Caenorhabditisのelegansの研究のための細菌を新陳代謝的に不活性化する方法論

サマリー

実験室での 線虫Caenorhabditis elegans の餌源は、生きた 大腸菌です。細菌は代謝的に活性であるため、 線虫 の代謝および薬物研究において交絡変数を示します。パラホルムアルデヒドを使用して細菌を代謝的に不活性化する詳細なプロトコルは、ここに記載されています。

要約

線虫Caenorhabditis elegansは、遺伝学、発生、老化、代謝、および行動の研究のための一般的なモデル生物です。線虫は生きたバクテリアの餌を摂取するため、その食物源の代謝活性は、線虫に対するさまざまな介入の直接的な影響を探す実験を混乱させる可能性があります。細菌代謝の交絡作用を避けるために、C.エレガンスの研究者は、紫外線(UV)照射、熱殺傷、抗生物質など、細菌を代謝的に不活性化する複数の方法を使用してきました。UV処理は比較的低スループットであり、細菌の死滅を成功させるために各プレートを検査する必要があるため、液体培養では使用できません。第2の治療法である熱殺傷は、細菌の食感と栄養価に悪影響を及ぼし、線虫の発生停止につながります。最後に、抗生物質治療は、細菌の増殖を防ぐだけでなく、線虫の生理機能を直接変化させる可能性があります。この原稿では、パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して細菌を代謝的に不活性化する代替方法について説明します。PFA処理は、細菌細胞内のタンパク質を架橋し、細胞構造と栄養成分を維持しながら代謝活性を防ぎます。この方法はハイスループットであり、PFA処理したバクテリアの1つのプレートの増殖をテストすることでバッチ全体が検証されるため、液体培養または固体プレートで使用できます。PFA処理による代謝不活性化は、C.エレガンスにおける薬物または代謝物の補給、ストレス耐性、メタボロミクス、および行動の研究における細菌代謝の交絡効果を排除するために使用できます。

概要

線虫は、1965年にモデル生物として提唱され¹、それ以来、遺伝学、発生、行動、老化、代謝の研究に広く採用され^{てきました2。}C.エレガンスは、その大きなひなサイズと透明なクチクラにより、蛍^{光レポーターによる}ハイスループットスクリーニングに特に適しています3。また、C.エレガンスは、その短いライフサイクル、雌雄同体生殖、ヒトとの遺伝的相同性などから、発生^4や老化生物学5の研究において貴重なモデル体系^{となっています。}さらに、C.エレガンスは比較的維持が容易です。線虫は、液体培養または固体寒天プレートで増殖し、生きた大腸菌OP50細菌の餌を消費^{することができます4。}

しかし、線虫の生きた食物源は、代謝、薬物補給、および行動の研究を混乱させる可能性があります。生きたバクテリアは独自の代謝を持っているため、バクテリアに影響を与える実験条件は、ワームが利用できる栄養素と代謝物も変化させます。例えば、細菌の鉄、アミノ酸、葉酸の濃度の違いは、線虫の発生、生理機能、寿命に多様な影響を及ぼし....

プロトコル

1.細菌接種

1. 10 gのトリプトン、5 gの酵母抽出物、および10 gの塩化ナトリウム(NaCl)を950 mLの蒸留水に溶解して、ルリアブロス(LB)を調製します。
2. 5Mの水酸化ナトリウム(NaOH)を添加して、LBのpHを7.0に調整します。これには、約0.2mLのNaOHしか必要ありません。
3. pH 調整した LB 培地を液体サイクルで 15 psi で 45 分間オートクレーブします。溶液を冷まし、室温で保存します。
4. 500 mL三角フラスコ内のLB100 mLに細菌の単一コロニーを接種します。バクテリアを37°Cのシェーカーインキュベーターで一晩培養します。
5. バクテリアコロニーの健康状態、フラスコのサイズ、シェーカーの設定速度に応じて、バクテリアが増殖するのにかかる時間は異なる場合があります。~14時間後、600 nm(OD₆₀₀)での細菌の光学濃度(OD)を確認します。
6. OD₆₀₀ が 3.0 (1 x 10⁹ コロニー形成単位 (CFU)/mL) のときに、シェーカーからバクテリアを除去します。OD₆₀₀ が 3.0 未満の場合は、目的の OD に達するまでフラスコをシェーカー インキュベーターに戻します。
7. バクテリアを50 mLのコニカルチューブに分注し、4°....

結果

プロトコルの詳細なワークフローを図1に示します。パラホルムアルデヒドを用いた線虫群の代謝および薬物研究において、細菌の複製(図2A)および代謝(図2B)を一貫して不活性化するハイスループットメソッドが開発され、最適化されました¹⁶。目標は、線虫のさまざまな健康状態に影響を与えることなく、細菌を一貫して死滅させるために必要な最低濃度のPFAと最短時間を決定することでした。これらの値は、ラボ環境に応じて場所によって、また細菌株によって異なる場合があります。例えば、HB101 細菌を 0.25% に 1 時間曝露すると、代謝不能になりますが(図 2C)、エンテロコッカス・フェカリス(EF)では、一貫した効果を得るために 1.0% の PFA 濃度が必要です(図 2D)。

ディスカッション

他の細菌殺傷法と比較したPFA殺菌の利点
PFA処理は、線虫の栄養価の高い食物源を維持しながら、細菌の代謝を防ぐためのハイスループットな方法です。PFA処理によるバクテリアの死滅には、他の方法に比べて複数の利点があります。UV処理では、すべてのプレートを正常に殺傷するためにテストする必要がありますが、PFA処理されたバクテリアのバッチからの単一のプレートをテストして、バッチ^{を検証することができます16}。PFA処理は細菌の代謝を除去するのにも非常に効果的であり(図2B)、PFA処理された細菌は抗生物質処理された細菌と比較して代謝活性が低下します¹⁹。PFA処理のもう一つの利点は、細菌が細胞構造と栄養プロファイルを維持することです。 その結果、線虫はPFA処理された細菌で発生する可能性がありますが、卵から熱死した細菌を与えると発生が停止します^13,16

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルミホイル	ステープル	2549291
ブンゼンバー	ナーVWR	470121-700
セル密度計	デンビル	80-3000-45
遠心分離機	Eppendorg	5430
ケミカル ヒューム フード	Labcono	975050411384RG
Conincal チューブ (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	フィッシャー	14-955-127
大腸菌 OP50	CGC	OP50
三角フラスコ	フィッシャー	250 mL:FB501250 500 mL:FB501500 1000 mL:FB5011000
接種ループ	フィッシャー	22-363-605
LB 寒天	フィッシャー	BP1425500
液体廃棄物収集ボトル	トーマス・サイエンティフィック	1230G50
硫酸マグネシウム (MgSO4)	Sigma	M7506
パラホルムアルデヒド (32%)	電子顕微鏡科学	15714-S	パラホルムアルデヒド – メタノールフリー溶液
ピペットール	エッペンドルフ	エッペンドルフ イージーペット 3
プラスチック皿 (100 mm)	Fisher	FB0875712
リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)	Fisher	P2853
タツノオトシゴ XFe96 キャリブラント	Agilent	100840-000
タツノオトシゴ XFe96 細胞外フラックスアッセイキットおよび細胞培養マイクロプレート	Agilent	101085-004
血清ピペット (50 mL)	Genesee Scientific	12-107
シェーカーインキュベーター	Thermo	11 676 083
塩化ナトリウム (NaCl)	Fisher	S640-3
水酸化ナトリウム (NaOH)	Fisher	S318500
リン酸二塩基性無水 (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
固形廃棄物収集バケツ	M&Mインダストリーズ	5.0ガロンM1トラディショナルバケ
トリプトン	ジェネシーサイエンティフィック	20-251
ボルテック	スサーモ	11676331
計量バランス	Cゴールデンウォール	HZ10K6B
酵母エキス	ジェネシーサイエンティフィック	20-255

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