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Biology

Méthodologie pour inactiver métaboliquement les bactéries pour la recherche sur Caenorhabditis elegans

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65775
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

La source de nourriture de Caenorhabditis elegans en laboratoire est Escherichia coli vivant. Étant donné que les bactéries sont métaboliquement actives, elles présentent une variable confondante dans les études métaboliques et médicamenteuses chez C. elegans. Un protocole détaillé pour inactiver métaboliquement les bactéries à l’aide de paraformaldéhyde est décrit ici.

Abstract

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle commun pour la recherche en génétique, développement, vieillissement, métabolisme et comportement. Étant donné que C. elegans consomme un régime de bactéries vivantes, l’activité métabolique de leur source de nourriture peut confondre les expériences visant à rechercher les effets directs de diverses interventions sur le ver. Pour éviter les effets confondants du métabolisme bactérien, les chercheurs de C. elegans ont utilisé plusieurs méthodes pour inactiver métaboliquement les bactéries, y compris l’irradiation ultraviolette (UV), l’élimination par la chaleur et les antibiotiques. Le traitement UV est relativement faible et ne peut pas être utilisé en culture liquide car chaque plaque doit être examinée pour une destruction bactérienne réussie. Une deuxième méthode de traitement, la chaleur meurtrière, affecte négativement la texture et la qualité nutritionnelle de la bactérie, conduisant à l’arrêt du développement de C. elegans. Enfin, le traitement antibiotique peut modifier directement la physiologie de C. elegans en plus d’empêcher la croissance bactérienne. Ce manuscrit décrit une méthode alternative pour inactiver métaboliquement les bactéries à l’aide du paraformaldéhyde (PFA). Le traitement PFA réticulant les protéines dans les cellules bactériennes pour empêcher l’activité métabolique tout en préservant la structure cellulaire et le contenu nutritionnel. Cette méthode est à haut débit et peut être utilisée dans la culture liquide ou les plaques solides, car le test de croissance d’une plaque de bactéries traitées au PFA valide l’ensemble du lot. L’inactivation métabolique par traitement PFA peut être utilisée pour éliminer les effets confondants du métabolisme bactérien sur les études de supplémentation en médicaments ou en métabolites, la résistance au stress, la métabolomique et le comportement chez C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans a été proposé à l’origine comme organisme modèle en 19651 et a depuis été largement adopté dans les études sur la génétique, le développement, le comportement, le vieillissement et le métabolisme2. En raison de la grande taille de son couvain et de sa cuticule transparente, C. elegans est particulièrement bien adapté au criblage à haut débit avec des rapporteurs fluorescents3. Leur cycle de vie court, leur reproduction hermaphrodite et leur homologie génétique avec l’homme font également de C. elegans un système modèle précieux pour les études sur le développement4 et la biologie du vieillissement5. De plus, C. elegans est relativement facile à entretenir. Les vers peuvent être cultivés en culture liquide ou sur des plaques de gélose solide et consommer un régime de bactéries vivantes Escherichia coli OP504.

Cependant, la source de nourriture vivante de C. elegans peut confondre les études sur le métabolisme, la supplémentation en médicaments et le comportement. Étant donné que les bactéries vivantes ont leur propre métabolisme, les conditions expérimentales qui affectent les bactéries modifient également les nutriments et les métabolites disponibles pour les vers. Par exemple, les différences dans les concentrations bactériennes de fer, d’acides aminés et de folate ont des effets divers sur le développement, la physiologie et la durée de vie de C. elegans 6. De nombreuses pratiques de laboratoire courantes peuvent provoquer de tels changements dans la composition nutritionnelle et les métabolites produits par l’OP50. Plus précisément, l’exposition à la 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUdR), un composé couramment utilisé pour empêcher la reproduction chez C. elegans, provoque de grands changements dans l’expression du gène OP50, y compris les voies de biosynthèse des acides aminés7. Les bactéries vivantes peuvent également confondre les études dans lesquelles C. elegans est complété par de petites molécules, car les bactéries peuvent métaboliser partiellement ou complètement les composés actifs. De plus, les effets de ces petites molécules sur les bactéries peuvent, à leur tour, modifier la physiologie de C. elegans, comme cela a été rapporté avec le médicament qui prolonge la durée de vie, la metformine8. Enfin, les bactéries vivantes peuvent modifier l’environnement du ver d’une manière qui modifie le comportement, par exemple en sécrétant des odorants attrayants9, en produisant des neuromodulateurs exogènes10 et en créant des gradients d’oxygène dans une pelouse bactérienne dense11.

Afin d’atténuer les effets confondants du métabolisme bactérien sur la recherche sur C . elegans , plusieurs méthodes ont été mises au point pour tuer les bactéries (tableau 1). Trois stratégies courantes pour tuer l’OP50 sont l’irradiation UV, l’élimination de la chaleur et le traitement antibiotique. Bien qu’elles soient simples et relativement peu coûteuses, chacune de ces méthodes peut avoir des effets indésirables sur les bactéries et C. elegans. La destruction des UV via un réticulant UV12 est à faible débit et le taux est limité par le nombre de plaques pouvant contenir le réticulant UV. De plus, l’efficacité de la destruction des UV peut varier d’une plaque à l’autre au sein d’un lot, et les tests de croissance sur toutes les plaques peuvent devenir difficiles dans les grandes expériences. L’OP50 qui tue la chaleur en exposant la culture à des températures de >60 °C s’accompagne d’un ensemble distinct de défis. Une chaleur élevée peut endommager les nutriments essentiels pour le ver et détruire la structure cellulaire des bactéries, créant une texture plus douce qui diminue le temps que les vers passent sur la nourriture13. Cette méthode ne peut pas non plus être utilisée tout au long du cycle de vie de C. elegans , car les vers nourris avec des bactéries tuées par la chaleur peuvent s’arrêter tôt dans leur développement13. Le traitement antibiotique est une troisième méthode courante pour supprimer le métabolisme bactérien14, mais les antibiotiques peuvent également modifier la croissance et le métabolisme des vers15.

Une solution pour éliminer les effets métaboliques des bactéries vivantes tout en préservant la structure bactérienne et les nutriments essentiels est de tuer l’OP50 avec du paraformaldéhyde (PFA)16. Le PFA est un polymère de formaldéhyde qui peut réticuler les protéines à l’intérieur des cellules17 pour empêcher la réplication bactérienne sans détruire les structures cellulaires internes comme la membrane plasmique interne18. En raison de cette préservation de la structure cellulaire interne, les bactéries traitées au PFA ne présentent aucune croissance ni activité métabolique, mais restent une source de nourriture comestible et riche en nutriments pour C. elegans16. Ici, un protocole détaillé est fourni qui montre comment inactiver métaboliquement les bactéries à l’aide de paraformaldéhyde.

Méthode Matériel requis Évolutif? Nutritionnel? Effets sur le ver ?
UV Réticulant UV Limité par : Oui Effets variables sur la durée de vie sur NGM12, 23, 24
Nombre de plaques pouvant s’adapter à la réticulation UV Effets variables sur la durée de vie sur FUdR24, 26, 27
Temps d’irradiation par plaque Diminution des préférences alimentaires16
Possibilité de vérifier la croissance de chaque plaque8
Chaleur Incubateur >60 °C Oui Non : détruit la paroi cellulaire, diminue la valeur nutritionnelle Arrêt développemental 13
Diminution de la préférence alimentaire13
Prolonge la durée de vie du NGM31
Antibiotiques Antibiotiques (kanamycine, carbénicilline, etc.) Oui Oui Retarde la croissance et le développement15
Prolonge la durée de vie en milieu liquide19
Prolonge la durée de vie du NGM15
L’APF 0,5 % de paraformaldéhyde Oui Oui Diminution de la petite taille du couvain16
Faible augmentation du temps de développement16
Diminution des préférences alimentaires16

Tableau 1. Comparaisons des méthodes pour tuer l’OP50. L’élimination des UV, l’élimination de la chaleur, le traitement antibiotique et le traitement par PFA ont des effets variés sur l’état nutritionnel des bactéries et la santé des vers nourris avec des bactéries traitées. Ces méthodes d’inactivation réplicative d’E. coli diffèrent également par les matériaux requis et l’évolutivité.

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Protocol

1. Inoculation des bactéries

  1. Préparez le bouillon Luria (LB) en dissolvant 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 10 g de chlorure de sodium (NaCl) dans 950 mL d’eau distillée.
  2. Ajustez le pH de la LB à 7,0 en ajoutant de l’hydroxyde de sodium (NaOH) 5M. Cela ne devrait nécessiter qu’environ 0,2 mL de NaOH.
  3. Autoclaver le média LB ajusté au pH sur un cycle liquide pendant 45 min à 15 psi. Laissez la solution refroidir et conservez-la à température ambiante.
  4. Inoculer une seule colonie de bactéries dans 100 mL de LB dans un erlenmeyer de 500 mL. Cultivez les bactéries pendant une nuit dans un incubateur à secousses à 37 °C.
  5. En fonction de l’état de santé de la colonie bactérienne, de la taille du flacon et de la vitesse à laquelle l’agitateur est réglé, le temps nécessaire à la croissance des bactéries peut varier. Après ~14 h, vérifier la densité optique (OD) des bactéries à 600 nm (OD600).
  6. Retirez les bactéries de l’agitateur lorsque le diamètre extérieur600 est de 3,0 (1 x 109 unités formant colonie (UFC)/mL). Si le diamètre extérieur600 est inférieur à 3,0, remettez le ballon dans l’incubateur à agitation jusqu’à ce que le diamètre extérieur souhaité soit atteint.
  7. Aliquotez les bactéries dans des tubes coniques de 50 mL et conservez-les à 4 °C ou passez à l’étape suivante.

2. Travailler avec du paraformaldéhyde

REMARQUE : La concentration de paraformaldéhyde (PFA) utilisée et la durée de l’exposition peuvent varier quelque peu en fonction du climat, de l’emplacement et du type de bactéries traitées. Un bon point de départ pour l’OP50 est l’exposition à 0,5 % de PFA pendant 1 h, tandis que 0,25 % de PFA pendant 1 h peut suffire pour HT115.

  1. Préparez du bouillon à 32 % de PFA ou utilisez une solution à 32 % de PFA achetée dans le commerce. Utilisez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous travaillez avec de l’APF. Portez des gants et des lunettes de protection.
  2. Ajoutez du PFA à l’intérieur d’une hotte chimique avec une ventilation adéquate. Jetez les produits de lavage et les embouts contenant du PFA dans des récipients appropriés pour les risques chimiques dans la hotte.

3. Traitement bactérien au paraformaldéhyde

  1. Une fois que les bactéries ont atteint un OD600 de 3,0, utiliser une pipette sérologique pour transférer 50 mL dans un nouveau erlenmeyer de 250 mL. Conservez le reste pour un témoin en direct, un témoin traité simulé (voir l’étape 4) ou pour traiter aussi bien avec de la PFA que nécessaire.
  2. Évitez de verser d’une fiole à l’autre et veillez à ne pas éclabousser les parois de la nouvelle fiole avec des bactéries. Les colonies situées sur le côté de la fiole peuvent recevoir une dose plus faible de PFA.
  3. Dans la hotte chimique, ajouter 781 μL de PFA à 32 % de bactéries à 50 mL pour porter la concentration finale à 0,5 %. Jetez l’embout utilisé dans un conteneur de déchets solides présentant des risques chimiques.
  4. Couvrir le flacon de papier d’aluminium et le remettre dans l’incubateur à 37 °C pendant 1 h. Après 1 h, retirez le flacon de l’incubateur et passez à l’étape 5.

4. Contrôle simulé

  1. Une fois que les bactéries ont atteint un diamètre extérieur de600 de 3,0, utiliser une pipette sérologique pour transférer 50 mL de bactéries dans un tube conique de 50 mL.
  2. Passez à l’étape 5.3 pour effectuer les étapes de lavage similaires à celles du groupe traité au PFA.

5. Laver les bactéries pour éliminer les résidus de PFA

  1. Dans la hotte chimique, à l’aide d’une pipette sérologique, transférer les bactéries traitées de l’erlenmeyer vers un tube conique de 50 ml. L’utilisation d’une pipette sérologique au lieu de verser les bactéries empêchera la contamination par des colonies bactériennes sur le bord de la fiole qui auraient pu éviter un traitement direct avec de la PFA.
  2. Centrifuger les bactéries traitées à environ 3000 x g pendant 20 min. Retirez le surnageant en le jetant dans un récipient à risque chimique pour déchets liquides dans la hotte chimique.
  3. Ajouter 25 mL de LB et de vortex pour remettre la pastille bactérienne en suspension (le remplissage complet du tube rend plus difficile la remise en suspension de la pastille). Répétez la centrifugation et la remise en suspension des granulés 4 fois.
  4. Remettre le granulé en suspension dans des volumes optimaux pour différents dosages. Pour les essais de durée de vie, ensemencer des plaques de 60 mm avec 200 μL de bactéries remises en suspension dans 10 mL de LB. La remise en suspension des bactéries dans 10 mL de LB permet d’obtenir une concentration 5 fois supérieure à celle de la culture originale de 50 mL.
  5. Conservez les bactéries à 4 °C.

6. Contrôle de la qualité de la croissance bactérienne

  1. Après le lavage final et la remise en suspension, strier une plaque LB (à l’aide d’une pointe de pipette stérile) avec les bactéries préparées. Il est recommandé de rayer le LB utilisé pour le lavage et la remise en suspension sur une plaque séparée afin de s’assurer que le LB utilisé n’a pas été contaminé.
  2. Placez les assiettes dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit. Vérifiez s’il y a des croissances. Les bactéries sont considérées comme mortes de manière réplicative lorsque les colonies ne se développent pas sur la plaque LB.

7. Contrôle de la qualité du métabolisme bactérien à l’aide d’un respiromètre

  1. Après le lavage final et la remise en suspension de l’étape 5.4, confirmez que les bactéries sont métaboliquement mortes à l’aide des outils disponibles tels que les respiromètres19,20 et la mesure du taux de consommation basale d’oxygène (OCR).
  2. Préparer la solution de M9 : Dissoudre 3 g de phosphate de potassium monobasique (KH2 PO 4), 6 g de phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4) et 5 g de chlorure de sodium (NaCl) dans 950 mL d’eau distillée. Autoclavez sur un cycle liquide pendant 45 min à 15 psi, puis laissez la solution refroidir à température ambiante. Ajouter 1 mL de sulfate de magnésium 1 M (MgSO4) et conserver à température ambiante.
  3. Hydrater la cartouche du respiromètre : Ajouter 200 μL de calibrant à tous les puits d’une plaque de 96 puits. Placez la cartouche dans la plaque à 96 puits et incubez-la toute la nuit dans un incubateur à 37 °C.
  4. Étalonnage du dosage : Le lendemain, placez la cartouche hydratée dans la machine et commencez l’étalonnage.
  5. Configuration de la plaque d’essai d’analyse : À l’aide d’une nouvelle plaque à 96 puits, ajouter 160 μL de M9 et 40 μL de bactéries préparées (1 x 109 UFC/mL) dans les puits d’essai. Ajouter 200 μL de M9 dans les 4 puits d’angle pour les utiliser comme puits vides. Ajouter 160 μL de M9 et 40 μL de LB utilisés pour le lavage et la remise en suspension pour les utiliser comme témoins négatifs. Ajouter 200 μL de M9 au reste des puits qui ne seront pas utilisés.
  6. Exécuter le test : Une fois l’étalonnage de la cartouche terminé, insérez la plaque de dosage de l’étape 7.5 dans la machine pour analyse. Les paramètres comprennent des étapes de mixage, d’attente, de mesure et de boucle. Les résultats seront affichés sous forme de taux de consommation d’oxygène (OCR). Les bactéries sont métaboliquement mortes et prêtes à l’emploi lorsque l’OCR est nul.

Figure 1
Graphique 1. Flux de travail pour le traitement du paraformaldéhyde. Une seule colonie de la bactérie E. coli OP50 est cultivée pendant la nuit. Le PFA est ajouté à une concentration finale de 0,5 % et la culture traitée au PFA est agitée pendant 1 h à 37 °C. Enfin, le PFA est éliminé en lavant la culture avec du LB 5x frais. Pour confirmer que les bactéries traitées sont inactives de manière réplicative, sortez une plaque LB des bactéries traitées et développez-les pendant la nuit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

Un flux de travail détaillé du protocole est illustré à la figure 1. Une méthode à haut débit a été mise au point et optimisée pour inactiver de façon constante la réplication bactérienne (figure 2A) et le métabolisme (figure 2B) pour les études métaboliques et médicamenteuses dans le cadre de la recherche sur C. elegans à l’aide du paraformaldéhyde16. L’objectif était de déterminer la plus faible concentration de PFA nécessaire et le temps le plus court nécessaire pour tuer systématiquement les bactéries sans affecter diverses mesures de la santé des vers. Ces valeurs peuvent varier d’un endroit à l’autre en fonction de l’environnement de laboratoire et d’une souche bactérienne à l’autre. Par exemple, l’exposition de la bactérie HB101 à 0,25 % pendant 1 h est suffisante pour la rendre métaboliquement inactive (Figure 2C), tandis qu’Enterococcus faecalis (EF) nécessite une concentration de PFA de 1,0 % (Figure 2D) pour un effet constant. Une approche d’optimisation individuelle des laboratoires a été établie précédemment16 et est détaillée dans ce présent travail.

Attraction et consommation de nourriture
Au fur et à mesure que les bactéries se développent et se répliquent, elles libèrent divers métabolites et phéromones qui attirent les vers. Pour déterminer si les vers restent attirés par l’OP50 traité à l’APF, les plaques ont été ensemencées avec de l’OP50 traité à l’APF ou traité simulé et le pourcentage de vers présents sur la pelouse par rapport à l’extérieur de la pelouse a été compilé. Les données montrent que les vers sont attirés par l’OP50 traité à la PFA, puisque la plupart des vers restent sur la pelouse bactérienne après 1 h (figure 3A), ce qui est similaire à ce qui est observé avec le témoin traité par simulation (figure 3B). Cependant, comme on pouvait s’y attendre, un test sensible par paires21 montre que C. elegans a une préférence plus marquée pour le témoin vivant traité simulé (figure 3C) lorsqu’il est ensemencé avec le témoin traité au PFA sur la même plaque. Après avoir établi que les vers sont attirés par les bactéries tuées par les PFA, bien que moins que les bactéries vivantes, il était impératif d’établir qu’ils mangent les aliments tués par les PFA. Pour déterminer si les vers consomment l’OP50 traité au PFA, le taux de pompage des vers sur différents types d’aliments a été mesuré. Comme le montre la figure 3D, les vers de l’OP50 traité à l’APF ont un taux de pompage plus élevé (+25 %) que les vers du témoin traité par simulation. Cela indique que les vers ne ralentissent pas délibérément leur taux de consommation d’aliments tués par le PFA et pourrait indiquer un taux de consommation plus élevé ou une réponse compensatoire à un changement dans la facilité de pompage des aliments traités.

Fécondité, développement et durée de vie
Les changements dans les conditions alimentaires peuvent avoir des effets physiologiques sur les vers13,22. Pour tester les effets généraux, les changements dans le taux de développement, la fécondité et la durée de vie ont été mesurés. L’OP50 traité au PFA retarde légèrement le temps de développement (~4 h) des vers de type sauvage N2, comme le montre la figure 4A. Le suivi de la capacité de ponte des vers élevés dans différentes conditions bactériennes montre une diminution légère mais significative de la fécondité (-21 %) chez les vers nourris avec de l’OP50 traité au PFA (Figure 4B). Pour les laboratoires intéressés par le vieillissement de C. elegans, l’effet de l’OP50 traité par PFA sur la longévité a ensuite été déterminé. Il est intéressant de noter que la durée de vie des vers de type sauvage nourris avec de l’OP50 traité au PFA n’était pas significativement différente de celle des vers nourris avec de l’OP50 traité simulé sur des plaques de milieu de croissance de nématodes (NGM) standard (Figure 4C), cependant, l’OP50 traité au PFA augmente la durée de vie du type sauvage (+23 %) lorsque le FUdR est présent (Figure 4D). L’alimentation d’OP50 traité par PFA à une souche20 surexprimant (OE) fmo-2 à longue durée de vie n’altère pas sa longévité par rapport aux vers de type sauvage (Figure 4E). Il a également été démontré que l’OP50 tué par les UV, la chaleur et les antibiotiques modifie la durée de vie de C. elegans. Plus précisément, il a été rapporté que les bactéries traitées aux UV prolongent la durée de vie sur NGM12,23 et sur FUdR 24. Cependant, il existe des données contradictoires sur l’interaction entre le FUdR et les bactéries tuées par les UV25,26 qui peuvent être dues à diverses méthodes de destruction des UV et à la validation de l’inactivité métabolique des bactéries. De plus, les bactéries tuées par la chaleur prolongent la durée de vie du NGM27, et les antibiotiques prolongent la durée de vie du NGM15 et de la culture liquide28.

Figure 2
Graphique 2. Le traitement des bactéries avec de la PFA inhibe la prolifération et le métabolisme. (A) Croissance des bactéries dans les unités formant colonie (UFC) d’OP50 traités par simulation et traités à 0,5 % par PFA. (B) Taux d’acidification extracellulaire (ECAR) en mpH/min de l’OP50 traité par simulation et traité par PFA à 0,5 %. (C) Taux de consommation basale d’oxygène (OCR) en pmol/min de HB101 traité par simulation, traité à 0,25 % par PFA et traité à 0,5 % par PFA. (D) Taux de consommation basale d’oxygène (ROC) en pmol/min d’entérocoques faecalis (FE) traités à la PFA à 0,25 %, traités à 0,5 % par PFA et à 1,0 % traités par PFA. Toutes les barres d’erreur indiquées dans les figures représentent l’erreur-type de la moyenne (SEM) ; Un test t bilatéral a été utilisé pour dériver les valeurs de p. indique une valeur de p < 0,0001. Ce chiffre a été modifié par rapport à 16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Les vers sont attirés par l’OP50 traité par PFA. Pourcentage de vers attirés par (A) une pelouse bactérienne traitée à la PFA ou (B) traitée par un simulacre d’OP50. (C) Test de la préférence des vers pour les tests sensibilisés par paires pour l’OP50 traité par simulation et traité par PFA. (D) Débit de pompage (pompes par 30 s) des vers sur OP50 traité au PFA ou traité simulément. Une analyse bilatérale du test t a été utilisée pour calculer les valeurs de p pour toutes les comparaisons. Toutes les barres d’erreur indiquées dans les figures représentent l’erreur-type de la moyenne (SEM) ; indique une valeur de p < 0,0001. Les panneaux A à C ont été modifiés à partir de 16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Les vers grandissent et se développent sur l’OP50 traité au PFA. (A) Temps de développement (h) des vers d’adultes pondant d’œuf à œuf sur OP50 traité par simulation et traité par PFA. (B) Descendance moyenne (nombre de vers) des vers nourris avec un traitement fictif ou un OP50 traité au PFA. (C, D) Pourcentage de vers vivants nourris avec de l’OP50 traité simulé ou traité au PFA sur des plaques de durée de vie (C) NGM et (D) FUdR. (E) Pourcentage de vers vivants de type sauvage et de vers fmo-2 OE nourris avec de l’OP50 traité à la PFA. Une analyse bilatérale du test t a été utilisée pour calculer les valeurs p pour les comparaisons de développement et de fécondité. Le test logarithmique a été utilisé pour dériver des valeurs p pour les comparaisons de durée de vie. Toutes les barres d’erreur indiquées dans les figures représentent l’erreur-type de la moyenne (SEM) ; * indique une valeur de p < 0,05, *** indique une valeur de p <0,001 et **** indique une valeur de p < 0,0001. Les panneaux A, B et D ont été modifiés à partir de16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Avantages de la destruction des PFA par rapport aux autres méthodes de destruction des bactéries
Le traitement par PFA est une méthode à haut débit pour prévenir le métabolisme bactérien tout en maintenant une source de nourriture nutritive pour C. elegans. L’élimination des bactéries par le biais d’un traitement PFA présente de multiples avantages par rapport aux autres méthodes. Contrairement au traitement UV, où chaque plaque doit être testée pour réussir à tuer, une seule plaque d’un lot de bactéries traitées aux PFA peut être testée pour valider le lot16. Le traitement par PFA est également très efficace pour éliminer le métabolisme bactérien (Figure 2B), et les bactéries traitées par PFA présentent une activité métabolique réduite par rapport aux bactéries traitées aux antibiotiques19. Un autre avantage du traitement par PFA est que les bactéries conservent leur structure cellulaire et leur profil nutritionnel. Par conséquent, les vers peuvent se développer sur des bactéries traitées au PFA, tandis que l’alimentation de bactéries tuées par la chaleur à partir de l’œuf entraîne un arrêt du développement13,16.

Étapes critiques et dépannage
Bien que le traitement des bactéries par PFA soit un protocole relativement simple, il est important de valider que chaque lot de bactéries est mort sur le plan réplicatif et métabolique (étapes 6 et 7) et de s’assurer que les étapes de lavage après le traitement par PFA sont effectuées à fond (étape 5). Si des colonies se développent à l’étape 6, ce qui indique que la bactérie n’est pas complètement morte, il est possible de dépanner la concentration de PFA et la durée du traitement par PFA à l’étape 3. Lors de l’optimisation du protocole de traitement par PFA, une concentration de 0,5 % de PFA était idéale pour tuer avec succès l’OP50 avec un minimum d’effets secondaires. 0,25 % de PFA n’était pas suffisant pour tuer métaboliquement toutes les souches de bactéries (Figure 2C-D) et l’augmentation de la concentration à 0,5 % de PFA n’a pas modifié le temps de développement, la durée de vie ou la préférence alimentaire des vers sur OP50 par rapport à 0,25 % de PFA. De plus, 1 heure d’inoculation avec PFA était le temps le plus court suffisant pour empêcher toute croissance bactérienne. Si les bactéries ne sont pas complètement tuées par une inoculation de 1 h avec 0,5 % de PFA, le temps d’inoculation et/ou la concentration de PFA peuvent être augmentés pour résoudre les problèmes d’efficacité de destruction. Une deuxième étape clé du protocole est le lavage des bactéries après le traitement aux PFA (étape 5). Il est très important d’effectuer les cinq lavages et d’éliminer complètement le surnageant à chaque lavage pour s’assurer qu’il ne reste pas de formaldéhyde dans les bactéries. Si les vers ne se développent pas bien ou ne pompent pas les bactéries traitées au PFA, des lavages supplémentaires peuvent être effectués.

Limites de la méthode
Bien que les bactéries tuées par les PFA soient idéales pour éliminer les effets confondants du métabolisme bactérien (figure 2B) des études sur C. elegans, cette méthode présente des limites. Plus précisément, le développement de C. elegans est légèrement plus lent sur les bactéries traitées par le PFA que sur les bactéries vivantes (figure 4A)16. Le traitement par PFA prolonge également la durée de vie des vers si le FUdR est présent (figure 4D), mais pas sur les plaques NGM (figure 4C)16. Cependant, d’autres méthodes présentent également ces défis ; Les bactéries tuées par les UV modifient également la durée de vie de C. elegans. La majorité des rapports suggèrent que les bactéries traitées aux UV prolongent la durée de vie des vers sur NGM12,23 et sur FUdR 24, avec d’autres études indiquant que le traitement UV n’affecte pas la durée de vie 24 et qu’il existe une interaction entre le traitement UV et le FUdR sur la durée de vie de C. elegans 25,26. En plus des effets sur la durée de vie des bactéries traitées aux PFA, les vers préfèrent passer du temps sur les bactéries vivantes par rapport aux bactéries traitées aux PFA (figure 3C)16, mais ont un taux de pompage plus élevé sur les aliments traités aux PFA (figure 3D). Cela suggère qu’ils peuvent consommer une quantité similaire de nourriture ou que les bactéries traitées par PFA sont plus faciles ou plus difficiles à manger. Bon nombre de ces effets sont également observés avec d’autres méthodes de destruction des bactéries12,13,14, ce qui suggère que les bactéries métaboliquement actives diminuent le temps de développement, raccourcissent la durée de vie et sont plus attrayantes pour C. elegans.

Applications potentielles des bactéries traitées aux PFA
Dans l’ensemble, la capacité de tuer rapidement et de manière fiable de grands lots de bactéries a un grand potentiel pour éliminer les effets confondants du métabolisme bactérien dans les études sur C. elegans. Cette capacité est particulièrement utile pour les criblages de médicaments, les expériences de supplémentation, les tests de toxicité, les études métabolomiques et l’examen des effets du métabolisme microbien sur le comportement de l’hôte. Vous trouverez ci-dessous de plus amples informations sur l’utilisation de bactéries traitées au PFA dans chacune de ces applications.

Expériences sur les médicaments, la supplémentation et la toxicité : Étant donné qu’une seule plaque par lot de bactéries traitées par PFA doit être testée pour le succès de destruction, les bactéries tuées par PFA peuvent être ajoutées à la culture liquide pour le criblage de médicaments à haut débit. Les bactéries traitées au PFA peuvent également être ensemencées sur des plaques solides avec de petites molécules ou des nutriments incorporés dans le milieu gélosé. Les plaques solides ensemencées avec des bactéries traitées au PFA pourraient également être utiles pour les tests de toxicité ou de réponse au stress. Des données non publiées suggèrent que les bactéries traitées au PFA peuvent aider à faire la distinction entre le rôle des voies de réponse au stress bactérien et les voies de résistance au stress des vers dans la résistance au paraquat et à la tunicamycine. L’utilisation de bactéries tuées par les PFA dans ces études de supplémentation et de toxicité médicamenteuses empêche les bactéries de métaboliser la molécule d’intérêt et garantira que tout phénotype observé résulte d’un composé agissant directement sur C. elegans. L’utilisation de bactéries métaboliquement mortes pour les expériences de médicaments et de supplémentation minimise également la variabilité du dosage, car les bactéries vivantes peuvent métaboliser différentes quantités du composé d’intérêt d’une expérience à l’autre.

Études métabolomiques : Les études métabolomiques de C. elegans peuvent également être confondues par le métabolisme bactérien : l’observation des changements dans le métabolisme des vers nécessite l’absence d’activité métabolique bactérienne29. Même de petits changements dans la source de nourriture bactérienne peuvent altérer le métabolome du ver. Par exemple, le métabolome des vers nourris avec des bactéries lavées vivantes diffère de celui des vers nourris avec des bactéries vivantes non lavées16. La consommation de bactéries traitées à la PFA modifie également le métabolome du ver par rapport à la consommation d’aliments vivants16 , mais permet de comparer les effets des conditions expérimentales sur le métabolisme de C. elegans indépendamment du métabolisme bactérien.

Études comportementales hôte-microbe : Enfin, les bactéries traitées au PFA pourraient être utilisées pour identifier les interactions entre le métabolisme bactérien et le comportement de l’hôte. Les métabolites sécrétés par les bactéries pathogènes et non pathogènes peuvent être attrayants ou répulsifs pour les vers afin d’affecter leur comportement de recherche de nourriture et d’alimentation10,11,30. De plus, les bactéries peuvent produire des neuromodulateurs qui entraînent des changements dans la locomotion30. De plus, la culture de C. elegans sur différentes souches de bactéries entraîne une modification de la taille du couvain, du temps de développement et de la physiologie31,32. Le traitement de ces bactéries avec de la PFA peut aider à déterminer si les effets d’une bactérie donnée sur C. elegans nécessitent un métabolisme bactérien actif.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par le NIH R21AG059117 et les laboratoires Paul F. Glenn pour la recherche sur la biologie du vieillissement de l’Université du Michigan. SB a été financé par T32AG000114. ESK a été financé par NSF DGE 1841052.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum Foil Staples 2549291
Bunsen burner VWR 470121-700 
Cell Density Meter Denville 80-3000-45 
Centrifuge Eppendorg 5430
Chemical fume hood Labcono 975050411384RG
Conincal tubes (50 mL) Fisher 339652
Cuvettes  Fisher 14-955-127
E. coli OP50 CGC OP50
Erlenmyer flasks Fisher 250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Inoculation loop Fisher 22-363-605
LB Agar Fisher BP1425500
Liquid waste collection bottle Thomas Scientific 1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M7506
Paraformaldehyde (32%) Electron Microscopy Sciences 15714-S Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor Eppendorf Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm) Fisher FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher P2853
Seahorse XF Calibrant Agilent 100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate Agilent 101085-004
Serological pipettes (50 mL) Genesee Scientific 12-107
Shaker incubator Thermo 11 676 083
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Sigma S374-500
Solid waste collection bucket M&M Industries  5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone Genesee Scientific 20-251
Vortex Thermo 11676331
Weighing balance C Goldenwall HZ10K6B
Yeast Extract Genesee Scientific 20-255

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References

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Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., Huang, S., Leiser, S. F. Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research. J. Vis. Exp. (197), e65775, doi:10.3791/65775 (2023).

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