Summary
Die Nahrungsquelle für Caenorhabditis elegans im Labor sind lebende Escherichia coli. Da Bakterien metabolisch aktiv sind, stellen sie eine Störvariable in metabolischen und medikamentösen Studien an C. elegans dar. Ein detailliertes Protokoll zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien mit Paraformaldehyd ist hier beschrieben.
Abstract
Caenorhabditis elegans ist ein gängiger Modellorganismus für die Erforschung von Genetik, Entwicklung, Alterung, Stoffwechsel und Verhalten. Da C. elegans sich von lebenden Bakterien ernährt, kann die Stoffwechselaktivität ihrer Nahrungsquelle Experimente verwirren, die nach den direkten Auswirkungen verschiedener Eingriffe auf den Wurm suchen. Um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels zu vermeiden, haben die Forscher von C. elegans mehrere Methoden zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien eingesetzt, darunter ultraviolette (UV)-Bestrahlung, Hitzeabtötung und Antibiotika. Die UV-Behandlung hat einen relativ geringen Durchsatz und kann nicht in der Flüssigkultur eingesetzt werden, da jede Platte auf eine erfolgreiche bakterielle Abtötung untersucht werden muss. Eine zweite Behandlungsmethode, die Hitzeabtötung, wirkt sich negativ auf die Textur und die Nährstoffqualität der Bakterien aus, was zum Entwicklungsstillstand von C. elegans führt. Schließlich kann die Behandlung mit Antibiotika die Physiologie von C. elegans direkt verändern und das Bakterienwachstum verhindern. Dieses Manuskript beschreibt eine alternative Methode zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien mittels Paraformaldehyd (PFA). Bei der PFA-Behandlung werden Proteine in Bakterienzellen vernetzt, um die Stoffwechselaktivität zu verhindern und gleichzeitig die Zellstruktur und den Nährstoffgehalt zu erhalten. Diese Methode hat einen hohen Durchsatz und kann in Flüssigkulturen oder festen Platten verwendet werden, da das Testen einer Platte mit PFA-behandelten Bakterien auf Wachstum die gesamte Charge validiert. Die metabolische Inaktivierung durch PFA-Behandlung kann verwendet werden, um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels auf Studien zur Arzneimittel- oder Metaboliten-Supplementierung, Stressresistenz, Metabolomik und Verhalten bei C. elegans zu eliminieren.
Introduction
Caenorhabditis elegans wurde ursprünglich 1965 als Modellorganismusvorgeschlagen 1 und hat sich seitdem in Studien zu Genetik, Entwicklung, Verhalten, Altern und Stoffwechsel 2durchgesetzt. Aufgrund ihrer großen Brutgröße und transparenten Kutikula eignet sich C. elegans besonders gut für das Hochdurchsatz-Screening mit fluoreszierenden Reportern3. Ihr kurzer Lebenszyklus, ihre hermaphroditische Vermehrung und ihre genetische Homologie mit dem Menschen machen C. elegans auch zu einem wertvollen Modellsystem für Studien zur Entwicklung4 und zur Alterungsbiologie5. Darüber hinaus sind C. elegans relativ pflegeleicht. Würmer können in Flüssigkultur oder auf festen Agarplatten gezüchtet werden und ernähren sich von lebenden Escherichia coli OP50-Bakterien4.
Die Lebendnahrungsquelle von C. elegans kann jedoch Studien über den Stoffwechsel, die Einnahme von Medikamenten und das Verhalten verfälschen. Da lebende Bakterien ihren eigenen Stoffwechsel haben, verändern Versuchsbedingungen, die auf die Bakterien einwirken, auch die Nährstoffe und Metaboliten, die den Würmern zur Verfügung stehen. Zum Beispiel haben Unterschiede in den bakteriellen Eisen-, Aminosäure- und Folatkonzentrationen unterschiedliche Auswirkungen auf die Entwicklung, Physiologie und Lebensdauer von C. elegans 6. Viele gängige Laborpraktiken können solche Veränderungen in der Nährstoffzusammensetzung und den von OP50 produzierten Metaboliten hervorrufen. Insbesondere die Exposition gegenüber 5-Fluor-2'-Desoxyuridin (FUdR), einer Verbindung, die üblicherweise zur Verhinderung der Fortpflanzung bei C. elegans verwendet wird, löst breite Veränderungen in der OP50-Genexpression aus, einschließlich der Aminosäurebiosynthesewege7. Lebende Bakterien können auch Studien verfälschen, in denen C. elegans mit kleinen Molekülen ergänzt wird, da Bakterien die Wirkstoffe teilweise oder vollständig verstoffwechseln können. Darüber hinaus können die Auswirkungen dieser kleinen Moleküle auf die Bakterien wiederum die Physiologie von C. elegans verändern, wie mit dem lebensverlängernden Medikament Metformin8 berichtet wurde. Schließlich können lebende Bakterien die Umgebung des Wurms auf eine Weise verändern, die das Verhalten ändert, wie z. B. die Sekretion attraktiver Geruchsstoffe9, die Produktion exogener Neuromodulatoren10 und die Schaffung von Sauerstoffgradienten in einem dichten Bakterienrasen11.
Um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels auf die Forschung an C. elegans abzuschwächen, wurden mehrere Methoden zur Abtötung von Bakterien entwickelt (Tabelle 1). Drei gängige Strategien zur Abtötung von OP50 sind UV-Bestrahlung, Hitzeabtötung und Antibiotikabehandlung. Obwohl sie unkompliziert und relativ kostengünstig sind, kann jede dieser Methoden unerwünschte Auswirkungen sowohl auf Bakterien als auch auf C. elegans haben. Die UV-Abtötung über einen UV-Vernetzer12 ist ein geringer Durchsatz, und die Geschwindigkeit ist durch die Anzahl der Platten begrenzt, die in den UV-Vernetzer passen können. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit der UV-Abtötung von Platte zu Platte innerhalb einer Charge variieren, und das Testen auf Wachstum auf allen Platten kann in großen Experimenten schwierig werden. Die hitzeabtötende OP50 durch die Aussetzung der Kultur gegenüber Temperaturen von >60 °C bringt eine Reihe anderer Herausforderungen mit sich. Hohe Hitze kann die für den Wurm wichtigen Nährstoffe schädigen und die Zellstruktur von Bakterien zerstören, wodurch eine weichere Textur entsteht, die die Zeit, die Würmer mit dem Futter verbringen, verringert13. Diese Methode kann auch nicht während des gesamten Lebenszyklus von C. elegans angewendet werden, da Würmer, die mit hitzeabgetöteten Bakterien gefüttert werden, in einem frühen Entwicklungsstadium zum Stillstand kommen können13. Die Behandlung mit Antibiotika ist eine dritte gängige Methode zur Unterdrückung des bakteriellen Stoffwechsels14, aber Antibiotika können auch das Wachstum und den Stoffwechsel von Würmern verändern15.
Eine Lösung, um die metabolischen Auswirkungen lebender Bakterien zu eliminieren und gleichzeitig die Bakterienstruktur und die essentiellen Nährstoffe zu erhalten, besteht darin, OP50 mit Paraformaldehyd (PFA)16 abzutöten. PFA ist ein Polymer aus Formaldehyd, das Proteine innerhalb von Zellen17 vernetzen kann, um die bakterielle Replikation zu verhindern, ohne interne Zellstrukturen wie die innere Plasmamembran18 zu zerstören. Aufgrund dieser Erhaltung der inneren Zellstruktur zeigen PFA-behandelte Bakterien kein Wachstum oder Stoffwechselaktivität, bleiben aber eine essbare und nährstoffreiche Nahrungsquelle für C. elegans16. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Verfügung gestellt, das zeigt, wie Bakterien mit Paraformaldehyd metabolisch inaktiviert werden können.
| Methode | Benötigte Materialien | Skalierbar? | Ernährungs? | Auswirkungen auf Worm? | ||||
| UV | UV-Vernetzer | Begrenzt durch: | Ja | Unterschiedliche Auswirkungen auf die Lebensdauer von NGM12, 23, 24 | ||||
| Anzahl der Platten, die in den UV-Vernetzer passen | Unterschiedliche Auswirkungen auf die Lebensdauer von FUdR24, 26, 27 | |||||||
| Bestrahlungszeit pro Platte | Verminderte Lebensmittelpräferenz16 | |||||||
| Fähigkeit, jede Platte auf Wachstum zu überprüfen8 | ||||||||
| Wärme | >60 °C Inkubator | Ja | Nein: zerstört die Zellwand, vermindert den Nährwert | Entwicklungsstillstand 13 | ||||
| Verminderte Lebensmittelpräferenz13 | ||||||||
| Verlängert die Lebensdauer des NGM31 | ||||||||
| Antibiotika | Antibiotika (Kanamycin, Carbenicillin, etc.) | Ja | Ja | Verzögert Wachstum und Entwicklung15 | ||||
| Verlängert die Lebensdauer in flüssigen Medien19 | ||||||||
| Verlängert die Lebensdauer des NGM15 | ||||||||
| PFA | 0,5 % Paraformaldehyd | Ja | Ja | Verkleinerung der kleinen Brut16 | ||||
| Geringe Erhöhung der Entwicklungszeit16 | ||||||||
| Verminderte Lebensmittelpräferenz16 | ||||||||
Tabelle 1. Vergleiche von Methoden zur Abtötung von OP50. UV-Abtötung, Hitzeabtötung, Antibiotikabehandlung und PFA-Behandlung haben unterschiedliche Auswirkungen auf den Ernährungszustand der Bakterien und die Gesundheit von Würmern, die mit behandelten Bakterien gefüttert werden. Diese Methoden zur replikativen Inaktivierung von E. coli unterscheiden sich auch in ihren benötigten Materialien und ihrer Skalierbarkeit.
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Protocol
1. Bakterien-Inokulation
- Bereiten Sie Luria-Brühe (LB) zu, indem Sie 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid (NaCl) in 950 ml destilliertem Wasser auflösen.
- Stellen Sie den pH-Wert des LB auf 7,0 ein, indem Sie 5 M Natriumhydroxid (NaOH) hinzufügen. Dies sollte nur etwa 0,2 ml NaOH erfordern.
- Autoklavieren Sie das pH-angepasste LB-Medium in einem Flüssigkeitszyklus für 45 Minuten bei 15 psi. Lassen Sie die Lösung abkühlen und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
- Eine einzelne Bakterienkolonie wird in 100 ml LB in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht in einem 37 °C heißen Schüttel-Inkubator.
- Abhängig von der Gesundheit der Bakterienkolonie, der Größe des Kolbens und der Geschwindigkeit, auf die der Schüttler eingestellt ist, kann die Zeit, die das Wachstum der Bakterien benötigt, variieren. Nach ~14 h ist die optische Dichte (OD) der Bakterien bei 600 nm (OD600) zu überprüfen.
- Entfernen Sie die Bakterien aus dem Schüttler, wenn der OD600 3,0 beträgt (1 x 109 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml). Wenn der Außendurchmesser600 kleiner als 3,0 ist, wird der Kolben wieder in den Schüttelinkubator gegeben, bis der gewünschte Außendurchmesser erreicht ist.
- Aliquotieren Sie die Bakterien in konische 50-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 °C oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
2. Arbeiten mit Paraformaldehyd
HINWEIS: Die verwendete Konzentration von Paraformaldehyd (PFA) und die Dauer der Exposition können je nach Klima, Standort und Art der zu behandelnden Bakterien etwas variieren. Ein guter Ausgangspunkt für OP50 ist die Exposition gegenüber 0,5 % PFA für 1 h, während 0,25 % PFA für 1 h für HT115 ausreichend sein können.
- Bereiten Sie 32 % PFA-Brühe vor oder verwenden Sie eine im Handel erhältliche 32 %ige PFA-Lösung. Verwenden Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA), wenn Sie mit PFA arbeiten. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz.
- Fügen Sie PFA in einen chemischen Abzug mit ausreichender Belüftung ein. Entsorgen Sie PFA-haltige Waschmittel und Spitzen in geeigneten Behältern für chemische Gefahren im Abzug.
3. Bakterielle Behandlung mit Paraformaldehyd
- Sobald die Bakterien einen OD600 von 3,0 erreicht haben, verwenden Sie eine serologische Pipette, um 50 ml in einen neuen 250-ml-Erlenmeyerkolben zu überführen. Bewahren Sie den Rest für eine Live-Kontrolle, eine simulierte Kontrolle (siehe Schritt 4) oder für die Behandlung mit PFA nach Bedarf auf.
- Vermeiden Sie es, von einem Kolben in einen anderen zu gießen, und achten Sie darauf, die Seiten des neuen Kolbens nicht mit Bakterien zu bespritzen. Kolonien an der Seite des Kolbens können eine niedrigere Dosis von PFA erhalten.
- In der Chemikalienhaube 781 μl 32 % PFA auf 50 ml Bakterien geben, um die Endkonzentration auf 0,5 % zu bringen. Entsorgen Sie die verwendete Spitze in einem Behälter für feste chemische Abfälle.
- Decken Sie den Kolben mit Folie ab und stellen Sie ihn für 1 h in den 37 °C heißen Schüttelinkubator. Nach 1 h nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und fahren Sie mit Schritt 5 fort.
4. Simulierte Kontrolle
- Sobald die Bakterien einen OD600 von 3,0 erreicht haben, verwenden Sie eine serologische Pipette, um 50 ml der Bakterien in ein konisches 50-ml-Röhrchen zu überführen.
- Fahren Sie mit Schritt 5.3 fort, um die Waschschritte ähnlich wie bei der PFA-behandelten Gruppe abzuschließen.
5. Waschen der Bakterien, um PFA-Reste zu entfernen
- In der Chemikalienhaube werden die behandelten Bakterien mit einer serologischen Pipette aus dem Erlenmeyerkolben in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt. Die Verwendung einer serologischen Pipette anstelle des Ausgießens der Bakterien verhindert eine Kontamination durch Bakterienkolonien am Rand des Kolbens, die möglicherweise eine direkte Behandlung mit PFA vermieden haben.
- Behandelte Bakterien bei ca. 3000 x g für 20 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn in einem Behälter für chemische Gefahren aus flüssigen Abfällen in der Chemikalienhaube entsorgen.
- Fügen Sie 25 ml LB und Vortex hinzu, um das Bakterienpellet zu resuspendieren (Wenn Sie das Röhrchen vollständig füllen, wird es schwieriger, das Pellet zu resuspendieren). Zentrifugation und Pellet-Resuspension 4x wiederholen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in Volumina, die für verschiedene Assays optimal sind. Für Lifelife-Assays werden 60-mm-Platten mit 200 μl Bakterien in 10 ml LB resuspendiert. Die Resuspendierung der Bakterien in 10 ml LB führt zu einer 5-fachen Konzentration gegenüber der ursprünglichen 50-ml-Kultur.
- Lagern Sie die Bakterien bei 4 °C.
6. Qualitätskontrolle des Bakterienwachstums
- Nach dem abschließenden Waschen und Resuspension wird eine LB-Platte (mit einer sterilen Pipettenspitze) mit den vorbereiteten Bakterien bestrichen. Es empfiehlt sich, das zum Waschen und Resuspendieren verwendete LB ebenfalls auf eine separate Platte zu streichen, um sicherzustellen, dass das verwendete LB nicht kontaminiert wurde.
- Stellen Sie die Platten über Nacht in einen 37 °C warmen Inkubator. Prüfen Sie, ob es Wachstum gibt. Die Bakterien gelten als replikativ tot, wenn auf der LB-Platte keine Kolonien wachsen.
7. Qualitätskontrolle des bakteriellen Stoffwechsels mittels Respirometer
- Vergewissern Sie sich nach dem abschließenden Waschen und der Resuspension aus Schritt 5.4, dass die Bakterien metabolisch abgestorben sind, indem Sie die verfügbaren Instrumente wie Respirometer19,20 verwenden und die basale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) messen.
- M9-Lösung vorbereiten: 3 g einbasisches Kaliumphosphat (KH2PO 4), 6 g dibasisches Natriumphosphat (Na2HPO4) und 5 g Natriumchlorid (NaCl) in 950 ml destilliertem Wasser lösen. Autoklavieren Sie in einem Flüssigkeitszyklus 45 Minuten lang bei 15 psi und lassen Sie die Lösung dann auf Raumtemperatur abkühlen. 1 ml 1 M Magnesiumsulfat (MgSO4) zugeben und bei Raumtemperatur lagern.
- Befeuchten Sie die Respirometerkartusche: Geben Sie 200 μl Kalibrant in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Legen Sie die Kartusche in die 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht in einem 37 °C warmen Inkubator.
- Assay-Kalibrierung: Legen Sie am nächsten Tag die hydratisierte Kartusche in das Gerät und beginnen Sie mit der Kalibrierung.
- Aufbau der Assay-Testplatte: Mit einer neuen 96-Well-Platte 160 μl M9 und 40 μl der vorbereiteten Bakterien (1 x 109 KBE/ml) in die Testwells geben. Geben Sie 200 μl M9 in die 4 Eckvertiefungen, um sie als Blindvertiefungen zu verwenden. Fügen Sie 160 μl M9 und 40 μl LB hinzu, die zum Waschen und Resuspendieren verwendet werden, um sie als Negativkontrollen zu verwenden. Geben Sie 200 μl M9 in die restlichen Vertiefungen, die nicht verwendet werden.
- Führen Sie den Assay durch: Sobald die Kartuschenkalibrierung abgeschlossen ist, setzen Sie die Assay-Platte aus Schritt 7.5 zur Analyse in das Gerät ein. Die Einstellungen umfassen Schritte zum Mischen, Warten, Messen und Loopen. Die Ergebnisse werden als Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) angezeigt. Die Bakterien sind metabolisch tot und einsatzbereit, wenn die OCR Null ist.
Abbildung 1. Arbeitsablauf für die Paraformaldehyd-Behandlung. Eine einzelne Kolonie von E. coli OP50-Bakterien wird über Nacht gezüchtet. PFA wird zu einer Endkonzentration von 0,5 % zugegeben und die PFA-behandelte Kultur wird 1 h bei 37 °C geschüttelt. Zum Schluss wird das PFA entfernt, indem die Kultur mit frischem LB 5x gewaschen wird. Um zu bestätigen, dass die behandelten Bakterien replizierend inaktiv sind, streifen Sie eine LB-Platte der behandelten Bakterien aus und wachsen Sie über Nacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Ein detaillierter Workflow des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Es wurde eine Hochdurchsatzmethode entwickelt und optimiert, um die bakterielle Replikation (Abbildung 2A) und den Stoffwechsel (Abbildung 2B) für Stoffwechsel- und Wirkstoffstudien in der C. elegans-Forschung unter Verwendung von Paraformaldehyd16 konsistent zu inaktivieren. Ziel war es, die niedrigste PFA-Konzentration und die kürzeste Zeitspanne zu bestimmen, die erforderlich ist, um die Bakterien konsequent abzutöten, ohne die Gesundheit der Würmer zu beeinträchtigen. Diese Werte können je nach Laborumgebung von einem Ort zum anderen und von einem Bakterienstamm zum anderen variieren. Zum Beispiel reicht die Exposition von HB101-Bakterien gegenüber 0,25 % für 1 Stunde aus, um sie metabolisch inaktiv zu machen (Abbildung 2C), während Enterococcus faecalis (EF) eine PFA-Konzentration von 1,0 % (Abbildung 2D) für eine konsistente Wirkung erfordert. Ein Ansatz zur individuellen Laboroptimierung wurde bereits etabliert16 und wird in der vorliegenden Arbeit detailliert beschrieben.
Nahrungsmittelanziehung und -konsum
Wenn Bakterien wachsen und sich vermehren, setzen sie verschiedene Metaboliten und Pheromone frei, die für die Würmer attraktiv sind. Um festzustellen, ob die Würmer weiterhin von dem PFA-behandelten OP50 angezogen werden, wurden die Platten mit PFA-behandeltem oder simuliertem OP50 besät und der Prozentsatz der auf dem Futterrasen vorhandenen Würmer im Vergleich zu außerhalb des Rasens tabellarisch dargestellt. Die Daten zeigen, dass Würmer von dem PFA-behandelten OP50 angezogen werden, da die meisten Würmer nach 1 Stunde auf dem Bakterienrasen verbleiben (Abbildung 3A), ähnlich wie bei der simulierten Kontrolle (Abbildung 3B). Wie erwartet, zeigt ein sensitiver paarweiser Assay21 jedoch, dass C. elegans eine stärkere Präferenz für die simulierte lebende Kontrolle (Abbildung 3C) hat, wenn sie mit der PFA-behandelten auf derselben Platte ausgesät wird. Nachdem festgestellt wurde, dass Würmer von PFA-abgetöteten Bakterien angezogen werden, wenn auch weniger als lebende Bakterien, war es unerlässlich nachzuweisen, dass sie die PFA-abgetötete Nahrung fressen. Um festzustellen, ob die Würmer das PFA-behandelte OP50 verzehren, wurde die Pumprate der Würmer auf verschiedenen Lebensmitteltypen gemessen. Wie in Abbildung 3D gezeigt, haben Würmer auf PFA-behandeltem OP50 eine höhere Pumprate (+25%) als Würmer auf der simulierten Kontrolle. Dies deutet darauf hin, dass Würmer ihre Fressgeschwindigkeit bei PFA-abgetöteten Lebensmitteln nicht absichtlich verlangsamen und könnten entweder auf eine höhere Fressrate oder eine kompensatorische Reaktion auf eine Veränderung der Leichtigkeit des Pumpens der behandelten Nahrung hinweisen.
Fruchtbarkeit, Entwicklung und Lebensdauer
Veränderungen der Nahrungsbedingungen können physiologische Auswirkungen auf Würmer haben13,22. Um die breite Wirkung zu testen, wurden Veränderungen in der Entwicklungsgeschwindigkeit, der Fruchtbarkeit und der Lebensdauer gemessen. PFA-behandeltes OP50 verzögert die Entwicklungszeit (~4 h) von Wildtyp-N2-Würmern leicht, wie in Abbildung 4A dargestellt. Die Überwachung der Eiablagekapazität von Würmern, die unter verschiedenen bakteriellen Bedingungen gezüchtet wurden, zeigt eine leichte, aber signifikante Abnahme der Fruchtbarkeit (-21 %) bei den Würmern, die mit PFA behandeltem OP50 gefüttert wurden (Abbildung 4B). Für Labore, die sich für das Altern von C. elegans interessierten, wurde dann die Wirkung von PFA-behandeltem OP50 auf die Langlebigkeit bestimmt. Interessanterweise unterschied sich die Lebensdauer von Wildtyp-Würmern, die mit PFA-behandeltem OP50 gefüttert wurden, nicht signifikant von der der Würmer, die mit Mock-behandeltem OP50 auf Standard-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)-Platten gefüttert wurden (Abbildung 4C), jedoch verlängert PFA-behandeltes OP50 die Wildtyp-Lebensdauer (+23%), wenn FUdR vorhanden ist (Abbildung 4D). Die Fütterung von PFA-behandeltem OP50 an einen langlebigen fmo-2-überexprimierenden (OE) Stamm20 ändert seine Langlebigkeit im Vergleich zu Wildtyp-Würmern nicht (Abbildung 4E). Es wurde auch gezeigt, dass UV-, Hitze- und Antibiotika-abgetötetes OP50 die Lebensdauer von C. elegans verändert. Insbesondere wurde berichtet, dass UV-behandelte Bakterien die Lebensdauer von NGM12,23 und FUdR 24 verlängern. Es gibt jedoch widersprüchliche Daten über die Interaktion von FUdR und UV-abgetöteten Bakterien25,26, die auf verschiedene Methoden der UV-Abtötung und die Validierung der metabolischen Inaktivität in den Bakterien zurückzuführen sein können. Darüber hinaus verlängern hitzeabgetötete Bakterien die Lebensdauer von NGM27 und Antibiotika verlängern die Lebensdauer von NGM15 und in Flüssigkultur28.
Abbildung 2. Die Behandlung von Bakterien mit PFA hemmt die Vermehrung und den Stoffwechsel. (A) Bakterienwachstum in koloniebildenden Einheiten (KBE) von nachbehandeltem und 0,5% PFA-behandeltem OP50. (B) Extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) in mpH/min von simuliertem und 0,5% PFA-behandeltem OP50. (C) Basaler Sauerstoffverbrauch (OCR) in pmol/min von simuliertem, 0,25 % PFA-behandeltem und 0,5 % PFA-behandeltem HB101. (D) Basaler Sauerstoffverbrauch (OCR) in pmol/min von simulierten, 0,25 % PFA-behandelten, 0,5 % PFA-behandelten und 1,0 % PFA-behandelten Enterococcus faecalis (EF). Alle in den Abbildungen dargestellten Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Ein zweiseitiger t-Test wurde verwendet, um p-Werte abzuleiten. bezeichnet den p-Wert < 0,0001. Diese Zahl wurde von 16 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Würmer werden von PFA-behandeltem OP50 angezogen. Prozentsatz der Würmer, die von (A) PFA-behandeltem oder (B) simuliertem OP50-Bakterienrasen angezogen werden. (C) Paarweise sensibilisierter Assay, der die Wurmpräferenz für mock-treated und PFA-behandeltes OP50 testet. (D) Pumprate (Pumpen pro 30 s) von Schnecken auf PFA-behandeltem oder nachbehandeltem OP50. Eine zweiseitige t-Test-Analyse wurde verwendet, um p-Werte für alle Vergleiche abzuleiten. Alle in den Abbildungen dargestellten Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. bezeichnet den p-Wert < 0,0001. Die Paneele A-C wurden von 16 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Würmer wachsen und entwickeln sich auf PFA-behandeltem OP50. (A) Entwicklungszeit (h) von Würmern von Ei-zu-Ei-legenden Erwachsenen auf simuliert und PFA-behandeltem OP50. (B) Durchschnittliche Nachkommenschaft (Anzahl der Würmer) von Würmern, die mit Mock-Treated oder PFA-behandeltem OP50 gefüttert wurden. (C, D) Prozentsatz der lebenden Würmer, die mit simuliertem oder PFA-behandeltem OP50 auf (C) NGM- und (D) FUdR-Lebensspannenplatten gefüttert wurden. (E) Prozentsatz der lebenden Wildtyp- und fmo-2-OE-Würmer, die mit PFA-behandeltem OP50 gefüttert wurden. Eine zweiseitige t-Test-Analyse wurde verwendet, um p-Werte für Entwicklungs- und Fruchtbarkeitsvergleiche abzuleiten. Der Log-Rank-Test wurde verwendet, um p-Werte für Lebensdauervergleiche abzuleiten. Alle in den Abbildungen dargestellten Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. * steht für den p-Wert < 0,05, *** für den p-Wert <0,001 und **** für den p-Wert < 0,0001. Die Panels A, B und D wurden von16 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Vorteile der PFA-Abtötung im Vergleich zu anderen bakterienabtötenden Methoden
Die PFA-Behandlung ist eine Hochdurchsatzmethode, um den bakteriellen Stoffwechsel zu verhindern und gleichzeitig eine nahrhafte Nahrungsquelle für C. elegans zu erhalten. Die Abtötung von Bakterien durch PFA-Behandlung hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden. Im Gegensatz zur UV-Behandlung, bei der jede Platte auf eine erfolgreiche Abtötung getestet werden muss, kann eine einzelne Platte aus einer Charge PFA-behandelter Bakterien getestet werden, um die Charge16 zu validieren. Die PFA-Behandlung ist auch sehr wirksam bei der Beseitigung des bakteriellen Stoffwechsels (Abbildung 2B), und PFA-behandelte Bakterien weisen im Vergleich zu mit Antibiotika behandelten Bakterien eine verminderte Stoffwechselaktivität auf19. Ein weiterer Vorteil der PFA-Behandlung ist, dass die Bakterien ihre Zellstruktur und ihr Nährwertprofil beibehalten. Folglich können sich Würmer auf PFA-behandelten Bakterien entwickeln, während die Fütterung von hitzeabgetöteten Bakterien aus dem Ei zu einem Entwicklungsstillstand führt13,16.
Kritische Schritte und Fehlerbehebung
Während die PFA-Behandlung von Bakterien ein relativ einfaches Protokoll ist, ist es wichtig zu validieren, dass jede Charge von Bakterien replikativ und metabolisch abgestorben ist (Schritte 6 und 7) und sicherzustellen, dass die Waschschritte nach der PFA-Behandlung gründlich durchgeführt werden (Schritt 5). Wenn in Schritt 6 Kolonien wachsen, was darauf hindeutet, dass die Bakterien nicht vollständig abgestorben sind, ist es möglich, die PFA-Konzentration und die Dauer der PFA-Behandlung in Schritt 3 zu beheben. Bei der Optimierung des PFA-Behandlungsprotokolls erwies sich eine PFA-Konzentration von 0,5 % als ideal, um OP50 mit minimalen Nebenwirkungen erfolgreich abzutöten. 0,25 % PFA reichten nicht aus, um alle Bakterienstämme metabolisch abzutöten (Abbildung 2C-D), und die Erhöhung der Konzentration auf 0,5 % PFA veränderte nicht die Entwicklungszeit, die Lebensdauer oder die Nahrungspräferenz der Würmer auf OP50 im Vergleich zu 0,25 % PFA. Außerdem war 1 Stunde Inokulation mit PFA die kürzeste Zeit, die ausreichte, um jegliches Bakterienwachstum zu verhindern. Wenn Bakterien durch eine 1-stündige Inokulation mit 0,5 % PFA nicht vollständig abgetötet werden, kann die Impfzeit und/oder die PFA-Konzentration erhöht werden, um die Abtötungseffizienz zu beheben. Ein zweiter wichtiger Schritt im Protokoll ist das Waschen der Bakterien nach der PFA-Behandlung (Schritt 5). Es ist sehr wichtig, alle fünf Wäschen abzuschließen und den Überstand bei jeder Wäsche vollständig zu entfernen, um sicherzustellen, dass kein Formaldehyd in den Bakterien verbleibt. Wenn die Würmer nicht gut wachsen oder die PFA-behandelten Bakterien nicht abpumpen, können zusätzliche Wäschen durchgeführt werden.
Einschränkungen der Methode
Während PFA-abgetötete Bakterien ideal sind, um die verwirrenden Effekte des bakteriellen Stoffwechsels (Abbildung 2B) aus C. elegans-Studien zu eliminieren, gibt es Einschränkungen bei dieser Methode. Insbesondere entwickeln sich C. elegans auf PFA-behandelten Bakterien im Vergleich zu lebenden Bakterien etwas langsamer (Abbildung 4A)16. Die PFA-Behandlung verlängert auch die Lebensdauer der Schnecken, wenn FUdR vorhanden ist (Abbildung 4D), jedoch nicht auf NGM-Platten (Abbildung 4C)16. Diese Herausforderungen stellen jedoch auch andere Methoden dar. UV-abgetötete Bakterien verändern auch die Lebensdauer von C. elegans. Die meisten Berichte deuten darauf hin, dass UV-behandelte Bakterien die Lebensdauer von Würmern auf NGM12,23 und auf FUdR 24 verlängern, wobei andere Studien darauf hindeuten, dass die UV-Behandlung die Lebensdauer nicht beeinflusst 24 und dass es eine Wechselwirkung zwischen UV-Behandlung und FUdR auf der Lebensdauer von C. elegans gibt25,26. Zusätzlich zu den Auswirkungen von PFA-behandelten Bakterien auf die Lebensdauer verbringen Würmer im Vergleich zu PFA-behandelten Bakterien lieber Zeit mit lebenden Bakterien (Abbildung 3C)16, haben aber eine höhere Pumprate auf PFA-behandelten Lebensmitteln (Abbildung 3D). Dies deutet darauf hin, dass sie möglicherweise eine ähnliche Menge an Nahrung zu sich nehmen oder dass PFA-behandelte Bakterien leichter oder schwerer zu essen sind. Viele dieser Effekte werden auch bei anderen Methoden zur Abtötung von Bakterien beobachtet12,13,14, was darauf hindeutet, dass metabolisch aktive Bakterien die Entwicklungszeit verkürzen, die Lebensdauer verkürzen und für C. elegans attraktiver sind.
Mögliche Anwendungen von PFA-behandelten Bakterien
Insgesamt hat die Fähigkeit, große Mengen von Bakterien schnell und zuverlässig abzutöten, ein großes Potenzial, die verwirrenden Effekte des bakteriellen Stoffwechsels in C. elegans-Studien zu eliminieren. Diese Fähigkeit ist besonders nützlich für Arzneimittelscreenings, Supplementierungsexperimente, Toxizitätstests, Metabolomik-Studien und die Untersuchung der Auswirkungen des mikrobiellen Stoffwechsels auf das Wirtsverhalten. Weitere Informationen zur Verwendung von PFA-behandelten Bakterien in jeder dieser Anwendungen finden Sie unten.
Arzneimittel-, Supplementierungs- und Toxizitätsexperimente: Da nur eine Platte pro Charge PFA-behandelter Bakterien auf Abtötungserfolg getestet werden muss, können PFA-abgetötete Bakterien für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening in die Flüssigkultur gegeben werden. PFA-behandelte Bakterien können auch auf feste Platten mit kleinen Molekülen oder Nährstoffen ausgesät werden, die in das Agarmedium eingearbeitet sind. Feste Platten, die mit PFA-behandelten Bakterien ausgesät sind, könnten auch für Toxizitäts- oder Stressreaktionstests nützlich sein. Unveröffentlichte Daten deuten darauf hin, dass PFA-behandelte Bakterien dazu beitragen können, zwischen der Rolle bakterieller Stressreaktionswege und Wurmstressresistenzpfade bei der Paraquat- und Tunicamycin-Resistenz zu unterscheiden. Die Verwendung von PFA-abgetöteten Bakterien in diesen Studien zur Arzneimittelergänzung und Toxizität verhindert, dass Bakterien das interessierende Molekül metabolisieren, und stellt sicher, dass jeder beobachtete Phänotyp auf eine Verbindung zurückzuführen ist, die direkt auf C. elegans wirkt. Die Verwendung von metabolisch toten Bakterien für Arzneimittel- und Supplementierungsexperimente minimiert auch die Variabilität der Dosierung, da lebende Bakterien von Experiment zu Experiment unterschiedliche Mengen der interessierenden Verbindung metabolisieren können.
Metabolomics-Studien: Metabolomics-Studien von C. elegans können auch durch den bakteriellen Stoffwechsel verfälscht werden: Die Beobachtung von Veränderungen im Wurmstoffwechsel erfordert das Fehlen bakterieller Stoffwechselaktivität29. Schon kleine Veränderungen an der bakteriellen Nahrungsquelle können das Metabolom des Wurms verändern. Zum Beispiel unterscheidet sich das Metabolom von Würmern, die mit lebend gewaschenen Bakterien gefüttert wurden, von dem Metabolom von Würmern, die mit lebenden ungewaschenen Bakterien gefüttert wurden16. Der Verzehr von PFA-behandelten Bakterien verändert auch das Metabolom des Wurms im Vergleich zum Verzehr von Lebendfutter16 , ermöglicht aber Vergleiche zwischen den Auswirkungen von Versuchsbedingungen auf den Stoffwechsel von C. elegans isoliert vom bakteriellen Stoffwechsel.
Wirt-Mikroben-Verhaltensstudien: Schließlich könnten PFA-behandelte Bakterien verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen dem bakteriellen Stoffwechsel und dem Wirtsverhalten zu identifizieren. Metaboliten, die sowohl von pathogenen als auch von nicht-pathogenen Bakterien abgesondert werden, können für Würmer attraktiv oder abstoßend sein, um ihr Futter- und Fressverhalten zu beeinflussen10,11,30. Darüber hinaus können Bakterien Neuromodulatoren produzieren, die Veränderungen in der Fortbewegung bewirken30. Darüber hinaus führt die Züchtung von C. elegans auf verschiedenen Bakterienstämmen zu einer veränderten Brutgröße, Entwicklungszeit und Physiologie31,32. Die Behandlung dieser Bakterien mit PFA kann helfen, festzustellen, ob die Auswirkungen eines bestimmten Bakteriums auf C. elegans einen aktiven bakteriellen Stoffwechsel erfordern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH R21AG059117 und den Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research an der University of Michigan finanziert. SB wurde von T32AG000114 finanziert. ESK wurde von der NSF DGE 1841052 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
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