata, pH 8,0. Conservare a temperatura ambiente.
  3. Preparare il sorbitolo 2,4 M in acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave.
  4. Preparare il saccarosio 2,5 M in acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave.
  5. Preparare 200 mM di fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) in isopropanolo. Conservare a −20 °C.
    ATTENZIONE: Il PMSF è tossico se ingerito e provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Non respirare la polvere e indossare guanti e occhiali protettivi.
  6. Preparare l'acido tricloroacetico (TCA) al 72% in acqua deionizzata. Conservare a 4 °C.
    ATTENZIONE: Il TCA può causare irritazione respiratoria, gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Non respirare la polvere e indossare guanti e occhiali protettivi.
  7. Preparare il tampone SM: 20 mM MOPS e 0,6 M di sorbitolo, pH 7,4.
  8. Preparare il tampone di rigonfiamento: 20 mM di MOPS, 0,5 mM di EDTA, 1 mM di PMSF e cocktail di inibitori della proteasi, pH 7,4.
  9. Preparare i tamponi gradiente di saccarosio: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M e 1,3 M di saccarosio in 20 mM di MOPS e 0,5 mM di EDTA, pH 7,4.
    NOTA: Tutti i tamponi possono essere conservati a 4 °C; tuttavia, si consiglia di conservare i tamponi contenenti saccarosio a una temperatura di -20 °C per evitare la crescita di funghi. Gli inibitori della proteasi devono essere aggiunti appena prima dell'uso.

2. Generazione di vescicole sottocondriali

  1. Isolare i mitocondri del lievito grezzo fresco secondo i protocolli stabiliti34,35.
    NOTA: Per questo esperimento, i mitocondri sono stati isolati da Saccharomyces cerevisiae. Non è necessaria la generazione di mitocondri puri a gradiente privi di altri organelli.
  2. Risospendere 10 mg di mitocondri appena isolati in tampone SM da 1,6 mL (4 °C) mediante pipettaggio (Figura 2, fase 1).
  3. Trasferire la sospensione mitocondriale in un matraccio di Erlenmeyer preraffreddato da 100 mL.
  4. Aggiungere lentamente 16 mL di tampone di rigonfiamento utilizzando una pipetta di vetro da 20 mL. Applicare una leggera agitazione costante sul ghiaccio durante l'aggiunta. Questo trattamento osmotico provoca l'assorbimento dell'acqua nello spazio della matrice. Il gonfiore della membrana interna mitocondriale interromperà la membrana esterna. Tuttavia, entrambe le membrane rimarranno in contatto nei siti di contatto9 (Figura 2, passaggio 2).
  5. Incubare i campioni con una leggera agitazione costante per 30 minuti su ghiaccio.
  6. Aggiungere lentamente 5 mL di soluzione di saccarosio 2,5 M utilizzando una pipetta di vetro da 5 mL per aumentare la concentrazione di saccarosio nei campioni a circa 0,55 M. Questo trattamento osmotico provoca un efflusso d'acqua dalla matrice36. Il restringimento della membrana interna ha lo scopo di massimizzare la sua distanza dai frammenti residui della membrana esterna. Ciò riduce la probabilità di generare vescicole ibride artificiali delle membrane interne ed esterne attraverso la sonicazione (Figura 2, passaggio 3).
  7. Incubare i campioni sotto leggera agitazione per 15 minuti su ghiaccio.
  8. Sottoporre i mitocondri a sonicazione per generare vescicole di membrana sottocondriali (Figura 2, passaggio 4).
    1. Trasferire la sospensione mitocondriale in una cella a rosetta preraffreddata.
    2. Sonicare la sospensione mitocondriale con un'ampiezza del 10% per 30 s mentre si raffredda la cella a rosetta in un bagno di ghiaccio.
    3. Far riposare la sospensione per 30 secondi in un bagno di ghiaccio.
    4. Ripetere i passaggi 2.8.2 e 2.8.3 altre tre volte.
      NOTA: Le condizioni di sonicazione variano a seconda del sonicatore utilizzato. L'ottimizzazione sarà necessaria per le singole macchine. Una sonicazione troppo dura porterà alla formazione artificiale di vescicole costituite da membrane mitocondriali interne ed esterne.

3. Separazione delle vescicole sottocondriali

  1. Separare le vescicole generate dai mitocondri intatti rimanenti mediante centrifugazione a 20.000 x g per 20 minuti a 4 °C. I mitocondri intatti pelletteranno mentre le vescicole rimarranno nel surnatante.
  2. Concentrare la miscela di vescicole.
    1. Trasferire il surnatante in provette di ultracentrifugazione fresche.
    2. Caricare un cuscino di 0,3 mL di soluzione di saccarosio 2,5 M sul fondo della provetta utilizzando una siringa da 1 mL dotata di cannula da 0,8 mm x 120 mm.
    3. Centrifugare a 118.000 x g per 100 minuti a 4 °C.
      NOTA: In questo caso è stato utilizzato un rotore a benna oscillante con un raggio massimo di 153,1 mm. Le condizioni di centrifugazione dipendono fortemente dal rotore e dovranno essere adattate quando si utilizza un altro rotore.
  3. Le vescicole appariranno come un disco sulla parte superiore del cuscino di saccarosio dopo la centrifugazione. Scartare circa il 90% del surnatante. A questo punto, raccogliere le vescicole concentrate risospendendole nel tampone rimanente, compreso il saccarosio da 2,5 M, mediante pipettaggio su e giù. Trasferire la sospensione in un omogeneizzatore Dounce ghiacciato.
  4. Omogeneizzare la sospensione con almeno 10 colpi utilizzando un vasaio in politetrafluoroetilene.
  5. Preparare il gradiente di saccarosio.
    1. Per un gradiente a gradini di 11 mL con cinque passaggi (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M e 0,8 M di saccarosio in 20 mM di MOPS e 0,5 mM di EDTA, pH 7,4), ogni strato ha 2,2 mL di soluzione di saccarosio.
      NOTA: Si consiglia un rifrattometro per misurare e regolare le concentrazioni di saccarosio; Tuttavia, non è essenziale. Applicare 10 μL di tampone al rifrattometro e rilevare i rispettivi indici di rifrazione. Il calcolo della concentrazione di saccarosio è il seguente:
      Equation 1
      1,3333 rappresenta l'indice di rifrazione dell'acqua. 0,048403 è un indice di conversione specifico del saccarosio ottenuto dalla scala lineare della rifrazione molare alla concentrazione di saccarosio in soluzioni acquose 37.
    2. Aggiungere la massima concentrazione di saccarosio alla provetta di centrifugazione e mettere la provetta a -20 °C. Attendere che lo strato sia completamente congelato prima di applicare quello successivo. Procedere di conseguenza fino all'aggiunta dell'ultimo strato e conservare i gradienti a −20 °C.
      NOTA: Ricordarsi di trasferire i gradienti congelati a 4 °C quando si inizia l'esperimento per consentire lo scongelamento dei gradienti. Ci vorranno circa 3 ore. Per la centrifugazione è stato utilizzato un rotore a secchiello oscillante con una capacità di 13,2 mL. Quando si utilizza un rotore diverso, i volumi del passo di gradiente devono essere adattati di conseguenza.
  6. Misurare la concentrazione di saccarosio dei campioni utilizzando un rifrattometro. Se non c'è accesso a un rifrattometro, si potrebbe in alternativa supporre che la concentrazione di saccarosio sia di 2 M. Questa presunta concentrazione di saccarosio sarà quindi la base per il passo successivo.
  7. Regolare la concentrazione di saccarosio a 0,6 M aggiungendo una quantità appropriata di 20 mM MOPS, 0,5 mM di EDTA, 1 mM di PMSF e cocktail di inibitori della proteasi, pH 7,4. Se la concentrazione di saccarosio è stimata a 2 M invece di essere misurata, si consiglia di verificare se la concentrazione è sufficientemente bassa dopo l'aggiustamento. Applicare una piccola aliquota del campione (ca. 50 μL) sopra 200 μL di saccarosio 0,8 M in una provetta. Il campione deve rimanere sopra il saccarosio 0,8 M.
  8. Caricare i campioni (circa 1 mL) sopra il gradiente di saccarosio (mantenere il 10% per riferimento futuro). Un pipettaggio accurato è importante per evitare il disturbo del gradiente (Figura 2, fase 5).
  9. Separare le vescicole mediante centrifugazione a 200.000 x g e 4 °C per 12 ore. Se possibile, impostare la centrifuga su un'accelerazione e una decelerazione lente per evitare il disturbo del gradiente (Figura 2, passaggio 6).
    NOTA: In questo caso è stato utilizzato un rotore a benna oscillante con un raggio massimo di 153,1 mm. Le condizioni di centrifugazione dipendono fortemente dal rotore e dovranno essere adattate quando si utilizza un altro rotore.
  10. Prelevare il gradiente dall'alto verso il basso in frazioni da 700 μL utilizzando una pipetta da 1 mL. Ciò si tradurrà in 17 frazioni, che consentono una risoluzione sufficiente.

4. Analisi delle vescicole sottocondriali

  1. Concentrare le proteine sottoponendo ciascuna frazione a due precipitazioni di TCA eseguite in sequenza38 per preparare i campioni SDS-PAGE.
    1. Aggiungere 200 μL di TCA al 72% alle singole frazioni e mescolare fino a ottenere una soluzione omogenea. Incubare le frazioni per 30 minuti su ghiaccio e pellettizzare le proteine precipitate mediante centrifugazione a 20.000 x g e 4 °C per 20 minuti. Eliminare il surnatante, aggiungere 500 μL di soluzione di TCA al 28 %, mescolare bene e ripetere la fase di centrifugazione.
    2. Lavare i pellet con 1 mL di acetone (−20°C) e centrifugare per 10 minuti a 20.000 x g e 4 °C. Scartare il surnatante e lasciare asciugare i pellet all'aria. Risospendere i pellet in 60 μL di tampone SDS e incubare i campioni per 5 minuti a 95 °C.
      NOTA: Una grande quantità di saccarosio rimarrà, in particolare nelle frazioni ad alta densità, dopo la prima precipitazione TCA. Questo verrà rimosso attraverso l'ulteriore precipitazione TCA.
  2. Analizzare 20 μL di ciascuna frazione mediante SDS-PAGE39 e immunoblotting40,41,42,43.

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Representative Results

È relativamente facile separare le membrane mitocondriali interne ed esterne. Tuttavia, la generazione e la separazione delle vescicole contenenti il sito di contatto sono molto più difficili. A nostro avviso, due passaggi sono critici ed essenziali: le condizioni di sonicazione e il gradiente utilizzato.

Di solito, si pensa che i gradienti lineari abbiano una risoluzione migliore rispetto ai gradienti a gradini. Tuttavia, la loro produzione riproducibile è noiosa e richiede attrezzature speciali. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo per generare un gradiente di passo con differenze relativamente piccole tra i singoli passi (vedi passaggio 3.5). Abbiamo ipotizzato che il gradiente a gradini sarebbe stato bilanciato durante la centrifugazione, risultando in un gradiente quasi lineare. Sorprendentemente, la determinazione delle concentrazioni di saccarosio delle singole frazioni dopo centrifugazione utilizzando un rifrattometro ha rivelato che il gradiente di gradino è effettivamente diventato virtualmente lineare dopo 12 ore di centrifugazione a 200.000 x g (Figura 3).

L'importanza di una lieve sonicazione è evidente in questi risultati rappresentativi. In condizioni di sonicazione lieve (Figura 4A), il marcatore mitocondriale della membrana esterna Tom40 è stato arricchito nelle prime frazioni a bassa densità (Frazione n. 4) ed è stato praticamente assente in quelle successive. Il marcatore mitocondriale della membrana interna Tim17 era concentrato in frazioni ad alta densità (frazione n. 17). Al contrario, la proteina del sito di contatto Mic60 si è accumulata in frazioni di concentrazione intermedia di saccarosio (frazione n. 12-14), indicando la generazione riuscita e la successiva separazione delle varie vescicole di membrana. Al contrario, con condizioni di sonicazione più difficili, il marcatore della membrana esterna mitocondriale Tom40 potrebbe essere rilevato in frazioni inferiori del gradiente (frazione n. 14 e frazione n. 17, Figura 4B). Inoltre, c'era una quantità significativa di Tim17 in frazioni di densità intermedia (Frazione n. 13 e Frazione n. 14, Figura 4B). L'accumulo aspecifico di marcatori di membrana esterna e interna in frazioni di densità intermedia indica la formazione artificiale di membrane miste, che inibisce l'identificazione di proteine candidate.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica dell'ultrastruttura mitocondriale. Una rappresentazione schematica di un mitocondrio per mostrare i diversi compartimenti, membrane e posizioni delle proteine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Flusso di lavoro del frazionamento mitocondriale per isolare le proteine del sito di contatto. Una panoramica schematica del processo descritto nel protocollo. I mitocondri (1) appena isolati erano (2) gonfi osmoticamente (3) e poi rimpiccioliti. (4) I mitocondri rimpiccioliti sono stati sottoposti a una lieve sonicazione per generare vescicole sottocondriali. (5) La miscela di vescicole è stata concentrata e caricata su un gradiente a gradini di saccarosio. (6) Attraverso la centrifugazione le vescicole della membrana esterna mitocondriale sono state arricchite a una bassa concentrazione di saccarosio, le vescicole della membrana interna mitocondriale ad un'alta concentrazione di saccarosio e le vescicole contenenti il sito di contatto a una concentrazione intermedia di saccarosio. Abbreviazioni: MIM, membrana interna mitocondriale; MOM, membrana esterna mitocondriale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Generazione di un gradiente lineare mediante centrifugazione. Sono stati preparati in parallelo gradienti a due stadi (1,3 M, 1,13 M, poi 1,02 M, 0,96 M e 0,8 M in 20 mM MOPS e 0,5 mM EDTA, pH 7,4) e 1 mL di saccarosio 0,6 M in 20 mM MOPS e 0,5 mM EDTA, pH 7,4, è stato caricato su entrambi i gradienti. I gradienti sono stati sottoposti a centrifugazione a 200.000 x g e 4°C per 12 h e raccolti in 17 frazioni ciascuno. La riproducibilità del metodo è stata testata determinando la concentrazione di saccarosio delle singole frazioni dei singoli gradienti utilizzando un rifrattometro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Isolamento delle proteine del sito di contatto con un impulso ultrasonico ben definito. (A,B) I mitocondri del lievito appena isolati sono stati sottoposti a trattamento osmotico ed esposti alla sonicazione. Le vescicole generate sono state separate utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità galleggiante del saccarosio. Il gradiente è stato frazionato, e le proteine nelle varie frazioni sono state sottoposte a precipitazione TCA. La distribuzione delle proteine marcatrici per la membrana esterna mitocondriale (Tom40), la membrana interna mitocondriale (Tim17) e i siti di contatto (Mic60) è stata analizzata mediante immunoblotting utilizzando gli anticorpi indicati. (A) Una lieve sonicazione (4 x 30 s, ampiezza del 10%) ha portato a una netta separazione delle proteine della membrana esterna (frazioni a bassa densità) e delle proteine della membrana interna (frazioni ad alta densità). Inoltre, la proteina del sito di contatto Mic60 è stata arricchita con successo in frazioni di densità intermedia. (B) Una sonicazione più dura (4 x 30 s, ampiezza del 20%) ha portato alla generazione di vescicole ibride e, quindi, non ha permesso una chiara separazione dei siti di contatto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il frazionamento mitocondriale è un esperimento complicato con diverse fasi molto complesse. Pertanto, abbiamo mirato a migliorare ulteriormente e, in una certa misura, semplificare il nostro metodoconsolidato 32. In questo caso, le sfide erano la necessità di attrezzature complicate e altamente specializzate, che spesso sono costruzioni individuali, e l'enorme consumo di tempo ed energia. A tal fine, abbiamo cercato di rimuovere le pompe e le singole costruzioni utilizzate per la colata e la raccolta del gradiente lineare e abbiamo cambiato il gradiente a gradini. È importante sottolineare che ci siamo resi conto che, almeno quando preparato come descritto qui, il gradiente diventa lineare durante la centrifugazione, rendendo questo un valido sostituto. Questo metodo (i) elimina la necessità di un miscelatore a gradiente, diminuendo così l'attrezzatura richiesta; (ii) consente di risparmiare tempo il giorno dell'esperimento, poiché il gradiente può essere preparato in anticipo; e (iii) è altamente riproducibile (Figura 3) se preparato secondo il metodo descritto, che prevede il congelamento dei singoli passaggi prima di sovrapporre il successivo. Questi gradienti possono anche essere conservati indefinitamente a -20°C. Inoltre, il caricamento del gradiente di sedimentazione qui suggerito è anche più facile rispetto a dover stratificare la miscela di vescicole sotto il gradiente, come descritto in metodi simili 9,32. Il caricamento di un gradiente di galleggiamento richiede una siringa con una lunga cannula per superare il gradiente già gettato. Questo passaggio è sempre stato problematico a causa del rischio di distruggere il gradiente. Un altro vantaggio di questo metodo è il minor tempo di centrifugazione di 12 ore rispetto a 24 ore e32, che riduce notevolmente il tempo e l'energia necessari per questo metodo. La fattibilità e la riproducibilità della procedura migliorata qui descritta sono evidenziate dalla recente identificazione del sito di contatto indipendente da MICOS formato da Cqd1 e Por1-Om1428.

Tuttavia, questo esperimento è ancora molto complesso. Per ottenere risultati ottimali, ci sono diversi criteri essenziali che devono essere presi in considerazione quando si applica questo protocollo.

Uno degli aspetti più importanti è la qualità dei mitocondri. Questi devono essere isolati di fresco. Pertanto, la coltivazione del lievito e l'isolamento dei mitocondri devono essere presi in considerazione durante la pianificazione della procedura. Un trattamento delicato dei mitocondri durante l'isolamento impedirà la rottura delle membrane, mentre è anche fondamentale inibire le proteasi con un'adeguata concentrazione di PMSF o, in alternativa, cocktail di inibitori della proteasi disponibili in commercio34.

Un altro passaggio importante, e uno degli aspetti più critici della procedura, è la sonicazione. È importante sottolineare che è possibile stimare la corretta intensità dell'impulso ultrasonico dal suono generato attraverso il vortice della sospensione (vedi video). Tuttavia, le condizioni ottimali devono essere determinate sperimentalmente per ogni configurazione sperimentale, non solo in base a marche e modelli diversi, ma anche a macchine diverse dello stesso modello. In particolare, lo smontaggio e la pulizia della punta influiscono anche sull'intensità della sonicazione, rendendo così necessario un riaggiustamento delle condizioni. La raccomandazione nel protocollo è anche quella di utilizzare una cella a rosetta per una maggiore efficienza, ma anche altri recipienti potrebbero funzionare. Una sonicazione troppo dura porterà alla formazione di vescicole miscelate artificialmente. Ciò si tradurrà in un forte accumulo di proteine di membrana interne ed esterne in frazioni di densità intermedia, che può essere anche più forte, come nell'esempio mostrato (Figura 4B). Se ciò accade, si dovrebbe ridurre l'ampiezza o il tempo della sonicazione. Tuttavia, i problemi possono sorgere anche quando la sonicazione non è abbastanza intensa. In questo caso, la resa delle vescicole generate potrebbe essere troppo bassa per rilevare le proteine mediante immunoblotting e, quindi, si dovrebbe aumentare l'ampiezza, il tempo o i cicli di sonicazione.

Infine, il gradiente è importante per la separazione delle varie specie di vescicole generate. Tuttavia, anche il massimo e il minimo ottimali del gradiente di saccarosio, così come il numero di passaggi, possono variare a seconda della configurazione individuale. In questo caso, un gradiente a cinque fasi con un massimo di 1,3 M di saccarosio e un minimo di 0,8 M di saccarosio è sufficiente per una separazione visibile e riproducibile delle vescicole contenenti il sito di contatto dalle vescicole mitocondriali della membrana interna ed esterna. All'inizio, è essenziale scegliere condizioni che lascino frazioni vuote sopra le vescicole della membrana esterna mitocondriale e sotto le vescicole della membrana interna mitocondriale per garantire una corretta separazione. La compressione delle frazioni superiori o inferiori potrebbe causare artefatti. Nelle fasi successive, quando è nota la molarità precisa del saccarosio in corrispondenza della quale si accumuleranno le vescicole della membrana interna ed esterna, il gradiente può essere ottimizzato aumentando o diminuendo le concentrazioni massime e minime di saccarosio per migliorare la risoluzione tra la membrana interna, la membrana esterna e i siti di contatto. Da notare che le condizioni di crescita del lievito possono influenzare il comportamento delle vescicole generate durante la centrifugazione per densità. Qui, il lievito è stato coltivato su un terreno ricco di YP (1% [p/v] estratto di lievito, 2% [p/v] peptone, pH 5,5) contenente glicerolo (3% [v/v]) come fonte di carbonio a 30 °C34,44. Altre condizioni di crescita potrebbero alterare la composizione proteica e lipidica dei mitocondri e, quindi, la densità delle vescicole generate.

Il metodo descritto fornisce un modo affidabile e riproducibile per isolare i siti di contatto. Tuttavia, l'identificazione della composizione proteica del rispettivo sito di contatto (componenti interni ed esterni della membrana) richiede ulteriori saggi come l'immunoprecipitazione, possibilmente in combinazione con la spettrometria di massa. Per questo, sono necessari anticorpi specifici e organismi modello che esprimano versioni marcate delle proteine candidate. Quando si utilizza il lievito come organismo modello, le proteine candidate possono essere facilmente ottenute grazie alla varietà di metodi di modificazione genetica disponibili e all'esistenza di librerie marcate45,46,47. Pertanto, abbiamo deciso di stabilire e ottimizzare questo protocollo per i mitocondri del lievito. Anche se dovrebbe essere possibile adattare il metodo per i mitocondri isolati da altri organismi, il lievito ha il vantaggio di consentire di ottenere elevate quantità di mitocondri in modo economico e veloce. Inoltre, l'utilizzo del lievito come organismo modello per la raccolta dei risultati iniziali è un modo ben collaudato per identificare i complessi proteici e i processi che si conservano negli eucarioti superiori fino all'uomo. Come affermato in precedenza, dopo l'identificazione e la caratterizzazione di MICOS nel lievito 9,10,11, è stato dimostrato che MICOS è conservato nella forma e nella funzione negli eucarioti superiori 21. Cqd1 e Por1, componenti del sitodi contatto indipendente MICOS-28 recentemente scoperto, sono anch'essi conservati, indicando che questo sito di contatto è presente anche negli eucarioti superiori.

L'importanza di continuare la ricerca su questi siti di contatto è sottolineata dai legami di MICOS con varie malattie neurodegenerative 18,48,49,50,51,52,53,54. La corretta fosforilazione di Mic60 da parte di PINK1 è stata collegata al mantenimento delle giunzioni crista in Drosophilia, e, quindi, questa via, che è conservata per gli esseri umani, può essere collegata alla malattia di Parkinson48. Inoltre, una mutazione puntiforme nella subunità MICOS umana Mic14 determina la destabilizzazione di MICOS e la conseguente alterazione dell'ultrastruttura mitocondriale, che sono state riscontrate in pazienti affetti da demenza frontotemporale e sclerosi laterale amiotrofica 50,51,52,53,54. Poiché la Mic14 è conservata dal lievito all'uomo, ulteriori studi su questa proteina potrebbero essere condotti utilizzando il lievito come organismo modello. Questa ricerca di base potrebbe portare a una migliore comprensione dei meccanismi alla base di queste malattie, il che potrebbe accelerare lo sviluppo di trattamenti e terapie efficaci per loro. Inoltre, le recenti scoperte di ulteriori siti di contatto indipendenti da MICOS27,28 indicano che questo campo è ancora in crescita. Pertanto, il protocollo qui presentato potrebbe aiutare a far progredire questa promettente e affascinante ricerca.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.

Acknowledgments

M.E.H. ringrazia la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), progetto numero 413985647, per il sostegno finanziario. Gli autori ringraziano il Dr. Michael Kiebler, dell'Università Ludwig-Maximilians di Monaco di Baviera, per il suo generoso e ampio sostegno. Siamo grati a Walter Neupert per il suo contributo scientifico, le discussioni utili e la continua ispirazione. J.F. ringrazia la Graduate School Life Science Munich (LSM) per il supporto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm Beckman Instruments, Germany 344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm Beckman Instruments, Germany 363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g Beckman Instruments, Germany 363055
Abbe refractometer Zeiss, Germany discontinued,
any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller Brandtech, USA BR26320 discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL DWK Life Science, Germany C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D Branson Ultrasonics, USA FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP Branson Ultrasonics, USA 101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell Branson Ultrasonics, USA 15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26 Beckman Instruments, Germany B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra Beckman Instruments, Germany 8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail Roche, Switzerland 11697498001
D-Sorbit Roth, Germany 6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) Roth, Germany 8043
Erlenmeyer flask, 100 mL Roth, Germany X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 Hirschmann, Germany 1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 Hirschmann, Germany 1180153
ice bath neoLab, Germany  S12651
Magnetic stirrer RCT basic IKA-Werke GmbH, Germany Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) Gerbu, Germany 1081
MyPipetman Select P1000 Gilson, USA FP10006S
MyPipetman Select P20 Gilson, USA FP10003S
MyPipetman Select P200 Gilson, USA FP10005S
Omnifix 1 mL Braun, Germany 4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Serva, Germany 32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm Braun, Germany 4022495052414
stirring bar, 15 mm VWR, USA 442-0366
Sucrose Merck, Germany S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Instruments, Germany 331362
Test tubes Eppendorf, Germany 3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel VWR, USA 432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip VWR, USA 432-0212
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma Aldrich, Germany 33731 discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS Roth, Germany 4855

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References

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Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali
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Khosravi, S., Frickel, J., Harner,… More

Khosravi, S., Frickel, J., Harner, M. E. An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites. J. Vis. Exp. (196), e65444, doi:10.3791/65444 (2023).

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