Summary
De voedselbron voor Caenorhabditis elegans in het lab is levende Escherichia coli. Omdat bacteriën metabolisch actief zijn, vormen ze een verstorende variabele in metabole en geneesmiddelstudies bij C. elegans. Een gedetailleerd protocol om bacteriën metabolisch te inactiveren met behulp van paraformaldehyde wordt hier beschreven.
Abstract
Caenorhabditis elegans is een veelgebruikt modelorganisme voor onderzoek op het gebied van genetica, ontwikkeling, veroudering, metabolisme en gedrag. Omdat C. elegans een dieet van levende bacteriën consumeert, kan de metabolische activiteit van hun voedselbron experimenten verwarren die op zoek zijn naar de directe effecten van verschillende interventies op de worm. Om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme te voorkomen, hebben C. elegans-onderzoekers meerdere methoden gebruikt om bacteriën metabolisch te inactiveren, waaronder ultraviolette (UV)-bestraling, warmtedodend en antibiotica. UV-behandeling heeft een relatief lage doorvoer en kan niet worden gebruikt in vloeibare cultuur omdat elke plaat moet worden onderzocht op succesvolle bacteriële doding. Een tweede behandelingsmethode, hittedodend, heeft een negatieve invloed op de textuur en voedingskwaliteit van de bacteriën, wat leidt tot de ontwikkelingsstop van C. elegans. Ten slotte kan behandeling met antibiotica de fysiologie van C. elegans direct veranderen, naast het voorkomen van bacteriegroei. Dit manuscript beschrijft een alternatieve methode om bacteriën metabolisch te inactiveren met behulp van paraformaldehyde (PFA). PFA-behandeling verknoopt eiwitten in bacteriële cellen om metabolische activiteit te voorkomen met behoud van de celstructuur en voedingswaarde. Deze methode heeft een hoge doorvoer en kan worden gebruikt in vloeibare cultuur of vaste platen, omdat het testen van één plaat met PFA-behandelde bacteriën op groei de hele batch valideert. Metabole inactivatie door middel van PFA-behandeling kan worden gebruikt om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme op onderzoeken naar suppletie met geneesmiddelen of metabolieten, stressbestendigheid, metabolomics en gedrag bij C. elegans te elimineren.
Introduction
Caenorhabditis elegans werd oorspronkelijk voorgesteld als een modelorganisme in 19651 en is sindsdien op grote schaal toegepast in studies naar genetica, ontwikkeling, gedrag, veroudering en metabolisme2. Door hun grote broedgrootte en transparante cuticula is C. elegans bijzonder geschikt voor high-throughput screening met fluorescerende reporters3. Hun korte levenscyclus, hermafrodiete voortplanting en genetische homologie met mensen maken C. elegans ook tot een waardevol modelsysteem voor studies over ontwikkeling4 en verouderingsbiologie5. Bovendien zijn C. elegans relatief gemakkelijk te onderhouden. Wormen kunnen worden gekweekt in vloeibare cultuur of op vaste agarplaten en een dieet van levende Escherichia coli OP50-bacteriën consumeren4.
De levende voedselbron van C. elegans kan echter studies naar metabolisme, medicijnsuppletie en gedrag verwarren. Omdat levende bacteriën hun eigen metabolisme hebben, veranderen experimentele omstandigheden die de bacteriën beïnvloeden ook de voedingsstoffen en metabolieten die beschikbaar zijn voor de wormen. Verschillen in bacteriële ijzer-, aminozuur- en foliumzuurconcentraties hebben bijvoorbeeld verschillende effecten op de ontwikkeling, fysiologie en levensduur van C. elegans. Veel gangbare laboratoriumpraktijken kunnen dergelijke veranderingen in de samenstelling van voedingsstoffen en metabolieten die door OP50 worden geproduceerd, veroorzaken. In het bijzonder veroorzaakt blootstelling aan 5-fluor-2'-deoxyuridine (FUdR), een verbinding die vaak wordt gebruikt om reproductie bij C. elegans te voorkomen, brede veranderingen in de genexpressie van OP50, inclusief aminozuurbiosyntheseroutes7. Levende bacteriën kunnen ook studies verwarren waarin C. elegans wordt aangevuld met kleine moleculen, omdat bacteriën de actieve verbindingen gedeeltelijk of volledig kunnen metaboliseren. Bovendien kunnen de effecten van deze kleine moleculen op de bacteriën op hun beurt de fysiologie van C. elegans veranderen, zoals werd gerapporteerd met het levensduurverlengende medicijn metformine8. Ten slotte kunnen levende bacteriën de omgeving van de worm veranderen op manieren die het gedrag veranderen, zoals het afscheiden van aantrekkelijke geurstoffen9, het produceren van exogene neuromodulatoren10 en het creëren van zuurstofgradiënten in een gazon met dichte bacteriën11.
Om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme op C. elegans-onderzoek te verminderen, zijn meerdere methoden ontwikkeld om bacteriën te doden (tabel 1). Drie veelgebruikte strategieën voor het doden van OP50 zijn UV-bestraling, hittedoding en antibioticabehandeling. Hoewel eenvoudig en relatief goedkoop, kan elk van deze methoden ongewenste effecten hebben op zowel bacteriën als C. elegans. UV-doding via een UV-crosslinker12 heeft een lage doorvoer en de snelheid wordt beperkt door het aantal platen dat in de UV-crosslinker past. Bovendien kan de werkzaamheid van UV-doding variëren van plaat tot plaat binnen een batch, en het testen op groei op alle platen kan moeilijk worden in grote experimenten. Het hittedoden van OP50 door cultuur bloot te stellen aan temperaturen van >60 °C brengt een aparte reeks uitdagingen met zich mee. Hoge hitte kan voedingsstoffen beschadigen die essentieel zijn voor de worm en de celstructuur van bacteriën vernietigen, waardoor een zachtere textuur ontstaat die de hoeveelheid tijd die wormen aan het voedsel besteden, vermindert. Deze methode kan ook niet gedurende de hele levenscyclus van C. elegans worden gebruikt, omdat wormen die door hitte gedode bacteriën krijgen, vroeg in de ontwikkeling kunnen stoppen13. Behandeling met antibiotica is een derde veelgebruikte methode om het bacteriële metabolisme te onderdrukken14, maar antibiotica kunnen ook de groei en het metabolisme van wormen veranderen15.
Een oplossing om de metabolische effecten van levende bacteriën te elimineren met behoud van de bacteriële structuur en essentiële voedingsstoffen, is het doden van OP50 met paraformaldehyde (PFA)16. PFA is een polymeer van formaldehyde dat eiwitten in cellen kan verknopen17 om bacteriële replicatie te voorkomen zonder interne celstructuren zoals het binnenste plasmamembraan te vernietigen18. Vanwege dit behoud van de interne celstructuur vertonen met PFA behandelde bacteriën geen groei of metabolische activiteit, maar blijven ze een eetbare en voedselrijke voedselbron voor C. elegans16. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven dat laat zien hoe bacteriën metabolisch kunnen worden geïnactiveerd met behulp van paraformaldehyde.
| Methode | Benodigde materialen | Schaalbare? | Voeding? | Effecten op worm? | ||||
| UV | UV-crosslinker | Beperkt door: | Ja | Variabele effecten op levensduur op NGM12, 23, 24 | ||||
| Aantal platen dat in UV-crosslinker past | Variabele effecten op de levensduur van FUdR24, 26, 27 | |||||||
| Bestralingstijd per plaat | Verminderde voedselvoorkeur16 | |||||||
| Mogelijkheid om elke plaat te controleren op groei8 | ||||||||
| Hitte | >60 °C incubator | Ja | Nee: vernietigt celwand, verminderde voedingswaarde | Ontwikkelingsstilstand 13 | ||||
| Verminderde voedselvoorkeur13 | ||||||||
| Verlengt de levensduur van NGM31 | ||||||||
| Antibiotica | Antibiotica (kanamycine, carbenicilline, enz.) | Ja | Ja | Vertraagt groei en ontwikkeling15 | ||||
| Verlengt de levensduur in vloeibare media19 | ||||||||
| Verlengt de levensduur van NGM15 | ||||||||
| PFA (PFA) | 0,5% paraformaldehyde | Ja | Ja | Kleine broedgrootte afname16 | ||||
| Kleine toename van de ontwikkelingstijd16 | ||||||||
| Verminderde voedselvoorkeur16 | ||||||||
Tabel 1. Vergelijkingen van methoden om OP50 te doden. UV-killing, hitte-killing, antibiotica-behandeling en PFA-behandeling hebben verschillende effecten op de voedingsstatus van de bacteriën en de gezondheid van wormen die behandelde bacteriën krijgen. Deze methoden voor het repliceren van E. coli verschillen ook in hun vereiste materialen en schaalbaarheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inenting tegen bacteriën
- Bereid Luria-bouillon (LB) door 10 g trypton, 5 g gistextract en 10 g natriumchloride (NaCl) op te lossen in 950 ml gedestilleerd water.
- Pas de pH van de LB aan naar 7.0 door 5M natriumhydroxide (NaOH) toe te voegen. Hiervoor is slechts ongeveer 0,2 ml NaOH nodig.
- Autoclaaf de pH-aangepaste LB-media op een vloeistofcyclus gedurende 45 minuten bij 15 psi. Laat de oplossing afkoelen en bewaar op kamertemperatuur.
- Inoculeer een enkele kolonie bacteriën in 100 ml LB in een erlenmeyer van 500 ml. Kweek de bacteriën een nacht in een 37 °C schudincubator.
- Afhankelijk van de gezondheid van de bacteriekolonie, de grootte van de kolf en de snelheid waarop de shaker is ingesteld, kan de tijd die de bacteriën nodig hebben om te groeien variëren. Controleer na ~14 uur de optische dichtheid (OD) van de bacteriën bij 600 nm (OD600).
- Verwijder de bacteriën uit de shaker wanneer de OD600 3.0 is (1 x 109 kolonievormende eenheden (CFU)/ml). Als de OD600 lager is dan 3,0, plaatst u de kolf terug in de schudincubator totdat de gewenste OD is bereikt.
- Aliquot de bacteriën in conische buisjes van 50 ml en bewaar ze bij 4 °C of ga verder met de volgende stap.
2. Werken met paraformaldehyde
OPMERKING: De gebruikte concentratie paraformaldehyde (PFA) en de duur van de blootstelling kunnen enigszins variëren, afhankelijk van het klimaat, de locatie en het type bacterie dat wordt behandeld. Een goed uitgangspunt voor OP50 is blootstelling aan 0,5% PFA gedurende 1 uur, terwijl 0,25% PFA gedurende 1 uur voldoende kan zijn voor HT115.
- Bereid 32% PFA-voorraad voor of gebruik een commercieel gekochte 32% PFA-oplossing. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij het werken met PFA. Draag handschoenen en oogbescherming.
- Voeg PFA toe in een chemische zuurkast met goede ventilatie. Gooi PFA-bevattende wasbeurten en tips weg in de juiste containers voor chemische gevaren in de zuurkast.
3. Bacteriële behandeling met paraformaldehyde
- Zodra de bacteriën een OD600 van 3,0 hebben bereikt, gebruikt u een serologische pipet om 50 ml over te brengen in een nieuwe erlenmeyer van 250 ml. Bewaar de rest voor een live controle, een nagebootste controle (zie stap 4), of om indien nodig ook met PFA te behandelen.
- Giet niet van de ene kolf naar de andere en pas op dat u de zijkanten van de nieuwe kolf niet met bacteriën bespat. Kolonies aan de zijkant van de kolf kunnen een lagere dosis PFA krijgen.
- Voeg in de chemische kap 781 μL 32% PFA toe aan 50 ml bacteriën om de uiteindelijke concentratie op 0,5% te brengen. Gooi de gebruikte stortplaats weg in een container voor chemisch afval voor chemisch afval.
- Dek de kolf af met folie en doe 1 uur terug in de schudincubator van 37 °C. Haal na 1 uur de kolf uit de incubator en ga verder met stap 5.
4. Nep-behandelde controle
- Zodra de bacteriën een OD600 van 3,0 hebben bereikt, gebruikt u een serologische pipet om 50 ml van de bacteriën over te brengen naar een conische buis van 50 ml.
- Ga verder met stap 5.3 om de wasstappen te voltooien die vergelijkbaar zijn met de met PFA behandelde groep.
5. Wassen van de bacteriën om achtergebleven PFA te verwijderen
- Gebruik in de chemische kap een serologische pipet om de behandelde bacteriën van de erlenmeyer over te brengen naar een conische buis van 50 ml. Door een serologische pipet te gebruiken in plaats van de bacteriën te gieten, wordt besmetting door bacteriekolonies aan de rand van de kolf voorkomen die mogelijk directe behandeling met PFA hebben vermeden.
- Centrifugeer behandelde bacteriën op ongeveer 3000 x g gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatans door het weg te gooien in een container voor vloeibaar afval met chemische gevaren in de chemicaliënkap.
- Voeg 25 ml LB en vortex toe om de bacteriepellet te resuspenderen (als u de buis volledig vult, wordt het moeilijker om de pellet opnieuw te suspenderen). Herhaal de centrifugatie en pelletresuspensie 4x.
- Resuspendeer de pellet in volumes die optimaal zijn voor verschillende tests. Voor levensduurtesten worden 60 mm zaadplaten met 200 μL bacteriën geresuspendeerd in 10 ml LB. Resuspenderen van de bacteriën in 10 ml LB resulteert in een concentratie van 5x de oorspronkelijke 50 ml cultuur.
- Bewaar de bacteriën bij 4 °C.
6. Kwaliteitscontrole van bacteriegroei
- Na de laatste wasbeurt en resuspensie bestrijft u een LB-plaat (met behulp van een steriele pipetpunt) met de voorbereide bacteriën. Het is een goede gewoonte om de LB die wordt gebruikt voor het wassen en resuspenderen ook op een aparte plaat te strepen om er zeker van te zijn dat de gebruikte LB niet verontreinigd is.
- Zet de borden een nacht in een incubator van 37 °C. Controleer op eventuele groei. De bacteriën worden als replicatief dood beschouwd wanneer kolonies niet op de LB-plaat groeien.
7. Kwaliteitscontrole van het bacteriemetabolisme met behulp van een ademhalingsmeter
- Bevestig na de laatste wasbeurt en resuspensie van stap 5.4 dat de bacteriën metabolisch dood zijn met behulp van beschikbare hulpmiddelen zoals ademhalingsmeters19,20 en het meten van het basale zuurstofverbruik (OCR).
- Bereid M9-oplossing: Los 3 g kaliumfosfaat monobasisch (KH 2 PO 4), 6 gnatriumfosfaat dibasisch (Na2HPO4) en 5 g natriumchloride (NaCl) op in 950 ml gedestilleerd water. Autoclaaf op een vloeistofcyclus gedurende 45 minuten bij 15 psi en laat de oplossing vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 1 ml 1 M magnesiumsulfaat (MgSO4) toe en bewaar bij kamertemperatuur.
- Hydrateer het patroon van de ademhalingsmeter: Voeg 200 μL calibrant toe aan alle putjes van een plaat met 96 putjes. Plaats de patroon in de plaat met 96 putjes en incubeer een nacht in een incubator van 37 °C.
- Kalibratie van de analyse: Plaats de volgende dag de gehydrateerde cartridge in de machine en begin met de kalibratie.
- Opstelling van de testplaat: Voeg met behulp van een nieuwe plaat met 96 putjes 160 μL M9 en 40 μL van de voorbereide bacteriën (1 x 109 CFU/ml) toe aan testputjes. Voeg 200 μL M9 toe aan de 4 hoekputjes om als blanco putjes te gebruiken. Voeg 160 μl M9 en 40 μl LB toe die worden gebruikt voor wassen en resuspenderen om als negatieve controles te gebruiken. Voeg 200 μL M9 toe aan de rest van de putjes die niet worden gebruikt.
- Voer de test uit: Zodra de cartridgekalibratie is voltooid, plaatst u de testplaat uit stap 7.5 in de machine voor analyse. De instellingen omvatten stappen om te mixen, wachten, meten en herhalen. De resultaten worden weergegeven als zuurstofverbruik (OCR). De bacteriën zijn metabolisch dood en klaar voor gebruik wanneer de OCR nul is.
Figuur 1. Workflow voor paraformaldehydebehandeling. Een enkele kolonie E. coli OP50-bacteriën wordt 's nachts gekweekt. PFA wordt toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% en de met PFA behandelde cultuur wordt gedurende 1 uur bij 37 °C geschud. Tot slot wordt de PFA verwijderd door de kweek te wassen met verse LB 5x. Om te bevestigen dat de behandelde bacteriën replicatief inactief zijn, streept u een LB-plaat van de behandelde bacteriën uit en groeit u 's nachts. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een gedetailleerde workflow van het protocol wordt weergegeven in figuur 1. Er werd een high-throughput-methode ontwikkeld en geoptimaliseerd om bacteriële replicatie (Figuur 2A) en metabolisme (Figuur 2B) consistent te inactiveren voor metabole en geneesmiddelenstudies in C. elegans-onderzoek met behulp van paraformaldehyde16. Het doel was om de laagste concentratie PFA te bepalen die nodig was en de kortste tijd die nodig was om de bacteriën consequent te doden zonder verschillende gezondheidsmaatregelen in de wormen te beïnvloeden. Deze waarden kunnen van locatie tot locatie verschillen, afhankelijk van de laboratoriumomgeving en van de ene bacteriestam tot de andere. Blootstelling van HB101-bacteriën aan 0,25% gedurende 1 uur is bijvoorbeeld voldoende om het metabolisch inactief te maken (Figuur 2C), terwijl Enterococcus faecalis (EF) een PFA-concentratie van 1,0% vereist (Figuur 2D) voor een consistent effect. Een aanpak voor individuele laboratoriumoptimalisatie werd eerder vastgesteld16 en wordt gedetailleerd beschreven in dit huidige werk.
Aantrekken en consumeren van voedsel
Naarmate bacteriën groeien en zich vermenigvuldigen, geven ze verschillende metabolieten en feromonen af die aantrekkelijk zijn voor de wormen. Om te bepalen of de wormen aangetrokken blijven tot de met PFA behandelde OP50, werden platen ingezaaid met PFA-behandelde of nepbehandelde OP50 en werd het percentage wormen dat aanwezig was op het voedselgazon in vergelijking met buiten het gazon getabelleerd. Gegevens tonen aan dat wormen worden aangetrokken door de met PFA behandelde OP50, aangezien de meeste wormen na 1 uur op het bacteriële gazon blijven (Figuur 3A), vergelijkbaar met wat wordt waargenomen bij de nepbehandelde controle (Figuur 3B). Zoals verwacht laat een gevoelige paarsgewijze test21 echter zien dat C. elegans een sterkere voorkeur heeft voor de nagebootste levende controle (Figuur 3C) wanneer ze worden gezaaid met de PFA die op dezelfde plaat is behandeld. Nadat was vastgesteld dat wormen worden aangetrokken door PFA-gedode bacteriën, zij het minder dan levende bacteriën, was het absoluut noodzakelijk om vast te stellen dat ze het PFA-gedode voedsel eten. Om te bepalen of de wormen de met PFA behandelde OP50 consumeren, werd de pompsnelheid van de wormen op verschillende soorten voedsel gemeten. Zoals te zien is in figuur 3D, hebben wormen op PFA-behandelde OP50 een hogere pompsnelheid (+25%) dan wormen op de nep-behandelde controlegroep. Dit geeft aan dat wormen niet doelbewust hun eetsnelheid vertragen op PFA-gedood voedsel en kunnen wijzen op een hogere eetsnelheid of een compenserende reactie op een verandering in het gemak van het pompen van het behandelde voedsel.
Vruchtbaarheid, ontwikkeling en levensduur
Veranderingen in voedselomstandigheden kunnen fysiologische effecten hebben op wormen13,22. Om brede effecten te testen, werden veranderingen in de ontwikkelingssnelheid, vruchtbaarheid en levensduur gemeten. PFA-behandelde OP50 vertraagt de ontwikkelingstijd (~4 uur) van wildtype N2-wormen enigszins, zoals weergegeven in figuur 4A. Monitoring van de legcapaciteit van wormen die onder verschillende bacteriële omstandigheden worden gekweekt, toont een lichte maar significante afname van de vruchtbaarheid (-21%) bij de wormen die met PFA behandelde OP50 kregen (Figuur 4B). Voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in veroudering van C. elegans, werd vervolgens het effect van PFA-behandelde OP50 op de levensduur bepaald. Interessant is dat de levensduur van wildtype wormen die PFA-behandelde OP50 kregen niet significant verschilde van de wormen die nep-behandelde OP50 kregen op standaard nematodengroeimedia (NGM)-platen (Figuur 4C), maar PFA-behandelde OP50 verlengt de levensduur van het wildtype (+23%) wanneer FUdR aanwezig is (Figuur 4D). Het voeren van met PFA behandelde OP50 aan een langlevende fmo-2 overexpressie (OE) stam20 verandert niets aan de levensduur in vergelijking met wildtype wormen (Figuur 4E). Van UV-, hitte- en antibiotica-gedode OP50 is ook aangetoond dat het de levensduur van C. elegans verandert. In het bijzonder is gemeld dat UV-behandelde bacteriën de levensduur verlengen op NGM12,23 en op FUdR 24. Er zijn echter tegenstrijdige gegevens over de interactie van FUdR en UV-gedode bacteriën25,26 die te wijten kunnen zijn aan verschillende methoden voor UV-doding en validatie van metabole inactiviteit in de bacteriën. Bovendien verlengen door hitte gedode bacteriën de levensduur op NGM27 en verlengen antibiotica de levensduur op NGM15 en in vloeibare cultuur28.
Figuur 2. Behandeling van bacteriën met PFA remt de proliferatie en het metabolisme. (A) Bacteriegroei in kolonievormende eenheden (CFU) van nepbehandelde en 0,5% PFA-behandelde OP50. (B) Extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) in mpH/min van nepbehandelde en 0,5% PFA-behandelde OP50. (C) Basaal zuurstofverbruik (OCR) in pmol/min van nagebootst, 0.25% PFA-behandeld en 0.5% PFA-behandeld HB101. (D) Basaal zuurstofverbruik (OCR) in pmol/min van nagebootst, 0,25% PFA-behandeld, 0,5% PFA-behandeld en 1,0% PFA-behandeld enterococcus faecalis (EF). Alle foutbalken in de figuren vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM); Een tweezijdige T-toets werd gebruikt om p-waarden af te leiden. Geeft p-waarde < 0,0001 aan. Dit cijfer is gewijzigd van 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Wormen worden aangetrokken door PFA-behandelde OP50. Percentage wormen dat wordt aangetrokken door (A) met PFA behandeld of (B) nepbehandeld OP50 bacterieel gazon. (C) Paarsgewijs gesensibiliseerde testtestwormvoorkeur voor nepbehandelde en PFA-behandelde OP50. (D) Pompsnelheid (pompen per 30 s) van wormen op PFA-behandelde of nepbehandelde OP50. Een tweezijdige t-toetsanalyse werd gebruikt om p-waarden af te leiden voor alle vergelijkingen. Alle foutbalken in de figuren vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM); Geeft p-waarde < 0,0001 aan. Panelen A-C zijn aangepast van 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Wormen groeien en ontwikkelen zich op PFA-behandelde OP50. (A) Ontwikkelingstijd (h) van wormen van ei-tot-eileggende volwassenen op nagebootst behandelde en PFA-behandelde OP50. (B) Gemiddeld nageslacht (aantal wormen) van wormen die zijn gevoed met nepbehandeling of PFA-behandeld OP50. (C, D) Percentage levend wormen gevoed met nepbehandeling of PFA-behandelde OP50 op (C) NGM- en (D) FUdR-levensduurplaten. (E) Percentage levend wildtype en fmo-2 OE-wormen gevoed met PFA-behandelde OP50. Een tweezijdige t-toetsanalyse werd gebruikt om p-waarden af te leiden voor ontwikkelings- en vruchtbaarheidsvergelijkingen. De log-rank-test werd gebruikt om p-waarden af te leiden voor levensduurvergelijkingen. Alle foutbalken in de figuren vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM); * staat voor p-waarde < 0,05, *** voor p-waarde <0,001 en **** voor p-waarde < 0,0001. Panelen A, B en D zijn gewijzigd van16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voordelen van PFA-dodend ten opzichte van andere bacteriedodende methoden
PFA-behandeling is een high-throughput methode om bacterieel metabolisme te voorkomen en tegelijkertijd een voedzame voedselbron voor C. elegans te behouden. Het doden van bacteriën via PFA-behandeling heeft meerdere voordelen ten opzichte van andere methoden. In tegenstelling tot UV-behandeling, waarbij elke plaat moet worden getest op succesvolle doding, kan een enkele plaat van een batch PFA-behandelde bacteriën worden getest om de batch16 te valideren. PFA-behandeling is ook zeer effectief in het elimineren van het bacteriële metabolisme (Figuur 2B), en met PFA behandelde bacteriën vertonen een verminderde metabole activiteit in vergelijking met met antibiotica behandelde bacteriën19. Een ander voordeel van een PFA-behandeling is dat de bacteriën hun celstructuur en voedingsprofiel behouden. Bijgevolg kunnen wormen zich ontwikkelen op met PFA behandelde bacteriën, terwijl het voeren van door hitte gedode bacteriën uit eieren resulteert in ontwikkelingsstilstand13,16.
Kritieke stappen en probleemoplossing
Hoewel het behandelen van PFA-bacteriën een relatief eenvoudig protocol is, is het belangrijk om te valideren dat elke batch bacteriën replicatief en metabolisch dood is (stap 6 en 7) en om ervoor te zorgen dat de wasstappen na de PFA-behandeling grondig worden uitgevoerd (stap 5). Als er in stap 6 toch kolonies groeien, wat aangeeft dat de bacterie niet helemaal dood is, is het mogelijk om in stap 3 problemen op te lossen met de PFA-concentratie en de duur van de PFA-behandeling. Bij het optimaliseren van het PFA-behandelingsprotocol was een concentratie van 0,5% PFA ideaal voor het succesvol doden van OP50 met minimale bijwerkingen. 0,25% PFA was niet voldoende om alle bacteriestammen metabolisch te doden (Figuur 2C-D) en het verhogen van de concentratie tot 0,5% PFA veranderde de ontwikkelingstijd, levensduur of voedselvoorkeur van wormen op OP50 niet ten opzichte van 0,25% PFA. Ook was 1 uur inoculatie met PFA de kortste tijd voldoende om alle bacteriegroei te voorkomen. Als bacteriën niet volledig worden gedood door een inenting van 1 uur met 0,5% PFA, kan de inoculatietijd en/of de PFA-concentratie worden verlengd om problemen met de dodingsefficiëntie op te lossen. Een tweede belangrijke stap in het protocol is het wassen van de bacteriën na een PFA-behandeling (stap 5). Het is erg belangrijk om alle vijf de wasbeurten te voltooien en het supernatans bij elke wasbeurt volledig te verwijderen om ervoor te zorgen dat er geen formaldehyde in de bacteriën achterblijft. Als wormen niet goed groeien of niet op de met PFA behandelde bacteriën pompen, kunnen extra wasbeurten worden uitgevoerd.
Beperkingen van de methode
Hoewel PFA-gedode bacteriën ideaal zijn voor het elimineren van de verstorende effecten van bacterieel metabolisme (Figuur 2B) uit C. elegans-studies, zijn er beperkingen aan deze methode. In het bijzonder hebben C. elegans een iets langzamere ontwikkeling op PFA-behandelde bacteriën in vergelijking met levende bacteriën (Figuur 4A)16. PFA-behandeling verlengt ook de levensduur van wormen als FUdR aanwezig is (Figuur 4D), maar niet op NGM (Figuur 4C) platen16. Andere methoden brengen deze uitdagingen echter ook met zich mee; UV-gedode bacteriën veranderen ook de levensduur van C. elegans. De meerderheid van de rapporten suggereert dat UV-behandelde bacteriën de levensduur van wormen verlengen op NGM12,23 en op FUdR 24, terwijl andere onderzoeken aangeven dat UV-behandeling geen invloed heeft op de levensduur 24 en dat er een interactie is tussen UV-behandeling en FUdR op C. elegans levensduur25,26. Naast de levensduureffecten van met PFA behandelde bacteriën, besteden wormen de voorkeur aan tijd aan levende bacteriën in vergelijking met met PFA behandelde bacteriën (Figuur 3C)16, maar hebben ze een hogere pompsnelheid op het met PFA behandelde voedsel (Figuur 3D). Dit suggereert dat ze een vergelijkbare hoeveelheid voedsel kunnen consumeren of dat met PFA behandelde bacteriën gemakkelijker of moeilijker te eten zijn. Veel van deze effecten worden ook waargenomen bij andere methoden om bacteriën te doden12,13,14, wat suggereert dat metabolisch actieve bacteriën de ontwikkelingstijd verkorten, de levensduur verkorten en aantrekkelijker zijn voor C. elegans.
Mogelijke toepassingen van PFA-behandelde bacteriën
Over het algemeen heeft het vermogen om snel en betrouwbaar grote hoeveelheden bacteriën te doden een groot potentieel voor het elimineren van de verstorende effecten van bacterieel metabolisme in C. elegans-studies. Dit vermogen is met name nuttig voor medicijnscreenings, suppletie-experimenten, toxiciteitstests, metabolomics-studies en het onderzoeken van de effecten van microbieel metabolisme op het gedrag van de gastheer. Meer informatie over het gebruik van met PFA behandelde bacteriën in elk van deze toepassingen vindt u hieronder.
Experimenten met geneesmiddelen, suppletie en toxiciteit: Omdat slechts één plaat per batch met PFA behandelde bacteriën hoeft te worden getest op het doden van succes, kunnen PFA-gedode bacteriën worden toegevoegd aan vloeibare cultuur voor screening van geneesmiddelen met een hoge doorvoer. PFA-behandelde bacteriën kunnen ook op vaste platen worden gezaaid met kleine moleculen of voedingsstoffen die in de agarmedia zijn verwerkt. Vaste platen bezaaid met PFA-behandelde bacteriën kunnen ook nuttig zijn voor toxiciteits- of stressresponstests. Niet-gepubliceerde gegevens suggereren dat met PFA behandelde bacteriën kunnen helpen onderscheid te maken tussen de rol van bacteriële stressresponsroutes en wormstressbestendigheidsroutes bij paraquat- en tunicamycineresistentie. Het gebruik van PFA-gedode bacteriën in deze geneesmiddelensuppletie- en toxiciteitsonderzoeken voorkomt dat bacteriën het betreffende molecuul metaboliseren en zal ervoor zorgen dat elk waargenomen fenotype het resultaat is van een verbinding die rechtstreeks op C. elegans inwerkt.Het gebruik van metabolisch dode bacteriën voor experimenten met geneesmiddelen en suppletie minimaliseert ook de variabiliteit in dosering, aangezien levende bacteriën van experiment tot experiment verschillende hoeveelheden van de verbinding van belang kunnen metaboliseren.
Metabolomics-studies: C. elegans metabolomics-studies kunnen ook worden verward door bacterieel metabolisme: het waarnemen van veranderingen in het wormmetabolisme vereist de afwezigheid van bacteriële metabole activiteit29. Zelfs kleine veranderingen in de bacteriële voedselbron kunnen het metaboloom van de worm veranderen. Het metaboloom van wormen die met levende gewassen bacteriën worden gevoed, verschilt bijvoorbeeld van het metaboloom van wormen die met levende, ongewassen bacteriën worden gevoed16. Het consumeren van met PFA behandelde bacteriën verandert ook het wormmetaboloom ten opzichte van het consumeren van levend voedsel16 , maar maakt vergelijkingen mogelijk tussen de effecten van experimentele omstandigheden op het metabolisme van C. elegans in isolatie van het bacteriële metabolisme.
Gedragsstudies van gastheer-microben: Ten slotte kunnen met PFA behandelde bacteriën worden gebruikt om interacties tussen het bacteriële metabolisme en het gedrag van de gastheer te identificeren. Metabolieten die worden uitgescheiden door zowel pathogene als niet-pathogene bacteriën kunnen aantrekkelijk of afstotend zijn voor wormen om hun foerageer- en voedingsgedrag te beïnvloeden10,11,30. Bovendien kunnen bacteriën neuromodulatoren produceren die veranderingen in de voortbeweging veroorzaken30. Bovendien resulteert het kweken van C. elegans op verschillende bacteriestammen in veranderde broedgrootte, ontwikkelingstijd en fysiologie31,32. Door deze bacteriën met PFA te behandelen, kan worden bepaald of de effecten van een bepaalde bacterie op C. elegans een actief bacterieel metabolisme vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NIH R21AG059117 en de Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research aan de Universiteit van Michigan. SB werd gefinancierd door T32AG000114. ESK werd gefinancierd door NSF DGE 1841052.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
- Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
- Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
- McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
- Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
- Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
- Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
- Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
- Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
- Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
- Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Felix, H.
- Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
- MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
- Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
- Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
- Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
- O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
- Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).
