Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מתודולוגיה להשבתה מטבולית של חיידקים למחקר Caenorhabditis elegans

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65775
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

מקור המזון של Caenorhabditis elegans במעבדה הוא Escherichia coli חי. מכיוון שחיידקים פעילים מטבולית, הם מציגים משתנה מבלבל במחקרים מטבוליים ותרופתיים ב- C. elegans. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לנטרול מטבולי של חיידקים באמצעות פרפורמלדהיד.

Abstract

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל נפוץ למחקר בגנטיקה, התפתחות, הזדקנות, מטבוליזם והתנהגות. מכיוון ש-C. elegans צורכים תזונה של חיידקים חיים, הפעילות המטבולית של מקור המזון שלהם יכולה לבלבל ניסויים המחפשים את ההשפעות הישירות של התערבויות שונות על התולעת. כדי להימנע מההשפעות המבלבלות של חילוף החומרים של חיידקים, חוקרי C. elegans השתמשו בשיטות רבות כדי להשבית חיידקים מבחינה מטבולית, כולל קרינה אולטרה סגולה (UV), הרג חום ואנטיביוטיקה. טיפול UV הוא בעל תפוקה נמוכה יחסית ולא ניתן להשתמש בו בתרבית נוזלית מכיוון שיש לבדוק כל צלחת להרג חיידקים מוצלח. שיטת טיפול שנייה, קוטלת חום, משפיעה לרעה על המרקם והאיכות התזונתית של החיידק, מה שמוביל למעצר התפתחותי של C. elegans. לבסוף, טיפול אנטיביוטי יכול לשנות ישירות את הפיזיולוגיה של C. elegans בנוסף למניעת צמיחת חיידקים. כתב יד זה מתאר שיטה חלופית לנטרול מטבולי של חיידקים באמצעות פרפורמלדהיד (PFA). טיפול PFA מצליב חלבונים בתוך תאי חיידקים כדי למנוע פעילות מטבולית תוך שמירה על מבנה התא ותכולת התזונה. שיטה זו היא בעלת תפוקה גבוהה וניתן להשתמש בה בתרבית נוזלית או בצלחות מוצקות, שכן בדיקת צלחת אחת של חיידקים שטופלו ב- PFA לגדילה מאמתת את כל האצווה. ניתן להשתמש בהשבתה מטבולית באמצעות טיפול PFA כדי לחסל את ההשפעות המבלבלות של מטבוליזם חיידקי על מחקרים של תוספי תרופות או מטבוליטים, עמידות ללחץ, מטבוליזם והתנהגות ב- C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans הוצע במקור כאורגניזם מודל בשנת 19651 ומאז אומץ באופן נרחב במחקרים על גנטיקה, התפתחות, התנהגות, הזדקנות ומטבוליזם2. בשל גודלם הגדול והציפורן השקופה שלהם, C. elegans מתאים במיוחד לסינון בתפוקה גבוהה עם כתבי פלורסנט3. מחזור החיים הקצר שלהם, הרבייה ההרמפרודיטית וההומולוגיה הגנטית שלהם עם בני אדם הופכים גם את C. elegans למערכת מודל רבת ערך למחקרים על התפתחות4 וביולוגיה של הזדקנות5. יתר על כן, C. elegans הם יחסית קל לתחזוקה. ניתן לגדל תולעים בתרבית נוזלית או על צלחות אגר מוצקות ולצרוך תזונה של חיידקי Escherichia coli OP50 חיים4.

עם זאת, מקור המזון החי של C. elegans יכול לבלבל מחקרים על חילוף חומרים, תוספי תרופות והתנהגות. מאחר שלחיידקים חיים יש חילוף חומרים משלהם, תנאי ניסוי שמשפיעים על החיידקים משנים גם את חומרי המזון והמטבוליטים הזמינים לתולעים. לדוגמה, להבדלים בריכוזי חיידקי ברזל, חומצות אמינו וחומצה פולית יש השפעות מגוונות על התפתחותו, הפיזיולוגיה ותוחלת החיים של C. elegans 6. שיטות מעבדה נפוצות רבות יכולות לגרום לשינויים כאלה בהרכב החומרים המזינים ובמטבוליטים המיוצרים על ידי OP50. באופן ספציפי, חשיפה ל-5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR), תרכובת נפוצה למניעת רבייה ב-C. elegans, מעוררת שינויים נרחבים בביטוי גנים מסוג OP50, כולל מסלולי ביוסינתזה של חומצות אמינו7. חיידקים חיים יכולים גם לבלבל מחקרים שבהם C. elegans מקבלים תוספת של מולקולות קטנות מכיוון שחיידקים יכולים לעכל באופן חלקי או מלא את החומרים הפעילים. יתר על כן, ההשפעות של מולקולות קטנות אלה על החיידקים יכולות, בתורן, לשנות את הפיזיולוגיה של C. elegans, כפי שדווח עם התרופה מאריכת תוחלת החיים מטפורמין8. לבסוף, חיידקים חיים יכולים לשנות את סביבת התולעת בדרכים שמשנות התנהגות, כגון הפרשת ריחות אטרקטיביים9, ייצור נוירומודולטורים אקסוגניים10 ויצירת שיפועי חמצן במדשאת חיידקים צפופה11.

כדי למתן את ההשפעות המבלבלות של מטבוליזם חיידקי על מחקר C. elegans , פותחו שיטות רבות להרג חיידקים (טבלה 1). שלוש אסטרטגיות נפוצות לחיסול OP50 הן הקרנת UV, הרג חום וטיפול אנטיביוטי. אמנם הן פשוטות וזולות יחסית, אך לכל אחת מהשיטות הללו יכולות להיות השפעות בלתי רצויות הן על חיידקים והן על C. elegans. הריגת UV באמצעות קרוסלינקר UV12 היא תפוקה נמוכה והקצב מוגבל על ידי מספר הלוחות שיכולים להתאים לקרוסלינקר UV. יתר על כן, היעילות של הרג UV יכולה להשתנות מצלחת לצלחת בתוך אצווה, ובדיקת צמיחה על כל הצלחות יכולה להיות קשה בניסויים גדולים. OP50 הורג חום על ידי חשיפת תרבית לטמפרטורות של >60 מעלות צלזיוס מגיע עם קבוצה נפרדת של אתגרים. חום גבוה עלול לפגוע בחומרים מזינים החיוניים לתולעת ולהרוס את המבנה התאי של החיידקים, וליצור מרקם רך יותר שמקטין את משך הזמן שהתולעים מבלות במזון13. שיטה זו גם אינה יכולה לשמש לאורך מחזור החיים של C. elegans מכיוון שתולעים הניזונות מחיידקים שנהרגו בחום יכולות לעצור בשלב מוקדם בהתפתחות13. טיפול אנטיביוטי הוא שיטה נפוצה שלישית לדיכוי חילוף החומרים של חיידקים14, אך אנטיביוטיקה יכולה גם לשנות את גדילת התולעים ואת חילוף החומרים15.

פתרון אחד לסילוק ההשפעות המטבוליות של חיידקים חיים תוך שמירה על מבנה החיידקים וחומרי המזון החיוניים הוא להרוג OP50 באמצעות פרפורמלדהיד (PFA)16. PFA הוא פולימר של פורמלדהיד שיכול להצליב חלבונים בתוך תאים17 כדי למנוע שכפול חיידקים מבלי להרוס מבני תאים פנימיים כמו קרום הפלזמה הפנימי18. בשל שימור זה של המבנה התאי הפנימי, חיידקים שטופלו ב-PFA אינם מפגינים גדילה או פעילות מטבולית, אך נשארים מקור מזון אכיל ועשיר בחומרים מזינים עבור C. elegans16. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק אשר מראה כיצד להשבית מטבולית חיידקים באמצעות paraformaldehyde.

שיטת חומרים נדרשים מדרגי? תזונתי? השפעות על תולעת?
UV UV-crosslinker מוגבל על ידי: כן השפעות משתנות על תוחלת החיים של NGM12, 23, 24
מספר צלחות שמתאימות לקרוסלינקר UV השפעות משתנות על תוחלת החיים ב-FUdR24, 26, 27
זמן הקרנה לצלחת ירידה בהעדפת מזון16
יכולת לבדוק כל צלחת לצמיחה8
חום אינקובטור >60 מעלות צלזיוס כן לא: הורס את דופן התא, יורד בערך התזונתי מעצר התפתחותי 13
ירידה בהעדפת מזון13
מאריך את תוחלת החיים של NGM31
אנטיביוטיקה אנטיביוטיקה (קנמיצין, קרבניצלין וכו ') כן כן מעכב צמיחה והתפתחות15
מאריך את תוחלת החיים במדיה נוזלית19
מאריך את תוחלת החיים של NGM15
פיפ"א 0.5% פרפורמאלדהיד כן כן הקטנת גודל ברוד קטן16
הגדלת זמן פיתוח קטנה16
ירידה בהעדפת מזון16

טבלה 1. השוואות של שיטות להרוג OP50. להרג קרינת UV, קוטל חום, טיפול אנטיביוטי וטיפול ב-PFA יש השפעות מגוונות על המצב התזונתי של החיידקים ועל בריאותם של תולעים הניזונות מחיידקים מטופלים. שיטות אלה להשבתה משכפלת של E. coli נבדלות גם בחומרים הנדרשים שלהן ובמדרגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חיסון חיידקים

  1. הכינו ציר לוריא (LB) על ידי המסת 10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים ו-10 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב-950 מ"ל מים מזוקקים.
  2. התאם את ה- pH של LB ל- 7.0 על ידי הוספת 5M נתרן הידרוקסידי (NaOH). זה צריך לדרוש רק כ 0.2 מ"ל של NaOH.
  3. בצע Autoclave של מדיית LB מותאמת pH במחזור נוזל למשך 45 דקות ב- 15 psi. אפשר לתמיסה להתקרר ולאחסן בטמפרטורת החדר.
  4. חסן מושבה אחת של חיידקים ב 100 מ"ל של LB בבקבוק Erlenmeyer 500 מ"ל. תרבית את החיידקים למשך הלילה באינקובטור שייקר של 37 מעלות צלזיוס.
  5. בהתאם לבריאות מושבת החיידקים, גודל הבקבוק והמהירות אליה מכוון השייקר, הזמן שלוקח לחיידקים לגדול עשוי להשתנות. לאחר ~14 שעות, בדוק את הצפיפות האופטית (OD) של החיידקים ב- 600 ננומטר (OD600).
  6. הסר את החיידקים מהשייקר כאשר OD600 הוא 3.0 (1 x 109 יחידות יוצרות מושבה (CFU)/מ"ל). אם OD600 קטן מ- 3.0, החזר את הבקבוק לאינקובטור השייקר עד שתגיע ל- OD הרצוי.
  7. Aliquot את החיידקים ב 50 מ"ל צינורות חרוטי ולאחסן ב 4 °C או להמשיך לשלב הבא.

2. עבודה עם paraformaldehyde

הערה: ריכוז הפרפורמאלדהיד (PFA) שבו נעשה שימוש, ומשך החשיפה עשויים להשתנות במידת מה בהתאם לאקלים, מיקום וסוג החיידקים המטופלים. נקודת התחלה טובה עבור OP50 היא חשיפה ל-0.5% PFA למשך שעה אחת, בעוד ש-0.25% PFA למשך שעה אחת עשוי להספיק עבור HT115.

  1. הכן מלאי PFA של 32% או השתמש בפתרון PFA 32% שנרכש באופן מסחרי. השתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) בעת עבודה עם PFA. יש ללבוש כפפות והגנה על העיניים.
  2. יש להוסיף PFA בתוך מכסה אדים כימי עם אוורור מתאים. יש להשליך את ה-PFA המכיל שטיפות וקצוות במיכלים מתאימים לסיכון כימי במכסה האדים.

3. טיפול חיידקי עם paraformaldehyde

  1. ברגע שהחיידקים מגיעים ל-OD600 של 3.0, השתמשו בפיפט סרולוגי כדי להעביר 50 מ"ל לתוך בקבוק חדש של 250 מ"ל Erlenmeyer. שמור את השאר עבור פקד חי, פקד מטופל דמה (ראה שלב 4), או כדי לטפל גם עם PFA לפי הצורך.
  2. הימנעו ממזיגה מבקבוק אחד למשנהו והיזהרו שלא להתיז את דפנות הבקבוק החדש בחיידקים. מושבות בצד הבקבוק עשויות לקבל מינון נמוך יותר של PFA.
  3. במכסה המנוע הכימי, הוסף 781 μL של 32% PFA לחיידקים 50 מ"ל כדי להביא את הריכוז הסופי ל -0.5%. יש להשליך את החוד המשמש במיכל מסוכן כימי מפסולת מוצקה.
  4. מכסים את הבקבוק בנייר כסף וחוזרים לאינקובטור השייקר של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר 1 שעה, להסיר את הבקבוק מן האינקובטור ולהמשיך לשלב 5.

4. שליטה מטופלת דמה

  1. ברגע שהחיידקים מגיעים ל-OD600 של 3.0, השתמשו בפיפט סרולוגי כדי להעביר 50 מ"ל של החיידק לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  2. המשך לשלב 5.3 כדי להשלים את שלבי הכביסה בדומה לקבוצה שטופלה ב- PFA.

5. שטיפת החיידקים כדי להסיר שאריות PFA

  1. במכסה המנוע הכימי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר את החיידקים המטופלים מבקבוק Erlenmeyer לצינור חרוטי 50 מ"ל. שימוש בפיפטה סרולוגית במקום לשפוך את החיידק ימנע זיהום מכל מושבות חיידקים בשולי הבקבוק שאולי נמנעו מטיפול ישיר ב- PFA.
  2. צנטריפוגה טיפלה בחיידקים בערך 3000 x גרם במשך 20 דקות. הסר את הסופרנאטנט על ידי השלכתו במיכל סיכון כימי לפסולת נוזלית במכסה המנוע הכימי.
  3. הוסף 25 מ"ל של LB ומערבולת כדי להשהות מחדש את הגלולה החיידקית (מילוי הצינור במלואו מקשה על השעיית הכדורית). צנטריפוגה חוזרת ומתלה כדורי 4x.
  4. השהה מחדש את הגלולה בנפחים אופטימליים לבדיקות שונות. עבור בדיקות תוחלת חיים, זרע 60 מ"מ לוחות עם 200 μL של חיידקים resuspended ב 10 מ"ל של LB. השעיה מחדש של החיידקים ב 10 מ"ל של LB מביא לריכוז 5x מן התרבית המקורית 50 מ"ל.
  5. אחסנו את החיידקים בטמפרטורה של 4°C.

6. בדיקת איכות של צמיחת חיידקים

  1. לאחר השטיפה הסופית וההשעיה, פזרו צלחת LB (באמצעות קצה פיפטה סטרילי) עם החיידקים המוכנים. זה נוהג טוב לפזר את LB המשמש לשטיפה ו resuspending על צלחת נפרדת, כמו גם כדי לוודא כי LB בשימוש לא היה מזוהם.
  2. מניחים את הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בדוק אם יש גידול. החיידקים נחשבים למתים באופן כפול כאשר מושבות אינן גדלות על צלחת LB.

7. בדיקת איכות חילוף החומרים של חיידקים באמצעות רספירומטר

  1. לאחר השטיפה הסופית וההשעיה משלב 5.4, ודא שהחיידקים מתים מטבולית באמצעות כלים זמינים כגון ספירומטרים19,20 ומדידת קצב צריכת החמצן הבסיסית (OCR).
  2. הכנת תמיסת M9: המסת 3 גרם אשלגן פוספט חד-בסיסי (KH 2 PO 4),6 גרם נתרן פוספט דיבסיסי (Na2HPO4), ו-5 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב-950 מ"ל מים מזוקקים. Autoclave על מחזור נוזל במשך 45 דקות ב 15 psi, ולאחר מכן לאפשר את הפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר. יש להוסיף 1 מ"ל של מגנזיום גופרתי בנפח 1 מ"מ (MgSO4) ולאחסן בטמפרטורת החדר.
  3. לחות את מחסנית הרספירומטר: הוסף 200 μL של כיול לכל הבארות של צלחת 96 בארות. מניחים את המחסנית בצלחת 96 בארות ודגרים למשך הלילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  4. כיול מבחן: ביום המחרת, הכנס את המחסנית המיובשת למכונה והתחל בכיול.
  5. הגדרת צלחת בדיקה: באמצעות צלחת חדשה של 96 בארות, הוסף 160 μL של M9 ו- 40 μL של החיידקים המוכנים (1 x 109 CFU/mL) כדי לבדוק בארות. הוסף 200 μL של M9 לארבע הבארות הפינתיות לשימוש כבארות ריקות. הוסף 160 μL של M9 ו- 40 μL של LB המשמש לשטיפה והשהייה מחדש לשימוש כבקרות שליליות. הוסף 200 μL של M9 לשאר הבארות שלא ישמשו.
  6. הפעל את הבדיקה: לאחר השלמת כיול המחסנית, הכנס את לוחית הבדיקה משלב 7.5 למכשיר לצורך ניתוח. ההגדרות כוללות שלבים לערבוב, המתנה, מדידה ולולאה. התוצאות יוצגו כקצב צריכת חמצן (OCR). החיידקים מתים מטבולית ומוכנים לשימוש כאשר זיהוי תווים אופטי (OCR) הוא אפס.

Figure 1
איור 1. זרימת עבודה לטיפול paraformaldehyde. מושבה אחת של חיידקי E. coli OP50 גדלה בן לילה. PFA מתווסף לריכוז סופי של 0.5%, והתרבית שטופלה ב- PFA מזועזעת במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, PFA מוסר על ידי שטיפת התרבית עם LB 5x טרי. כדי לוודא שהחיידקים המטופלים אינם פעילים באופן משכפל, הוציאו צלחת LB של החיידקים המטופלים וגדלו בן לילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זרימת עבודה מפורטת של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. שיטה בעלת תפוקה גבוהה פותחה ועברה אופטימיזציה כדי להשבית באופן עקבי שכפול חיידקים (איור 2A) ומטבוליזם (איור 2B) עבור מחקרים מטבוליים ותרופתיים במחקר C. elegans באמצעות פרפורמלדהיד16. המטרה הייתה לקבוע את הריכוז הנמוך ביותר של PFA הדרוש ואת משך הזמן הקצר ביותר הדרוש כדי להרוג את החיידקים באופן עקבי מבלי להשפיע על מדדי בריאות שונים בתולעים. ערכים אלה עשויים להשתנות ממקום למקום, בהתאם לסביבת המעבדה, ומזן חיידקי אחד למשנהו. לדוגמה, חשיפה של חיידקי HB101 ל-0.25% למשך שעה אחת מספיקה כדי להפוך אותם ללא פעילים מטבולית (איור 2C), בעוד ש-Enterococcus faecalis (EF) דורש ריכוז PFA של 1.0% (איור 2D) להשפעה עקבית. גישה לאופטימיזציה פרטנית של מעבדות נקבעה בעבר16 והיא מפורטת בעבודה הנוכחית.

משיכה וצריכה של מזון
כאשר חיידקים גדלים ומשתכפלים, הם משחררים מטבוליטים ופרומונים שונים המושכים את התולעים. כדי לקבוע אם התולעים נשארות נמשכות ל-OP50 שטופל ב-PFA, הצלחות נזרעו עם OP50 שטופל ב-PFA או טופל במדומה, ואחוז התולעים שנכחו על מדשאת המזון בהשוואה לדשא נבדק. הנתונים מראים שתולעים נמשכות ל-OP50 שטופל ב-PFA, מאחר שרוב התולעים נשארות על הדשא החיידקי אחרי שעה אחת (איור 3A), בדומה למה שנצפה בקבוצת הביקורת שטופלה בדמה (איור 3B). אולם, כצפוי, בדיקת זוג רגיש21 מראה של-C. elegans יש העדפה חזקה יותר לבקרה החיה שטופלה בדמה (איור 3C) כאשר הם נזרעים עם ה-PFA שטופל באותה צלחת. לאחר שהוכח כי תולעים נמשכות לחיידקים שהומתו על ידי PFA, אם כי פחות מחיידקים חיים, היה הכרחי לקבוע שהם אוכלים את המזון שהומת על ידי PFA. כדי לקבוע אם התולעים צורכות OP50 שטופל ב-PFA, נמדד קצב השאיבה של התולעים על סוגי מזון שונים. כפי שניתן לראות באיור 3D, לתולעים ב-OP50 שטופל ב-PFA יש קצב שאיבה גבוה יותר (+25%) מאשר לתולעים בקבוצת הביקורת שטופלה בדמה. זה מצביע על כך שתולעים אינן מאטות בכוונה את קצב האכילה שלהן על מזון שנהרג על ידי PFA, ויכול להצביע על קצב אכילה גבוה יותר או על תגובה מפצה לשינוי בקלות שאיבת המזון המטופל.

פריון, התפתחות ותוחלת חיים
לשינויים בתנאי המזון יכולות להיות השפעות פיזיולוגיות על תולעים13,22. כדי לבדוק השפעות רחבות נמדדו שינויים בקצב ההתפתחות, הפריון ותוחלת החיים. OP50 שטופל ב-PFA מעכב מעט את זמן ההתפתחות (~4 שעות) של תולעי Wildtype N2 כפי שמוצג באיור 4A. מעקב אחר יכולת הטלת הביצים של תולעים שגדלו בתנאים חיידקיים שונים מראה ירידה קלה אך משמעותית בצואה (21%-) בתולעים שניזונו מ-OP50 שטופל ב-PFA (איור 4B). עבור מעבדות המעוניינות בהזדקנות C. elegans, נקבעה ההשפעה של OP50 שטופל ב- PFA על אריכות ימים. באופן מעניין, תוחלת החיים של תולעי בר שניזונו מ-OP50 שטופל ב-PFA לא הייתה שונה באופן משמעותי מתולעים שניזונו מ-OP50 שטופל במדומה על לוחות סטנדרטיים של מדיה לגידול נמטודות (NGM) (איור 4C), אולם OP50 שטופל ב-PFA מאריך את תוחלת החיים של סוג הבר (+23%) כאשר קיים FUdR (איור 4D). הזנת OP50 שטופל ב-PFA בזן20 בעל ביטוי יתר של fmo-2 (OE) אינו משנה את תוחלת החיים שלו בהשוואה לתולעי בר (איור 4E). הודגם כי OP50 שהומת על-ידי קרינת UV, חום ואנטיביוטיקה משנים את תוחלת החיים של C. elegans. באופן ספציפי, דווח כי חיידקים שטופלו בקרינת UV מאריכים את תוחלת החיים ב-NGM12,23 וב-FUdR 24. עם זאת, ישנם נתונים סותרים על האינטראקציה של FUdR וחיידקים שהומתו על ידי UV25,26 שעשויים לנבוע משיטות מגוונות של הרג UV ותיקוף של חוסר פעילות מטבולית בחיידקים. בנוסף, חיידקים שהומתו בחום מאריכים את תוחלת החיים ב-NGM27, ואנטיביוטיקה מאריכה את תוחלת החיים ב-NGM15 ובתרבית נוזלית28.

Figure 2
איור 2. טיפול בחיידקים עם PFA מעכב שגשוג ומטבוליזם. (A) צמיחת חיידקים ביחידות יוצרות מושבה (CFU) של OP50 שטופל בדמה ו-0.5% טופל ב-PFA. (B) שיעור החמצה חוץ-תאי (ECAR) ב-mpH/min של OP50 שטופל במדומה וב-0.5% OP50 שטופל ב-PFA. (C) שיעור צריכת חמצן בסיסי (OCR) ב-pmol לדקה של HB101 שטופל ב-PM, ב-0.25% ב-PFA וב-0.5% ב-HB101 שטופל ב-PFA. (D) שיעור צריכת החמצן הבסיסית (OCR) ב-pmol לדקה של טיפול מדומה, 0.25% מטופל ב-PFA, 0.5% מטופל ב-PFA ו-1.0% אנטרוקוקוס פאקאליס (EF) שטופל ב-PFA. כל קווי השגיאה המוצגים באיורים מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM); מבחן T דו-זנבי שימש לגזירת ערכי P. מציין ערך p < 0.0001. נתון זה שונה מ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. תולעים נמשכות ל-OP50 שטופל ב-PFA. אחוז התולעים שנמשכות לדשא חיידקי OP50 שטופל ב-(A) ב-PFA או (B) טופל בלעג. (C) העדפת תולעים לבדיקת רגישות זוגית עבור OP50 שטופל במדומה וטופל ב-PFA. (D) קצב שאיבה (משאבות לכל 30 שניות) של תולעים ב-OP50 שטופל ב-PFA או טופל בדמה. ניתוח מבחן t דו-זנבי שימש כדי לגזור ערכי p עבור כל ההשוואות. כל קווי השגיאה המוצגים באיורים מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM); מציין ערך p < 0.0001. לוחות A-C שונו מ -16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. תולעים גדלות ומתפתחות על OP50 שטופל ב-PFA. (A) זמן התפתחות (h) של תולעים מבוגרים מטילי ביצים על OP50 שטופל במדומה וטופל ב-PFA. (B) צאצאים ממוצעים (מספר התולעים) של תולעים שניזונו מ-OP50 מדומה או מ-PFA. (ג, ד) אחוז החיים של תולעים שניזונו מ-OP50 שטופל במדומה או טופל ב-PFA על לוחות (C) NGM ו-(D) FUdR. (E) אחוז התולעים החיות מסוג בר ו-fmo-2 OE שניזונו מ-OP50 שטופל ב-PFA. ניתוח מבחן t דו-זנבי שימש לגזירת ערכי p לצורך השוואות התפתחות ופריון. מבחן דירוג היומן שימש לגזירת ערכי p להשוואות תוחלת חיים. כל קווי השגיאה המוצגים באיורים מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM); * מציין ערך p < 0.05, *** מציין ערך p <0.001, ו- **** מציין ערך p < 0.0001. לוחות A, B ו- D שונו מ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרונות של הרג PFA ביחס לשיטות הרג חיידקים אחרות
טיפול PFA הוא שיטה בעלת תפוקה גבוהה למניעת חילוף חומרים חיידקי תוך שמירה על מקור מזון מזין עבור C. elegans. להרג חיידקים באמצעות טיפול PFA יש יתרונות רבים על פני שיטות אחרות. שלא כמו טיפול UV, שבו כל צלחת חייבת להיבדק להרג מוצלח, צלחת אחת מאצווה של חיידקים שטופלו ב- PFA יכולה להיבדק כדי לאמת את אצווה16. טיפול ב-PFA הוא גם יעיל מאוד בסילוק חילוף החומרים של חיידקים (איור 2B), וחיידקים שטופלו ב-PFA מפגינים פעילות מטבולית מופחתת ביחס לחיידקים שטופלו באנטיביוטיקה19. יתרון נוסף של טיפול ב-PFA הוא שהחיידקים שומרים על המבנה התאי והפרופיל התזונתי שלהם. כתוצאה מכך, תולעים יכולות להתפתח על חיידקים שטופלו ב-PFA, בעוד שהזנת חיידקים שנהרגו בחום מביצים גורמת למעצר התפתחותי13,16.

שלבים קריטיים ופתרון בעיות
בעוד שחיידקים המטפלים ב-PFA הם פרוטוקול פשוט יחסית, חשוב לוודא שכל אצווה של חיידקים מתה מבחינה שכפול ומטבולית (שלבים 6 ו-7) ולוודא ששלבי השטיפה לאחר טיפול ב-PFA נעשים ביסודיות (שלב 5). אם מושבות אכן גדלות בשלב 6, מה שמעיד על כך שהחיידק אינו מת לחלוטין, ניתן לפתור את ריכוז ה-PFA ואת משך הטיפול ב-PFA בשלב 3. כאשר מיטוב פרוטוקול הטיפול ב-PFA, ריכוז של 0.5% של PFA היה אידיאלי לחיסול מוצלח של OP50 עם תופעות לוואי מינימליות. 0.25% PFA לא הספיק כדי להרוג מטבולית את כל זני החיידקים (איור 2C-D), והעלאת הריכוז ל-0.5% PFA לא שינתה את זמן ההתפתחות, תוחלת החיים או העדפת המזון של תולעים ב-OP50 ביחס ל-0.25% PFA. כמו כן, שעה אחת של חיסון עם PFA היה הזמן הקצר ביותר מספיק כדי למנוע את כל צמיחת חיידקים. אם חיידקים לא נהרגים לחלוטין על ידי חיסון של שעה אחת עם 0.5% PFA, ניתן להגדיל את זמן החיסון ו / או ריכוז PFA כדי לפתור בעיות יעילות ההרג. שלב מפתח שני בפרוטוקול הוא שטיפת החיידקים לאחר טיפול PFA (שלב 5). חשוב מאוד להשלים את כל חמש השטיפות ולהסיר לחלוטין את הסופרנאטנט בכל שטיפה כדי להבטיח שלא יישאר פורמלדהיד בחיידקים. אם התולעים אינן גדלות היטב או אינן שואבות על החיידקים שטופלו ב- PFA, ניתן לבצע שטיפות נוספות.

מגבלות השיטה
בעוד שחיידקים שהומתו על-ידי PFA אידיאליים לסילוק ההשפעות המבלבלות של מטבוליזם חיידקי (איור 2B) ממחקרי C. elegans, לשיטה זו יש מגבלות. באופן ספציפי, ל-C. elegans יש התפתחות מעט איטית יותר של חיידקים שטופלו ב-PFA בהשוואה לחיידקים חיים (איור 4A)16. טיפול ב-PFA גם מאריך את תוחלת החיים של תולעים אם קיים FUdR (איור 4D), אבל לא על לוחות NGM (איור 4C)16. עם זאת, גם שיטות אחרות מציבות אתגרים אלה; חיידקים שהומתו על-ידי קרינת על-סגול משנים גם את תוחלת החיים של C. elegans. רוב הדיווחים מצביעים על כך שחיידקים שטופלו ב- UV מאריכים את תוחלת החיים של תולעים ב- NGM12,23 וב- FUdR 24, כאשר מחקרים אחרים מצביעים על כך שטיפול ב- UV אינו משפיע על תוחלת החיים 24 וכי קיימת אינטראקציה בין טיפול UV ו- FUdR בתוחלת החיים של C. elegans 25,26. בנוסף להשפעות על תוחלת החיים של חיידקים שטופלו ב-PFA, תולעים מעדיפות להקדיש זמן לחיידקים חיים יחסית לחיידקים שטופלו ב-PFA (איור 3C)16, אבל יש להן קצב שאיבה גבוה יותר על המזון שטופל ב-PFA (איור 3D). זה מצביע על כך שהם עשויים לצרוך כמות דומה של מזון או שחיידקים שטופלו ב- PFA קלים או קשים יותר לאכילה. רבות מההשפעות הללו נצפות גם בשיטות אחרות להרג חיידקים12,13,14, דבר המצביע על כך שחיידקים פעילים מטבולית מקצרים את זמן ההתפתחות, מקצרים את תוחלת החיים ומושכים יותר את C. elegans.

יישומים פוטנציאליים של חיידקים שטופלו ב-PFA
בסך הכל, ליכולת להרוג במהירות ובאמינות קבוצות גדולות של חיידקים יש פוטנציאל גדול לחיסול ההשפעות המבלבלות של מטבוליזם חיידקי במחקרי C. elegans. יכולת זו שימושית במיוחד עבור מסכי תרופות, ניסויי תוספים, בדיקות רעילות, מחקרים מטבוליים, ובחינת ההשפעות של מטבוליזם מיקרוביאלי על התנהגות המאכסן. מידע נוסף על השימוש בחיידקים שטופלו ב-PFA בכל אחד מהיישומים הללו מופיע להלן.

ניסויי תרופות, תוספים ורעילות: מאחר שיש לבדוק רק צלחת אחת לכל אצווה של חיידקים שטופלו ב-PFA כדי להרוג את הצלחתם, ניתן להוסיף חיידקים שהומתו על-ידי PFA לתרבית נוזלית לצורך סינון תרופות בתפוקה גבוהה. ניתן גם לזרוע חיידקים שטופלו ב-PFA על צלחות מוצקות עם מולקולות קטנות או חומרים מזינים המשולבים במצע האגר. צלחות מוצקות שנזרעו עם חיידקים שטופלו ב-PFA יכולות להיות שימושיות גם למבחני רעילות או תגובת לחץ. נתונים שלא פורסמו מצביעים על כך שחיידקים שטופלו ב-PFA יכולים לעזור להבחין בין התפקיד של מסלולי תגובת עקה חיידקיים לבין מסלולי עמידות לעקה של תולעים בעמידות לפרקוואט ולטוניקמיצין. שימוש בחיידקים שהומתו על-ידי PFA במחקרי תוספי תרופות ורעילות אלה ימנע מחיידקים לעכל את המולקולה המעניינת ויבטיח שכל פנוטיפ שנצפה נובע מתרכובת הפועלת ישירות על C. elegans. שימוש בחיידקים מתים מטבולית לניסויים בתרופות ובתוספי מזון גם ממזער את השונות במינון, שכן חיידקים חיים יכולים לעכל כמויות שונות של תרכובת העניין מניסוי לניסוי.

מחקרים מטבולומיים: מחקרי מטבולומיקה של C. elegans יכולים להתבלבל גם על ידי מטבוליזם חיידקי: התבוננות בשינויים במטבוליזם של תולעים דורשת היעדר פעילות מטבולית חיידקית29. אפילו שינויים קטנים במקור המזון החיידקי יכולים לשנות את חילוף החומרים של התולעת. לדוגמה, חילוף החומרים של תולעים הניזונות מחיידקים שטופים חיים שונה מהמטבוליזם של תולעים הניזונות מחיידקים חיים לא שטופים16. צריכת חיידקים שטופלו ב-PFA משנה גם את חילוף החומרים של התולעים ביחס לצריכת מזון חי16 אך מאפשרת השוואה בין ההשפעות של תנאי ניסוי על חילוף החומרים של C. elegans בבידוד מחילוף החומרים של חיידקים.

מחקרים התנהגותיים בין חיידקים מארחים: לבסוף, חיידקים שטופלו ב-PFA יכולים לשמש לזיהוי אינטראקציות בין חילוף החומרים של החיידקים לבין התנהגות המארח. מטבוליטים המופרשים על ידי חיידקים פתוגניים ולא פתוגניים יכולים להיות אטרקטיביים או דוחים לתולעים כדי להשפיע על התנהגות הליקוט וההזנה שלהם10,11,30. יתר על כן, חיידקים יכולים לייצר נוירומודולטורים המניעים שינויים בתנועה30. נוסף על כך, גידול C. elegans על זנים שונים של חיידקים גורם לשינוי בגודל החיידק, בזמן ההתפתחות ובפיזיולוגיה31,32. טיפול בחיידקים אלה עם PFA יכול לעזור לקבוע אם ההשפעות של חיידק נתון על C. elegans דורשות מטבוליזם חיידקי פעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי NIH R21AG059117 ומעבדות פול פ. גלן לביולוגיה של חקר ההזדקנות באוניברסיטת מישיגן. SB מומן על ידי T32AG000114. ESK מומנה על ידי NSF DGE 1841052.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum Foil Staples 2549291
Bunsen burner VWR 470121-700 
Cell Density Meter Denville 80-3000-45 
Centrifuge Eppendorg 5430
Chemical fume hood Labcono 975050411384RG
Conincal tubes (50 mL) Fisher 339652
Cuvettes  Fisher 14-955-127
E. coli OP50 CGC OP50
Erlenmyer flasks Fisher 250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Inoculation loop Fisher 22-363-605
LB Agar Fisher BP1425500
Liquid waste collection bottle Thomas Scientific 1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M7506
Paraformaldehyde (32%) Electron Microscopy Sciences 15714-S Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor Eppendorf Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm) Fisher FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher P2853
Seahorse XF Calibrant Agilent 100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate Agilent 101085-004
Serological pipettes (50 mL) Genesee Scientific 12-107
Shaker incubator Thermo 11 676 083
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Sigma S374-500
Solid waste collection bucket M&M Industries  5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone Genesee Scientific 20-251
Vortex Thermo 11676331
Weighing balance C Goldenwall HZ10K6B
Yeast Extract Genesee Scientific 20-255

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  3. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
  4. Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
  5. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  6. Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
  7. McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
  8. Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
  9. Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
  10. Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
  11. Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
  12. Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
  13. Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
  14. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  15. Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
  16. Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
  17. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  18. Felix, H. Permeabilized and immobilized cells. Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).
  19. Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
  20. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  21. Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
  22. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  23. Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
  24. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  25. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  26. Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
  27. Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
  28. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
  29. Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
  30. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  31. Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
  32. Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).

Tags

חיידקים מושבתים מטבולית Caenorhabditis elegans מחקר מחקר גנטי מחקר פיתוח מחקר הזדקנות מחקר מטבוליזם מחקר התנהגות מטבוליזם חיידקי הקרנת UV קוטל חום אנטיביוטיקה טיפול PFA טיפול paraformaldehyde שיטת תפוקה גבוהה
מתודולוגיה להשבתה מטבולית של חיידקים למחקר <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., … More

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., Huang, S., Leiser, S. F. Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research. J. Vis. Exp. (197), e65775, doi:10.3791/65775 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter