Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metode til metabolisk inaktivering af bakterier til Caenorhabditis elegans Research

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65775
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

Fødevarekilden til Caenorhabditis elegans i laboratoriet er levende Escherichia coli. Da bakterier er metabolisk aktive, præsenterer de en forvirrende variabel i metaboliske og lægemiddelundersøgelser i C. elegans. En detaljeret protokol til metabolisk inaktivering af bakterier ved anvendelse af paraformaldehyd er beskrevet her.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en fælles modelorganisme til forskning i genetik, udvikling, aldring, stofskifte og adfærd. Fordi C. elegans spiser en diæt af levende bakterier, kan den metaboliske aktivitet af deres fødekilde forvirre eksperimenter på udkig efter de direkte virkninger af forskellige indgreb på ormen. For at undgå de forvirrende virkninger af bakteriel metabolisme har C. elegans forskere brugt flere metoder til metabolisk inaktivering af bakterier, herunder ultraviolet (UV) bestråling, varmedræbende og antibiotika. UV-behandling er relativt lav gennemstrømning og kan ikke bruges i flydende kultur, fordi hver plade skal undersøges for vellykket bakteriedrab. En anden behandlingsmetode, varmedræbende, påvirker bakteriernes tekstur og ernæringsmæssige kvalitet negativt, hvilket fører til udviklingsstop af C. elegans. Endelig kan antibiotikabehandling direkte ændre C. elegans fysiologi ud over at forhindre bakterievækst. Dette manuskript beskriver en alternativ metode til metabolisk inaktivering af bakterier ved hjælp af paraformaldehyd (PFA). PFA-behandling krydsbinder proteiner i bakterieceller for at forhindre metabolisk aktivitet og samtidig bevare cellulær struktur og næringsindhold. Denne metode er høj kapacitet og kan bruges i flydende kultur eller faste plader, da test af en plade PFA-behandlede bakterier til vækst validerer hele batchen. Metabolisk inaktivering gennem PFA-behandling kan bruges til at eliminere de forvirrende virkninger af bakteriel metabolisme på undersøgelser af lægemiddel- eller metabolittilskud, stressresistens, metabolomics og adfærd i C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans blev oprindeligt foreslået som en modelorganisme i 19651 og er siden blevet bredt vedtaget i undersøgelser af genetik, udvikling, adfærd, aldring og metabolisme2. På grund af deres store yngelstørrelse og gennemsigtige neglebånd er C. elegans særligt velegnet til screening med høj kapacitet med fluorescerende reportere3. Deres korte livscyklus, hermafroditisk reproduktion og genetisk homologi med mennesker gør også C. elegans til et værdifuldt modelsystem til studier af udvikling4 og aldringsbiologi5. Desuden er C. elegans relativt nemme at vedligeholde. Orme kan dyrkes i flydende kultur eller på faste agarplader og forbruge en diæt af levende Escherichia coli OP50 bakterier4.

Men, levende fødekilde af C. elegans kan forvirre undersøgelser af stofskifte, lægemiddeltilskud, og adfærd. Fordi levende bakterier har deres eget stofskifte, ændrer eksperimentelle forhold, der påvirker bakterierne, også de næringsstoffer og metabolitter, der er tilgængelige for ormene. For eksempel har forskelle i bakteriel jern-, aminosyre- og folatkoncentrationer forskellige virkninger på C. elegans ' udvikling, fysiologi og levetid6. Mange almindelige laboratoriepraksis kan fremkalde sådanne ændringer i næringsstofsammensætningen og metabolitterne produceret af OP50. Specifikt fremkalder eksponering for 5-fluor-2'-deoxyuridin (FUdR), en forbindelse, der almindeligvis anvendes til at forhindre reproduktion i C. elegans, brede ændringer i OP50-genekspression, herunder aminosyrebiosynteseveje7. Levende bakterier kan også forvirre undersøgelser, hvor C. elegans suppleres med små molekyler, fordi bakterier helt eller delvist kan metabolisere de aktive forbindelser. Desuden kan virkningerne af disse små molekyler på bakterierne igen ændre C. elegans fysiologi, som det blev rapporteret med det levetidsforlængende lægemiddel metformin8. Endelig kan levende bakterier ændre ormens miljø på måder, der ændrer adfærd, såsom at udskille attraktive lugtstoffer9, producere eksogene neuromodulatorer10 og skabe iltgradienter i en tæt bakterieplæne11.

For at afbøde de forvirrende virkninger af bakteriel metabolisme på C. elegans-forskning er der udviklet flere metoder til at dræbe bakterier (tabel 1). Tre almindelige strategier til at dræbe OP50 er UV-bestråling, varmedræbende og antibiotikabehandling. Selvom det er ligetil og relativt billigt, kan hver af disse metoder have uønskede virkninger på både bakterier og C. elegans. UV-dræbende via en UV-tværbinding12 er lav gennemstrømning, og hastigheden er begrænset af antallet af plader, der kan passe i UV-tværbinderen. Desuden kan effektiviteten af UV-dræbning variere fra plade til plade inden for et parti, og test for vækst på alle plader kan blive vanskelig i store eksperimenter. Varmedræbende OP50 ved at udsætte kulturen for temperaturer på >60 °C kommer med et separat sæt udfordringer. Høj varme kan beskadige næringsstoffer, der er afgørende for ormen og ødelægge bakteriens cellulære struktur, hvilket skaber en blødere tekstur, der reducerer den tid, orme bruger på maden13. Denne metode kan heller ikke bruges i hele C. elegans livscyklus, fordi orme fodret med varmedræbte bakterier kan arrestere tidligt i udviklingen13. Antibiotikabehandling er en tredje almindelig metode til at undertrykke bakteriel metabolisme14, men antibiotika kan også ændre ormvækst og metabolisme15.

En løsning til at eliminere de metaboliske virkninger af levende bakterier, samtidig med at bakteriestrukturen og essentielle næringsstoffer bevares, er at dræbe OP50 med paraformaldehyd (PFA)16. PFA er en polymer af formaldehyd, der kan tværbinde proteiner i celler17 for at forhindre bakteriel replikation uden at ødelægge indre cellestrukturer som den indre plasmamembran18. På grund af denne bevarelse af den indre cellulære struktur udviser PFA-behandlede bakterier ingen vækst eller metabolisk aktivitet, men forbliver en spiselig og næringsrig fødekilde til C. elegans16. Her leveres en detaljeret protokol, der viser, hvordan man metabolisk inaktiverer bakterier ved hjælp af paraformaldehyd.

Metode Påkrævede materialer Skalerbar? Ernæringsmæssig? Virkninger på orm?
UV UV-tværbinding Begrænset af: Ja Variable effekter på levetid på NGM12, 23, 24
Antal plader, der passer i UV-tværbinding Variable effekter på levetid på FUdR24, 26, 27
Bestrålingstid pr. plade Nedsat madpræference16
Evne til at kontrollere hver plade for vækst8
Varme >60 °C inkubator Ja Nej: ødelægger cellevæggen, nedsat næringsværdi Udviklingsstop 13
Nedsat madpræference13
Forlænger levetiden på NGM31
Antibiotika Antibiotika (kanamycin, carbenicillin osv.) Ja Ja Forsinker vækst og udvikling15
Forlænger levetiden i flydende medier19
Forlænger levetiden på NGM15
PFA 0,5% Paraformaldehyd Ja Ja Lille yngelstørrelse falder16
Lille stigning i udviklingstiden16
Nedsat madpræference16

Tabel 1. Sammenligninger af metoder til at dræbe OP50. UV-dræbende, varmedræbende, antibiotikabehandling og PFA-behandling har varierende effekt på bakteriernes ernæringstilstand og sundheden hos orme, der fodres med behandlede bakterier. Disse metoder til replikativt inaktivering af E. coli adskiller sig også i deres krævede materialer og skalerbarhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bakterie podning

  1. Forbered Luria bouillon (LB) ved at opløse 10 g trypton, 5 g gærekstrakt og 10 g natriumchlorid (NaCl) i 950 ml destilleret vand.
  2. LB's pH justeres til 7,0 ved at tilsætte 5M natriumhydroxid (NaOH). Dette bør kun kræve ca. 0,2 ml NaOH.
  3. Det pH-justerede LB-medie autoklaveres på et væskeprogram i 45 minutter ved 15 psi. Lad opløsningen afkøle og opbevar den ved stuetemperatur.
  4. Pod en enkelt bakteriekoloni i 100 ml LB i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Dyrk bakterierne natten over i en 37 °C shaker inkubator.
  5. Afhængigt af bakteriekoloniens sundhed, kolbens størrelse og den hastighed, som rysteren er indstillet til, kan den tid, det tager for bakterierne at vokse, variere. Efter ~ 14 timer kontrolleres bakteriens optiske densitet (OD) ved 600 nm (OD600).
  6. Fjern bakterierne fra rysteren, når OD600 er 3,0 (1 x 109 kolonidannende enheder (CFU) / ml). Hvis OD600 er mindre end 3,0, sættes kolben tilbage i rysteinkubatoren, indtil den ønskede OD er nået.
  7. Bakterierne anbringes i 50 ml koniske rør og opbevares ved 4 °C eller fortsættes til næste trin.

2. Arbejde med paraformaldehyd

BEMÆRK: Den anvendte koncentration af paraformaldehyd (PFA) og eksponeringens varighed kan variere noget afhængigt af klima, placering og type bakterier, der behandles. Et godt udgangspunkt for OP50 er eksponering for 0,5 % PFA i 1 time, mens 0,25 % PFA i 1 time kan være tilstrækkeligt for HT115.

  1. Forbered 32% PFA-lager eller brug kommercielt købt 32% PFA-opløsning. Brug korrekt personlige værnemidler, når du arbejder med PFA. Brug handsker og øjenbeskyttelse.
  2. Tilføj PFA inde i en kemisk damphætte med korrekt ventilation. Bortskaf PFA-holdige vaske og spidser i korrekte kemiske farebeholdere i stinkdækslet.

3. Bakteriel behandling med paraformaldehyd

  1. Når bakterierne når en OD600 på 3,0, skal du bruge en serologisk pipette til at overføre 50 ml til en ny 250 ml Erlenmeyerkolbe. Gem resten til en live kontrol, en mock-behandlet kontrol (se trin 4) eller til at behandle så godt med PFA efter behov.
  2. Undgå at hælde fra en kolbe til en anden, og pas på ikke at sprøjte siderne af den nye kolbe med bakterier. Kolonier på siden af kolben kan få en lavere dosis PFA.
  3. I den kemiske hætte tilsættes 781 μL 32% PFA til 50 ml bakterier for at bringe den endelige koncentration til 0,5%. Bortskaf den anvendte spids i en kemisk farebeholder til fast affald.
  4. Kolben dækkes med folie og føres tilbage til rysteinkubatoren ved 37 °C i 1 time. Efter 1 time fjernes kolben fra inkubatoren og fortsæt til trin 5.

4. Mock-behandlet kontrol

  1. Når bakterierne når en OD600 på 3,0, skal du bruge en serologisk pipette til at overføre 50 ml af bakterierne til et 50 ml konisk rør.
  2. Fortsæt til trin 5.3 for at fuldføre vasketrinnene svarende til den PFA-behandlede gruppe.

5. Vask bakterierne for at fjerne resterende PFA

  1. I kemikaliehætten skal du bruge en serologisk pipette til at overføre de behandlede bakterier fra Erlenmeyerkolben til et 50 ml konisk rør. Brug af en serologisk pipette i stedet for at hælde bakterierne vil forhindre kontaminering fra eventuelle bakteriekolonier på kanten af kolben, der kan have undgået direkte behandling med PFA.
  2. Centrifugebehandlede bakterier ved ca. 3000 x g i 20 min. Supernatanten fjernes ved at bortskaffe den i en kemisk farebeholder til flydende affald i kemikaliehætten.
  3. Tilsæt 25 ml LB og hvirvel for at resuspendere bakteriepillen (Fyldning af røret gør det sværere at resuspendere pelleten). Gentag centrifugering og pelletresuspension 4x.
  4. Resuspender pellet i mængder, der er optimale til forskellige analyser. Til levetidsanalyser frø 60 mm plader med 200 μL bakterier resuspenderet i 10 ml LB. Resuspendering af bakterierne i 10 ml LB resulterer i en 5x koncentration fra den oprindelige 50 ml kultur.
  5. Opbevar bakterierne ved 4 °C.

6. Kvalitetskontrol af bakterievækst

  1. Efter den endelige vask og resuspension stribe en LB-plade (ved hjælp af en steril pipettespids) med de tilberedte bakterier. Det er god praksis også at stribe den LB, der bruges til vask og resuspendering, på en separat plade for at sikre, at den anvendte LB ikke var forurenet.
  2. Pladerne anbringes i en 37 °C inkubator natten over. Kontroller for enhver vækst. Bakterierne betragtes som replikativt døde, når kolonier ikke vokser på LB-pladen.

7. Kvalitetskontrol af bakteriel metabolisme ved hjælp af et respirometer

  1. Efter den endelige vask og resuspension fra trin 5.4 skal du bekræfte, at bakterierne er metabolisk døde ved hjælp af tilgængelige værktøjer såsom respirometre19,20 og måling af basal iltforbrugshastighed (OCR).
  2. Forbered M9-opløsning: 3 g monobasisk kaliumphosphat (KH2PO 4), 6 g natriumphosphatdibasisk (Na2HPO4) og 5 g natriumchlorid (NaCl) opløses i 950 ml destilleret vand. Autoklave på et væskeprogram i 45 minutter ved 15 psi, og lad derefter opløsningen afkøle til stuetemperatur. Tilsæt 1 ml 1 M magnesiumsulfat (MgSO4) og opbevar ved stuetemperatur.
  3. Fugt respirometerpatronen: Tilsæt 200 μL kalibrant til alle huller i en plade med 96 huller. Cylinderampullen anbringes i 96-brøndspladen og inkuberes natten over i en inkubator på 37 °C.
  4. Analysekalibrering: Den følgende dag anbringes den hydratiserede cylinderampul i maskinen, og kalibreringen påbegyndes.
  5. Assay testpladeopsætning: Brug en ny 96-brøndplade til at tilføje 160 μL M9 og 40 μL af de prepped bakterier (1 x 109 CFU / ml) for at teste brønde. Der tilsættes 200 μL M9 til de 4 hjørnehuller, der skal bruges som tomme huller. Der tilsættes 160 μL M9 og 40 μL LB, der anvendes til vask og resuspendering, til brug som negative kontroller. Tilsæt 200 μL M9 til resten af de brønde, der ikke vil blive brugt.
  6. Kør analysen: Når patronkalibreringen er fuldført, skal du indsætte analysepladen fra trin 7.5 i maskinen til analyse. Indstillingerne inkluderer trin til at blande, vente, måle og sløjfe. Resultaterne vises som iltforbrugshastighed (OCR). Bakterierne er metabolisk døde og klar til brug, når OCR er nul.

Figure 1
Figur 1. Arbejdsproces til paraformaldehydbehandling. En enkelt koloni af E. coli OP50 bakterier dyrkes natten over. PFA tilsættes til en slutkoncentration på 0,5 %, og den PFA-behandlede kultur rystes i 1 time ved 37 °C. Endelig fjernes PFA'en ved at vaske kulturen med frisk LB 5x. For at bekræfte, at de behandlede bakterier er replikativt inaktive, skal du stryge en LB-plade af de behandlede bakterier og vokse natten over. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En detaljeret arbejdsgang for protokollen er vist i figur 1. En high-throughput metode blev udviklet og optimeret til konsekvent at inaktivere bakteriel replikation (figur 2A) og metabolisme (figur 2B) til metaboliske og lægemiddelundersøgelser i C. elegans forskning ved anvendelse af paraformaldehyd16. Målet var at bestemme den laveste koncentration af PFA, der var nødvendig, og den korteste tid, der kræves for konsekvent at dræbe bakterierne uden at påvirke forskellige sundhedsforanstaltninger i ormene. Disse værdier kan variere fra et sted til et andet afhængigt af laboratoriemiljøet og fra en bakteriestamme til en anden. For eksempel er eksponering af HB101-bakterier til 0,25% i 1 time tilstrækkelig til at gøre den metabolisk inaktiv (figur 2C), mens Enterococcus faecalis (EF) kræver en 1,0% PFA-koncentration (figur 2D) for en konsistent effekt. En tilgang til individuel laboratorieoptimering blev tidligere etableret16 og er detaljeret i dette aktuelle arbejde.

Mad tiltrækning og forbrug
Når bakterier vokser og replikerer, frigiver de forskellige metabolitter og feromoner, der er attraktive for ormene. For at afgøre, om ormene forbliver tiltrukket af den PFA-behandlede OP50, blev pladerne podet med PFA-behandlet eller mock-behandlet OP50, og procentdelen af orme, der var til stede på madplænen sammenlignet med uden for plænen, blev tabuleret. Data viser, at orme tiltrækkes af den PFA-behandlede OP50, da de fleste orme forbliver på bakterieplænen efter 1 time (figur 3A), svarende til hvad der observeres med den mock-behandlede kontrol (figur 3B). Som forventet viser et følsomt parvist assay21 imidlertid, at C. elegans har en stærkere præference for den mock-behandlede levende kontrol (figur 3C), når de sås med PFA-behandlet på samme plade. Efter at have fastslået, at orme tiltrækkes af PFA-dræbte bakterier, omend mindre end levende bakterier, var det bydende nødvendigt at fastslå, at de spiser den PFA-dræbte mad. For at afgøre, om ormene indtager den PFA-behandlede OP50, blev ormenes pumpehastighed på forskellige fødevaretyper målt. Som vist i figur 3D har orme på PFA-behandlet OP50 en højere pumpehastighed (+25%) end orme på den mock-behandlede kontrol. Dette indikerer, at orme ikke målrettet bremser deres spisehastighed på PFA-dræbt mad og kan enten indikere en højere spisehastighed eller en kompenserende reaktion på en ændring i letheden ved at pumpe den behandlede mad.

Fecundity, udvikling og levetid
Ændringer i fødeforholdene kan have fysiologiske virkninger på orme13,22. For at teste for brede effekter blev ændringer i udviklingshastighed, frugtbarhed og levetid målt. PFA-behandlet OP50 forsinker udviklingstiden (~4 timer) for vildtype N2-orme en smule som vist i figur 4A. Overvågning af æglægningskapaciteten hos orme dyrket på forskellige bakteriebetingelser viser et lille, men signifikant fald i frugtbarhed (-21%) hos orme fodret med PFA-behandlet OP50 (figur 4B). For laboratorier, der er interesseret i C. elegans aldring, blev effekten af PFA-behandlet OP50 på levetiden derefter bestemt. Interessant nok var levetiden for vildtypeorme fodret med PFA-behandlet OP50 ikke signifikant forskellig fra ormene fodret mock-behandlet OP50 på standard nematodevækstmedier (NGM) plader (figur 4C), men PFA-behandlet OP50 øger vildtypens levetid (+23%), når FUdR er til stede (figur 4D). Fodring af PFA-behandlet OP50 til en langlivet fmo-2 overekspressionsstamme (OE)20 ændrer ikke dens levetid sammenlignet med vildtypeorme (figur 4E). UV-, varme- og antibiotikadræbte OP50 har også vist sig at ændre C. elegans levetid. Specifikt er UV-behandlede bakterier rapporteret at forlænge levetiden på NGM12,23 og på FUdR 24. Der er imidlertid modstridende data om interaktionen mellem FUdR og UV-dræbte bakterier25,26, der kan skyldes forskellige metoder til UV-drab og validering af metabolisk inaktivitet i bakterierne. Derudover forlænger varmedræbte bakterier levetiden på NGM27, og antibiotika forlænger levetiden på NGM15 og i flydende kultur28.

Figure 2
Figur 2. Behandling af bakterier med PFA hæmmer spredning og metabolisme. (A) Bakterievækst i kolonidannende enheder (CFU) af mock-behandlede og 0,5% PFA-behandlede OP50. (B) Ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) i mpH/min af mock-behandlede og 0,5% PFA-behandlede OP50. (C) Basal iltforbrugshastighed (OCR) i pmol/min af mock-behandlet, 0,25% PFA-behandlet og 0,5% PFA-behandlet HB101. (D) Basal iltforbrugshastighed (OCR) i pmol/min af mock-behandlet, 0,25% PFA-behandlet, 0,5% PFA-behandlet og 1,0% PFA-behandlet enterococcus faecalis (EF). Alle fejlbjælker vist i tal repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM); En tosidet T-test blev brugt til at udlede p-værdier. angiver p-værdi < 0,0001. Dette tal er ændret fra 16. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Orme tiltrækkes af PFA-behandlet OP50. Procent af orme tiltrukket af (A) PFA-behandlet eller (B) mock-behandlet OP50 bakteriel græsplæne. (C) Parvis sensibiliseret assaytestormpræference for mock-behandlede og PFA-behandlede OP50. (D) Pumpehastighed (pumper pr. 30 s) af orme på PFA-behandlede eller mock-behandlede OP50. En tosidet t-testanalyse blev brugt til at udlede p-værdier for alle sammenligninger. Alle fejlbjælker vist i tal repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM); angiver p-værdi < 0,0001. Panelerne A-C er blevet ændret fra 16. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Orme vokser og udvikler sig på PFA-behandlet OP50. (A) Udviklingstid (h) af orme fra æg-til-æg-æglæggende voksne på mock-behandlede og PFA-behandlede OP50. (B) Gennemsnitligt afkom (antal orme) af orme, der fodres med mock-treated eller PFA-behandlet OP50. (C, D) Procent levende af orme fodret mock-behandlede eller PFA-behandlede OP50 på (C) NGM og (D) FUdR levetidsplader. (E) Procent levende af vildtype- og fmo-2 OE-orme fodret med PFA-behandlet OP50. En tosidet t-testanalyse blev brugt til at udlede p-værdier til sammenligning af udvikling og frugtbarhed. Log-rank-testen blev brugt til at udlede p-værdier til sammenligning af levetid. Alle fejlbjælker vist i tal repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM); * angiver p-værdi < 0,05, *** angiver p-værdi <0,001, og **** angiver p-værdi < 0,0001. Panelerne A, B og D er blevet ændret fra16. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordele ved PFA-drab i forhold til andre bakteriedræbende metoder
PFA-behandling er en high-throughput metode til at forebygge bakteriel metabolisme og samtidig opretholde en nærende fødekilde for C. elegans. At dræbe bakterier via PFA-behandling har flere fordele i forhold til andre metoder. I modsætning til UV-behandling, hvor hver plade skal testes for vellykket drab, kan en enkelt plade fra et parti PFA-behandlede bakterier testes for at validere batch16. PFA-behandling er også meget effektiv til at eliminere bakteriel metabolisme (figur 2B), og PFA-behandlede bakterier udviser nedsat metabolisk aktivitet i forhold til antibiotikabehandlede bakterier19. En anden fordel ved PFA-behandling er, at bakterierne bevarer deres cellestruktur og ernæringsprofil. Derfor kan orme udvikle sig på PFA-behandlede bakterier, mens fodring af varmedræbte bakterier fra æg resulterer i udviklingsstop13,16.

Kritiske trin og fejlfinding
Mens PFA-behandling af bakterier er en relativt ligetil protokol, er det vigtigt at validere, at hvert parti bakterier er replikativt og metabolisk døde (trin 6 og 7) og at sikre, at vasketrinnene efter PFA-behandling udføres grundigt (trin 5). Hvis kolonierne vokser i trin 6, hvilket indikerer, at bakterierne ikke er helt døde, er det muligt at fejlfinde koncentrationen af PFA og varigheden af PFA-behandlingen i trin 3. Ved optimering af PFA-behandlingsprotokollen var en koncentration på 0,5% PFA ideel til succesfuldt at dræbe OP50 med minimale bivirkninger. 0,25% PFA var ikke tilstrækkeligt til metabolisk at dræbe alle bakteriestammer (figur 2C-D), og forøgelse af koncentrationen til 0,5% PFA ændrede ikke udviklingstid, levetid eller fødepræference for orme på OP50 i forhold til 0,25% PFA. Desuden var 1 times podning med PFA den korteste tid, der var tilstrækkelig til at forhindre al bakterievækst. Hvis bakterier ikke dræbes fuldstændigt ved en 1 times podning med 0,5% PFA, kan podningstiden og / eller PFA-koncentrationen øges for at fejlfinde drabseffektivitet. Et andet vigtigt trin i protokollen er at vaske bakterierne efter PFA-behandling (trin 5). Det er meget vigtigt at færdiggøre alle fem vaske og fjerne supernatanten fuldstændigt ved hver vask for at sikre, at der ikke er formaldehyd tilbage i bakterierne. Hvis ormene ikke vokser godt eller ikke pumper på de PFA-behandlede bakterier, kan der udføres yderligere vask.

Begrænsninger af metoden
Mens PFA-dræbte bakterier er ideelle til at eliminere de forvirrende virkninger af bakteriel metabolisme (figur 2B) fra C. elegans-undersøgelser, er der begrænsninger for denne metode. Specifikt har C. elegans lidt langsommere udvikling på PFA-behandlede bakterier i forhold til levende bakterier (figur 4A)16. PFA-behandling forlænger også ormens levetid, hvis FUdR er til stede (figur 4D), men ikke på NGM (figur 4C) plader16. Andre metoder giver imidlertid også disse udfordringer; UV-dræbte bakterier ændrer også C. elegans levetid. De fleste rapporter tyder på, at UV-behandlede bakterier forlænger ormens levetid på NGM12,23 og på FUdR 24, mens andre undersøgelser indikerer, at UV-behandling ikke påvirker levetid 24, og at der er et samspil mellem UV-behandling og FUdR på C. elegans levetid25,26. Ud over levetidseffekterne af PFA-behandlede bakterier foretrækker orme at bruge tid på levende bakterier i forhold til PFA-behandlede bakterier (figur 3C)16, men har en højere pumpehastighed på den PFA-behandlede mad (figur 3D). Dette tyder på, at de kan indtage en lignende mængde mad, eller at PFA-behandlede bakterier er lettere eller sværere at spise. Mange af disse virkninger observeres også med andre metoder til at dræbe bakterier12,13,14, hvilket tyder på, at metabolisk aktive bakterier reducerer udviklingstiden, forkorter levetiden og er mere attraktive for C. elegans.

Potentielle anvendelser af PFA-behandlede bakterier
Samlet set har evnen til hurtigt og pålideligt at dræbe store partier bakterier stort potentiale for at eliminere de forvirrende virkninger af bakteriel metabolisme i C. elegans-undersøgelser. Denne evne er især nyttig til lægemiddelskærme, tilskudsforsøg, toksicitetsanalyser, metabolomics-undersøgelser og undersøgelse af virkningerne af mikrobiel metabolisme på værtsadfærd. Mere information om brugen af PFA-behandlede bakterier i hver af disse applikationer er nedenfor.

Lægemiddel-, tilskuds- og toksicitetseksperimenter: Fordi kun en plade pr. Batch af PFA-behandlede bakterier skal testes for at dræbe succes, kan PFA-dræbte bakterier tilsættes til flydende kultur til screening af lægemidler med høj kapacitet. PFA-behandlede bakterier kan også podes på faste plader med små molekyler eller næringsstoffer inkorporeret i agarmediet. Faste plader podet med PFA-behandlede bakterier kan også være nyttige til toksicitets- eller stressresponsassays. Upublicerede data tyder på, at PFA-behandlede bakterier kan hjælpe med at skelne mellem rollen af bakterielle stress-responsveje og ormestressresistensveje i paraquat- og tunicamycinresistens. Brug af PFA-dræbte bakterier i disse lægemiddeltilskud og toksicitetsundersøgelser forhindrer bakterier i at metabolisere molekylet af interesse og vil sikre, at enhver observeret fænotype skyldes en forbindelse, der virker direkte på C. elegans. Brug af metabolisk døde bakterier til lægemiddel- og tilskudsforsøg minimerer også variabiliteten i dosering, da levende bakterier kan metabolisere forskellige mængder af forbindelsen af interesse fra eksperiment til eksperiment.

Metabolomics-undersøgelser: C. elegans metabolomics-undersøgelser kan også forvirres af bakteriel metabolisme: observation af ændringer i ormmetabolisme kræver fravær af bakteriel metabolisk aktivitet29. Selv små ændringer i den bakterielle fødekilde kan ændre ormens metabolom. For eksempel adskiller metabolomet af orme fodret levende vaskede bakterier sig fra metabolomet af orme fodret levende uvaskede bakterier16. Indtagelse af PFA-behandlede bakterier ændrer også ormens metabolom i forhold til indtagelse af levende mad16 , men giver mulighed for sammenligninger mellem virkningerne af eksperimentelle betingelser på C. elegans metabolisme isoleret fra bakteriel metabolisme.

Værtsmikrobeadfærdsundersøgelser: Endelig kan PFA-behandlede bakterier bruges til at identificere interaktioner mellem bakteriel metabolisme og værtsadfærd. Metabolitter udskilt af både patogene og ikke-patogene bakterier kan være attraktive eller frastødende for orme for at påvirke deres fouragerings- og fodringsadfærd10,11,30. Desuden kan bakterier producere neuromodulatorer, der driver ændringer i bevægelse30. Derudover resulterer dyrkning af C. elegans på forskellige bakteriestammer i ændret yngelstørrelse, udviklingstid og fysiologi31,32. Behandling af disse bakterier med PFA kan hjælpe med at bestemme, om virkningerne af en given bakterie på C. elegans kræver aktiv bakteriel metabolisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af NIH R21AG059117 og Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research ved University of Michigan. SB blev finansieret af T32AG000114. ESK blev finansieret af NSF DGE 1841052.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum Foil Staples 2549291
Bunsen burner VWR 470121-700 
Cell Density Meter Denville 80-3000-45 
Centrifuge Eppendorg 5430
Chemical fume hood Labcono 975050411384RG
Conincal tubes (50 mL) Fisher 339652
Cuvettes  Fisher 14-955-127
E. coli OP50 CGC OP50
Erlenmyer flasks Fisher 250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Inoculation loop Fisher 22-363-605
LB Agar Fisher BP1425500
Liquid waste collection bottle Thomas Scientific 1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M7506
Paraformaldehyde (32%) Electron Microscopy Sciences 15714-S Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor Eppendorf Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm) Fisher FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher P2853
Seahorse XF Calibrant Agilent 100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate Agilent 101085-004
Serological pipettes (50 mL) Genesee Scientific 12-107
Shaker incubator Thermo 11 676 083
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Sigma S374-500
Solid waste collection bucket M&M Industries  5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone Genesee Scientific 20-251
Vortex Thermo 11676331
Weighing balance C Goldenwall HZ10K6B
Yeast Extract Genesee Scientific 20-255

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  3. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
  4. Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
  5. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  6. Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
  7. McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
  8. Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
  9. Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
  10. Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
  11. Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
  12. Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
  13. Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
  14. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  15. Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
  16. Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
  17. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  18. Felix, H. Permeabilized and immobilized cells. Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).
  19. Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
  20. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  21. Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
  22. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  23. Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
  24. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  25. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  26. Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
  27. Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
  28. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
  29. Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
  30. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  31. Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
  32. Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).

Tags

Metabolisk inaktivere bakterier Caenorhabditis elegans forskning genetisk forskning udviklingsforskning aldringsforskning metabolismeforskning adfærdsforskning bakteriel metabolisme UV-bestråling varmedræbende antibiotika PFA-behandling paraformaldehydbehandling metode med høj kapacitet
Metode til metabolisk inaktivering af bakterier til <em>Caenorhabditis elegans</em> Research
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., … More

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., Huang, S., Leiser, S. F. Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research. J. Vis. Exp. (197), e65775, doi:10.3791/65775 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter