Summary
実験室での 線虫Caenorhabditis elegans の餌源は、生きた 大腸菌です。細菌は代謝的に活性であるため、 線虫 の代謝および薬物研究において交絡変数を示します。パラホルムアルデヒドを使用して細菌を代謝的に不活性化する詳細なプロトコルは、ここに記載されています。
Abstract
線虫Caenorhabditis elegansは、遺伝学、発生、老化、代謝、および行動の研究のための一般的なモデル生物です。線虫は生きたバクテリアの餌を摂取するため、その食物源の代謝活性は、線虫に対するさまざまな介入の直接的な影響を探す実験を混乱させる可能性があります。細菌代謝の交絡作用を避けるために、C.エレガンスの研究者は、紫外線(UV)照射、熱殺傷、抗生物質など、細菌を代謝的に不活性化する複数の方法を使用してきました。UV処理は比較的低スループットであり、細菌の死滅を成功させるために各プレートを検査する必要があるため、液体培養では使用できません。第2の治療法である熱殺傷は、細菌の食感と栄養価に悪影響を及ぼし、線虫の発生停止につながります。最後に、抗生物質治療は、細菌の増殖を防ぐだけでなく、線虫の生理機能を直接変化させる可能性があります。この原稿では、パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して細菌を代謝的に不活性化する代替方法について説明します。PFA処理は、細菌細胞内のタンパク質を架橋し、細胞構造と栄養成分を維持しながら代謝活性を防ぎます。この方法はハイスループットであり、PFA処理したバクテリアの1つのプレートの増殖をテストすることでバッチ全体が検証されるため、液体培養または固体プレートで使用できます。PFA処理による代謝不活性化は、C.エレガンスにおける薬物または代謝物の補給、ストレス耐性、メタボロミクス、および行動の研究における細菌代謝の交絡効果を排除するために使用できます。
Introduction
線虫は、1965年にモデル生物として提唱され1、それ以来、遺伝学、発生、行動、老化、代謝の研究に広く採用されてきました2。C.エレガンスは、その大きなひなサイズと透明なクチクラにより、蛍光レポーターによるハイスループットスクリーニングに特に適しています3。また、C.エレガンスは、その短いライフサイクル、雌雄同体生殖、ヒトとの遺伝的相同性などから、発生4や老化生物学5の研究において貴重なモデル体系となっています。さらに、C.エレガンスは比較的維持が容易です。線虫は、液体培養または固体寒天プレートで増殖し、生きた大腸菌OP50細菌の餌を消費することができます4。
しかし、線虫の生きた食物源は、代謝、薬物補給、および行動の研究を混乱させる可能性があります。生きたバクテリアは独自の代謝を持っているため、バクテリアに影響を与える実験条件は、ワームが利用できる栄養素と代謝物も変化させます。例えば、細菌の鉄、アミノ酸、葉酸の濃度の違いは、線虫の発生、生理機能、寿命に多様な影響を及ぼします6。多くの一般的なラボの慣行は、OP50によって生成される栄養素組成と代謝物にそのような変化を引き起こす可能性があります。具体的には、線虫の繁殖を防ぐために一般的に使用される化合物である5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(FUdR)への曝露は、アミノ酸生合成経路を含むOP50遺伝子発現の広範な変化を誘発する7。また、生きたバクテリアは、活性化合物を部分的または完全に代謝できるため、C.エレガンスに低分子を添加する研究を混乱させる可能性があります。さらに、これらの低分子が細菌に及ぼす影響は、寿命を延ばす薬メトホルミン8で報告されているように、線虫の生理機能を変化させる可能性があります。最後に、生きたバクテリアは、魅力的な匂い物質を分泌する9、外因性の神経調節物質10を産生する、密集したバクテリアの芝生に酸素勾配を作り出す11など、行動を変化させる方法で線虫の環境を変化させることができる。
C.エレガンス研究に対する細菌代謝の交絡効果を軽減するために、細菌を殺すための複数の方法が開発されています(表1)。OP50を殺すための3つの一般的な戦略は、UV照射、熱殺傷、および抗生物質治療です。これらの方法はどれも簡単で比較的低コストですが、細菌と線虫の両方に望ましくない影響を与える可能性があります。UV架橋剤12を介したUV殺滅は、低スループットであり、その速度は、UV架橋剤に収まることができるプレートの数によって制限される。さらに、UV殺傷の有効性はバッチ内のプレートごとに異なる可能性があり、大規模な実験ではすべてのプレートでの成長試験が困難になる可能性があります。培養液を>60°Cの温度にさらしてOP50を熱殺傷するには、別の課題があります。高熱は、線虫に不可欠な栄養素を損傷し、細菌の細胞構造を破壊し、線虫が食物に費やす時間を減らす、より柔らかい食感を作り出します13。また、熱死細菌を与えられた線虫は発生初期に停止する可能性があるため、この方法はC.エレガンスのライフサイクル全体を通じて使用することはできません13。抗生物質治療は、細菌の代謝を抑制するための第3の一般的な方法である14が、抗生物質は線虫の成長と代謝を変化させることもできる15。
バクテリアの構造と必須栄養素を維持しながら、生きたバクテリアの代謝効果を排除する1つの解決策は、パラホルムアルデヒド(PFA)16でOP50を殺すことです。PFAはホルムアルデヒドのポリマーであり、細胞内のタンパク質を架橋して17、内側の原形質膜18のような内部細胞構造を破壊することなく細菌の複製を防ぐことができる。このように細胞内部構造が保たれているため、PFA処理された細菌は増殖や代謝活性を示さないが、C.エレガンスにとって食用で栄養豊富な食物源であり続ける16。 ここでは、パラホルムアルデヒドを使用して細菌を代謝的に不活性化する方法を示す詳細なプロトコルが提供されています。
| 方式 | 必要な材料 | スケーラブル。 | 栄養。 | ワームへの影響は? | ||||
| UV/紫外線 | UV架橋剤 | 制限対象: | はい | NGM12、23、24の寿命に対するさまざまな影響 | ||||
| UV架橋剤に収まる段数 | FUdR24、26、27の寿命に対するさまざまな影響 | |||||||
| プレートあたりの照射時間 | 食の嗜好性の低下16 | |||||||
| すべてのプレートの成長をチェックする機能8 | ||||||||
| 熱 | >60°Cインキュベーター | はい | いいえ:細胞壁を破壊し、栄養価を低下させます | 発達停止 13 | ||||
| 食の嗜好の低下13 | ||||||||
| NGM31の寿命を延ばす | ||||||||
| 抗生物質 | 抗生物質(カナマイシン、カルベニシリンなど) | はい | はい | 成長と発展を遅らせる15 | ||||
| 液体媒体の寿命を延ばす19 | ||||||||
| NGM15の寿命を延ばす | ||||||||
| PFAの | 0.5%パラホルムアルデヒド | はい | はい | 小さなひなのサイズの減少16 | ||||
| 開発時間の小幅な増加16 | ||||||||
| 食の嗜好性の低下16 | ||||||||
表 1.OP50を殺す方法の比較。 紫外線殺傷、熱殺傷、抗生物質処理、PFA処理は、細菌の栄養状態と、処理された細菌を与えられた線虫の健康にさまざまな影響を及ぼします。 大腸菌 を複製的に不活性化するこれらの方法は、必要な材料とスケーラビリティも異なります。
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Protocol
1.細菌接種
- 10 gのトリプトン、5 gの酵母抽出物、および10 gの塩化ナトリウム(NaCl)を950 mLの蒸留水に溶解して、ルリアブロス(LB)を調製します。
- 5Mの水酸化ナトリウム(NaOH)を添加して、LBのpHを7.0に調整します。これには、約0.2mLのNaOHしか必要ありません。
- pH 調整した LB 培地を液体サイクルで 15 psi で 45 分間オートクレーブします。溶液を冷まし、室温で保存します。
- 500 mL三角フラスコ内のLB100 mLに細菌の単一コロニーを接種します。バクテリアを37°Cのシェーカーインキュベーターで一晩培養します。
- バクテリアコロニーの健康状態、フラスコのサイズ、シェーカーの設定速度に応じて、バクテリアが増殖するのにかかる時間は異なる場合があります。~14時間後、600 nm(OD600)での細菌の光学濃度(OD)を確認します。
- OD600 が 3.0 (1 x 109 コロニー形成単位 (CFU)/mL) のときに、シェーカーからバクテリアを除去します。OD600 が 3.0 未満の場合は、目的の OD に達するまでフラスコをシェーカー インキュベーターに戻します。
- バクテリアを50 mLのコニカルチューブに分注し、4°Cで保存するか、次のステップに進みます。
2. パラホルムアルデヒドの取り扱い
注:使用されるパラホルムアルデヒド(PFA)の濃度、および曝露期間は、気候、場所、および処理する細菌の種類によって多少異なる場合があります。OP50 の適切な出発点は、0.5% PFA に 1 時間曝露することですが、HT115 では 0.25% PFA に 1 時間曝露するだけで十分です。
- 32%PFAストックを調製するか、市販の32%PFA溶液を使用します。PFAを扱うときは、適切な個人用保護具(PPE)を使用してください。手袋と目の保護具を着用してください。
- 適切な換気で化学ヒュームフード内にPFAを追加します。PFAを含む洗浄剤とチップは、ドラフト内の適切な化学的危険容器に廃棄してください。
3.パラホルムアルデヒドによる細菌治療
- バクテリアがOD600 から 3.0 に達したら、血清ピペットを使用して、50 mL を新しい 250 mL 三角フラスコに移します。残りは、ライブコントロール、モック処理コントロール (ステップ 4 を参照)、または必要に応じて PFA で処理するために保存します。
- あるフラスコから別のフラスコに注ぐことは避け、新しいフラスコの側面にバクテリアが飛び散らないように注意してください。フラスコの側面にあるコロニーは、より低用量のPFAを投与される場合があります。
- ケミカルフードで、781 μL の 32% PFA を 50 mL のバクテリアに添加し、最終濃度を 0.5% にします。使用したチップは、固形廃棄物の化学物質危険容器に廃棄してください。
- フラスコをホイルで覆い、37°Cのシェーカーインキュベーターに1時間戻します。1時間後、フラスコをインキュベーターから取り出し、手順5に進みます。
4. 模擬処理コントロール
- バクテリアがOD600 3.0に達したら、血清ピペットを使用して、50 mLのバクテリアを50 mLのコニカルチューブに移します。
- ステップ 5.3 に進み、PFA 処理グループと同様の洗浄ステップを完了します。
5.バクテリアを洗浄して残留PFAを除去する
- ケミカルフード内で、血清ピペットを使用して、処理した細菌を三角フラスコから50 mLのコニカルチューブに移します。バクテリアを注ぐ代わりに血清ピペットを使用すると、PFAによる直接処理を避けた可能性のあるフラスコの縁にあるバクテリアコロニーからの汚染を防ぐことができます。
- 処理したバクテリアを約3000 x g で20分間遠心分離します。上澄み液は、薬品フード内の廃薬品危険容器に廃棄して除去します。
- 25 mLのLBとボルテックスを加えて、細菌ペレットを再懸濁します(チューブを完全に充填すると、ペレットの再懸濁が難しくなります)。遠心分離とペレット再懸濁を4回繰り返します。
- さまざまなアッセイに最適な量でペレットを再懸濁します。ライフスパンアッセイでは、200 μL の細菌を 10 mL の LB に再懸濁した 60 mm プレートに播種し、10 mL の LB に細菌を再懸濁すると、元の 50 mL の培養物から 5 倍の濃度が得られます。
- バクテリアを4°Cで保存します。
6. 細菌増殖の品質チェック
- 最終洗浄と再懸濁の後、準備したバクテリアでLBプレートを(滅菌ピペットチップを使用して)ストリークします。洗浄と再懸濁に使用したLBを別のプレートにストリークして、使用したLBが汚染されていないことを確認することをお勧めします。
- プレートを37°Cのインキュベーターに一晩置きます。成長がないか確認します。バクテリアは、LBプレート上でコロニーが成長しないと、複製死したと見なされます。
7. 呼吸計による細菌代謝の品質チェック
- ステップ5.4からの最終洗浄と再懸濁の後、呼吸計19,20などの利用可能なツールを使用して、細菌が代謝的に死んでいることを確認し、基礎酸素消費率(OCR)を測定します。
- M9溶液を調製する:3gのリン酸カリウム一塩基性(KH 2PO 4)、6gのリン酸二塩基性ナトリウム(Na2HPO4)、および5gの塩化ナトリウム(NaCl)を950mLの蒸留水に溶解する。15psiで45分間液体サイクルでオートクレーブし、溶液を室温まで冷却します。1 mL の 1 M 硫酸マグネシウム (MgSO4) を加え、室温で保存します。
- 呼吸計カートリッジの水和:96ウェルプレートのすべてのウェルに200 μLのキャリブラントを添加します。カートリッジを96ウェルプレートに入れ、37°Cのインキュベーターで一晩インキュベートします。
- アッセイのキャリブレーション:翌日、水和カートリッジを機械に入れ、キャリブレーションを開始します。
- アッセイテストプレートのセットアップ:新しい96ウェルプレートを使用して、160 μLのM9と40 μLの調製した細菌(1 x 109 CFU/mL)をウェルに添加します。200 μL の M9 を 4 コーナーウェルに添加し、ブランクウェルとして使用します。160 μL の M9 と 40 μL の LB を洗浄および再懸濁に用いて、ネガティブコントロールとして使用します。200 μL の M9 を、使用しない残りのウェルに加えます。
- アッセイの実行:カートリッジのキャリブレーションが完了したら、ステップ7.5のアッセイプレートを分析用のマシンに挿入します。設定には、ミキシング、待機、測定、ループのステップが含まれます。結果は酸素消費率(OCR)として表示されます。バクテリアは代謝的に死んでおり、OCRがゼロになるとすぐに使用できます。
図 1.パラホルムアルデヒド処理のワークフロー。大腸菌OP50バクテリアの単一コロニーを一晩で増殖させます。PFAを最終濃度0.5%になるように添加し、PFA処理した培養液を37°Cで1時間振とうします。 最後に、培養液を新鮮なLB 5xで洗浄してPFAを除去します。処理した細菌が複製的に不活性であることを確認するには、処理した細菌のLBプレートをストリークし、一晩増殖させます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
プロトコルの詳細なワークフローを図1に示します。パラホルムアルデヒドを用いた線虫群の代謝および薬物研究において、細菌の複製(図2A)および代謝(図2B)を一貫して不活性化するハイスループットメソッドが開発され、最適化されました16。目標は、線虫のさまざまな健康状態に影響を与えることなく、細菌を一貫して死滅させるために必要な最低濃度のPFAと最短時間を決定することでした。これらの値は、ラボ環境に応じて場所によって、また細菌株によって異なる場合があります。例えば、HB101 細菌を 0.25% に 1 時間曝露すると、代謝不能になりますが(図 2C)、エンテロコッカス・フェカリス(EF)では、一貫した効果を得るために 1.0% の PFA 濃度が必要です(図 2D)。個々のラボ最適化のためのアプローチは以前に確立されており16、この現在の作業で詳述されています。
食の誘致と消費
バクテリアが成長して複製すると、ワームにとって魅力的なさまざまな代謝物やフェロモンが放出されます。線虫がPFA処理されたOP50に引き寄せられたままであるかどうかを判断するために、プレートにPFA処理または模擬処理されたOP50を播種し、芝生外と比較して食用芝生に存在する線虫の割合を表にしました。データによると、ほとんどの線虫は1時間後も細菌の芝生に留まるため(図3A)、模擬処理した対照(図3B)と同様に、線虫はPFA処理したOP50に引き付けられます。しかしながら、予想通り、高感度のペアワイズアッセイ21 は、同じプレート上でPFA処理を播種した場合、 C.エレガンスは 、モック処理されたライブコントロール(図3C)に対してより強い選好性を有することを示している。線虫は、生きた細菌よりも少ないものの、PFAで殺された細菌に引き寄せられることを立証したので、PFAで殺された食物を食べることを立証することが不可欠でした。線虫がPFA処理されたOP50を消費するかどうかを判断するために、さまざまな種類の食品に対する線虫のポンプ速度を測定しました。 図 3D に示すように、PFA 処理した OP50 の線虫は、模擬処理したコントロールの線虫よりも高い排気速度(+25%)を示します。これは、線虫がPFAで殺された食物を食べる速度を意図的に遅くしているわけではないことを示しており、摂食率が高いか、処理された食物の搾乳しやすさの変化に対する代償反応を示している可能性があります。
繁殖力、発達、寿命
食物条件の変化は、線虫に生理学的影響を与える可能性があります13,22。広範な効果を検証するために、発育速度、繁殖力、および寿命の変化を測定しました。PFA処理したOP50は、図4Aに示すように、野生型N2線虫の発生時間をわずかに遅らせます(~4時間)。異なる細菌条件で増殖した線虫の産卵能力をモニタリングすると、PFA処理OP50を給餌した線虫の繁殖力がわずかながら有意に低下(-21%)することが示されました(図4B)。次に、線虫の老化に関心のあるラボでは、PFA処理したOP50が寿命に及ぼす影響を測定しました。興味深いことに、PFA処理したOP50を給餌した野生型線虫の寿命は、標準的な線虫増殖培地(NGM)プレート上で模擬処理したOP50を給餌した線虫と有意差はありませんでした(図4C)が、PFA処理OP50は、FUdRが存在すると野生型の寿命が長くなります(図4D)。PFA処理したOP50を長寿命のfmo-2過剰発現(OE)株20に給餌しても、野生型線虫と比較して寿命は変わりません(図4E)。UV、熱、抗生物質で死滅したOP50も、線虫の寿命を変化させることが示されています。具体的には、UV処理されたバクテリアは、NGM12,23およびFUdR 24で寿命を延ばすことが報告されています。しかし、FUdRとUVで殺された細菌の相互作用に関する矛盾するデータ25,26があり、これはUV殺傷のさまざまな方法と細菌の代謝不活性の検証が原因である可能性があります。さらに、熱死菌はNGM27の寿命を延ばし、抗生物質はNGM15と液体培養28の寿命を延ばします。
図 2.PFAによる細菌の処理は、増殖と代謝を阻害します。 (A)模擬処理および0.5%PFA処理OP50のコロニー形成単位(CFU)における細菌増殖。(B)モック処理したOP50と0.5%PFA処理したOP50の細胞外酸性化率(ecar)(mpH/min)。(C) 基礎酸素消費量 (OCR) (モック処理、0.25% PFA 処理、および 0.5% PFA 処理 HB101 の pmol/min)。(D)模擬処理、0.25%PFA処理、0.5%PFA処理、および1.0%PFA処理エン テロコッカスフェカリス (EF)の基礎酸素消費率(pmol/min)。図に示されているすべての誤差範囲は、平均の標準誤差(SEM)を表しています。両側t検定を使用してp値を導き出しました。p値<0.0001を示します。この数字は 16 から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 3.線虫はPFA処理されたOP50に引き付けられます。 (A)PFA処理または(B)模擬処理されたOP50細菌芝生に引き寄せられた線虫の割合。(C)モック処理およびPFA処理OP50のペアワイズ感作アッセイ試験線虫の好み。(D)PFA 処理またはモック処理した OP50 でのワームのポンピング速度(30 秒あたりのポンプ数)。両側t検定分析を使用して、すべての比較のp値を導き出しました。図に示されているすべての誤差範囲は、平均の標準誤差(SEM)を表しています。p値<0.0001を示します。パネルA-Cは 16から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4.線虫はPFA処理されたOP50で増殖し、発達します。 (A)模擬処理およびPFA処理OP50での産卵成虫からの線虫の発生時間(h)。(B)模擬処理またはPFA処理OP50を給餌した線虫の平均子孫(線虫の数)。(C、D)(C)NGM および (D)FUdR 寿命プレートに模擬処理または PFA 処理した OP50 を給餌した線虫の生存率。(E)PFA処理OP50を給餌した野生型および fmo-2 OE線虫の生存率。両側t検定分析を使用して、発育と繁殖力の比較のためのp値を導き出しました。ログランク検定は、寿命比較のp値を導き出すために使用されました。図に示されているすべての誤差範囲は、平均の標準誤差(SEM)を表しています。* は p 値 < 0.05、*** は p 値 <0.001、**** は p 値 < 0.0001 を表します。パネル A、B、D は16 から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
他の細菌殺傷法と比較したPFA殺菌の利点
PFA処理は、線虫の栄養価の高い食物源を維持しながら、細菌の代謝を防ぐためのハイスループットな方法です。PFA処理によるバクテリアの死滅には、他の方法に比べて複数の利点があります。UV処理では、すべてのプレートを正常に殺傷するためにテストする必要がありますが、PFA処理されたバクテリアのバッチからの単一のプレートをテストして、バッチを検証することができます16。PFA処理は細菌の代謝を除去するのにも非常に効果的であり(図2B)、PFA処理された細菌は抗生物質処理された細菌と比較して代謝活性が低下します19。PFA処理のもう一つの利点は、細菌が細胞構造と栄養プロファイルを維持することです。 その結果、線虫はPFA処理された細菌で発生する可能性がありますが、卵から熱死した細菌を与えると発生が停止します13,16。
重要な手順とトラブルシューティング
PFA処理細菌は比較的簡単なプロトコルですが、細菌の各バッチが複製および代謝的に死滅していることを検証し(ステップ6および7)、PFA処理後の洗浄ステップが完全に行われていることを確認することが重要です(ステップ5)。ステップ6でコロニーが増殖し、細菌が完全に死滅していないことを示している場合は、ステップ3でPFAの濃度とPFA処理の期間をトラブルシューティングすることができます。PFA処理プロトコルを最適化する場合、0.5%濃度のPFAは、最小限の副作用でOP50を正常に死滅させるのに理想的でした。0.25%のPFAは、すべての細菌株を代謝的に死滅させるのに十分ではなく(図2C-D)、濃度を0.5%PFAに上げても、0.25%PFAと比較して、OP50の線虫の発生時間、寿命、または食物嗜好は変化しませんでした。また、PFAの接種は、すべての細菌の増殖を防ぐのに十分な最短時間でした。0.5%PFAを1時間接種しても細菌が完全に死滅しない場合は、接種時間やPFA濃度を上げて、殺菌効率をトラブルシューティングすることができます。プロトコルの2番目の重要なステップは、PFA処理後のバクテリアの洗浄です(ステップ5)。5回の洗浄をすべて完了し、洗浄のたびに上清を完全に除去して、細菌にホルムアルデヒドが残らないようにすることが非常に重要です。線虫がうまく増殖しない場合、またはPFA処理されたバクテリアをポンピングしない場合は、追加の洗浄を実行できます。
この方法の制限
PFAで死滅した細菌は、線虫の研究から細菌代謝の交絡効果を排除するのに理想的ですが(図2B)、この方法には限界があります。具体的には、C.エレガンスは、生きた細菌と比較して、PFA処理された細菌での発生がわずかに遅い(図4A)16。PFA処理は、FUdRが存在する場合(図4D)でも線虫の寿命を延ばすが、NGM(図4C)プレートには存在しない16。ただし、他の方法にもこれらの課題があります。紫外線で殺されたバクテリアは、C.エレガンスの寿命も変えます。大多数の報告は、UV処理された細菌がNGM12,23およびFUdR 24で線虫の寿命を延ばすことを示唆しており、他の研究では、UV処理は寿命に影響を与えず24、C.エレガンスの寿命25,26でUV処理とFUdRの間に相互作用があることが示されています。PFA処理細菌の寿命効果に加えて、線虫はPFA処理細菌(図3C)16に比べて生きた細菌に時間を費やすことを好みますが、PFA処理された食品のポンプ速度は高くなります(図3D)。これは、彼らが同じ量の食物を摂取する可能性があること、またはPFA処理された細菌が食べやすいか難しいことを示唆しています。これらの効果の多くは、細菌を殺す他の方法でも観察され12,13,14、代謝活性細菌は発生時間を短縮し、寿命を縮め、C.エレガンスにとってより魅力的であることを示唆しています。
PFA処理菌の応用可能性
全体として、大量の細菌を迅速かつ確実に殺す能力は、 C.エレガンス 研究における細菌代謝の交絡効果を排除する大きな可能性を秘めています。この能力は、薬物スクリーニング、サプリメント実験、毒性アッセイ、メタボロミクス研究、および微生物代謝が宿主の行動に及ぼす影響を調べるために特に有用です。これらの各アプリケーションにおけるPFA処理細菌の使用の詳細については、以下をご覧ください。
薬物、添加、毒性の実験:PFA処理した細菌のバッチごとに1プレートのみで死滅試験が成功するため、PFAで死滅した細菌を液体培養に添加して、ハイスループットの薬物スクリーニングを行うことができます。PFA処理されたバクテリアは、低分子または栄養素を寒天培地に取り込んだ固体プレートに播種することもできます。PFA処理したバクテリアを播種した固体プレートは、毒性やストレス応答のアッセイにも有用です。未発表のデータによると、PFA処理された細菌は、パラコートおよびチュニカマイシン耐性における細菌ストレス応答経路と線虫ストレス耐性経路の役割を区別するのに役立つ可能性があります。これらの薬物補給および毒性試験でPFA死滅細菌を使用すると、細菌が目的の分子を代謝するのを防ぎ、観察された表現型が線虫に直接作用する化合物から得られることが保証され ます。 また、代謝的に死んだ細菌を薬物実験やサプリメント実験に使用すると、生きた細菌は実験ごとに異なる量の目的化合物を代謝できるため、投与量のばらつきを最小限に抑えることができます。
メタボロミクス研究:C.エレガンスの メタボロミクス研究は、細菌の代謝によっても交絡される可能性があり、線虫の代謝の変化を観察するには、細菌の代謝活性がないことが必要です29。バクテリアの餌源を少し変えるだけでも、線虫のメタボロームが変わる可能性があります。例えば、生きた洗浄細菌を給餌した線虫のメタボロームは、未洗浄の生きた細菌を与えられた線虫のメタボロームとは異なる16。PFA処理された細菌を摂取すると、生きた餌を摂取する場合と比較して線虫のメタボロームも変化します16 が、細菌の代謝から分離して 、線虫 の代謝に対する実験条件の影響を比較することができます。
宿主微生物の行動研究:最後に、PFA処理された細菌を使用して、細菌の代謝と宿主の行動の間の相互作用を特定することができます。病原菌と非病原菌の両方から分泌される代謝産物は、線虫にとって魅力的または忌避的であり、線虫の採餌および摂食行動に影響を与える可能性があります10,11,30。さらに、バクテリアは、運動の変化を駆動する神経調節物質を産生することができる30。さらに、異なる菌株でC.エレガンスを増殖させると、ひなのサイズ、発生時間、および生理機能が変化します31,32。これらの細菌をPFAで処理すると、線虫に対する特定の細菌の影響が活発な細菌代謝を必要とするかどうかを判断するのに役立ちます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、NIH R21AG059117とミシガン大学のPaul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Researchから資金提供を受けました。SBはT32AG000114から資金提供を受けました。ESKはNSF DGE 1841052から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
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