Summary
Митохондриальные контактные сайты представляют собой белковые комплексы, которые взаимодействуют с митохондриальными внутренними и внешними мембранными белками. Эти участки необходимы для связи между митохондриальными мембранами и, таким образом, между цитозолем и митохондриальным матриксом. В этой статье мы опишем метод выявления кандидатов, подходящих для этого конкретного класса белков.
Abstract
Митохондрии присутствуют практически во всех эукариотических клетках и выполняют важнейшие функции, выходящие далеко за рамки производства энергии, например, синтез железо-серных кластеров, липидов или белков, буферизациюCa2+ и индукцию апоптоза. Кроме того, митохондриальная дисфункция приводит к тяжелым заболеваниям человека, таким как рак, диабет и нейродегенерация. Для того, чтобы выполнять эти функции, митохондрии должны взаимодействовать с остальной частью клетки через свою оболочку, состоящую из двух мембран. Поэтому эти две мембраны должны постоянно взаимодействовать. Белковые контактные участки между внутренней и внешней мембранами митохондрий имеют важное значение в этом отношении. На данный момент выявлено несколько мест контакта. В описанном здесь методе митохондрии Saccharomyces cerevisiae используются для выделения контактных сайтов и, таким образом, идентификации кандидатов, которые квалифицируются для белков контактных сайтов. Мы использовали этот метод для идентификации митохондриального контактного сайта и комплекса организующей системы cristae (MICOS), одного из основных контактных сайтов-образующих комплексов во внутренней мембране митохондрий, который сохраняется от дрожжей до человека. Недавно мы усовершенствовали этот метод, чтобы идентифицировать новый контактный сайт, состоящий из Cqd1 и комплекса Por1-Om14.
Introduction
Митохондрии выполняют множество различных функций у эукариот, наиболее известной из которых является производство АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другие функции включают производство железо-серных кластеров, синтез липидов, а у высших эукариот — передачу сигналов Ca2+ и индукцию апоптоза 1,2,3,4. Эти функции неразрывно связаны с их сложной ультраструктурой.
Митохондриальная ультраструктура была впервые описана с помощью электронной микроскопии5. Показано, что митохондрии представляют собой достаточно сложные органеллы, состоящие из двух мембран: митохондриальной наружной мембраны и митохондриальной внутренней мембраны. Таким образом, этими мембранами образуются два водных компартмента: межмембранное пространство и матрикс. Митохондриальная внутренняя мембрана может быть еще более разделена на различные секции. Внутренняя пограничная мембрана находится в непосредственной близости от наружной, а кристы образуют инвагинации. Так называемые кристальные соединения соединяют внутреннюю пограничную мембрану и кристы (рис. 1). Кроме того, электронные микрофотографии осмотически сморщенных митохондрий показывают, что существуют участки, в которых митохондриальные мембраны плотно соединены 6,7. Эти так называемые контактные участки образованы белковыми комплексами, охватывающими две мембраны (рис. 1). Считается, что эти сайты взаимодействия необходимы для жизнеспособности клеток из-за их важности для регуляции митохондриальной динамики и наследования, а также передачи метаболитов и сигналов между цитозолью и матриксом8.
Комплекс MICOS во внутренней мембране митохондрий, вероятно, является наиболее охарактеризованным и наиболее универсальным контактным сайтообразующим комплексом. MICOS был описан у дрожжей в 2011 году и состоит из шести субъединиц 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 и Mic10. Они образуют комплекс примерно в 1,5 МДа, который локализуется в кристальных соединениях 9,10,11. Удаление одной из основных субъединиц, Mic10 или Mic60, приводит к отсутствию этого комплекса 9,11, что означает, что эти две субъединицы необходимы для стабильности MICOS. Интересно, что MICOS образует не один, а несколько сайтов контакта с различными белками и комплексами митохондриальной внешней мембраны: комплексом TOM 11,12, комплексом TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, комплексом Fzo1-Ugo19, Por1 10, OM45 10 и Miro 17. Это убедительно указывает на то, что комплекс MICOS участвует в различных митохондриальных процессах, таких как импорт белка, метаболизм фосфолипидов и генерация митохондриальной ультраструктуры18. Последняя функция, вероятно, является основной функцией MICOS, поскольку отсутствие комплекса MICOS, индуцированного делецией MIC10 или MIC60, приводит к аномальной ультраструктуре митохондрий, в которой практически полностью отсутствуют регулярные кристы. Вместо этого внутренние мембранные везикулы без соединения с внутренней пограничной мембраной накапливают19, 20. Важно отметить, что MICOS сохраняется по форме и функциям от дрожжей до человека21. Связь мутаций в субъединицах MICOS с тяжелыми заболеваниями человека также подчеркивает ее важность для высших эукариот22,23. Несмотря на то, что MICOS очень универсален, необходимо наличие дополнительных мест контакта (на основании наших неопубликованных наблюдений). Действительно, было идентифицировано несколько других мест контакта, например, механизмы митохондриального слияния Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 или Mdm31-Por1, который участвует в биосинтезе митохондриально-специфического фосфолипидного кардиолипина 27. Недавно мы усовершенствовали метод, который привел нас к идентификации MICOS для идентификации Cqd1 как части нового контактного сайта, образованного с внешним мембранным комплексом Por1-Om1428. Интересно, что этот контактный сайт также, по-видимому, участвует во многих процессах, таких как гомеостаз митохондриальных мембран, метаболизм фосфолипидов и распределение коэнзима Q28,29.
Здесь мы использовали вариацию ранее описанного фракционирования митохондрий 9,30,31,32,33. Осмотическая обработка митохондрий приводит к разрушению митохондриальной внешней мембраны и к уменьшению матричного пространства, оставляя две мембраны только в непосредственной близости в местах контакта. Это позволяет генерировать везикулы, состоящие исключительно из митохондриальной внешней мембраны или митохондриальной внутренней мембраны или в местах контакта обеих мембран с помощью мягкого ультразвукового воздействия. Из-за того, что внутренняя мембрана митохондрий обладает гораздо более высоким соотношением белка к липидам, пузырьки внутренней мембраны митохондрий демонстрируют более высокую плотность по сравнению с пузырьками внешней мембраны митохондрий. Разница в плотности может быть использована для разделения мембранных везикул с помощью центрифугирования с градиентом плотности сахарозы. Таким образом, пузырьки внешней мембраны митохондрий накапливаются при низких концентрациях сахарозы, в то время как пузырьки внутренней мембраны митохондрий обогащаются при высоких концентрациях сахарозы. Везикулы, содержащие контактные участки, концентрируются в промежуточных концентрациях сахарозы (рис. 2). Следующий протокол подробно описывает этот усовершенствованный метод, который требует меньше специализированного оборудования, времени и энергии по сравнению с нашим ранее разработанным методом32 и предоставляет полезный инструмент для идентификации возможных белков контактного сайта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Буферы и складские растворы
- Раствор 1 М 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (MOPS) в деионизированной воде, рН 7,4. Хранить при температуре 4 °C.
- Приготовьте 500 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в деионизированной воде, рН 8,0. Хранить при комнатной температуре.
- Приготовьте 2,4 М сорбита в деионизированной воде. После автоклавирования хранить при комнатной температуре.
- Приготовьте 2,5 М сахарозы в деионизированной воде. После автоклавирования хранить при комнатной температуре.
- Приготовьте 200 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) в изопропаноле. Хранить при температуре −20 °C.
ВНИМАНИЕ: PMSF токсичен при проглатывании и вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз. Не вдыхайте пыль, надевайте защитные перчатки и очки. - Приготовьте 72% трихлоруксусную кислоту (ТСА) в деионизированной воде. Хранить при температуре 4 °C.
ВНИМАНИЕ: ТСА может вызвать раздражение дыхательных путей, тяжелые ожоги кожи и повреждение глаз. Не вдыхайте пыль, надевайте защитные перчатки и очки. - Приготовьте буфер SM: 20 мМ MOPS и 0,6 М сорбитола, pH 7,4.
- Приготовьте буфер для набухания: 20 мМ MOPS, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF и коктейль ингибиторов протеазы, pH 7,4.
- Приготовьте буферы градиента сахарозы: 0,8 М, 0,96 М, 1,02 М, 1,13 М и 1,3 М сахарозы в 20 мМ MOPS и 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы можно хранить при температуре 4 °C; однако рекомендуется хранить буферы, содержащие сахарозу, при температуре −20 °C, чтобы избежать роста грибков. Ингибиторы протеазы должны быть добавлены свежими перед использованием.
2. Генерация субмитохондриальных везикул
- Изолируют митохондрии сырых дрожжей в свежем виде в соответствии с установленными протоколами34,35.
Примечание: Для этого эксперимента митохондрии были выделены из Saccharomyces cerevisiae. Генерация градиентных чистых митохондрий, лишенных других органелл, не требуется. - Ресуспендировать 10 мг свежевыделенных митохондрий в буфере SM объемом 1,6 мл (4 °C) путем пипетирования (рис. 2, шаг 1).
- Переложите митохондриальную суспензию в предварительно охлажденную колбу Эрленмейера объемом 100 мл.
- Медленно добавьте 16 мл буфера для набухания с помощью стеклянной пипетки объемом 20 мл. Применяйте постоянное мягкое помешивание льда во время добавления. Эта осмотическая обработка приводит к поглощению воды в матричное пространство. Отек внутренней мембраны митохондрий нарушит работу наружной мембраны. Тем не менее, обе мембраны будут оставаться в контакте в местах контакта9 (рис. 2, шаг 2).
- Инкубируют образцы при постоянном слабом помешивании в течение 30 мин на льду.
- Медленно добавляют 5 мл 2,5 М раствора сахарозы с помощью стеклянной пипетки объемом 5 мл, чтобы увеличить концентрацию сахарозы в образцах примерно до 0,55 М. Эта осмотическая обработка приводит к оттоку воды из матрицы36. Усадка внутренней мембраны предназначена для того, чтобы максимально увеличить ее расстояние до остаточных фрагментов наружной мембраны. Это снижает вероятность генерации искусственных гибридных везикул внутренней и наружной мембран с помощью ультразвуковой обработки (рис. 2, шаг 3).
- Инкубируют образцы при слабом помешивании в течение 15 мин на льду.
- Подвергните митохондрии ультразвуковой обработке для создания субмитохондриальных мембранных везикул (рис. 2, шаг 4).
- Перенесите митохондриальную суспензию в предварительно охлажденную розеточную клетку.
- Ультразвуковая обработка митохондриальной суспензии с амплитудой 10% в течение 30 с при одновременном охлаждении розетки клетки в ледяной бане.
- Отдохните суспензию в течение 30 с на ледяной бане.
- Повторите шаги 2.8.2 и 2.8.3 еще три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия ультразвуковой обработки зависят от используемого ультразвукового аппарата. Оптимизация будет необходима для отдельных машин. Слишком жесткое ультразвуковое воздействие приведет к искусственному образованию везикул, состоящих из внутренней и внешней мембран митохондрий.
3. Разделение субмитохондриальных везикул
- Образовавшиеся везикулы отделяют от оставшихся неповрежденных митохондрий центрифугированием при 20 000 x g в течение 20 мин при 4 °C. Интактные митохондрии будут опрокидываться, в то время как везикулы останутся в надосадочной жидкости.
- Сконцентрируйте везикулезную смесь.
- Перелейте надосадочную жидкость в свежие ультрацентрифугирующие пробирки.
- Загрузите подушечку из 0,3 мл 2,5 М раствора сахарозы на дно пробирки с помощью шприца объемом 1 мл, оснащенного канюлей 0,8 мм х 120 мм.
- Центрифуга при 118 000 x g в течение 100 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь был использован ротор качающегося ковша с максимальным радиусом 153,1 мм. Условия центрифугирования сильно зависят от ротора и должны быть адаптированы при использовании другого ротора.
- После центрифугирования везикулы появятся в виде диска на верхней части подушки сахарозы. Выбросьте примерно 90% надосадочной жидкости. Теперь соберите концентрированные везикулы, повторно суспендировав их в оставшемся буфере, включая 2,5 М сахарозу, путем пипетирования вверх и вниз. Перелейте суспензию в ледяной гомогенизатор Dounce.
- Гомогенизируйте суспензию не менее чем 10 ударами с помощью политетрафторэтиленового гончара.
- Приготовьте градиент сахарозы.
- Для ступенчатого градиента 11 мл с пятью ступенями (1,3 М, 1,13 М, 1,02 М, 0,96 М и 0,8 М сахарозы в 20 мМ MOPS и 0,5 мМ ЭДТА, pH 7,4) каждый слой содержит 2,2 мл раствора сахарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения и регулировки концентраций сахарозы рекомендуется использовать рефрактометр; Однако это не обязательно. Нанесите 10 мкл буфера на рефрактометр и определите соответствующие показатели преломления. Расчет концентрации сахарозы производится следующим образом:
1,3333 представляет собой показатель преломления воды. 0,048403 – индекс специфической конверсии сахарозы, полученный путем линейного масштабирования молярной рефракции в концентрацию сахарозы в водных растворах 37. - Добавьте самую высокую концентрацию сахарозы в центрифугированную пробирку и поставьте пробирку на температуру −20 °C. Подождите, пока слой полностью застынет, прежде чем наносить следующий. Действуйте соответствующим образом, пока не будет добавлен последний слой, и храните градиенты при температуре −20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте перевести замороженные градиенты на 4 °C в начале эксперимента, чтобы градиенты оттаяли. Это займет примерно 3 часа. Для центрифугирования здесь использовался ротор с качающимся ковшом емкостью 13,2 мл. При использовании другого ротора объемы шага градиента должны быть соответствующим образом адаптированы.
- Для ступенчатого градиента 11 мл с пятью ступенями (1,3 М, 1,13 М, 1,02 М, 0,96 М и 0,8 М сахарозы в 20 мМ MOPS и 0,5 мМ ЭДТА, pH 7,4) каждый слой содержит 2,2 мл раствора сахарозы.
- Измерьте концентрацию сахарозы в образцах с помощью рефрактометра. Если нет доступа к рефрактометру, можно предположить, что концентрация сахарозы составляет 2 М. Эта предполагаемая концентрация сахарозы будет основой для следующего этапа.
- Доведите концентрацию сахарозы до 0,6 М, добавив соответствующее количество 20 мМ MOPS, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF и коктейль ингибиторов протеазы, pH 7,4. Если концентрация сахарозы оценивается как 2 М, а не измеряется, рекомендуется проверить, достаточно ли низка концентрация после корректировки. Нанесите небольшую аликвоту образца (около 50 мкл) поверх 200 мкл 0,8 М сахарозы в пробирке. Образец должен оставаться сверху 0,8 М сахарозы.
- Загрузите образцы (примерно 1 мл) поверх градиента сахарозы (оставьте 10% для дальнейшего использования). Важно осторожное пипетирование, чтобы избежать нарушения градиента (Рисунок 2, шаг 5).
- Разделяют везикулы центрифугированием при 200 000 x g и 4 °C в течение 12 ч. Если возможно, настройте центрифугу на медленное ускорение и замедление, чтобы избежать нарушения градиента (Рисунок 2, шаг 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь был использован ротор качающегося ковша с максимальным радиусом 153,1 мм. Условия центрифугирования сильно зависят от ротора и должны быть адаптированы при использовании другого ротора. - Соберите градиент сверху вниз фракциями по 700 мкл с помощью пипетки объемом 1 мл. В результате получится 17 дробей, что позволяет получить достаточное разрешение.
4. Анализ субмитохондриальных везикул
- Концентрируют белки, подвергая каждую фракцию двум последовательно выполненным осаждениям ТСА38 для подготовки образцов SDS-PAGE.
- Добавьте 200 мкл 72% ТСА к отдельным фракциям и перемешайте до однородности раствора. Инкубируют фракции в течение 30 мин на льду и гранулируют осажденные белки центрифугированием при 20 000 x g и 4 °C в течение 20 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 500 мкл 28 % раствора ТСА, хорошо перемешайте и повторите этап центрифугирования.
- Промойте гранулы 1 мл ацетона (−20 °C) и центрифугируйте в течение 10 минут при 20 000 x g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и дайте гранулам высохнуть на воздухе. Повторно суспендируйте гранулы в 60 мкл буфера для образцов SDS и инкубируйте образцы в течение 5 минут при 95 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большое количество сахарозы остается, особенно во фракциях высокой плотности, после первого осаждения ТСА. Они будут удалены за счет дополнительных осадков TCA.
- Анализируют по 20 мкл каждой фракции с помощью SDS-PAGE39 и иммуноблоттинга40,41,42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Относительно легко разделить внутреннюю и внешнюю мембраны митохондрий. Однако генерация и разделение пузырьков, содержащих контактный сайт, значительно сложнее. На наш взгляд, важными и важными являются два этапа: условия ультразвуковой обработки и используемый градиент.
Обычно считается, что линейные градиенты имеют лучшее разрешение по сравнению со ступенчатыми градиентами. Однако их воспроизводимое производство утомительно и требует специального оборудования. Поэтому мы разработали метод генерации градиента шага с относительно небольшими различиями между отдельными шагами (см. шаг 3.5). Мы предположили, что градиент шага будет уравновешен при центрифугировании, что приведет к почти линейному градиенту. Поразительно, но определение концентраций сахарозы в отдельных фракциях после центрифугирования с помощью рефрактометра показало, что градиент шага действительно стал практически линейным после 12 ч центрифугирования при 200 000 x g (рис. 3).
Важность мягкого ультразвукового воздействия очевидна в этих репрезентативных результатах. В условиях мягкого ультразвукового воздействия (рис. 4А) маркер внешней мембраны митохондрий Tom40 обогащался в ранних фракциях низкой плотности (фракция No 4) и практически отсутствовал в более поздних. Маркер внутренней мембраны митохондрий Tim17 концентрировался во фракциях высокой плотности (фракция No 17). Напротив, в контактном сайте белка Mic60 накапливались фракции промежуточной концентрации сахарозы (фракция No 12-14), что свидетельствует об успешной генерации и последующем разделении различных мембранных везикул. Напротив, при более жестких условиях ультразвуковой обработки маркер внешней мембраны митохондрий Tom40 может быть обнаружен в более низких фракциях градиента (фракция No 14 и фракция No 17, рис. 4B). Кроме того, значительное количество Tim17 было обнаружено во фракциях промежуточной плотности (фракция No 13 и фракция No 14, рисунок 4Б). Неспецифическое накопление маркеров внешней и внутренней мембраны во фракциях промежуточной плотности свидетельствует об искусственном образовании смешанных мембран, что тормозит идентификацию белков-кандидатов.
Рисунок 1: Схематическое изображение митохондриальной ультраструктуры. Схематическое изображение митохондрии, показывающее различные компартменты, мембраны и расположение белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рабочий процесс митохондриального фракционирования для выделения белков контактного сайта. Схематический обзор процесса, описанного в протоколе. (1) свежеизолированные митохондрии были (2) осмотически набухшими (3), а затем сморщенными. (4) Сморщенные митохондрии возражали против умеренного ультразвукового воздействия для генерации субмитохондриальных везикул. (5) Смесь везикул концентрировали и загружали на ступенчатый градиент сахарозы. (6) Путем центрифугирования везикулы внешней мембраны митохондрий обогащали при низкой концентрации сахарозы, везикулы внутренней мембраны митохондрий — при высокой концентрации сахарозы, а везикулы, содержащие сайт контакта, — при промежуточной концентрации сахарозы. Сокращения: MIM, митохондриальная внутренняя мембрана; MOM, митохондриальная наружная мембрана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Генерация линейного градиента центрифугированием. Параллельно готовили два ступенчатых градиента (1,3 М, 1,13 М, затем 1,02 М, 0,96 М и 0,8 М в 20 мМ MOPS и 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,4), и на оба градиента загружали 1 мл 0,6 М сахарозы в 20 мМ MOPS и 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,4. Градиенты подвергали центрифугированию при 200 000 x g и 4°C в течение 12 ч и собирали по 17 фракций каждая. Воспроизводимость метода проверяли путем определения концентрации сахарозы в отдельных фракциях отдельных градиентов с помощью рефрактометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Выделение белков контактного сайта с помощью четко выраженного ультразвукового импульса. (А,Б) Свежевыделенные митохондрии дрожжей подвергали осмотической обработке и воздействию ультразвука. Полученные везикулы разделяли с помощью центрифугирования с градиентом плотности сахарозы. Градиент фракционировали, а белки в различных фракциях подвергали осаждению ТСА. Распределение маркерных белков для наружной мембраны митохондрий (Tom40), внутренней мембраны митохондрий (Tim17) и контактных сайтов (Mic60) анализировали методом иммуноблоттинга с использованием указанных антител. (A) Мягкая ультразвуковая обработка (4 x 30 с, амплитуда 10%) привела к четкому разделению белков внешней мембраны (фракции низкой плотности) и белков внутренней мембраны (фракции высокой плотности). Кроме того, белок контактного сайта Mic60 был успешно обогащен фракциями промежуточной плотности. (Б) Более жесткое ультразвуковое воздействие (4 x 30 с, амплитуда 20%) приводило к образованию гибридных везикул и, таким образом, не позволяло четко разделить места контакта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Митохондриальное субфракционирование представляет собой сложный эксперимент с несколькими очень сложными этапами. Поэтому мы стремились к дальнейшему совершенствованию и, в определенной степени, к упрощению нашего устоявшегося метода32. Здесь сложность заключалась в том, что требовалось сложное и узкоспециализированное оборудование, которое часто представляет собой отдельные конструкции, а также огромные затраты времени и энергии. С этой целью мы постарались отказаться от насосов и отдельных конструкций, используемых для литья и уборки линейного градиента, и перешли на ступенчатый градиент. Важно отметить, что мы поняли, что, по крайней мере, при приготовлении так, как описано здесь, градиент становится линейным во время центрифугирования, что делает его допустимой заменой. Этот метод (i) устраняет необходимость в градиентном смесителе, что приводит к уменьшению требуемого оборудования; (ii) экономит время в день эксперимента, так как градиент может быть подготовлен заранее; и (iii) обладает высокой воспроизводимостью (рис. 3) при приготовлении в соответствии с описанным методом, который включает замораживание отдельных этапов перед наложением следующего сверху. Эти градиенты также могут храниться неограниченное время при температуре −20°C. Кроме того, нагружение предлагаемого здесь градиента седиментации также проще, чем прослоение везикулярной смеси под градиентом, как описано в аналогичных методах 9,32. Для загрузки флотационного градиента требуется шприц с длинной канюлей для прохождения уже отлитого градиента. Этот шаг всегда был проблематичным из-за риска разрушения градиента. Еще одним преимуществом этого метода является меньшее время центрифугирования 12 ч по сравнению с 24 ч32, что значительно сокращает время и энергию, необходимые для этого метода. Осуществимость и воспроизводимость описанной здесь усовершенствованной процедуры подчеркивается недавней идентификацией MICOS-независимого контактного сайта, образованного Cqd1 и Por1-Om1428.
Тем не менее, этот эксперимент все еще очень сложен. Для получения оптимальных результатов необходимо учитывать несколько важных критериев при применении этого протокола.
Одним из наиболее важных аспектов является качество митохондрий. Они должны быть свежеизолированы. Поэтому культивирование дрожжей, а также выделение митохондрий должны быть приняты во внимание при планировании процедуры. Щадящая обработка митохондрий во время изоляции предотвратит разрушение мембран, в то время как также крайне важно ингибировать протеазы соответствующей концентрацией PMSF или, в качестве альтернативы, коммерчески доступными коктейлями ингибиторов протеазы34.
Еще одним важным этапом и одним из самых важных аспектов процедуры является ультразвуковая терапия. Важно отметить, что правильно оценить интенсивность ультразвукового импульса можно по звуку, генерируемому при закручивании суспензии (см. видео). Тем не менее, оптимальные условия должны быть определены экспериментально для каждой экспериментальной установки, не только на основе разных марок и моделей, но и на разных машинах одной и той же модели. Примечательно, что разборка и очистка наконечника также влияют на интенсивность ультразвуковой обработки, что делает необходимой перенастройку условий. Рекомендация в протоколе также заключается в том, чтобы использовать розетку для более высокой эффективности, но другие сосуды также могут подойти. Слишком резкое ультразвуковое воздействие приведет к образованию искусственно смешанных везикул. Это приведет к сильному накоплению белков внутренней и внешней мембраны во фракциях промежуточной плотности, которые могут быть еще сильнее, как в показанном примере (рис. 4Б). В этом случае следует уменьшить амплитуду или время ультразвукового воздействия. Однако проблемы также могут возникнуть, когда ультразвуковая обработка недостаточно интенсивна. В этом случае выход сгенерированных везикул может быть слишком низким для обнаружения белков методом иммуноблоттинга, и, следовательно, придется увеличивать амплитуду, время или циклы ультразвуковой обработки.
Наконец, градиент важен для разделения различных образующихся везикул. Однако оптимальный максимум и минимум градиента сахарозы, а также количество ступеней также могут варьироваться в зависимости от индивидуальной настройки. Здесь пятиступенчатый градиент с максимумом 1,3 М сахарозы и минимумом 0,8 М сахарозы был достаточен для видимого и воспроизводимого отделения везикул, содержащих контактный сайт, от внутренних и наружных мембранных везикул митохондрий. Для начала важно выбрать условия, при которых остаются пустые фракции над пузырьками внешней мембраны митохондрий и под везикулами внутренней мембраны митохондрий, чтобы обеспечить правильное разделение. Сжатие верхних или нижних фракций может привести к появлению артефактов. На более поздних этапах, когда известна точная молярность сахарозы, при которой будут накапливаться внутренние и внешние мембранные везикулы, градиент может быть оптимизирован путем увеличения или уменьшения максимальной и минимальной концентраций сахарозы для улучшения разрешения между внутренней мембраной, внешней мембраной и контактными участками. Следует отметить, что условия роста дрожжей могут влиять на поведение образующихся везикул при центрифугировании плотности. Здесь дрожжи выращивали на богатой среде YP (1% [w/v] дрожжевого экстракта, 2% [w/v] пептона, pH 5,5), содержащей глицерин (3 % [v/v]) в качестве источника углерода при 30 °C34,44. Другие условия роста могут изменять белковый и липидный состав митохондрий и, таким образом, плотность образующихся везикул.
Описанный метод обеспечивает надежный и воспроизводимый способ изоляции мест контакта. Однако для определения белкового состава соответствующего контактного участка (внутреннего и внешнего компонентов мембраны) необходимы дополнительные анализы, такие как иммунопреципитация, возможно, в сочетании с масс-спектрометрией. Для этого необходимы специфические антитела и модельные организмы, экспрессирующие меченые версии белковых кандидатов. При использовании дрожжей в качестве модельного организма можно легко получить белковые кандидаты благодаря разнообразию доступных методов генетической модификации и существованию меченых библиотек45,46,47. Поэтому мы решили создать и оптимизировать этот протокол для митохондрий дрожжей. Несмотря на то, что метод можно адаптировать для митохондрий, изолированных от других организмов, преимущество дрожжей заключается в том, что они позволяют получать большое количество митохондрий дешевым и быстрым способом. Более того, использование дрожжей в качестве модельного организма для получения первоначальных результатов является хорошо зарекомендовавшим себя способом идентификации белковых комплексов и процессов, которые сохраняются у высших эукариот вплоть до человека. Как указывалось ранее, после идентификации и характеристики MICOS у дрожжей 9,10,11 было показано, что MICOS сохраняется по форме и функциям у высших эукариот21. Cqd1 и Por1, компоненты недавно обнаруженного MICOS-независимого контактного сайта28, также сохраняются, что указывает на то, что этот контактный сайт также присутствует у высших эукариот.
Важность продолжения исследований этих контактных участков подчеркивается связями MICOS с различными нейродегенеративными заболеваниями 18,48,49,50,51,52,53,54. Правильное фосфорилирование Mic60 с помощью PINK1 было связано с поддержанием кристальных соединений в Drosophilia, и, таким образом, этот путь, который сохраняется для людей, может быть связанс болезнью Паркинсона. Кроме того, точечная мутация в субъединице MICOS человека Mic14 приводит к дестабилизации MICOS и последующему изменению ультраструктуры митохондрий, которые были обнаружены у пациентов, страдающих лобно-височной деменцией и боковым амиотрофическим склерозом 50,51,52,53,54. Поскольку Mic14 сохраняется от дрожжей до человека, дальнейшие исследования этого белка могут быть проведены с использованием дрожжей в качестве модельного организма. Это фундаментальное исследование может привести к лучшему пониманию основных механизмов этих заболеваний, что может ускорить разработку эффективных методов их лечения. Более того, недавние открытия дополнительных MICOS-независимых контактных участков27,28 указывают на то, что это поле все еще растет. Таким образом, представленный здесь протокол может помочь в продвижении этого многообещающего и увлекательного исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
M.E.H. выражает благодарность Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), проект номер 413985647, за финансовую поддержку. Авторы благодарят д-ра Михаэля Киблера, Университет Людвига-Максимилиана, Мюнхен, за его щедрую и всестороннюю поддержку. Мы благодарны Вальтеру Нойперту за его научный вклад, полезные дискуссии и постоянное вдохновение. Й.Ф. благодарит Высшую школу наук о жизни в Мюнхене (LSM) за поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any Abbe refractometer can be used |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
References
- Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
- Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
- Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
- Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
- Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
- Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
- Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
- Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
- Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
- vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
- Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
- Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
- Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
- Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
- Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
- Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
- Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
- John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
- Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
- Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
- Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
- Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
- Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
- Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
- Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
- Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
- Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
- Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
- Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
- Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
- Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
- Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
- Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
- Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
- Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
- Koontz, L.
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Al-Tubuly, A. A.
- Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Sherman, F.
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
- Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
- Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
- Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
- Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
