Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

منهجية لتعطيل البكتيريا الأيضية لأبحاث التهاب Caenorhabditis elegans

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65775
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

مصدر الغذاء ل Caenorhabditis elegans في المختبر هو الإشريكية القولونية الحية. نظرا لأن البكتيريا نشطة في التمثيل الغذائي ، فإنها تقدم متغيرا مربكا في الدراسات الأيضية والدوائية في C. elegans. يتم وصف بروتوكول مفصل لتعطيل البكتيريا الأيضية باستخدام بارافورمالدهيد هنا.

Abstract

Caenorhabditis elegans هو كائن نموذجي شائع للبحث في علم الوراثة والتنمية والشيخوخة والتمثيل الغذائي والسلوك. نظرا لأن C. elegans تستهلك نظاما غذائيا من البكتيريا الحية ، فإن النشاط الأيضي لمصدر غذائها يمكن أن يربك التجارب التي تبحث عن التأثيرات المباشرة للتدخلات المختلفة على الدودة. لتجنب الآثار المربكة لعملية التمثيل الغذائي البكتيرية ، استخدم باحثو C. elegans طرقا متعددة لتعطيل البكتيريا الأيضية ، بما في ذلك الأشعة فوق البنفسجية (UV) ، والقتل الحراري ، والمضادات الحيوية. المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية منخفضة الإنتاجية نسبيا ولا يمكن استخدامها في الثقافة السائلة لأنه يجب فحص كل لوحة بحثا عن قتل بكتيري ناجح. تؤثر طريقة العلاج الثانية ، القتل الحراري ، سلبا على نسيج البكتيريا وجودتها الغذائية ، مما يؤدي إلى توقف نمو C. elegans. أخيرا ، يمكن للعلاج بالمضادات الحيوية أن يغير بشكل مباشر فسيولوجيا C. elegans بالإضافة إلى منع نمو البكتيريا. تصف هذه المخطوطة طريقة بديلة لتعطيل البكتيريا الأيضية باستخدام بارافورمالدهايد (PFA). يربط علاج PFA البروتينات داخل الخلايا البكتيرية لمنع النشاط الأيضي مع الحفاظ على البنية الخلوية والمحتوى الغذائي. هذه الطريقة عالية الإنتاجية ويمكن استخدامها في الزراعة السائلة أو الألواح الصلبة ، حيث أن اختبار لوحة واحدة من البكتيريا المعالجة ب PFA للنمو يتحقق من صحة الدفعة بأكملها. يمكن استخدام تعطيل التمثيل الغذائي من خلال علاج PFA للقضاء على الآثار المربكة لعملية التمثيل الغذائي البكتيرية على دراسات مكملات الأدوية أو المستقلب ، ومقاومة الإجهاد ، والأيض ، والسلوك في C. elegans.

Introduction

تم اقتراح Caenorhabditis elegans في الأصل ككائن نموذجي في عام 19651 ومنذ ذلك الحين تم اعتماده على نطاق واسع في دراسات علم الوراثة والتنمية والسلوك والشيخوخة والتمثيل الغذائي2. نظرا لحجم الحضنة الكبير والبشرة الشفافة ، فإن C. elegans مناسبة بشكل خاص للفحص عالي الإنتاجية مع مراسلي الفلورسنت3. كما أن دورة حياتها القصيرة ، والتكاثر الخنثى ، والتماثل الجيني مع البشر تجعل من C. elegans نظاما نموذجيا قيما للدراسات حول التطور4 وبيولوجيا الشيخوخة5. علاوة على ذلك ، من السهل نسبيا الحفاظ على C. elegans. يمكن زراعة الديدان في الثقافة السائلة أو على ألواح أجار صلبة وتستهلك نظاما غذائيا من بكتيريا الإشريكية القولونية OP50 الحية4.

ومع ذلك ، فإن مصدر الغذاء الحي ل C. elegans يمكن أن يربك دراسات التمثيل الغذائي ومكملات الأدوية والسلوك. نظرا لأن البكتيريا الحية لها عملية التمثيل الغذائي الخاصة بها ، فإن الظروف التجريبية التي تؤثر على البكتيريا تغير أيضا العناصر الغذائية والمستقلبات المتاحة للديدان. على سبيل المثال ، الاختلافات في تركيزات الحديد البكتيري والأحماض الأمينية وحمض الفوليك لها تأثيرات متنوعة على تطور C. elegans وعلم وظائف الأعضاء وعمر6. يمكن للعديد من الممارسات المعملية الشائعة أن تثير مثل هذه التغييرات في تكوين المغذيات والمستقلبات التي ينتجها OP50. على وجه التحديد ، فإن التعرض ل 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) ، وهو مركب شائع الاستخدام لمنع التكاثر في C. elegans ، يثير تغييرات واسعة في التعبير الجيني OP50 ، بما في ذلك مسارات التخليق الحيويللأحماض الأمينية 7. يمكن للبكتيريا الحية أيضا أن تربك الدراسات التي تستكمل فيها C. elegans بجزيئات صغيرة لأن البكتيريا يمكنها استقلاب المركبات النشطة جزئيا أو كليا. علاوة على ذلك ، فإن تأثيرات هذه الجزيئات الصغيرة على البكتيريا يمكن ، بدورها ، تغيير فسيولوجيا C. elegans ، كما ورد مع عقار الميتفورمين8 الذي يطيل العمر. أخيرا ، يمكن للبكتيريا الحية تغيير بيئة الدودة بطرق تغير السلوك ، مثل إفراز الروائحالجذابة 9 ، وإنتاج معدلات عصبية خارجية10 ، وإنشاء تدرجات الأكسجين في حديقة بكتيرية كثيفة11.

للتخفيف من الآثار المربكة لعملية التمثيل الغذائي البكتيرية على أبحاث C. elegans ، تم تطوير طرق متعددة لقتل البكتيريا (الجدول 1). ثلاث استراتيجيات شائعة لقتل OP50 هي الأشعة فوق البنفسجية والقتل الحراري والعلاج بالمضادات الحيوية. على الرغم من أنها مباشرة ومنخفضة التكلفة نسبيا ، إلا أن كل طريقة من هذه الطرق يمكن أن يكون لها تأثيرات غير مرغوب فيها على كل من البكتيريا و C. elegans. قتل الأشعة فوق البنفسجية عبر رابط متشابك للأشعة فوق البنفسجية12 منخفض الإنتاجية والمعدل محدود بعدد اللوحات التي يمكن وضعها في الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية. علاوة على ذلك ، يمكن أن تختلف فعالية قتل الأشعة فوق البنفسجية من لوحة إلى أخرى داخل دفعة ، وقد يصبح اختبار النمو على جميع الألواح صعبا في التجارب الكبيرة. يأتي OP50 القاتل للحرارة من خلال تعريض الثقافة لدرجات حرارة تصل إلى >60 درجة مئوية مع مجموعة منفصلة من التحديات. يمكن أن تؤدي الحرارة العالية إلى إتلاف العناصر الغذائية الضرورية للدودة وتدمير البنية الخلوية للبكتيريا ، مما يخلق نسيجا أكثر نعومة يقلل من مقدار الوقت الذي تقضيه الديدان في الطعام13. لا يمكن استخدام هذه الطريقة أيضا طوال دورة حياة C. elegans لأن الديدان التي تتغذى على البكتيريا المقتولة بالحرارة يمكن أن تتوقف في وقت مبكر من التطور13. العلاج بالمضادات الحيوية هو طريقة ثالثة شائعة لقمع التمثيل الغذائي البكتيري14 ، ولكن المضادات الحيوية يمكن أن تغير أيضا نمو الدودة والتمثيل الغذائي15.

أحد الحلول للقضاء على الآثار الأيضية للبكتيريا الحية مع الحفاظ على البنية البكتيرية والعناصر الغذائية الأساسية هو قتل OP50 باستخدام بارافورمالدهيد (PFA) 16. PFA هو بوليمر من الفورمالديهايد يمكنه ربط البروتينات داخل الخلايا17 لمنع تكاثر البكتيريا دون تدمير هياكل الخلايا الداخلية مثل غشاء البلازما الداخلي18. بسبب هذا الحفاظ على البنية الخلوية الداخلية ، لا تظهر البكتيريا المعالجة ب PFA أي نمو أو نشاط استقلابي ولكنها تظل مصدرا غذائيا صالحا للأكل وغنيا بالمغذيات ل C. elegans16. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل يوضح كيفية تعطيل البكتيريا الأيضية باستخدام بارافورمالدهيد.

أسلوب المواد المطلوبة قابله؟ الغذائيه؟ الآثار على الدودة؟
الاشعه فوق البنفسجيه الأشعة فوق البنفسجية المتقاطعة مقيد ب: نعم تأثيرات متغيرة على العمر الافتراضي على NGM12 و 23 و 24
عدد اللوحات التي تتناسب مع الأشعة فوق البنفسجية المتشابكة التأثيرات المتغيرة على العمر الافتراضي على FUdR24 و 26 و 27
وقت التشعيع لكل لوحة انخفاض تفضيل الطعام16
القدرة على فحص كل لوحة للنمو8
حرارة حاضنة >60 درجة مئوية نعم لا: يدمر جدار الخلية ، ويقلل من القيمة الغذائية السكتة التنموية 13
انخفاض تفضيل الطعام13
يطيل العمر الافتراضي على NGM31
المضادات الحيويه المضادات الحيوية (كاناميسين ، كاربينيسيلين ، إلخ) نعم نعم يؤخر النمو والتنمية15
يطيل العمر الافتراضي في الوسائط السائلة19
يطيل العمر الافتراضي على NGM15
بفا 0.5٪ بارافورمالدهيد نعم نعم انخفاض حجم الحضنة الصغيرة16
زيادة وقت التطوير الصغير16
انخفاض تفضيل الطعام16

الجدول 1. مقارنات طرق قتل OP50. القتل بالأشعة فوق البنفسجية ، والقتل الحراري ، والعلاج بالمضادات الحيوية ، والعلاج ب PFA لها تأثيرات متنوعة على الحالة التغذوية للبكتيريا وصحة الديدان التي تتغذى على البكتيريا المعالجة. تختلف طرق تعطيل الإشريكية القولونية هذه أيضا في المواد المطلوبة وقابلية التوسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تلقيح البكتيريا

  1. تحضير مرق لوريا (LB) عن طريق إذابة 10 غرام من التربتون ، و 5 غرام من خلاصة الخميرة ، و 10 غرام من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) في 950 مل من الماء المقطر.
  2. اضبط الرقم الهيدروجيني ل LB إلى 7.0 بإضافة 5M هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). يجب أن يتطلب هذا حوالي 0.2 مل فقط من هيدروكسيد الصوديوم.
  3. الأوتوكلاف وسائط LB المعدلة بالأس الهيدروجيني على دورة سائلة لمدة 45 دقيقة عند 15 رطل / بوصة مربعة. اترك المحلول يبرد ويخزن في درجة حرارة الغرفة.
  4. تلقيح مستعمرة واحدة من البكتيريا في 100 مل من LB في دورق Erlenmeyer سعة 500 مل. استزرع البكتيريا طوال الليل في حاضنة خلط 37 درجة مئوية.
  5. اعتمادا على صحة المستعمرة البكتيرية وحجم القارورة والسرعة التي يتم ضبط شاكر عليها ، قد يختلف الوقت الذي تستغرقه البكتيريا لتنمو. بعد ~ 14 ساعة ، تحقق من الكثافة البصرية (OD) للبكتيريا عند 600 نانومتر (OD600).
  6. قم بإزالة البكتيريا من شاكر عندما يكون OD600 هو 3.0 (1 × 109 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل). إذا كان OD600 أقل من 3.0 ، فأعد القارورة إلى حاضنة شاكر حتى يتم الوصول إلى OD المطلوب.
  7. قسمة البكتيريا في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو انتقل إلى الخطوة التالية.

2. العمل مع بارافورمالدهيد

ملاحظة: قد يختلف تركيز بارافورمالدهيد (PFA) المستخدم ومدة التعرض إلى حد ما اعتمادا على المناخ والموقع ونوع البكتيريا التي يتم علاجها. نقطة انطلاق جيدة ل OP50 هي التعرض ل 0.5٪ PFA لمدة 1 ساعة ، في حين أن 0.25٪ PFA لمدة 1 ساعة قد تكون كافية ل HT115.

  1. قم بإعداد 32٪ من مخزون PFA أو استخدم حل PFA 32٪ الذي تم شراؤه تجاريا. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند العمل مع PFA. ارتداء القفازات وحماية العين.
  2. أضف PFA داخل غطاء دخان كيميائي مع تهوية مناسبة. تخلص من PFA المحتوي على الغسالات والنصائح في حاويات الخطر الكيميائي المناسبة في غطاء الدخان.

3. العلاج البكتيري مع بارافورمالدهيد

  1. بمجرد أن تصل البكتيريا إلى OD600 من 3.0 ، استخدم ماصة مصلية لنقل 50 مل إلى دورق Erlenmeyer جديد سعة 250 مل. احفظ الباقي لعنصر تحكم مباشر ، أو عنصر تحكم معالج وهميا (انظر الخطوة 4) ، أو للتعامل أيضا مع PFA حسب الحاجة.
  2. تجنب السكب من قارورة إلى أخرى وكن حذرا حتى لا ترش جوانب القارورة الجديدة بالبكتيريا. قد تتلقى المستعمرات الموجودة على جانب القارورة جرعة أقل من PFA.
  3. في الغطاء الكيميائي ، أضف 781 ميكرولتر من 32٪ PFA إلى 50 مل من البكتيريا ليصل التركيز النهائي إلى 0.5٪. تخلص من الطرف المستخدم في حاوية النفايات الصلبة الخطرة الكيميائية.
  4. قم بتغطية القارورة بورق القصدير والعودة إلى حاضنة الخفق 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة وانتقل إلى الخطوة 5.

4. السيطرة على وهمية

  1. بمجرد أن تصل البكتيريا إلى OD600 من 3.0 ، استخدم ماصة مصلية لنقل 50 مل من البكتيريا إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  2. انتقل إلى الخطوة 5.3 لإكمال خطوات الغسيل المشابهة للمجموعة المعالجة ب PFA.

5. غسل البكتيريا لإزالة PFA المتبقية

  1. في الغطاء الكيميائي ، استخدم ماصة مصلية لنقل البكتيريا المعالجة من دورق Erlenmeyer إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. إن استخدام ماصة مصلية بدلا من صب البكتيريا سيمنع التلوث من أي مستعمرات بكتيرية على حافة القارورة التي ربما تجنبت العلاج المباشر باستخدام PFA.
  2. البكتيريا المعالجة بالطرد المركزي عند حوالي 3000 × جم لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق التخلص منها في حاوية خطر كيميائي للنفايات السائلة في الغطاء الكيميائي.
  3. أضف 25 مل من LB والدوامة لإعادة تعليق الحبيبات البكتيرية (ملء الأنبوب بالكامل يجعل من الصعب إعادة تعليق الحبيبات). كرر الطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات 4x.
  4. أعد تعليق الحبيبات بأحجام مثالية للمقايسات المختلفة. لمقايسات العمر الافتراضي ، يتم إعادة تعليق ألواح البذور 60 مم مع 200 ميكرولتر من البكتيريا في 10 مل من LB. يؤدي تعليق البكتيريا في 10 مل من LB إلى تركيز 5x من مزرعة 50 مل الأصلية.
  5. قم بتخزين البكتيريا في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

6. فحص جودة نمو البكتيريا

  1. بعد الغسيل النهائي والتعليق ، قم بخط لوحة LB (باستخدام طرف ماصة معقمة) مع البكتيريا المعدة. من الممارسات الجيدة وضع خط LB المستخدم للغسيل والتعليق على لوحة منفصلة أيضا للتأكد من أن LB المستخدم غير ملوث.
  2. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. تحقق من أي نمو. تعتبر البكتيريا ميتة بشكل متماثل عندما لا تنمو المستعمرات على صفيحة LB.

7. فحص الجودة لعملية التمثيل الغذائي البكتيرية باستخدام مقياس التنفس

  1. بعد الغسيل النهائي وإعادة التعليق من الخطوة 5.4 ، تأكد من أن البكتيريا ميتة أيضيا باستخدام الأدوات المتاحة مثل مقاييس التنفس19,20 وقياس معدل استهلاك الأكسجين الأساسي (OCR).
  2. تحضير محلول M9: قم بإذابة 3 جم من فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH 2PO 4) ، و 6 جم من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na2HPO4) ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) في 950 مل من الماء المقطر. الأوتوكلاف على دورة سائلة لمدة 45 دقيقة عند 15 رطل / بوصة مربعة ، ثم اترك المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 1 مل من 1 M كبريتات المغنيسيوم (MgSO4) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بترطيب خرطوشة مقياس التنفس: أضف 200 ميكرولتر من المعايرة إلى جميع آبار لوحة 96 بئرا. ضع الخرطوشة في لوحة 96 بئرا واحتضانها طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية.
  4. معايرة الفحص: في اليوم التالي ، ضع الخرطوشة المائية في الجهاز وابدأ المعايرة.
  5. إعداد لوحة اختبار الفحص: باستخدام لوحة جديدة من 96 بئرا ، أضف 160 ميكرولتر من M9 و 40 ميكرولتر من البكتيريا الجاهزة (1 × 109 CFU / mL) لاختبار الآبار. أضف 200 ميكرولتر من M9 إلى 4 آبار زاوية لاستخدامها كآبار فارغة. أضف 160 ميكرولتر من M9 و 40 ميكرولتر من LB المستخدمة للغسيل والتعليق لاستخدامها كعناصر تحكم سلبية. أضف 200 ميكرولتر من M9 إلى بقية الآبار التي لن يتم استخدامها.
  6. قم بتشغيل الفحص: بمجرد اكتمال معايرة الخرطوشة، أدخل لوحة الفحص من الخطوة 7.5 في الجهاز لتحليلها. تتضمن الإعدادات خطوات الخلط والانتظار والقياس والتكرار. ستظهر النتائج كمعدل استهلاك الأكسجين (OCR). البكتيريا ميتة أيضيا وجاهزة للاستخدام عندما يكون OCR صفرا.

Figure 1
الشكل 1. سير العمل لعلاج بارافورمالدهايد. تزرع مستعمرة واحدة من بكتيريا E. coli OP50 بين عشية وضحاها. يضاف PFA إلى تركيز نهائي بنسبة 0.5٪ ، ويتم اهتزاز الثقافة المعالجة ب PFA لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. أخيرا ، تتم إزالة PFA عن طريق غسل الثقافة باستخدام LB 5x جديد. للتأكد من أن البكتيريا المعالجة غير نشطة بشكل متكرر ، قم بإخراج صفيحة LB من البكتيريا المعالجة وتنمو بين عشية وضحاها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر سير عمل مفصل للبروتوكول في الشكل 1. تم تطوير طريقة عالية الإنتاجية وتحسينها لتعطيل التكاثر البكتيري باستمرار (الشكل 2 أ) والتمثيل الغذائي (الشكل 2 ب) للدراسات الأيضية والدوائية في أبحاث C. elegans باستخدام بارافورمالدهايد16. كان الهدف هو تحديد أقل تركيز مطلوب من PFA وأقصر وقت مطلوب لقتل البكتيريا باستمرار دون التأثير على التدابير الصحية المختلفة في الديدان. قد تختلف هذه القيم من موقع إلى آخر اعتمادا على بيئة المختبر ، ومن سلالة بكتيرية إلى أخرى. على سبيل المثال ، يعد تعرض بكتيريا HB101 إلى 0.25٪ لمدة ساعة واحدة كافيا لجعلها غير نشطة من الناحية الأيضية (الشكل 2C) ، بينما تتطلب المكورات المعوية البرازية (EF) تركيز PFA بنسبة 1.0٪ (الشكل 2D) للحصول على تأثير ثابت. تم إنشاء نهج لتحسين المختبر الفردي سابقا16 وهو مفصل في هذا العمل الحالي.

جذب الطعام واستهلاكه
مع نمو البكتيريا وتكاثرها ، فإنها تطلق العديد من المستقلبات والفيرومونات الجذابة للديدان. لتحديد ما إذا كانت الديدان لا تزال تنجذب إلى OP50 المعالج ب PFA ، تم زرع الألواح باستخدام OP50 المعالج ب PFA أو المعالجة بوهمية وتم جدولة النسبة المئوية للديدان الموجودة في العشب الغذائي مقارنة بخارج العشب. تشير البيانات إلى أن الديدان تنجذب إلى OP50 المعالج ب PFA ، حيث تبقى معظم الديدان على العشب البكتيري بعد 1 ساعة (الشكل 3 أ) ، على غرار ما لوحظ مع التحكم المعالج وهميا (الشكل 3 ب). ومع ذلك ، كما هو متوقع ، يظهر الفحص الزوجي الحساس21 أن C. elegans لديها تفضيل أقوى للتحكم الحي المعالج بالصور الوهمية (الشكل 3C) عند البذر مع PFA المعالج على نفس اللوحة. بعد إثبات أن الديدان تنجذب إلى البكتيريا التي يقتلها PFA ، وإن كانت أقل من البكتيريا الحية ، كان من الضروري إثبات أنها تأكل الطعام الذي قتله PFA. لتحديد ما إذا كانت الديدان تستهلك OP50 المعالج ب PFA ، تم قياس معدل ضخ الديدان على أنواع الطعام المختلفة. كما هو موضح في الشكل 3D ، فإن الديدان على OP50 المعالجة ب PFA لديها معدل ضخ أعلى (+ 25٪) من الديدان الموجودة في السيطرة المعالجة الوهمية. يشير هذا إلى أن الديدان لا تبطئ عمدا معدل تناولها للأغذية التي قتلها PFA ويمكن أن تشير إما إلى ارتفاع معدل الأكل أو استجابة تعويضية للتغير في سهولة ضخ الطعام المعالج.

الخصوبة والتنمية والعمر الافتراضي
يمكن أن يكون للتغيرات في الظروف الغذائية تأثيرات فسيولوجية على الديدان13,22. لاختبار التأثيرات الواسعة ، تم قياس التغيرات في معدل التطور والخصوبة والعمر. يؤخر OP50 المعالج ب PFA وقت التطور قليلا (~ 4 ساعات) لديدان N2 من النوع البري كما هو موضح في الشكل 4A. تظهر مراقبة قدرة وضع البيض للديدان المزروعة في ظروف بكتيرية مختلفة انخفاضا طفيفا ولكنه مهم في الخصوبة (-21٪) في الديدان التي تغذت على OP50 المعالج ب PFA (الشكل 4 ب). بالنسبة للمختبرات المهتمة بشيخوخة C. elegans ، تم تحديد تأثير OP50 المعالج ب PFA على طول العمر. ومن المثير للاهتمام ، أن عمر الديدان البرية التي تغذت على OP50 المعالج ب PFA لم يكن مختلفا بشكل كبير عن الديدان التي تغذت على OP50 المعالجة وهمية على ألواح وسائط نمو الديدان الخيطية القياسية (NGM) (الشكل 4C) ، ومع ذلك ، فإن OP50 المعالج ب PFA يزيد من عمر النوع البري (+23٪) عند وجود FUdR (الشكل 4D). إن تغذية OP50 المعالج ب PFA إلى سلالة fmo-2 مفرطة التعبير (OE)طويلة العمر 20 لا يغير طول عمرها مقارنة بالديدان البرية (الشكل 4E). كما ثبت أن OP50 المقتولة بالأشعة فوق البنفسجية والحرارة والمضادات الحيوية تغير عمر C. elegans. على وجه التحديد ، تم الإبلاغ عن البكتيريا المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية لإطالة العمر على NGM12،23 وعلى FUdR24. ومع ذلك ، هناك بيانات متضاربة حول تفاعل البكتيريا FUdR والبكتيريا المقتولة بالأشعة فوق البنفسجية25,26 والتي قد تكون بسبب طرق متنوعة لقتل الأشعة فوق البنفسجية والتحقق من عدم النشاط الأيضي في البكتيريا. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل البكتيريا المقتولة بالحرارة على إطالة عمر NGM27 ، والمضادات الحيوية تطيل العمر على NGM15 وفي الثقافة السائلة28.

Figure 2
الشكل 2. علاج البكتيريا مع PFA يمنع الانتشار والتمثيل الغذائي. (أ) نمو البكتيريا في وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) من OP50 المعالجة و 0.5٪ المعالجة ب PFA. (ب) معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) في mpH / min من OP50 المعالج بالوهمية و 0.5٪ المعالج ب PFA. (ج) معدل استهلاك الأكسجين الأساسي (OCR) في pmol / min من المعالجة الوهمية ، و 0.25٪ المعالجة ب PFA ، و 0.5٪ HB101 المعالج ب PFA. (د) معدل استهلاك الأكسجين الأساسي (OCR) في pmol / min من المعالجة الوهمية ، و 0.25٪ المعالجة ب PFA ، و 0.5٪ المعالجة ب PFA ، و 1.0٪ بالمكورات المعوية البرازية المعالجة ب PFA (EF). تمثل جميع أشرطة الخطأ الموضحة بالأشكال الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) ؛ تم استخدام اختبار T ثنائي الذيل لاشتقاق قيم p. تشير إلى القيمة الاحتمالية < 0.0001. وقد عدل هذا الرقم من 16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. تنجذب الديدان إلى OP50 المعالج ب PFA. النسبة المئوية للديدان التي تنجذب إلى (أ) العشب البكتيري OP50 المعالج ب PFA أو (ب) العشب البكتيري OP50 المعالج بالوهمية. (ج) اختبار اختبار المقايسة الزوجي الثنائي تفضيل الدودة للمعالجة الوهمية والمعالجة ب PFA. (د) معدل ضخ (مضخات لكل 30 ثانية) من الديدان على OP50 المعالج ب PFA أو المعالج بالوهمية. تم استخدام تحليل اختبار t ثنائي الطرف لاشتقاق قيم p لجميع المقارنات. تمثل جميع أشرطة الخطأ الموضحة بالأشكال الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) ؛ تشير إلى القيمة الاحتمالية < 0.0001. تم تعديل اللوحات A-C من 16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. تنمو الديدان وتتطور على OP50 المعالج ب PFA. (أ) وقت تطور الديدان (ح) من البيض البالغ إلى وضع البيض على OP50 المعالج والمعالج ب PFA. (ب) متوسط ذرية (عدد الديدان) من الديدان التي تغذت على OP50 المعالجة الوهمية أو المعالجة ب PFA. (ج، د) النسبة المئوية للديدان التي تغذت على OP50 المعالجة بوهمية أو المعالجة ب PFA على (C) NGM و (D) لوحات عمر FUdR. (ه) النسبة المئوية على قيد الحياة من الديدان البرية والديدان fmo-2 OE التي تغذت على OP50 المعالج ب PFA. تم استخدام تحليل اختبار t ثنائي الطرف لاشتقاق قيم p للتنمية ومقارنات الخصوبة. تم استخدام اختبار رتبة اللوغاريتم لاشتقاق قيم p لمقارنات العمر. تمثل جميع أشرطة الخطأ الموضحة بالأشكال الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) ؛ * تشير إلى القيمة p < 0.05 ، *** تشير إلى القيمة p <0.001 ، و **** تشير إلى القيمة p < 0.0001. تم تعديل اللوحات A و B و D من16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فوائد قتل PFA بالنسبة إلى طرق القتل البكتيرية الأخرى
علاج PFA هو طريقة عالية الإنتاجية لمنع التمثيل الغذائي البكتيري مع الحفاظ على مصدر غذائي مغذي ل C. elegans. قتل البكتيريا عن طريق علاج PFA له مزايا متعددة على الطرق الأخرى. على عكس المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية ، حيث يجب اختبار كل لوحة للقتل الناجح ، يمكن اختبار لوحة واحدة من مجموعة من البكتيريا المعالجة ب PFA للتحقق من صحة الدفعة16. كما أن علاج PFA فعال جدا في القضاء على التمثيل الغذائي البكتيري (الشكل 2B) ، وتظهر البكتيريا المعالجة ب PFA انخفاضا في النشاط الأيضي مقارنة بالبكتيريا المعالجة بالمضادات الحيوية19. فائدة أخرى لعلاج PFA هي أن البكتيريا تحافظ على بنيتها الخلوية وملفها الغذائي. وبالتالي ، يمكن أن تتطور الديدان على البكتيريا المعالجة ب PFA ، في حين أن تغذية البكتيريا المقتولة بالحرارة من البيض تؤدي إلى توقف النمو13،16.

الخطوات الهامة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
في حين أن البكتيريا المعالجة ل PFA هي بروتوكول مباشر نسبيا ، فمن المهم التحقق من أن كل دفعة من البكتيريا ميتة بشكل متماثل وأيضي (الخطوتان 6 و 7) والتأكد من أن خطوات الغسيل بعد معالجة PFA تتم بدقة (الخطوة 5). إذا نمت المستعمرات في الخطوة 6 ، مما يشير إلى أن البكتيريا لم تمت تماما ، فمن الممكن استكشاف تركيز PFA ومدة علاج PFA وإصلاحها في الخطوة 3. عند تحسين بروتوكول علاج PFA ، كان تركيز 0.5٪ من PFA مثاليا لقتل OP50 بنجاح مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية. 0.25٪ PFA لم يكن كافيا لقتل جميع سلالات البكتيريا أيضيا (الشكل 2C-D) وزيادة التركيز إلى 0.5٪ PFA لم يغير وقت النمو أو العمر أو تفضيل الطعام للديدان على OP50 بالنسبة إلى 0.25٪ PFA. أيضا ، كان 1 ساعة من التلقيح مع PFA أقصر وقت كاف لمنع كل نمو البكتيريا. إذا لم يتم قتل البكتيريا بالكامل عن طريق تلقيح 1 ساعة مع 0.5٪ PFA ، يمكن زيادة وقت التلقيح و / أو تركيز PFA لاستكشاف كفاءة القتل وإصلاحها. الخطوة الرئيسية الثانية في البروتوكول هي غسل البكتيريا بعد معالجة PFA (الخطوة 5). من المهم جدا إكمال جميع الغسلات الخمس وإزالة المادة الطافية تماما مع كل غسلة لضمان عدم بقاء الفورمالديهايد في البكتيريا. إذا كانت الديدان لا تنمو بشكل جيد أو لا تضخ البكتيريا المعالجة ب PFA ، فيمكن إجراء عمليات غسل إضافية.

حدود الطريقة
في حين أن البكتيريا المقتولة من PFA مثالية للقضاء على الآثار المربكة لعملية التمثيل الغذائي البكتيرية (الشكل 2B) من دراسات C. elegans ، إلا أن هناك قيودا على هذه الطريقة. على وجه التحديد ، C. elegans لديها تطور أبطأ قليلا على البكتيريا المعالجة ب PFA بالنسبة للبكتيريا الحية (الشكل 4A)16. تعمل معالجة PFA أيضا على إطالة عمر الدودة إذا كان FUdR موجودا (الشكل 4D) ، ولكن ليس على لوحات NGM (الشكل 4C)16. ومع ذلك ، فإن الأساليب الأخرى تطرح أيضا هذه التحديات. تغير البكتيريا المقتولة بالأشعة فوق البنفسجية أيضا عمر C. elegans. تشير غالبية التقارير إلى أن البكتيريا المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية تطيل عمر الدودة على NGM12,23 وعلى FUdR 24 ، مع دراسات أخرى تشير إلى أن العلاج بالأشعة فوق البنفسجية لا يؤثر على عمر 24 وأن هناك تفاعلا بين العلاج بالأشعة فوق البنفسجية و FUdR على عمر C. elegans 25,26. بالإضافة إلى التأثيرات العمرية للبكتيريا المعالجة ب PFA ، تفضل الديدان قضاء بعض الوقت على البكتيريا الحية بالنسبة للبكتيريا المعالجة ب PFA (الشكل 3C)16 ولكن لديها معدل ضخ أعلى على الطعام المعالج ب PFA (الشكل 3D). هذا يشير إلى أنهم قد يستهلكون كمية مماثلة من الطعام أو أن البكتيريا المعالجة ب PFA أسهل أو أصعب في تناولها. لوحظت العديد من هذه التأثيرات أيضا مع طرق أخرى لقتل البكتيريا12،13،14 ، مما يشير إلى أن البكتيريا النشطة الأيضية تقلل من وقت النمو ، وتقصر من العمر الافتراضي ، وأكثر جاذبية ل C. elegans.

التطبيقات المحتملة للبكتيريا المعالجة ب PFA
بشكل عام ، فإن القدرة على قتل دفعات كبيرة من البكتيريا بسرعة وموثوقية لديها إمكانات كبيرة للقضاء على الآثار المربكة لعملية التمثيل الغذائي البكتيرية في دراسات C. elegans. هذه القدرة مفيدة بشكل خاص لشاشات الأدوية ، وتجارب المكملات ، ومقايسات السمية ، ودراسات الأيض ، وفحص آثار التمثيل الغذائي الميكروبي على سلوك المضيف. مزيد من المعلومات حول استخدام البكتيريا المعالجة ب PFA في كل من هذه التطبيقات أدناه.

تجارب الأدوية والمكملات والسمية: نظرا لأنه يجب اختبار صفيحة واحدة فقط لكل دفعة من البكتيريا المعالجة ب PFA لقتل النجاح ، يمكن إضافة البكتيريا المقتولة من PFA إلى الثقافة السائلة لفحص الأدوية عالي الإنتاجية. يمكن أيضا زرع البكتيريا المعالجة ب PFA على ألواح صلبة تحتوي على جزيئات صغيرة أو مغذيات مدمجة في وسط الآجار. يمكن أن تكون الصفائح الصلبة المصنفة بالبكتيريا المعالجة ب PFA مفيدة أيضا لفحوصات السمية أو الاستجابة للإجهاد. تشير البيانات غير المنشورة إلى أن البكتيريا المعالجة ب PFA يمكن أن تساعد في التمييز بين دور مسارات الاستجابة للإجهاد البكتيري ومسارات مقاومة الإجهاد للديدان في مقاومة الباراكوات والتونيكاميسين. إن استخدام البكتيريا التي قتلها PFA في هذه المكملات الدوائية ودراسات السمية يمنع البكتيريا من استقلاب الجزيء محل الاهتمام وسيضمن أن أي نمط ظاهري لوحظ ينتج عن مركب يعمل مباشرة على C. elegans. إن استخدام البكتيريا الميتة الأيضية لتجارب الأدوية والمكملات يقلل أيضا من التباين في الجرعات ، حيث يمكن للبكتيريا الحية استقلاب كميات مختلفة من المركب محل الاهتمام من تجربة إلى أخرى.

دراسات الأيض: يمكن أيضا الخلط بين دراسات الأيض C. elegans عن طريق التمثيل الغذائي البكتيري: تتطلب مراقبة التغيرات في استقلاب الدودة عدم وجود نشاط استقلابي بكتيري29. حتى التغييرات الصغيرة في مصدر الغذاء البكتيري يمكن أن تغير مستقلب الدودة. على سبيل المثال ، يختلف مستقلب الديدان التي تتغذى على البكتيريا المغسولة الحية عن مستقلب الديدان التي تتغذى على البكتيريا الحية غير المغسولة16. يؤدي استهلاك البكتيريا المعالجة ب PFA أيضا إلى تغيير مستقلب الدودة بالنسبة إلى استهلاك الطعام الحي16 ولكنه يسمح بإجراء مقارنات بين تأثيرات الظروف التجريبية على استقلاب C. elegans بمعزل عن التمثيل الغذائي البكتيري.

الدراسات السلوكية للميكروب المضيف: أخيرا ، يمكن استخدام البكتيريا المعالجة ب PFA لتحديد التفاعلات بين التمثيل الغذائي البكتيري وسلوك المضيف. يمكن أن تكون المستقلبات التي تفرزها كل من البكتيريا المسببة للأمراض وغير المسببة للأمراض جذابة أو طاردة للديدان للتأثير على سلوكها في البحث عن الطعام والتغذية 10،11،30. علاوة على ذلك ، يمكن للبكتيريا إنتاج معدلات عصبية تقود التغييرات في الحركة30. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي نمو C. elegans على سلالات مختلفة من البكتيريا إلى تغيير حجم الحضنة ووقت النمو وعلم وظائف الأعضاء31,32. يمكن أن يساعد علاج هذه البكتيريا باستخدام PFA في تحديد ما إذا كانت تأثيرات بكتيريا معينة على C. elegans تتطلب استقلاب بكتيري نشط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R21AG059117 ومختبرات بول إف جلين لبيولوجيا أبحاث الشيخوخة في جامعة ميشيغان. تم تمويل SB من قبل T32AG000114. تم تمويل ESK من قبل NSF DGE 1841052.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum Foil Staples 2549291
Bunsen burner VWR 470121-700 
Cell Density Meter Denville 80-3000-45 
Centrifuge Eppendorg 5430
Chemical fume hood Labcono 975050411384RG
Conincal tubes (50 mL) Fisher 339652
Cuvettes  Fisher 14-955-127
E. coli OP50 CGC OP50
Erlenmyer flasks Fisher 250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Inoculation loop Fisher 22-363-605
LB Agar Fisher BP1425500
Liquid waste collection bottle Thomas Scientific 1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M7506
Paraformaldehyde (32%) Electron Microscopy Sciences 15714-S Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor Eppendorf Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm) Fisher FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher P2853
Seahorse XF Calibrant Agilent 100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate Agilent 101085-004
Serological pipettes (50 mL) Genesee Scientific 12-107
Shaker incubator Thermo 11 676 083
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Sigma S374-500
Solid waste collection bucket M&M Industries  5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone Genesee Scientific 20-251
Vortex Thermo 11676331
Weighing balance C Goldenwall HZ10K6B
Yeast Extract Genesee Scientific 20-255

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  3. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
  4. Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
  5. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  6. Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
  7. McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
  8. Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
  9. Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
  10. Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
  11. Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
  12. Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
  13. Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
  14. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  15. Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
  16. Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
  17. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  18. Felix, H. Permeabilized and immobilized cells. Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).
  19. Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
  20. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  21. Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
  22. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  23. Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
  24. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  25. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  26. Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
  27. Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
  28. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
  29. Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
  30. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  31. Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
  32. Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).

Tags

البكتيريا المعطلة الأيضية ، أبحاث Caenorhabditis elegans ، البحوث الجينية ، أبحاث التطوير ، أبحاث الشيخوخة ، أبحاث التمثيل الغذائي ، أبحاث السلوك ، التمثيل الغذائي البكتيري ، الأشعة فوق البنفسجية ، القتل الحراري ، المضادات الحيوية ، علاج PFA ، علاج بارافورمالدهيد ، طريقة عالية الإنتاجية
منهجية لتعطيل البكتيريا الأيضية لأبحاث <em>التهاب Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., … More

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., Huang, S., Leiser, S. F. Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research. J. Vis. Exp. (197), e65775, doi:10.3791/65775 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter