Summary

Caenorhabditis elegans Araştırmaları için Bakterileri Metabolik Olarak İnaktive Etme Metodolojisi

Published: July 28, 2023
doi:

Summary

Laboratuvarda Caenorhabditis elegans için besin kaynağı canlı Escherichia coli’dir. Bakteriler metabolik olarak aktif olduklarından, metabolik ve ilaç çalışmalarında karıştırıcı bir değişken sunarlar. Paraformaldehit kullanarak bakterileri metabolik olarak etkisiz hale getirmek için ayrıntılı bir protokol burada açıklanmaktadır.

Abstract

Caenorhabditis elegans , genetik, gelişim, yaşlanma, metabolizma ve davranış araştırmaları için yaygın bir model organizmadır. C. elegans canlı bakteri diyeti tükettiğinden, besin kaynaklarının metabolik aktivitesi, çeşitli müdahalelerin solucan üzerindeki doğrudan etkilerini arayan deneyleri karıştırabilir. Bakteriyel metabolizmanın kafa karıştırıcı etkilerinden kaçınmak için, C. elegans araştırmacıları, ultraviyole (UV) ışınlama, ısı öldürme ve antibiyotikler dahil olmak üzere bakterileri metabolik olarak etkisiz hale getirmek için birçok yöntem kullandılar. UV işlemi nispeten düşük verimlidir ve sıvı kültürde kullanılamaz çünkü her plakanın başarılı bakteri öldürme açısından incelenmesi gerekir. İkinci bir tedavi yöntemi olan ısı öldürme, bakterilerin dokusunu ve beslenme kalitesini olumsuz etkileyerek C. elegans’ın gelişimsel durmasına yol açar. Son olarak, antibiyotik tedavisi, bakteri üremesini önlemenin yanı sıra C. elegans fizyolojisini doğrudan değiştirebilir. Bu makale, paraformaldehit (PFA) kullanarak bakterileri metabolik olarak etkisiz hale getirmek için alternatif bir yöntemi açıklamaktadır. PFA tedavisi, hücresel yapıyı ve besin içeriğini korurken metabolik aktiviteyi önlemek için bakteri hücreleri içindeki proteinleri çapraz bağlar. Bu yöntem yüksek verimlidir ve bir PFA ile muamele edilmiş bakteri plakasının büyüme açısından test edilmesi tüm partiyi doğruladığından, sıvı kültürde veya katı plakalarda kullanılabilir. PFA tedavisi yoluyla metabolik inaktivasyon, bakteri metabolizmasının ilaç veya metabolit takviyesi, stres direnci, metabolomik ve davranış çalışmaları üzerindeki kafa karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırmak için kullanılabilir.

Introduction

Caenorhabditis elegans ilk olarak 1965’te bir model organizma olarak önerildi1 ve o zamandan beri genetik, gelişim, davranış, yaşlanma ve metabolizma çalışmalarında yaygın olarak benimsendi2. Büyük kuluçka boyutları ve şeffaf kütikülleri nedeniyle, C. elegans özellikle floresan raportörlerle yüksek verimli tarama için çok uygundur3. Kısa yaşam döngüleri, hermafrodit üremeleri ve insanlarla genetik homolojileri de C. elegans’ı gelişim4 ve yaşlanma biyolojisi5 üzerine yapılan çalışmalar için değerli bir model sistem haline getirmektedir. Ayrıca, C. elegans’ın bakımı nispeten kolaydır. Solucanlar sıvı kültürde veya katı agar plakalarında yetiştirilebilir ve canlı Escherichia coli OP50 bakterilerinden oluşan bir diyet tüketebilir4.

Bununla birlikte, canlı besin kaynağı C. elegans metabolizma, ilaç takviyesi ve davranış çalışmalarını karıştırabilir. Canlı bakterilerin kendi metabolizmaları olduğu için, bakterileri etkileyen deneysel koşullar, solucanlar için mevcut olan besinleri ve metabolitleri de değiştirir. Örneğin, bakteriyel demir, amino asit ve folat konsantrasyonlarındaki farklılıkların C. elegans’ın gelişimi, fizyolojisi ve ömrü üzerinde çeşitli etkileri vardır6. Birçok yaygın laboratuvar uygulaması, OP50 tarafından üretilen besin bileşiminde ve metabolitlerde bu tür değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Spesifik olarak, C. elegans’ta üremeyi önlemek için yaygın olarak kullanılan bir bileşik olan 5-floro-2′-deoksiüridine (FUdR) maruz kalma, amino asit biyosentez yolları7 dahil olmak üzere OP50 gen ekspresyonunda geniş değişiklikler ortaya çıkarır. Canlı bakteriler ayrıca C. elegans’ın küçük moleküllerle desteklendiği çalışmaları da karıştırabilir, çünkü bakteriler aktif bileşikleri kısmen veya tamamen metabolize edebilir. Dahası, bu küçük moleküllerin bakteriler üzerindeki etkileri, yaşam süresini uzatan ilaç metformin8 ile bildirildiği gibi, C. elegans fizyolojisini değiştirebilir. Son olarak, canlı bakteriler solucanın ortamını, çekici koku maddeleri 9 salgılamak, eksojen nöromodülatörler10 üretmek ve yoğun bir bakteri çiminde oksijen gradyanları oluşturmak11 gibi davranışları değiştirecek şekilde değiştirebilir.

Bakteri metabolizmasının C. elegans araştırmaları üzerindeki kafa karıştırıcı etkilerini azaltmak için, bakterileri öldürmek için birden fazla yöntem geliştirilmiştir (Tablo 1). OP50’yi öldürmek için üç yaygın strateji UV ışınlaması, ısı öldürme ve antibiyotik tedavisidir. Basit ve nispeten düşük maliyetli olsa da, bu yöntemlerin her birinin hem bakteriler hem de C. elegans üzerinde istenmeyen etkileri olabilir. UV çapraz bağlayıcı12 aracılığıyla UV öldürme düşük verimlidir ve hız, UV çapraz bağlayıcıya sığabilecek plaka sayısı ile sınırlıdır. Ayrıca, UV öldürmenin etkinliği bir parti içinde plakadan plakaya değişebilir ve büyük deneylerde tüm plakalarda büyüme testi yapmak zor olabilir. OP50’yi kültürü >60 °C’lik sıcaklıklara maruz bırakarak ısıyı öldürmek ayrı bir dizi zorlukla birlikte gelir. Yüksek ısı, solucan için gerekli olan besin maddelerine zarar verebilir ve bakterilerin hücresel yapısını tahrip edebilir, bu da solucanların gıdaya harcadığı süreyi azaltan daha yumuşak bir doku oluşturur13. Bu yöntem aynı zamanda C. elegans’ın yaşam döngüsü boyunca kullanılamaz çünkü ısıyla öldürülmüş bakterilerle beslenen solucanlar gelişimin erken dönemlerinde tutuklanabilir13. Antibiyotik tedavisi, bakteri metabolizmasını baskılamak için üçüncü bir yaygın yöntemdir14, ancak antibiyotikler solucan büyümesini ve metabolizmasınıda değiştirebilir 15.

Bakteri yapısını ve temel besin maddelerini korurken canlı bakterilerin metabolik etkilerini ortadan kaldırmanın bir çözümü, OP50’yi paraformaldehit (PFA)16 ile öldürmektir. PFA, iç plazma zarı18 gibi iç hücre yapılarını tahrip etmeden bakteriyel replikasyonu önlemek için hücreler17 içindeki proteinleri çapraz bağlayabilen bir formaldehit polimeridir. İç hücresel yapının bu şekilde korunması nedeniyle, PFA ile tedavi edilen bakteriler büyüme veya metabolik aktivite göstermez, ancak C. elegans16 için yenilebilir ve besin açısından zengin bir besin kaynağı olarak kalır. Burada, paraformaldehit kullanarak bakterilerin metabolik olarak nasıl etkisiz hale getirileceğini gösteren ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.

Yöntem Gerekli Malzemeler Ölçeklenebilir? Beslenme? Solucan Üzerindeki Etkileri?
UV UV çapraz bağlayıcı Şununla sınırlı: Evet NGM12, 23, 24’te yaşam süresi üzerindeki değişken etkiler
UV çapraz bağlayıcıya uyan plaka sayısı FUdR24, 26, 27 üzerindeki yaşam süresi üzerindeki değişken etkiler
Plaka başına ışınlama süresi Yiyecek tercihinde azalma16
Her plakayı büyüme açısından kontrol etme yeteneği8
Isı >60 °C inkübatör Evet Hayır: hücre duvarını tahrip eder, besin değerini azaltır Gelişimsel tutuklama 13
Yiyecek tercihinde azalma13
NGM31’in kullanım ömrünü uzatır
Antibiyotik Antibiyotikler (kanamisin, karbenisilin vb.) Evet Evet Büyüme ve gelişmeyi geciktirir15
Sıvı ortamlarda kullanım ömrünü uzatır19
NGM15’in kullanım ömrünü uzatır
PFA (Üstün Başarı T % 0.5 Paraformaldehit Evet Evet Küçük kuluçka boyutunun azalması16
Küçük geliştirme süresi artışı16
Yiyecek tercihinde azalma16

Tablo 1. OP50’yi öldürme yöntemlerinin karşılaştırılması. UV öldürme, ısı öldürme, antibiyotik tedavisi ve PFA tedavisi, bakterilerin beslenme durumu ve tedavi edilen bakterilerle beslenen solucanların sağlığı üzerinde çeşitli etkilere sahiptir. E. coli’yi replikatif olarak inaktive etmek için kullanılan bu yöntemler, gerekli malzemeleri ve ölçeklenebilirlikleri bakımından da farklılık gösterir.

Protocol

1. Bakteri aşılaması 10 g tripton, 5 g maya özü ve 10 g sodyum klorürü (NaCl) 950 mL damıtılmış suda çözerek Luria suyunu (LB) hazırlayın. 5M sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek LB’nin pH’ını 7.0’a ayarlayın. Bu sadece yaklaşık 0.2 mL NaOH gerektirmelidir. pH ayarlı LB ortamını 15 psi’de 45 dakika boyunca bir sıvı döngüsünde otoklavlayın. Çözeltinin soğumasını ve oda sıcaklığında saklanmasını bekleyin. 500 mL’lik bir Erlenmeyer…

Representative Results

Protokolün ayrıntılı bir iş akışı Şekil 1’de gösterilmektedir. Paraformaldehit16 kullanılarak C. elegans araştırmalarında metabolik ve ilaç çalışmaları için bakteriyel replikasyonu (Şekil 2A) ve metabolizmayı (Şekil 2B) sürekli olarak etkisiz hale getirmek için yüksek verimli bir yöntem geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Amaç, ihtiyaç duyulan en düşük PFA konsant…

Discussion

PFA öldürmenin diğer bakteri öldürme yöntemlerine göre faydaları
PFA tedavisi, C. elegans için besleyici bir besin kaynağı sağlarken bakteri metabolizmasını önlemek için yüksek verimli bir yöntemdir. PFA tedavisi ile bakterileri öldürmenin diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Her plakanın başarılı öldürme için test edilmesi gereken UV tedavisinden farklı olarak, parti16’yı doğrulamak için PFA ile muamele edilmiş bir bakter…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH R21AG059117 ve Michigan Üniversitesi’ndeki Paul F. Glenn Yaşlanma Araştırmaları Biyolojisi Laboratuvarları tarafından finanse edildi. SB, T32AG000114 tarafından finanse edildi. ESK, NSF DGE 1841052 tarafından finanse edildi.

Materials

Aluminum Foil Staples 2549291
Bunsen burner VWR 470121-700 
Cell Density Meter Denville 80-3000-45 
Centrifuge Eppendorg 5430
Chemical fume hood Labcono 975050411384RG
Conincal tubes (50 mL) Fisher 339652
Cuvettes  Fisher 14-955-127
E. coli OP50 CGC OP50
Erlenmyer flasks Fisher 250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Inoculation loop Fisher 22-363-605
LB Agar Fisher BP1425500
Liquid waste collection bottle Thomas Scientific 1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M7506
Paraformaldehyde (32%) Electron Microscopy Sciences 15714-S Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor Eppendorf Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm) Fisher FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher P2853
Seahorse XF Calibrant Agilent 100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate Agilent 101085-004
Serological pipettes (50 mL) Genesee Scientific 12-107
Shaker incubator Thermo 11 676 083
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Sigma S374-500
Solid waste collection bucket M&M Industries  5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone Genesee Scientific 20-251
Vortex Thermo 11676331
Weighing balance C Goldenwall HZ10K6B
Yeast Extract Genesee Scientific 20-255

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. . Elegans II. 33, (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  3. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
  4. Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
  5. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  6. Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
  7. McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
  8. Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
  9. Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
  10. Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
  11. Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
  12. Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
  13. Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal’s food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
  14. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  15. Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
  16. Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
  17. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  18. Felix, H. Permeabilized and immobilized cells. Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).
  19. Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
  20. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  21. Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
  22. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  23. Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
  24. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  25. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  26. Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
  27. Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
  28. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
  29. Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
  30. O’Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  31. Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
  32. Dirksen, P., et al. Cembio – the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).

Play Video

Cite This Article
Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., Huang, S., Leiser, S. F. Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research. J. Vis. Exp. (197), e65775, doi:10.3791/65775 (2023).

View Video