Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65444
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG
* These authors contributed equally

Summary

Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

Abstract

Las mitocondrias están presentes en prácticamente todas las células eucariotas y realizan funciones esenciales que van mucho más allá de la producción de energía, por ejemplo, la síntesis de grupos de hierro-azufre, lípidos o proteínas, la amortiguación de Ca2+ y la inducción de la apoptosis. Del mismo modo, la disfunción mitocondrial da lugar a enfermedades humanas graves como el cáncer, la diabetes y la neurodegeneración. Para realizar estas funciones, las mitocondrias tienen que comunicarse con el resto de la célula a través de su envoltura, que consta de dos membranas. Por lo tanto, estas dos membranas tienen que interactuar constantemente. Los sitios de contacto proteico entre las membranas interna y externa mitocondrial son esenciales a este respecto. Hasta el momento, se han identificado varios sitios de contacto. En el método descrito aquí, las mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae se utilizan para aislar los sitios de contacto y, por lo tanto, identificar candidatos que califican para proteínas del sitio de contacto. Utilizamos este método para identificar el complejo del sitio de contacto mitocondrial y el sistema organizador de crestas (MICOS), uno de los principales complejos formadores de sitios de contacto en la membrana interna mitocondrial, que se conserva de la levadura a los humanos. Recientemente, mejoramos aún más este método para identificar un nuevo sitio de contacto que consiste en Cqd1 y el complejo Por1-Om14.

Introduction

Las mitocondrias realizan una variedad de funciones diferentes en los eucariotas, siendo la más conocida la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Otras funciones incluyen la producción de grupos de hierro-azufre, la síntesis de lípidos y, en eucariotas superiores, la señalización de Ca2+ y la inducción de la apoptosis 1,2,3,4. Estas funciones están inseparablemente ligadas a su compleja ultraestructura.

La ultraestructura mitocondrial fue descrita por primera vez por microscopía electrónica5. Se demostró que las mitocondrias son orgánulos bastante complejos que constan de dos membranas: la membrana externa mitocondrial y la membrana interna mitocondrial. Así, estas membranas forman dos compartimentos acuosos: el espacio intermembrana y la matriz. La membrana interna mitocondrial se puede dividir aún más en diferentes secciones. La membrana límite interna permanece muy cerca de la membrana externa, y las crestas forman invaginaciones. Las llamadas uniones crista conectan la membrana límite interna y las crestas (Figura 1). Además, las micrografías electrónicas de mitocondrias osmóticamente encogidas revelan que existen sitios en los que las membranas mitocondriales están estrechamente conectadas 6,7. Estos llamados sitios de contacto están formados por complejos proteicos que abarcan las dos membranas (Figura 1). Se cree que estos sitios de interacción son esenciales para la viabilidad celular debido a su importancia para la regulación de la dinámica mitocondrial y la herencia, así como para la transferencia de metabolitos y señales entre el citosol y la matriz8.

El complejo MICOS en la membrana interna mitocondrial es probablemente el complejo formador de sitios de contacto mejor caracterizado y más versátil. MICOS fue descrito en levaduras en 2011, y consta de seis subunidades 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 y Mic10. Estos forman un complejo de aproximadamente 1,5 MDa que se localiza en las unionescrista 9,10,11. La deleción de cualquiera de las subunidades centrales, Mic10 o Mic60, conduce a la ausencia de este complejo 9,11, lo que significa que estas dos subunidades son esenciales para la estabilidad de MICOS. Curiosamente, MICOS forma no solo uno, sino múltiples sitios de contacto con varias proteínas y complejos de la membrana externa mitocondrial: el complejo TOM 11,12, el complejo TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, el complejo Fzo1-Ugo19,Por1 10, OM45 10 y Miro 17. Esto indica fuertemente que el complejo MICOS está involucrado en varios procesos mitocondriales, como la importación de proteínas, el metabolismo de los fosfolípidos y la generación de la ultraestructura mitocondrial18. Esta última función es probablemente la principal función de MICOS, ya que la ausencia del complejo MICOS inducida a través de la deleción de MIC10 o MIC60 conduce a una ultraestructura mitocondrial anormal que carece prácticamente por completo de crestas regulares. En cambio, las vesículas de membrana interna sin conexión con la membrana límite interna acumulan19, 20. Es importante destacar que MICOS se conserva en forma y función desde la levadura hasta el ser humano21. La asociación de mutaciones en subunidades MICOS con enfermedades humanas graves también enfatiza su importancia para los eucariotas superiores22,23. Aunque MICOS es muy versátil, deben existir sitios de contacto adicionales (según nuestras observaciones no publicadas). De hecho, se han identificado varios otros sitios de contacto, por ejemplo, las maquinarias de fusión mitocondrial Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1, que está involucrada en la biosíntesis del fosfolípido mitocondrial específico cardiolipina 27. Recientemente, mejoramos el método que nos llevó a la identificación de MICOS para identificar Cqd1 como parte de un nuevo sitio de contacto formado con el complejo de membrana externa Por1-Om1428. Curiosamente, este sitio de contacto también parece estar involucrado en múltiples procesos, como la homeostasis de la membrana mitocondrial, el metabolismo de los fosfolípidos y la distribución de la coenzima Q28,29.

En este caso, se utilizó una variación del fraccionamiento de mitocondrias descrito anteriormente 9,30,31,32,33. El tratamiento osmótico de las mitocondrias conduce a la ruptura de la membrana externa mitocondrial y a una contracción del espacio de la matriz, dejando las dos membranas solo muy cerca en los sitios de contacto. Esto permite la generación de vesículas que consisten exclusivamente en la membrana externa mitocondrial o en la membrana interna mitocondrial o en los sitios de contacto de ambas membranas a través de una sonicación suave. Debido a que la membrana interna mitocondrial posee una proporción proteína-lípidos mucho más alta, las vesículas de la membrana interna mitocondrial exhiben una mayor densidad en comparación con las vesículas de la membrana externa mitocondrial. La diferencia de densidad se puede utilizar para separar las vesículas de membrana a través de la centrifugación en gradiente de densidad de flotación de sacarosa. Por lo tanto, las vesículas de la membrana externa mitocondrial se acumulan a bajas concentraciones de sacarosa, mientras que las vesículas de la membrana interna mitocondrial se enriquecen a altas concentraciones de sacarosa. Las vesículas que contienen los sitios de contacto se concentran en concentraciones intermedias de sacarosa (Figura 2). El siguiente protocolo describe en detalle este método mejorado, que requiere menos equipo especializado, tiempo y energía en comparación con el establecido anteriormente32, y proporciona una herramienta útil para la identificación de posibles proteínas en el sitio de contacto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tampones y soluciones madre

  1. Prepare una solución de ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS) 1 M en agua desionizada, pH 7,4. Conservar a 4 °C.
  2. Preparar 500 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en agua desionizada, pH 8,0. Almacenar a temperatura ambiente.
  3. Preparar sorbitol 2,4 M en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.
  4. Preparar 2,5 M de sacarosa en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.
  5. Prepare 200 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en isopropanol. Conservar a -20 °C.
    PRECAUCIÓN: El PMSF es tóxico si se ingiere y causa quemaduras graves en la piel y daños oculares. No respire el polvo y use guantes y gafas protectoras.
  6. Preparar ácido tricloroacético (TCA) al 72% en agua desionizada. Conservar a 4 °C.
    PRECAUCIÓN: El TCA puede causar irritación respiratoria, quemaduras graves en la piel y daño ocular. No respire el polvo y use guantes y gafas protectoras.
  7. Preparar el tampón SM: 20 mM MOPS y 0,6 M de sorbitol, pH 7,4.
  8. Prepare el tampón de hinchamiento: 20 mM de MOPS, 0,5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y cóctel de inhibidores de la proteasa, pH 7,4.
  9. Prepare los tampones de gradiente de sacarosa: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M y 1,3 M de sacarosa en 20 mM de MOPS y 0,5 mM de EDTA, pH 7,4.
    NOTA: Todos los tampones se pueden almacenar a 4 °C; sin embargo, se recomienda almacenar los tampones que contienen sacarosa a -20 °C para evitar el crecimiento de hongos. Los inhibidores de la proteasa deben añadirse de nuevo antes de su uso.

2. Generación de vesículas submitocondriales

  1. Aislar las mitocondrias crudas de levadura frescas de acuerdo con los protocolos establecidos34,35.
    NOTA: Para este experimento, se aislaron mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae. No es necesaria la generación de mitocondrias puras en gradiente desprovistas de otros orgánulos.
  2. Resuspender 10 mg de mitocondrias recién aisladas en 1,6 ml de tampón SM (4 °C) mediante pipeteo (Figura 2, paso 1).
  3. Transfiera la suspensión mitocondrial a un matraz Erlenmeyer de 100 ml preenfriado.
  4. Agregue lentamente 16 ml de tampón de hinchazón con una pipeta de vidrio de 20 ml. Aplique una agitación suave constante sobre hielo durante la adición. Este tratamiento osmótico da como resultado la absorción de agua en el espacio de la matriz. La hinchazón de la membrana interna mitocondrial alterará la membrana externa. Sin embargo, ambas membranas permanecerán en contacto en los sitios de contacto9 (Figura 2, paso 2).
  5. Incubar las muestras bajo agitación suave constante durante 30 minutos en hielo.
  6. Agregue lentamente 5 ml de solución de sacarosa 2,5 M con una pipeta de vidrio de 5 ml para aumentar la concentración de sacarosa en las muestras a aproximadamente 0,55 M. Este tratamiento osmótico da como resultado un flujo de agua de la matriz36. La contracción de la membrana interna tiene como objetivo maximizar su distancia a los fragmentos residuales de la membrana externa. Esto disminuye la probabilidad de generar vesículas híbridas artificiales de membranas internas y externas a través de la sonicación (Figura 2, paso 3).
  7. Incubar las muestras bajo una agitación suave durante 15 minutos en hielo.
  8. Sométase las mitocondrias a sonicación para generar vesículas de membrana submitocondrial (Figura 2, paso 4).
    1. Transfiera la suspensión mitocondrial a una celda roseta preenfriada.
    2. Sonicar la suspensión mitocondrial a una amplitud del 10% durante 30 s mientras se enfría la célula roseta en un baño de hielo.
    3. Deje reposar la suspensión durante 30 s en un baño de hielo.
    4. Repita los pasos 2.8.2 y 2.8.3 tres veces más.
      NOTA: Las condiciones de sonicación variarán según el sonicador utilizado. La optimización será necesaria para máquinas individuales. La sonicación demasiado dura conducirá a la formación artificial de vesículas formadas por membranas internas y externas mitocondriales.

3. Separación de vesículas submitocondriales

  1. Separar las vesículas generadas de las mitocondrias intactas restantes mediante centrifugación a 20.000 x g durante 20 min a 4 °C. Las mitocondrias intactas se granularán mientras que las vesículas permanecerán en el sobrenadante.
  2. Concentra la mezcla de vesículas.
    1. Transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrifugación nuevos.
    2. Cargue una almohadilla de 0,3 ml de solución de sacarosa 2,5 M en el fondo del tubo utilizando una jeringa de 1 ml equipada con una cánula de 0,8 mm x 120 mm.
    3. Centrifugar a 118.000 x g durante 100 min a 4 °C.
      NOTA: En este caso, se utilizó un rotor de cangilón basculante con un radio máximo de 153,1 mm. Las condiciones de centrifugación dependen en gran medida del rotor y tendrán que adaptarse cuando se utilice otro rotor.
  3. Las vesículas aparecerán como un disco en la parte superior de la almohadilla de sacarosa después de la centrifugación. Deseche aproximadamente el 90% del sobrenadante. Ahora, recoja las vesículas concentradas resuspendiéndolas en el tampón restante, incluida la sacarosa de 2,5 M, pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión a un homogeneizador Dounce helado.
  4. Homogeneizar la suspensión con al menos 10 pasadas utilizando un alfarero de politetrafluoroetileno.
  5. Prepara el degradado de sacarosa.
    1. Para un gradiente escalonado de 11 mL con cinco pasos (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M y 0,8 M de sacarosa en 20 mM de MOPS y 0,5 mM de EDTA, pH 7,4), cada capa tiene 2,2 mL de solución de sacarosa.
      NOTA: Se recomienda un refractómetro para medir y ajustar las concentraciones de sacarosa; sin embargo, no es esencial. Aplique 10 μL del tampón al refractómetro y detecte los respectivos índices de refracción. El cálculo de la concentración de sacarosa es el siguiente:
      Equation 1
      1.3333 representa el índice de refracción del agua. 0,048403 es un índice de conversión específico de sacarosa obtenido a partir del escalado lineal de la refractividad molar a la concentración de sacarosa en soluciones acuosas 37.
    2. Agregue la concentración más alta de sacarosa al tubo de centrifugación y coloque el tubo a -20 °C. Espere hasta que la capa esté completamente congelada antes de aplicar la siguiente. Proceda en consecuencia hasta que se agregue la última capa y almacene los degradados a -20 °C.
      NOTA: Recuerde transferir los gradientes congelados a 4 °C al iniciar el experimento para permitir que los gradientes se descongelen. Esto tomará aproximadamente 3 h. Para la centrifugación se utilizó un rotor de cangilón basculante con una capacidad de 13,2 ml. Cuando se utiliza un rotor diferente, los volúmenes de paso de gradiente deben adaptarse en consecuencia.
  6. Mida la concentración de sacarosa de las muestras con un refractómetro. Si no hay acceso a un refractómetro, se podría suponer alternativamente que la concentración de sacarosa es de 2 M. Esta supuesta concentración de sacarosa será la base para el siguiente paso.
  7. Ajuste la concentración de sacarosa a 0,6 M mediante la adición de una cantidad adecuada de 20 mM de MOPS, 0,5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y cóctel de inhibidores de proteasa, pH 7,4. Si la concentración de sacarosa se estima en 2 M en lugar de medirse, se recomienda probar si la concentración es lo suficientemente baja después del ajuste. Aplique una pequeña alícuota de la muestra (aprox. 50 μL) sobre 200 μL de sacarosa 0,8 M en un tubo de ensayo. La muestra debe permanecer encima de la sacarosa 0,8 M.
  8. Cargue las muestras (aproximadamente 1 ml) en la parte superior del gradiente de sacarosa (guarde el 10% para referencia posterior). Es importante un pipeteo cuidadoso para evitar la alteración del gradiente (Figura 2, paso 5).
  9. Separar las vesículas por centrifugación a 200.000 x g y 4 °C durante 12 h. Si es posible, ajuste la centrífuga a aceleración y desaceleración lentas para evitar la perturbación del gradiente (Figura 2, paso 6).
    NOTA: En este caso, se utilizó un rotor de cangilón basculante con un radio máximo de 153,1 mm. Las condiciones de centrifugación dependen en gran medida del rotor y tendrán que adaptarse cuando se utilice otro rotor.
  10. Coseche el gradiente de arriba a abajo en fracciones de 700 μL con una pipeta de 1 mL. Esto dará como resultado 17 fracciones, lo que permite una resolución suficiente.

4. Análisis de vesículas suzocondriales

  1. Concentrar las proteínas sometiendo cada fracción a dos precipitaciones de TCA38 realizadas secuencialmente para preparar las muestras SDS-PAGE.
    1. Añadir 200 μL de TCA al 72% a las fracciones individuales y mezclar hasta que la solución sea homogénea. Incubar las fracciones durante 30 min en hielo, y granular las proteínas precipitadas por centrifugación a 20.000 x g y 4 °C durante 20 min. Deseche el sobrenadante, agregue 500 μL de solución de TCA al 28 %, mezcle bien y repita el paso de centrifugación.
    2. Lavar los gránulos con 1 ml de acetona (−20 °C) y centrifugar durante 10 min a 20.000 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante y deje que los gránulos se sequen al aire. Vuelva a suspender los gránulos en 60 μL de tampón de muestra SDS e incube las muestras durante 5 min a 95 °C.
      NOTA: Quedará una gran cantidad de sacarosa, particularmente en las fracciones de alta densidad, después de la primera precipitación de TCA. Esto se eliminará a través de la precipitación adicional de TCA.
  2. Analizar 20 μL de cada fracción mediante SDS-PÁGINA39 e inmunotransferencia40,41,42,43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Es relativamente fácil separar las membranas internas y externas mitocondriales. Sin embargo, la generación y separación de vesículas que contienen sitios de contacto es mucho más difícil. En nuestra opinión, dos pasos son críticos y esenciales: las condiciones de sonicación y el gradiente utilizado.

Por lo general, se cree que los degradados lineales tienen una mejor resolución en comparación con los degradados escalonados. Sin embargo, su producción reproducible es tediosa y requiere equipos especiales. Por lo tanto, establecimos un método para generar un gradiente de pasos con diferencias relativamente pequeñas entre los pasos individuales (ver paso 3.5). Especulamos que el gradiente de paso se equilibraría tras la centrifugación, lo que daría como resultado un gradiente casi lineal. Sorprendentemente, la determinación de las concentraciones de sacarosa de las fracciones individuales después de la centrifugación utilizando un refractómetro reveló que el gradiente de paso se volvió prácticamente lineal después de 12 h de centrifugación a 200.000 x g (Figura 3).

La importancia de la sonicación suave es evidente en estos resultados representativos. En condiciones de sonicación leve (Figura 4A), el marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 se enriqueció en las fracciones tempranas de baja densidad (Fracción n.º 4) y estuvo prácticamente ausente en las posteriores. El marcador de membrana interna mitocondrial Tim17 se concentró en fracciones de alta densidad (Fracción Nº 17). Por el contrario, la proteína Mic60 en el sitio de contacto se acumuló en fracciones de concentración intermedia de sacarosa (Fracción No. 12-14), lo que indica la generación exitosa y la posterior separación de las diversas vesículas de membrana. Por el contrario, con condiciones de sonicación más duras, el marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 podría detectarse en fracciones más bajas del gradiente (Fracción n.º 14 y Fracción n.º 17, Figura 4B). Además, hubo una cantidad significativa de Tim17 en fracciones de densidad intermedia (Fracción Nº 13 y Fracción Nº 14, Figura 4B). La acumulación inespecífica de marcadores de membrana externa e interna en fracciones de densidad intermedia indica la formación artificial de membranas mixtas, lo que inhibe la identificación de proteínas candidatas.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática de la ultraestructura mitocondrial. Una representación esquemática de una mitocondria para mostrar los diferentes compartimentos, membranas y ubicaciones de proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Flujo de trabajo del fraccionamiento mitocondrial para aislar proteínas en el sitio de contacto. Una descripción general esquemática del proceso descrito en el protocolo. Las (1) mitocondrias recién aisladas estaban (2) hinchadas osmóticamente (3) y luego encogidas. (4) Las mitocondrias encogidas se sometieron a una sonicación leve para generar vesículas suestocondriales. (5) La mezcla de vesículas se concentró y se cargó en un gradiente escalonado de sacarosa. (6) A través de la centrifugación, las vesículas de la membrana externa mitocondrial se enriquecieron a una baja concentración de sacarosa, las vesículas de la membrana interna mitocondrial a una alta concentración de sacarosa y las vesículas que contienen el sitio de contacto a una concentración intermedia de sacarosa. Abreviaturas: MIM, membrana interna mitocondrial; MOM: membrana externa mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Generación de un gradiente lineal por centrifugación. Se prepararon dos gradientes escalonados (1,3 M, 1,13 M, luego 1,02 M, 0,96 M y 0,8 M en MOPS de 20 mM y EDTA de 0,5 mM, pH 7,4) en paralelo, y se cargó 1 mL de sacarosa de 0,6 M en MOPS de 20 mM y EDTA de 0,5 m, pH 7,4, en ambos gradientes. Los gradientes se sometieron a centrifugación a 200.000 x g y 4°C durante 12 h y se cosecharon en 17 fracciones cada uno. La reproducibilidad del método se comprobó mediante la determinación de la concentración de sacarosa de las fracciones individuales de los gradientes individuales utilizando un refractómetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Aislamiento de proteínas en el sitio de contacto con un pulso ultrasónico bien definido. (A,B) Las mitocondrias de levadura recién aisladas se sometieron a un tratamiento osmótico y se expusieron a sonicación. Las vesículas generadas se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de flotación de sacarosa. El gradiente se fraccionó y las proteínas de las distintas fracciones se sometieron a precipitación de TCA. La distribución de las proteínas marcadoras para la membrana externa mitocondrial (Tom40), la membrana interna mitocondrial (Tim17) y los sitios de contacto (Mic60) se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando los anticuerpos indicados. (A) La sonicación leve (4 x 30 s, 10% de amplitud) dio lugar a una clara separación de las proteínas de la membrana externa (fracciones de baja densidad) y las proteínas de la membrana interna (fracciones de alta densidad). Además, la proteína Mic60 en el sitio de contacto se enriqueció con éxito en fracciones de densidad intermedia. (B) La sonicación más dura (4 x 30 s, 20% de amplitud) dio lugar a la generación de vesículas híbridas y, por tanto, no permitió una separación clara de los puntos de contacto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El subfraccionamiento mitocondrial es un experimento complicado con varios pasos muy complejos. Por lo tanto, nuestro objetivo era mejorar aún más y, hasta cierto punto, simplificar nuestro método establecido32. En este caso, los desafíos eran la necesidad de equipos complicados y altamente especializados, que a menudo son construcciones individuales, y el enorme consumo de tiempo y energía. Con este fin, intentamos eliminar las bombas y las construcciones individuales utilizadas para la fundición y la recolección del gradiente lineal y cambiamos a un gradiente escalonado. Es importante destacar que nos dimos cuenta de que, al menos cuando se prepara como se describe aquí, el gradiente se vuelve lineal durante la centrifugación, lo que lo convierte en un reemplazo válido. Este método (i) elimina la necesidad de un mezclador de gradiente, disminuyendo así el equipo necesario; (ii) ahorra tiempo el día del experimento, ya que el gradiente se puede preparar con anticipación; y (iii) es altamente reproducible (Figura 3) cuando se prepara de acuerdo con el método descrito, que implica congelar los pasos individuales antes de colocar el siguiente en capas encima. Estos gradientes también se pueden almacenar indefinidamente a -20 °C. Además, la carga del gradiente de sedimentación aquí sugerido también es más fácil que tener que colocar la mezcla de vesículas debajo del gradiente, como se describe en métodos similares 9,32. La carga de un gradiente de flotación requiere una jeringa con una cánula larga para pasar el gradiente ya fundido. Este paso siempre fue problemático debido al riesgo de destruir el gradiente. Otra ventaja de este método es el menor tiempo de centrifugación de 12 h en comparación con 24 h32, lo que reduce en gran medida el tiempo y la energía necesarios para este método. La viabilidad y la reproducibilidad del procedimiento mejorado aquí descrito se ponen de manifiesto por la reciente identificación del sitio de contacto independiente de MICOS formado por Cqd1 y Por1-Om1428.

Sin embargo, este experimento sigue siendo muy complejo. Para obtener resultados óptimos, hay varios criterios esenciales que deben tenerse en cuenta a la hora de aplicar este protocolo.

Uno de los aspectos más importantes es la calidad de las mitocondrias. Estos tienen que estar recién aislados. Por lo tanto, el cultivo de levaduras, así como el aislamiento de las mitocondrias, deben tenerse en cuenta al planificar el procedimiento. El tratamiento suave de las mitocondrias durante el aislamiento evitará la ruptura de las membranas, mientras que también es fundamental inhibir las proteasas con una concentración adecuada de PMSF o, alternativamente, cócteles de inhibidores de proteasas disponibles comercialmente34.

Otro paso importante, y uno de los aspectos más críticos del procedimiento, es la sonicación. Es importante destacar que es posible estimar la intensidad correcta del pulso ultrasónico por el sonido generado a través del remolino de la suspensión (ver video). Sin embargo, las condiciones óptimas deben determinarse experimentalmente para cada configuración experimental, no solo en función de diferentes marcas y modelos, sino también de diferentes máquinas del mismo modelo. En particular, el desmontaje y la limpieza de la punta también afectan a la intensidad de la sonicación, lo que hace necesario un reajuste de las condiciones. La recomendación en el protocolo también es usar una celda de roseta para una mayor eficiencia, pero otros vasos también podrían funcionar. La sonicación demasiado dura conducirá a la formación de vesículas mezcladas artificialmente. Esto dará lugar a una fuerte acumulación de proteínas de membrana interna y externa en fracciones de densidad intermedia, que pueden ser aún más fuertes, como en el ejemplo mostrado (Figura 4B). Si esto ocurre, hay que reducir la amplitud o el tiempo de la sonicación. Sin embargo, también pueden surgir problemas cuando la sonicación no es lo suficientemente intensa. En este caso, el rendimiento de las vesículas generadas podría ser demasiado bajo para detectar proteínas por inmunotransferencia y, por lo tanto, habría que aumentar la amplitud, el tiempo o los ciclos de sonicación.

Por último, el gradiente es importante para la separación de las distintas especies de vesículas generadas. Sin embargo, el máximo y el mínimo óptimos del gradiente de sacarosa, así como el número de pasos, también pueden variar en función de la configuración individual. En este caso, un gradiente de cinco pasos con un máximo de 1,3 M de sacarosa y un mínimo de 0,8 M de sacarosa fue suficiente para una separación visible y reproducible de las vesículas que contienen el sitio de contacto de las vesículas de la membrana interna y externa mitocondrial. Al principio, es esencial elegir condiciones que dejen fracciones vacías por encima de las vesículas de la membrana externa mitocondrial y por debajo de las vesículas de la membrana interna mitocondrial para asegurar una correcta separación. La compresión de las fracciones superior o inferior puede dar lugar a artefactos. En pasos posteriores, cuando se conoce la molaridad precisa de la sacarosa en la que se acumularán las vesículas de la membrana interna y externa, el gradiente se puede optimizar aumentando o disminuyendo las concentraciones máximas y mínimas de sacarosa para mejorar la resolución entre la membrana interna, la membrana externa y los sitios de contacto. Cabe destacar que las condiciones de crecimiento de la levadura pueden afectar el comportamiento de las vesículas generadas tras la centrifugación por densidad. Aquí, la levadura se cultivó en un medio rico en YP (1% [p/v] de extracto de levadura, 2% [p/v] de peptona, pH 5,5) que contenía glicerol (3 % [v/v]) como fuente de carbono a 30 °C34,44. Otras condiciones de crecimiento pueden alterar la composición proteica y lipídica de las mitocondrias y, por lo tanto, la densidad de las vesículas generadas.

El método descrito proporciona una forma fiable y reproducible de aislar los sitios de contacto. Sin embargo, la identificación de la composición proteica del sitio de contacto respectivo (componentes internos y externos de la membrana) requiere ensayos adicionales como la inmunoprecipitación, posiblemente en combinación con espectrometría de masas. Para ello, son necesarios anticuerpos específicos y organismos modelo que expresen versiones marcadas de las proteínas candidatas. Cuando se utiliza la levadura como organismo modelo, se pueden obtener fácilmente candidatos a proteínas debido a la variedad de métodos de modificación genética disponibles y a la existencia de bibliotecas marcadas45,46,47. Por lo tanto, decidimos establecer y optimizar este protocolo para las mitocondrias de levadura. Aunque debería ser posible adaptar el método para mitocondrias aisladas de otros organismos, la levadura tiene la ventaja de permitir obtener grandes cantidades de mitocondrias de forma barata y rápida. Además, el uso de levaduras como organismo modelo para recopilar los resultados iniciales es una forma bien probada de identificar complejos y procesos proteicos que se conservan en eucariotas superiores hasta los humanos. Como se indicó anteriormente, después de la identificación y caracterización de MICOS en levaduras 9,10,11, se demostró que MICOS se conserva en forma y función en eucariotas superiores21. Cqd1 y Por1, componentes del sitio de contacto28 independiente de MICOS recientemente descubierto, también se conservan, lo que indica que este sitio de contacto también está presente en eucariotas superiores.

La importancia de la investigación continua en estos sitios de contacto se ve subrayada por los vínculos de MICOS con diversas enfermedades neurodegenerativas 18,48,49,50,51,52,53,54. La correcta fosforilación de Mic60 por PINK1 se ha relacionado con el mantenimiento de las uniones crista en Drosophilia y, por lo tanto, esta vía, que se conserva en humanos, puede estar relacionada con la enfermedad de Parkinson48. Además, una mutación puntual en la subunidad MICOS humana Mic14 provoca la desestabilización de MICOS y la consiguiente alteración de la ultraestructura mitocondrial, que se han encontrado en pacientes con demencia frontotemporal y esclerosis lateral amiotrófica 50,51,52,53,54. Dado que Mic14 se conserva de la levadura a los seres humanos, se podrían realizar más estudios sobre esta proteína utilizando la levadura como organismo modelo. Esta investigación básica podría conducir a una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de estas enfermedades, lo que podría acelerar el desarrollo de tratamientos y terapias eficientes para ellas. Por otra parte, los recientes descubrimientos de otros sitios de contacto independientes de MICOS27,28 indican que este campo sigue creciendo. Por lo tanto, el protocolo aquí presentado podría ayudar a avanzar en esta prometedora y fascinante investigación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Acknowledgments

M.E.H. agradece a la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), proyecto número 413985647, por su apoyo financiero. Los autores agradecen al Dr. Michael Kiebler, de la Universidad Ludwig-Maximilians, Múnich, por su generoso y amplio apoyo. Agradecemos a Walter Neupert por su aporte científico, sus útiles discusiones y su continua inspiración. J.F. agradece a la Escuela de Graduados de Ciencias de la Vida de Múnich (LSM) por su apoyo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm Beckman Instruments, Germany 344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm Beckman Instruments, Germany 363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g Beckman Instruments, Germany 363055
Abbe refractometer Zeiss, Germany discontinued,
any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller Brandtech, USA BR26320 discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL DWK Life Science, Germany C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D Branson Ultrasonics, USA FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP Branson Ultrasonics, USA 101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell Branson Ultrasonics, USA 15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26 Beckman Instruments, Germany B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra Beckman Instruments, Germany 8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail Roche, Switzerland 11697498001
D-Sorbit Roth, Germany 6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) Roth, Germany 8043
Erlenmeyer flask, 100 mL Roth, Germany X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 Hirschmann, Germany 1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 Hirschmann, Germany 1180153
ice bath neoLab, Germany  S12651
Magnetic stirrer RCT basic IKA-Werke GmbH, Germany Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) Gerbu, Germany 1081
MyPipetman Select P1000 Gilson, USA FP10006S
MyPipetman Select P20 Gilson, USA FP10003S
MyPipetman Select P200 Gilson, USA FP10005S
Omnifix 1 mL Braun, Germany 4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Serva, Germany 32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm Braun, Germany 4022495052414
stirring bar, 15 mm VWR, USA 442-0366
Sucrose Merck, Germany S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Instruments, Germany 331362
Test tubes Eppendorf, Germany 3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel VWR, USA 432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip VWR, USA 432-0212
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma Aldrich, Germany 33731 discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS Roth, Germany 4855

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

Tags

Sitios de Contacto Mitocondrial Mitocondrias Células Eucariotas Producción de Energía Grupos de Hierro-Azufre Lípidos Proteínas Amortiguación de Ca2+ Apoptosis Disfunción Mitocondrial Enfermedades Humanas Cáncer Diabetes Neurodegeneración Envoltura Mitocondrial Dos Membranas Sitios de Contacto Proteicos Membrana Interna Membrana Externa Mitocondrias de Saccharomyces Cerevisiae Proteínas del Sitio De Contacto Sitio De Contacto Mitocondrial Y Complejo Sistema Organizador De Cristas (MICOS) Levadura A Humanos Cqd1 Y El Complejo Por1-OM14
Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khosravi, S., Frickel, J., Harner,… More

Khosravi, S., Frickel, J., Harner, M. E. An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites. J. Vis. Exp. (196), e65444, doi:10.3791/65444 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter