Laboratuvarda Caenorhabditis elegans için besin kaynağı canlı Escherichia coli’dir. Bakteriler metabolik olarak aktif olduklarından, metabolik ve ilaç çalışmalarında karıştırıcı bir değişken sunarlar. Paraformaldehit kullanarak bakterileri metabolik olarak etkisiz hale getirmek için ayrıntılı bir protokol burada açıklanmaktadır.
Caenorhabditis elegans , genetik, gelişim, yaşlanma, metabolizma ve davranış araştırmaları için yaygın bir model organizmadır. C. elegans canlı bakteri diyeti tükettiğinden, besin kaynaklarının metabolik aktivitesi, çeşitli müdahalelerin solucan üzerindeki doğrudan etkilerini arayan deneyleri karıştırabilir. Bakteriyel metabolizmanın kafa karıştırıcı etkilerinden kaçınmak için, C. elegans araştırmacıları, ultraviyole (UV) ışınlama, ısı öldürme ve antibiyotikler dahil olmak üzere bakterileri metabolik olarak etkisiz hale getirmek için birçok yöntem kullandılar. UV işlemi nispeten düşük verimlidir ve sıvı kültürde kullanılamaz çünkü her plakanın başarılı bakteri öldürme açısından incelenmesi gerekir. İkinci bir tedavi yöntemi olan ısı öldürme, bakterilerin dokusunu ve beslenme kalitesini olumsuz etkileyerek C. elegans’ın gelişimsel durmasına yol açar. Son olarak, antibiyotik tedavisi, bakteri üremesini önlemenin yanı sıra C. elegans fizyolojisini doğrudan değiştirebilir. Bu makale, paraformaldehit (PFA) kullanarak bakterileri metabolik olarak etkisiz hale getirmek için alternatif bir yöntemi açıklamaktadır. PFA tedavisi, hücresel yapıyı ve besin içeriğini korurken metabolik aktiviteyi önlemek için bakteri hücreleri içindeki proteinleri çapraz bağlar. Bu yöntem yüksek verimlidir ve bir PFA ile muamele edilmiş bakteri plakasının büyüme açısından test edilmesi tüm partiyi doğruladığından, sıvı kültürde veya katı plakalarda kullanılabilir. PFA tedavisi yoluyla metabolik inaktivasyon, bakteri metabolizmasının ilaç veya metabolit takviyesi, stres direnci, metabolomik ve davranış çalışmaları üzerindeki kafa karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırmak için kullanılabilir.
Caenorhabditis elegans ilk olarak 1965’te bir model organizma olarak önerildi1 ve o zamandan beri genetik, gelişim, davranış, yaşlanma ve metabolizma çalışmalarında yaygın olarak benimsendi2. Büyük kuluçka boyutları ve şeffaf kütikülleri nedeniyle, C. elegans özellikle floresan raportörlerle yüksek verimli tarama için çok uygundur3. Kısa yaşam döngüleri, hermafrodit üremeleri ve insanlarla genetik homolojileri de C. elegans’ı gelişim4 ve yaşlanma biyolojisi5 üzerine yapılan çalışmalar için değerli bir model sistem haline getirmektedir. Ayrıca, C. elegans’ın bakımı nispeten kolaydır. Solucanlar sıvı kültürde veya katı agar plakalarında yetiştirilebilir ve canlı Escherichia coli OP50 bakterilerinden oluşan bir diyet tüketebilir4.
Bununla birlikte, canlı besin kaynağı C. elegans metabolizma, ilaç takviyesi ve davranış çalışmalarını karıştırabilir. Canlı bakterilerin kendi metabolizmaları olduğu için, bakterileri etkileyen deneysel koşullar, solucanlar için mevcut olan besinleri ve metabolitleri de değiştirir. Örneğin, bakteriyel demir, amino asit ve folat konsantrasyonlarındaki farklılıkların C. elegans’ın gelişimi, fizyolojisi ve ömrü üzerinde çeşitli etkileri vardır6. Birçok yaygın laboratuvar uygulaması, OP50 tarafından üretilen besin bileşiminde ve metabolitlerde bu tür değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Spesifik olarak, C. elegans’ta üremeyi önlemek için yaygın olarak kullanılan bir bileşik olan 5-floro-2′-deoksiüridine (FUdR) maruz kalma, amino asit biyosentez yolları7 dahil olmak üzere OP50 gen ekspresyonunda geniş değişiklikler ortaya çıkarır. Canlı bakteriler ayrıca C. elegans’ın küçük moleküllerle desteklendiği çalışmaları da karıştırabilir, çünkü bakteriler aktif bileşikleri kısmen veya tamamen metabolize edebilir. Dahası, bu küçük moleküllerin bakteriler üzerindeki etkileri, yaşam süresini uzatan ilaç metformin8 ile bildirildiği gibi, C. elegans fizyolojisini değiştirebilir. Son olarak, canlı bakteriler solucanın ortamını, çekici koku maddeleri 9 salgılamak, eksojen nöromodülatörler10 üretmek ve yoğun bir bakteri çiminde oksijen gradyanları oluşturmak11 gibi davranışları değiştirecek şekilde değiştirebilir.
Bakteri metabolizmasının C. elegans araştırmaları üzerindeki kafa karıştırıcı etkilerini azaltmak için, bakterileri öldürmek için birden fazla yöntem geliştirilmiştir (Tablo 1). OP50’yi öldürmek için üç yaygın strateji UV ışınlaması, ısı öldürme ve antibiyotik tedavisidir. Basit ve nispeten düşük maliyetli olsa da, bu yöntemlerin her birinin hem bakteriler hem de C. elegans üzerinde istenmeyen etkileri olabilir. UV çapraz bağlayıcı12 aracılığıyla UV öldürme düşük verimlidir ve hız, UV çapraz bağlayıcıya sığabilecek plaka sayısı ile sınırlıdır. Ayrıca, UV öldürmenin etkinliği bir parti içinde plakadan plakaya değişebilir ve büyük deneylerde tüm plakalarda büyüme testi yapmak zor olabilir. OP50’yi kültürü >60 °C’lik sıcaklıklara maruz bırakarak ısıyı öldürmek ayrı bir dizi zorlukla birlikte gelir. Yüksek ısı, solucan için gerekli olan besin maddelerine zarar verebilir ve bakterilerin hücresel yapısını tahrip edebilir, bu da solucanların gıdaya harcadığı süreyi azaltan daha yumuşak bir doku oluşturur13. Bu yöntem aynı zamanda C. elegans’ın yaşam döngüsü boyunca kullanılamaz çünkü ısıyla öldürülmüş bakterilerle beslenen solucanlar gelişimin erken dönemlerinde tutuklanabilir13. Antibiyotik tedavisi, bakteri metabolizmasını baskılamak için üçüncü bir yaygın yöntemdir14, ancak antibiyotikler solucan büyümesini ve metabolizmasınıda değiştirebilir 15.
Bakteri yapısını ve temel besin maddelerini korurken canlı bakterilerin metabolik etkilerini ortadan kaldırmanın bir çözümü, OP50’yi paraformaldehit (PFA)16 ile öldürmektir. PFA, iç plazma zarı18 gibi iç hücre yapılarını tahrip etmeden bakteriyel replikasyonu önlemek için hücreler17 içindeki proteinleri çapraz bağlayabilen bir formaldehit polimeridir. İç hücresel yapının bu şekilde korunması nedeniyle, PFA ile tedavi edilen bakteriler büyüme veya metabolik aktivite göstermez, ancak C. elegans16 için yenilebilir ve besin açısından zengin bir besin kaynağı olarak kalır. Burada, paraformaldehit kullanarak bakterilerin metabolik olarak nasıl etkisiz hale getirileceğini gösteren ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.
Yöntem | Gerekli Malzemeler | Ölçeklenebilir? | Beslenme? | Solucan Üzerindeki Etkileri? | ||||
UV | UV çapraz bağlayıcı | Şununla sınırlı: | Evet | NGM12, 23, 24’te yaşam süresi üzerindeki değişken etkiler | ||||
UV çapraz bağlayıcıya uyan plaka sayısı | FUdR24, 26, 27 üzerindeki yaşam süresi üzerindeki değişken etkiler | |||||||
Plaka başına ışınlama süresi | Yiyecek tercihinde azalma16 | |||||||
Her plakayı büyüme açısından kontrol etme yeteneği8 | ||||||||
Isı | >60 °C inkübatör | Evet | Hayır: hücre duvarını tahrip eder, besin değerini azaltır | Gelişimsel tutuklama 13 | ||||
Yiyecek tercihinde azalma13 | ||||||||
NGM31’in kullanım ömrünü uzatır | ||||||||
Antibiyotik | Antibiyotikler (kanamisin, karbenisilin vb.) | Evet | Evet | Büyüme ve gelişmeyi geciktirir15 | ||||
Sıvı ortamlarda kullanım ömrünü uzatır19 | ||||||||
NGM15’in kullanım ömrünü uzatır | ||||||||
PFA (Üstün Başarı T | % 0.5 Paraformaldehit | Evet | Evet | Küçük kuluçka boyutunun azalması16 | ||||
Küçük geliştirme süresi artışı16 | ||||||||
Yiyecek tercihinde azalma16 |
Tablo 1. OP50’yi öldürme yöntemlerinin karşılaştırılması. UV öldürme, ısı öldürme, antibiyotik tedavisi ve PFA tedavisi, bakterilerin beslenme durumu ve tedavi edilen bakterilerle beslenen solucanların sağlığı üzerinde çeşitli etkilere sahiptir. E. coli’yi replikatif olarak inaktive etmek için kullanılan bu yöntemler, gerekli malzemeleri ve ölçeklenebilirlikleri bakımından da farklılık gösterir.
PFA öldürmenin diğer bakteri öldürme yöntemlerine göre faydaları
PFA tedavisi, C. elegans için besleyici bir besin kaynağı sağlarken bakteri metabolizmasını önlemek için yüksek verimli bir yöntemdir. PFA tedavisi ile bakterileri öldürmenin diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Her plakanın başarılı öldürme için test edilmesi gereken UV tedavisinden farklı olarak, parti16’yı doğrulamak için PFA ile muamele edilmiş bir bakter…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH R21AG059117 ve Michigan Üniversitesi’ndeki Paul F. Glenn Yaşlanma Araştırmaları Biyolojisi Laboratuvarları tarafından finanse edildi. SB, T32AG000114 tarafından finanse edildi. ESK, NSF DGE 1841052 tarafından finanse edildi.
Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
Vortex | Thermo | 11676331 | |
Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |