Summary
Mitokondrielle kontaktsteder er proteinkomplekser som interagerer med mitokondrielle indre og ytre membranproteiner. Disse stedene er avgjørende for kommunikasjonen mellom mitokondriemembranene og dermed mellom cytosol og mitokondriematrisen. Her beskriver vi en metode for å identifisere kandidater som kvalifiserer for denne spesifikke klassen av proteiner.
Abstract
Mitokondrier er tilstede i nesten alle eukaryote celler og utfører viktige funksjoner som går langt utover energiproduksjon, for eksempel syntese av jern-svovelklynger, lipider eller proteiner, Ca2 + buffering og induksjon av apoptose. På samme måte resulterer mitokondriell dysfunksjon i alvorlige menneskelige sykdommer som kreft, diabetes og nevrodegenerasjon. For å utføre disse funksjonene må mitokondrier kommunisere med resten av cellen over konvolutten, som består av to membraner. Derfor må disse to membranene samhandle hele tiden. Proteinholdige kontaktsteder mellom mitokondrielle indre og ytre membraner er avgjørende i denne forbindelse. Så langt er det identifisert flere kontaktsteder. I metoden beskrevet her brukes Saccharomyces cerevisiae mitokondrier til å isolere kontaktsteder og dermed identifisere kandidater som kvalifiserer for kontaktstedproteiner. Vi brukte denne metoden for å identifisere mitokondriekontaktstedet og cristae organiseringssystem (MICOS) -komplekset, et av de viktigste kontaktsteddannende kompleksene i mitokondriell indre membran, som er konservert fra gjær til mennesker. Nylig har vi ytterligere forbedret denne metoden for å identifisere et nytt kontaktsted bestående av Cqd1 og Por1-Om14-komplekset.
Introduction
Mitokondrier utfører en rekke forskjellige funksjoner i eukaryoter, med den mest kjente som produksjon av ATP gjennom oksidativ fosforylering. Andre funksjoner inkluderer produksjon av jern-svovelklynger, lipidsyntese og i høyere eukaryoter, Ca2+ signalering og induksjon av apoptose 1,2,3,4. Disse funksjonene er uadskillelig knyttet til deres komplekse ultrastruktur.
Mitokondriell ultrastruktur ble først beskrevet ved elektronmikroskopi5. Det ble vist at mitokondrier er ganske komplekse organeller bestående av to membraner: mitokondriell ytre membran og mitokondriell indre membran. Dermed dannes to vandige rom av disse membranene: intermembranrommet og matrisen. Den mitokondrielle indre membranen kan deles enda lenger inn i forskjellige seksjoner. Den indre grensemembranen forblir i nærheten av den ytre membranen, og cristae danner invaginasjoner. Såkalte crista-kryss forbinder indre grensehinne og cristae (figur 1). Videre avslører elektronmikrografer av osmotisk krympede mitokondrier at steder eksisterer hvor mitokondriemembranene er tett forbundet 6,7. Disse såkalte kontaktstedene dannes av proteinkomplekser som spenner over de to membranene (figur 1). Det antas at disse interaksjonsstedene er avgjørende for cellens levedyktighet på grunn av deres betydning for regulering av mitokondriell dynamikk og arv, samt overføring av metabolitter og signaler mellom cytosol og matrise8.
MICOS-komplekset i mitokondriell indre membran er sannsynligvis det best karakteriserte og det mest allsidige kontaktsteddannende komplekset. MICOS ble beskrevet i gjær i 2011, og den består av seks underenheter 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 og Mic10. Disse danner et kompleks på ca. 1,5 MDa som lokaliseres til crista-kryssene 9,10,11. Slettingen av enten kjerneunderenhet, Mic10 eller Mic60, fører til fraværet av denne komplekse 9,11, noe som betyr at disse to underenhetene er avgjørende for stabiliteten til MICOS. Interessant nok danner MICOS ikke bare ett, men flere kontaktsteder med forskjellige mitokondrielle ytre membranproteiner og komplekser: TOM-komplekset 11,12, TOB/SAM-komplekset 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1-komplekset9, Por1 10, OM45 10 og Miro 17. Dette indikerer sterkt at MICOS-komplekset er involvert i forskjellige mitokondrielle prosesser, for eksempel proteinimport, fosfolipidmetabolisme og generering av mitokondriell ultrastruktur18. Sistnevnte funksjon er sannsynligvis den viktigste funksjonen til MICOS, da fraværet av MICOS-komplekset indusert gjennom sletting av MIC10 eller MIC60 fører til en unormal mitokondriell ultrastruktur som nesten helt mangler regelmessig cristae. I stedet akkumuleres indre membranvesikler uten tilkobling til den indre grensemembranen19, 20. Det er viktig at MICOS er bevart i form og funksjon fra gjær til menneske21. Assosiasjonen av mutasjoner i MICOS-underenheter med alvorlige menneskelige sykdommer understreker også dens betydning for høyere eukaryoter22,23. Selv om MICOS er svært allsidig, må det finnes flere kontaktsteder (basert på våre upubliserte observasjoner). Faktisk har flere andre kontaktsteder blitt identifisert, for eksempel mitokondriefusjonsmaskineriene Mgm1-Ugo1 / Fzo1 24,25,26 eller Mdm31-Por1, som er involvert i biosyntesen av mitokondrie-spesifikk fosfolipidkardiolipin 27. Nylig forbedret vi metoden som førte oss til identifiseringen av MICOS for å identifisere Cqd1 som en del av et nytt kontaktsted dannet med det ytre membrankomplekset Por1-Om1428. Interessant nok synes dette kontaktstedet også å være involvert i flere prosesser som mitokondriemembranhomeostase, fosfolipidmetabolisme og fordelingen av koenzym Q28,29.
Her brukte vi en variant av den tidligere beskrevne fraksjoneringen av mitokondrier 9,30,31,32,33. Osmotisk behandling av mitokondrier fører til forstyrrelse av mitokondriell ytre membran og til krymping av matriksrommet, og etterlater de to membranene bare i umiddelbar nærhet på kontaktsteder. Dette muliggjør generering av vesikler som utelukkende består av mitokondriell ytre membran eller mitokondriell indre membran eller ved å inneholde kontaktsteder for begge membraner gjennom mild lydbehandling. På grunn av at den mitokondrielle indre membranen har et mye høyere protein-til-lipid-forhold, viser mitokondrielle indre membranvesikler en høyere tetthet sammenlignet med mitokondrielle ytre membranvesikler. Forskjellen i tetthet kan brukes til å skille membranvesiklene gjennom sukrose, oppdrifts, tetthetsgradient, sentrifugering. Dermed akkumuleres mitokondrielle ytre membranvesikler ved lave sukrosekonsentrasjoner, mens mitokondrielle indre membranvesikler er anriket ved høye sukrosekonsentrasjoner. Vesiklene som inneholder kontaktstedene, konsentrerer seg i middels sukrosekonsentrasjoner (figur 2). Følgende protokoll beskriver denne forbedrede metoden, som krever mindre spesialisert utstyr, tid og energi sammenlignet med vår tidligere etablerte32, i detalj og gir et nyttig verktøy for identifisering av mulige kontaktstedproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffere og lagerløsninger
- Lag en 1 M 3-morfolinopropan-1-sulfonsyre (MOPS) løsning i avionisert vann, pH 7,4. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered 500 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i avionisert vann, pH 8,0. Oppbevares i romtemperatur.
- Forbered 2,4 M sorbitol i avionisert vann. Oppbevares i romtemperatur etter autoklavering.
- Forbered 2,5 M sukrose i avionisert vann. Oppbevares i romtemperatur etter autoklavering.
- Tilbered 200 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) i isopropanol. Oppbevares ved -20 °C.
FORSIKTIG: PMSF er giftig ved svelging og forårsaker alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Ikke pust inn støvet, og bruk vernehansker og vernebriller. - Tilbered 72% trikloreddiksyre (TCA) i avionisert vann. Oppbevares ved 4 °C.
FORSIKTIG: TCA kan forårsake luftveisirritasjon, alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Ikke pust inn støvet, og bruk vernehansker og vernebriller. - Forbered SM-bufferen: 20 mM MOPS og 0,6 M sorbitol, pH 7,4.
- Forbered hevelsesbufferen: 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF og proteasehemmercocktail, pH 7,4.
- Forbered sukrosegradientbufferne: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M og 1,3 M sukrose i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
MERK: Alle bufferne kan oppbevares ved 4 °C. Det anbefales imidlertid å lagre de sukroseholdige bufferne ved -20 °C for å unngå soppvekst. Proteasehemmerne må tilsettes ferskt før bruk.
2. Generering av submitokondrielle vesikler
- Isoler rå gjær mitokondrier ferskt i henhold til etablerte protokoller34,35.
MERK: For dette eksperimentet ble mitokondrier isolert fra Saccharomyces cerevisiae. Genereringen av gradient rene mitokondrier uten andre organeller er ikke nødvendig. - Resuspender 10 mg nyisolerte mitokondrier i 1,6 ml SM-buffer (4 °C) ved pipettering (figur 2, trinn 1).
- Overfør mitokondriesuspensjonen til en forkjølt 100 ml Erlenmeyer-kolbe.
- Tilsett sakte 16 ml hevelsesbuffer ved hjelp av en 20 ml glasspipette. Påfør konstant mild omrøring på is under tilsetningen. Denne osmotiske behandlingen resulterer i vannopptak i matriksrommet. Hevelsen av mitokondriell indre membran vil forstyrre den ytre membranen. Begge membranene vil imidlertid holde kontakten på kontaktstedene9 (figur 2, trinn 2).
- Inkuber prøvene under konstant mild omrøring i 30 min på is.
- Tilsett sakte 5 ml 2,5 M sukroseoppløsning ved hjelp av en 5 ml glasspipette for å øke sukrosekonsentrasjonen i prøvene til ca. 0,55 M. Denne osmotiske behandlingen resulterer i en vannutstrømning fra matriks36. Krympingen av den indre membranen er ment å maksimere avstanden til de resterende fragmentene av den ytre membranen. Dette reduserer sannsynligheten for å generere kunstige hybridvesikler av indre og ytre membraner gjennom sonikering (figur 2, trinn 3).
- Inkuber prøvene under mild omrøring i 15 min på is.
- Underkast mitokondriene til sonikering for å generere submitokondrielle membranvesikler (figur 2, trinn 4).
- Overfør mitokondriell suspensjon til en forkjølt rosettcelle.
- Sonikere mitokondriell suspensjon ved en 10% amplitude i 30 sekunder mens du avkjøler rosettcellen i et isbad.
- Hvil suspensjonen i 30 s i et isbad.
- Gjenta trinn 2.8.2 og trinn 2.8.3 tre ganger til.
MERK: Sonikeringsforholdene vil variere i henhold til sonikatoren som brukes. Optimalisering vil være nødvendig for individuelle maskiner. Sonikering som er for hard, vil føre til kunstig dannelse av vesikler bestående av mitokondrielle indre og ytre membraner.
3. Separasjon av submitokondrielle vesikler
- Separer de genererte vesiklene fra de gjenværende intakte mitokondriene ved sentrifugering ved 20 000 x g i 20 minutter ved 4 °C. De intakte mitokondriene vil pelletere mens vesiklene vil forbli i supernatanten.
- Konsentrer vesikelblandingen.
- Overfør supernatanten til friske ultrasentrifugeringsrør.
- Legg en pute på 0,3 ml 2,5 M sukroseoppløsning i bunnen av røret ved hjelp av en 1 ml sprøyte utstyrt med en 0,8 mm x 120 mm kanyle.
- Sentrifuge ved 118 000 x g i 100 minutter ved 4 °C.
MERK: Her ble det brukt en svingende bøtte rotor med en maksimal radius på 153,1 mm. Sentrifugeringsforholdene avhenger sterkt av rotoren og må tilpasses når en annen rotor brukes.
- Vesiklene vil vises som en plate på toppen av sukroseputen etter sentrifugeringen. Kast ca. 90 % av supernatanten. Høst nå de konsentrerte vesiklene ved å resuspendere dem i den gjenværende bufferen, inkludert 2,5 M, sukrose ved å pipettere opp og ned. Overfør suspensjonen til en iskald Dounce-homogenisator.
- Homogeniser suspensjonen med minst 10 slag ved bruk av en polytetrafluoretylenpottemaker.
- Forbered sukrosegradienten.
- For en 11 ml trinngradient med fem trinn (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M og 0,8 M sukrose i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4), har hvert lag 2,2 ml sukroseløsning.
MERK: Et refraktometer anbefales for å måle og justere sukrosekonsentrasjonene; Det er imidlertid ikke avgjørende. Påfør 10 μL av bufferen på refraktometeret, og oppdag de respektive brytningsindeksene. Beregningen av sukrosekonsentrasjon er som følger:
1.3333 representerer brytningsindeksen for vann. 0,048403 er en sukrosespesifikk konverteringsindeks oppnådd fra lineær skalering av molær brytning til sukrosekonsentrasjon i vandige oppløsninger 37. - Tilsett den høyeste sukrosekonsentrasjonen i sentrifugeringsrøret, og sett røret ved -20 °C. Vent til laget er helt frosset før du påfører det neste. Fortsett deretter til det siste laget er tilsatt, og lagre gradientene ved -20 ° C.
MERK: Husk å overføre de frosne gradientene til 4 °C når du starter eksperimentet, slik at gradientene tiner. Dette vil ta ca. 3 timer. For sentrifugeringen her ble det brukt en svingende bøtte rotor med en kapasitet på 13,2 ml. Når en annen rotor brukes, må gradienttrinnvolumene tilpasses tilsvarende.
- For en 11 ml trinngradient med fem trinn (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M og 0,8 M sukrose i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4), har hvert lag 2,2 ml sukroseløsning.
- Mål sukrosekonsentrasjonen av prøvene ved hjelp av et refraktometer. Hvis det ikke er tilgang til refraktometer, kan man alternativt anta at sukrosekonsentrasjonen er 2 M. Denne antatte sukrosekonsentrasjonen vil da være grunnlaget for neste trinn.
- Juster sukrosekonsentrasjonen til 0,6 M ved tilsetning av en passende mengde 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF og proteasehemmercocktail, pH 7,4. Hvis sukrosekonsentrasjonen er estimert til 2 M i stedet for å bli målt, anbefales det å teste om konsentrasjonen er lav nok etter justering. Påfør en liten alikot av prøven (ca. 50 μL) på toppen av 200 μL 0,8 M sukrose i et reagensrør. Prøven må holde seg på toppen av 0,8 M sukrose.
- Legg prøvene (ca. 1 ml) på toppen av sukrosegradienten (behold 10 % for senere referanse). Forsiktig pipettering er viktig for å unngå forstyrrelser i gradienten (figur 2, trinn 5).
- Separer vesiklene ved sentrifugering ved 200 000 x g og 4 °C i 12 timer. Hvis mulig, sett sentrifugen til langsom akselerasjon og retardasjon for å unngå forstyrrelse av gradienten (figur 2, trinn 6).
MERK: Her ble det brukt en svingende bøtte rotor med en maksimal radius på 153,1 mm. Sentrifugeringsforholdene avhenger sterkt av rotoren og må tilpasses når en annen rotor brukes. - Høst gradienten fra topp til bunn i 700 μL fraksjoner ved hjelp av en 1 ml pipette. Dette vil resultere i 17 fraksjoner, noe som gir tilstrekkelig oppløsning.
4. Analyse av submitokondrielle vesikler
- Konsentrer proteinene ved å utsette hver fraksjon for to sekvensielt utførte TCA-utfellinger38 for å forberede SDS-PAGE-prøvene.
- Tilsett 200 μL 72 % TCA til de enkelte fraksjonene, og bland til oppløsningen er homogen. Inkuber fraksjonene i 30 min på is, og pellet de utfelte proteinene ved sentrifugering ved 20 000 x g og 4 °C i 20 minutter. Kast supernatanten, tilsett 500 mikrol 28 % TCA-oppløsning, bland godt og gjenta sentrifugeringstrinnet.
- Vask pelletsene med 1 ml aceton (-20 °C), og sentrifuge i 10 minutter ved 20 000 x g og 4 °C. Kast supernatanten og la pelletsene lufttørke. Resuspender pelletsene i 60 μL SDS-prøvebuffer, og inkuber prøvene i 5 minutter ved 95 °C.
MERK: En stor mengde sukrose vil forbli, spesielt i fraksjonene med høy tetthet, etter den første TCA-nedbøren. Dette vil bli fjernet gjennom den ekstra TCA-nedbøren.
- Analyser 20 μL av hver fraksjon ved SDS-SIDE39 og immunoblotting40,41,42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er relativt enkelt å skille mitokondrielle indre og ytre membraner. Imidlertid er generering og separasjon av kontaktstedholdige vesikler mye vanskeligere. Etter vår mening er to trinn kritiske og essensielle: sonikeringsforholdene og gradienten som brukes.
Vanligvis antas lineære gradienter å ha en bedre oppløsning sammenlignet med trinngradienter. Imidlertid er deres reproduserbare produksjon kjedelig og krever spesialutstyr. Derfor etablerte vi en metode for å generere en trinngradient med relativt små forskjeller mellom de enkelte trinnene (se steg 3.5). Vi spekulerte på om trinngradienten ville bli balansert ved sentrifugering, noe som resulterte i en nesten lineær gradient. Påfallende nok viste bestemmelsen av sukrosekonsentrasjonene av de enkelte fraksjonene etter sentrifugering ved hjelp av et refraktometer at trinngradienten faktisk ble tilnærmet lineær etter 12 timers sentrifugering ved 200 000 x g (figur 3).
Betydningen av mild sonikering er tydelig i disse representative resultatene. I milde sonikeringsforhold (figur 4A) ble den mitokondrielle ytre membranmarkøren Tom40 beriket i de tidlige lavtetthetsfraksjonene (fraksjon nr. 4) og var praktisk talt fraværende i de senere. Den mitokondrielle indre membranmarkøren Tim17 var konsentrert i fraksjoner med høy tetthet (fraksjon nr. 17). I motsetning til dette akkumulerte kontaktstedproteinet Mic60 i fraksjoner av mellomliggende sukrosekonsentrasjon (fraksjon nr. 12-14), noe som indikerer vellykket generering og påfølgende separasjon av de forskjellige membranvesiklene. I kontrast, med tøffere sonikeringsforhold, kunne den mitokondrielle ytre membranmarkøren Tom40 detekteres i lavere fraksjoner av gradienten (fraksjon nr. 14 og fraksjon nr. 17, figur 4B). I tillegg var det en betydelig mengde Tim17 i fraksjoner av middels tetthet (fraksjon nr. 13 og fraksjon nr. 14, figur 4B). Den uspesifikke akkumuleringen av ytre og indre membranmarkører i fraksjoner av mellomliggende tetthet indikerer kunstig dannelse av blandede membraner, noe som hemmer identifiseringen av kandidatproteiner.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av mitokondriell ultrastruktur. En skjematisk fremstilling av en mitokondrie for å vise de forskjellige rommene, membranene og proteinstedene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt av mitokondriell fraksjonering for å isolere proteiner på kontaktstedet. En skjematisk oversikt over prosessen beskrevet i protokollen. De (1) nyisolerte mitokondriene var (2) osmotisk hovne (3) og deretter krympet. (4) De krympede mitokondriene ble utsatt for mild sonikering for å generere submitokondrielle vesikler. (5) Vesikkelblandingen ble konsentrert og lastet på en sukrosetrinngradient. (6) Gjennom sentrifugering ble mitokondrielle ytre membranvesikler anriket ved lav sukrosekonsentrasjon, mitokondrielle indre membranvesikler ved høy sukrosekonsentrasjon og kontaktstedsholdige vesikler ved en mellomliggende sukrosekonsentrasjon. Forkortelser: MIM, mitokondriell indre membran; MOM, mitokondriell ytre membran. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Generering av en lineær gradient ved sentrifugering. To trinns gradienter (1,3 M, 1,13 M, deretter 1,02 M, 0,96 M og 0,8 M i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4) ble fremstilt parallelt, og 1 ml 0,6 M sukrose i 20 mM MOPS og 0,5 mM EDTA, pH 7,4, ble lastet på begge gradienter. Gradientene ble sentrifugert ved 200 000 x g og 4 °C i 12 timer og høstet i 17 fraksjoner hver. Reproduserbarheten av metoden ble testet ved bestemmelse av sukrosekonsentrasjonen av de enkelte fraksjonene av de enkelte gradienter ved bruk av et refraktometer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Isolering av proteiner på kontaktstedet med veldefinert ultralydpuls. (A,B) Ferskt isolerte gjærmitokondrier ble utsatt for osmotisk behandling og utsatt for sonikering. De genererte vesiklene ble separert ved hjelp av sukrose, oppdrifts, tetthet, gradient, sentrifugering. Gradienten ble fraksjonert, og proteinene i de ulike fraksjonene ble utsatt for TCA-utfelling. Fordelingen av markørproteinene for mitokondriell ytre membran (Tom40), mitokondriell indre membran (Tim17) og kontaktsteder (Mic60) ble analysert ved immunblotting ved bruk av de angitte antistoffene. (A) Mild sonikering (4 x 30 s, 10% amplitude) resulterte i en klar separasjon av ytre membranproteiner (fraksjoner med lav tetthet) og indre membranproteiner (fraksjoner med høy tetthet). I tillegg ble kontaktstedsproteinet Mic60 vellykket anriket i fraksjoner av mellomtetthet. (B) Harsher sonication (4 x 30 s, 20% amplitude) resulterte i generering av hybridvesikler og tillot dermed ikke en klar separasjon av kontaktsteder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondriell subfraksjonering er et komplisert eksperiment med flere svært komplekse trinn. Derfor ønsket vi å ytterligere forbedre og til en viss grad forenkle vår etablerte metode32. Her var utfordringene kravet til komplisert og høyt spesialisert utstyr, som ofte er enkeltkonstruksjoner, og det enorme tids- og energiforbruket. Til dette formål prøvde vi å fjerne pumpene og individuelle konstruksjoner som ble brukt til støping og høsting av den lineære gradienten og endret til en trinngradient. Det er viktig at vi innså at, i det minste når den er forberedt som beskrevet her, blir gradienten lineær under sentrifugering, noe som gjør dette til en gyldig erstatning. Denne metoden (i) eliminerer behovet for en gradientblander, og reduserer dermed det nødvendige utstyret; (ii) sparer tid på forsøksdagen, siden gradienten kan utarbeides på forhånd; og (iii) er svært reproduserbar (figur 3) når den fremstilles i henhold til den beskrevne metoden, som innebærer å fryse de enkelte trinnene før lagdeling av neste på toppen. Disse gradientene kan også lagres på ubestemt tid ved -20 °C. I tillegg er belastningen av den her foreslåtte sedimentasjonsgradienten også enklere enn å måtte legge vesikkelblandingen under gradienten, som beskrevet i lignende metoder 9,32. Lasting av en flytende gradient krever en sprøyte med en lang kanyle for å passere den allerede støpte gradienten. Dette trinnet var alltid problematisk på grunn av risikoen for å ødelegge gradienten. En annen fordel med denne metoden er den lavere sentrifugeringstiden på 12 timer sammenlignet med 24 timer32, noe som i stor grad reduserer tiden og energien som kreves for denne metoden. Gjennomførbarheten og reproduserbarheten av den forbedrede prosedyren beskrevet her er fremhevet av den nylige identifiseringen av det MICOS-uavhengige kontaktstedet dannet av Cqd1 og Por1-Om1428.
Dette eksperimentet er imidlertid fortsatt svært komplekst. For å oppnå optimale resultater er det flere viktige kriterier som må tas i betraktning ved bruk av denne protokollen.
En av de viktigste aspektene er kvaliteten på mitokondriene. Disse må være nyisolerte. Derfor må dyrking av gjær samt isolering av mitokondrier tas i betraktning under planlegging av prosedyren. Skånsom behandling av mitokondriene under isoleringen vil forhindre forstyrrelse av membranene, samtidig som det er kritisk å hemme proteaser med en passende konsentrasjon av PMSF eller alternativt kommersielt tilgjengelige proteasehemmercocktailer34.
Et annet viktig skritt, og en av de mest kritiske aspektene ved prosedyren, er lydbehandlingen. Det er viktig at det er mulig å estimere riktig intensitet av ultralydpulsen ved lyden som genereres gjennom suspensjonens virvling (se video). Imidlertid må de optimale forholdene bestemmes eksperimentelt for hvert eksperimentelt oppsett, ikke bare basert på forskjellige merker og modeller, men også forskjellige maskiner av samme modell. Spesielt påvirker demontering og rengjøring av spissen også intensiteten av sonikeringen, og gjør dermed en justering av forholdene nødvendig. Anbefalingen i protokollen er også å bruke en rosettcelle for høyere effektivitet, men andre fartøy kan også fungere. Sonikering som er for hard, vil føre til dannelse av kunstig blandede vesikler. Dette vil resultere i en sterk akkumulering av indre og ytre membranproteiner i fraksjoner av mellomliggende tetthet, som kan være enda sterkere, som i det viste eksemplet (figur 4B). Hvis dette skjer, bør man redusere amplituden eller tiden for sonikeringen. Imidlertid kan det også oppstå problemer når sonikeringen ikke er intens nok. I dette tilfellet kan utbyttet av de genererte vesiklene være for lavt til å oppdage proteiner ved immunoblotting, og dermed må man øke amplitude, tid eller sykluser av sonikering.
Endelig er gradienten viktig for separasjonen av de forskjellige vesikkelartene som genereres. Imidlertid kan det optimale maksimumet og minimum av sukrosegradienten, samt antall trinn, også variere avhengig av det enkelte oppsettet. Her er en fem-trinns gradient med maksimalt 1,3 M sukrose og minimum 0,8 M sukrose tilstrekkelig for en synlig og reproduserbar separasjon av kontaktstedsholdige vesikler fra mitokondrielle indre og ytre membranvesikler. I begynnelsen er det viktig å velge forhold som etterlater tomme fraksjoner over mitokondrielle ytre membranvesikler og under mitokondrielle indre membranvesikler for å sikre riktig separasjon. Komprimering av enten den øverste eller nederste fraksjonen kan føre til artefakter. Ved senere trinn, når den nøyaktige molariteten av sukrose hvor de indre og ytre membranvesiklene vil akkumulere er kjent, kan gradienten optimaliseres ved å øke eller redusere maksimums- og minimumssukrosekonsentrasjonene for å forbedre oppløsningen mellom indre membran, ytre membran og kontaktsteder. Merk at vekstforholdene til gjær kan påvirke oppførselen til de genererte vesiklene ved tetthetsentrifugering. Her ble gjæren dyrket på rikt YP-medium (1% [w/v] gjærekstrakt, 2% [w/v] pepton, pH 5,5) som inneholdt glyserol (3% [v/v]) som karbonkilde ved 30 °C34,44. Andre vekstforhold kan endre protein- og lipidsammensetningen av mitokondriene og dermed tettheten av de genererte vesiklene.
Den beskrevne metoden gir en pålitelig og reproduserbar måte å isolere kontaktsteder på. Identifisering av proteinsammensetningen til det respektive kontaktstedet (indre og ytre membrankomponenter) trenger imidlertid ytterligere analyser som immunutfelling, muligens i kombinasjon med massespektrometri. For dette er det nødvendig med spesifikke antistoffer og modellorganismer som uttrykker merkede versjoner av proteinkandidatene. Når du bruker gjær som modellorganisme, kan proteinkandidater lett oppnås på grunn av mangfoldet av genetiske modifikasjonsmetoder som er tilgjengelige og eksistensen av merkede biblioteker45,46,47. Derfor bestemte vi oss for å etablere og optimalisere denne protokollen for gjærmitokondrier. Selv om det burde være mulig å tilpasse metoden for mitokondrier isolert fra andre organismer, har gjær fordelen av at store mengder mitokondrier kan oppnås på en billig og rask måte. Videre er bruk av gjær som modellorganisme for å samle de første resultatene en velprøvd måte å identifisere proteinkomplekser og prosesser som er konservert i høyere eukaryoter opp til mennesker. Som nevnt tidligere, etter identifisering og karakterisering av MICOS i gjær 9,10,11, ble det vist at MICOS er bevart i form og funksjon i høyere eukaryoter 21. Cqd1 og Por1, komponenter fra det nylig oppdagede MICOS-uavhengige kontaktstedet28, er også bevart, noe som indikerer at dette kontaktstedet også er tilstede i høyere eukaryoter.
Viktigheten av fortsatt forskning på disse kontaktstedene understrekes av MICOS' koblinger til ulike nevrodegenerative sykdommer 18,48,49,50,51,52,53,54. Den korrekte fosforyleringen av Mic60 av PINK1 har vært knyttet til vedlikehold av crista-kryss i drosofili, og dermed kan denne veien, som er bevart for mennesker, være forbundet med Parkinsons sykdom48. Videre resulterer en punktmutasjon i den humane MICOS-subenheten Mic14 i destabilisering av MICOS og den påfølgende endringen av mitokondriell ultrastruktur, som er funnet hos pasienter som lider av frontotemporal demens og amyotrofisk lateralsklerose 50,51,52,53,54. Siden Mic14 er konservert fra gjær til mennesker, kan videre studier på dette proteinet utføres ved hjelp av gjær som modellorganisme. Denne grunnleggende forskningen kan føre til en bedre forståelse av de underliggende mekanismene til disse sykdommene, noe som kan fremskynde utviklingen av effektiv behandling og terapi for dem. Videre indikerer de nylige funnene av flere MICOS-uavhengige kontaktsteder27,28 at dette feltet fortsatt vokser. Derfor kan den her presenterte protokollen bidra til å utvikle denne lovende og fascinerende forskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
M.E.H. anerkjenner Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), prosjektnummer 413985647, for økonomisk støtte. Forfatterne takker Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians University, München, for hans sjenerøse og omfattende støtte. Vi er takknemlige for Walter Neupert for hans vitenskapelige innspill, nyttige diskusjoner og løpende inspirasjon. JF takker Graduate School Life Science München (LSM) for støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any Abbe refractometer can be used |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
References
- Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
- Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
- Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
- Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
- Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
- Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
- Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
- Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
- Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
- vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
- Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
- Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
- Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
- Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
- Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
- Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
- Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
- John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
- Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
- Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
- Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
- Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
- Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
- Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
- Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
- Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
- Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
- Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
- Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
- Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
- Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
- Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
- Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
- Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
- Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
- Koontz, L.
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Al-Tubuly, A. A.
- Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Sherman, F.
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
- Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
- Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
- Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
- Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
