Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

केनोरहाब्डिस एलिगेंस रिसर्च के लिए बैक्टीरिया को चयापचय रूप से निष्क्रिय करने की पद्धति

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65775
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

प्रयोगशाला में केनोरहाब्डिस एलिगेंस के लिए खाद्य स्रोत जीवित एस्चेरिचिया कोलाई है। चूंकि बैक्टीरिया चयापचय रूप से सक्रिय होते हैं, इसलिए वे सी एलिगेंस में चयापचय और दवा अध्ययन में एक भ्रमित चर प्रस्तुत करते हैं।पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करके बैक्टीरिया को चयापचय रूप से निष्क्रिय करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल यहां वर्णित है।

Abstract

केनोरहाब्डिस एलिगेंस आनुवंशिकी, विकास, उम्र बढ़ने, चयापचय और व्यवहार में अनुसंधान के लिए एक सामान्य मॉडल जीव है। एलिगेंस जीवित बैक्टीरिया के आहार का उपभोग करते हैं, उनके खाद्य स्रोत की चयापचय गतिविधि कीड़े पर विभिन्न हस्तक्षेपों के प्रत्यक्ष प्रभावों की तलाश में प्रयोगों को भ्रमित कर सकती है। बैक्टीरियल चयापचय के भ्रामक प्रभावों से बचने के लिए, सी एलिगेंस शोधकर्ताओं ने पराबैंगनी (यूवी)-विकिरण, गर्मी-हत्या और एंटीबायोटिक दवाओं सहित बैक्टीरिया को चयापचय रूप से निष्क्रिय करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया है। यूवी उपचार अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट है और तरल संस्कृति में इसका उपयोग नहीं किया जा सकता है क्योंकि प्रत्येक प्लेट को सफल जीवाणु हत्या के लिए जांच की जानी चाहिए। एक दूसरी उपचार विधि, हीट-किलिंग, बैक्टीरिया की बनावट और पोषण की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करती है, जिससे सी एलिगेंस की विकासात्मक गिरफ्तारी होती है। अंत में, एंटीबायोटिक उपचार बैक्टीरिया के विकास को रोकने के अलावा सी एलिगेंस फिजियोलॉजी को सीधे बदल सकता है। यह पांडुलिपि पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करके बैक्टीरिया को चयापचय रूप से निष्क्रिय करने के लिए एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करती है। पीएफए उपचार सेलुलर संरचना और पोषण सामग्री को संरक्षित करते हुए चयापचय गतिविधि को रोकने के लिए बैक्टीरिया कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन को क्रॉस-लिंक करता है। यह विधि उच्च-थ्रूपुट है और इसका उपयोग तरल संस्कृति या ठोस प्लेटों में किया जा सकता है, क्योंकि विकास के लिए पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया की एक प्लेट का परीक्षण पूरे बैच को मान्य करता है। पीएफए उपचार के माध्यम से चयापचय निष्क्रियता का उपयोग सी एलिगेंस में दवा या मेटाबोलाइट पूरक, तनाव प्रतिरोध, मेटाबोलॉमिक्स और व्यवहार के अध्ययन पर जीवाणु चयापचय के भ्रामक प्रभावों को खत्म करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

केनोरहाब्डिस एलिगेंस को मूल रूप से 1965 1 में एक मॉडल जीव के रूप में प्रस्तावित किया गया था और तब से आनुवंशिकी, विकास, व्यवहार, उम्रबढ़ने और चयापचय के अध्ययन में व्यापक रूप से अपनाया गया है। अपने बड़े ब्रूड आकार और पारदर्शी छल्ली के कारण, सी एलिगेंस फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स3 के साथ उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से अनुकूल है। उनका छोटा जीवन चक्र, हेर्मेथ्रोडिटिक प्रजनन और मनुष्यों के साथ आनुवंशिक होमोलॉजी भी सी एलिगेंस को विकास4 और उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान5 पर अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली बनाती है। इसके अलावा, सी एलिगेंस को बनाए रखना अपेक्षाकृत आसान है। कीड़े तरल संस्कृति में या ठोस आगर प्लेटों पर उगाए जा सकते हैं और जीवित एस्चेरिचिया कोलाई ओपी 50बैक्टीरिया 4 के आहार का उपभोग कर सकते हैं।

एलिगेंस का जीवित खाद्य स्रोत चयापचय, दवा पूरकता और व्यवहार के अध्ययन को भ्रमित कर सकता है। क्योंकि जीवित बैक्टीरिया का अपना चयापचय होता है, बैक्टीरिया को प्रभावित करने वाली प्रयोगात्मक स्थितियां कीड़े के लिए उपलब्ध पोषक तत्वों और चयापचयों को भी बदल देती हैं। उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल आयरन, अमीनो एसिड और फोलेट सांद्रता में अंतर सी एलिगेंस के विकास, शरीर विज्ञान और जीवनकाल6 पर विविध प्रभाव डालता है। कई सामान्य प्रयोगशाला प्रथाएं ओपी 50 द्वारा उत्पादित पोषक तत्व संरचना और मेटाबोलाइट्स में इस तरह के परिवर्तन प्राप्त कर सकती हैं। विशेष रूप से, 5-फ्लोरो -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (एफयूडीआर) के संपर्क में, एक यौगिक जो आमतौर पर सी एलिगेंस में प्रजनन को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है, ओपी 50 जीन अभिव्यक्ति में व्यापक परिवर्तन प्राप्त करता है, जिसमें अमीनो एसिड बायोसिंथेसिस मार्ग7 शामिल हैं। जीवित बैक्टीरिया उन अध्ययनों को भी भ्रमित कर सकते हैं जिनमें सी एलिगेंस को छोटे अणुओं के साथ पूरक किया जाता है क्योंकि बैक्टीरिया सक्रिय यौगिकों को आंशिक रूप से या पूरी तरह से चयापचय कर सकते हैं। इसके अलावा, बैक्टीरिया पर इन छोटे अणुओं के प्रभाव, बदले में, सी एलिगेंस फिजियोलॉजी को बदल सकते हैं, जैसा कि जीवनकाल-विस्तारित दवा मेटफॉर्मिन8 के साथ बताया गया था। अंत में, जीवित बैक्टीरिया कृमि के वातावरण को उन तरीकों से बदल सकते हैं जो व्यवहार को बदलते हैं, जैसे कि आकर्षक गंधकों को स्रावित करना9, बहिर्जात न्यूरोमोड्यूलेटर10 का उत्पादन करना, और घने बैक्टीरिया लॉन11 में ऑक्सीजन ग्रेडिएंट बनाना।

एलिगेंस अनुसंधान पर जीवाणु चयापचय के भ्रामक प्रभावों को कम करने के लिए, बैक्टीरिया को मारने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं (तालिका 1)। ओपी 50 को मारने के लिए तीन सामान्य रणनीतियां यूवी-विकिरण, गर्मी-हत्या और एंटीबायोटिक उपचार हैं। जबकि सीधा और अपेक्षाकृत कम लागत वाला, इनमें से प्रत्येक विधि बैक्टीरिया और सी एलिगेंस दोनों पर अवांछनीय प्रभाव डाल सकती है। यूवी क्रॉसलिंकर12 के माध्यम से यूवी-किलिंग कम-थ्रूपुट है और दर उन प्लेटों की संख्या से सीमित है जो यूवी क्रॉसलिंकर में फिट हो सकती हैं। इसके अलावा, यूवी-किलिंग की प्रभावकारिता एक बैच के भीतर प्लेट से प्लेट में भिन्न हो सकती है, और सभी प्लेटों पर विकास के लिए परीक्षण बड़े प्रयोगों में मुश्किल हो सकता है। >60 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर संस्कृति को उजागर करके हीट-किलिंग ओपी 50 चुनौतियों का एक अलग सेट आता है। उच्च गर्मी कीड़े के लिए आवश्यक पोषक तत्वों को नुकसान पहुंचा सकती है और बैक्टीरिया की सेलुलर संरचना को नष्ट कर सकती है, जिससे एक नरम बनावट बनती हैजो कीड़े को भोजन पर खर्च करने की मात्रा को कम करती है। एलिगेंस के पूरे जीवन चक्र में इस विधि का भी उपयोग नहीं किया जा सकता है क्योंकि गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया को खिलाए गए कीड़ेविकास में जल्दी गिरफ्तार हो सकते हैं। एंटीबायोटिक उपचार बैक्टीरिया चयापचय को दबाने के लिए एक तीसरी आम विधि है14, लेकिन एंटीबायोटिक्स कृमि वृद्धि और चयापचयको भी बदल सकते हैं।

बैक्टीरिया संरचना और आवश्यक पोषक तत्वों को संरक्षित करते हुए जीवित बैक्टीरिया के चयापचय प्रभाव को खत्म करने का एक समाधान पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) 16 के साथ ओपी 50 को मारना है। पीएफए फॉर्मलाडेहाइड का एक बहुलक है जो आंतरिक प्लाज्मा झिल्ली18 जैसी आंतरिक कोशिका संरचनाओं को नष्ट किए बिना बैक्टीरिया प्रतिकृति को रोकने के लिए कोशिकाओं17 के भीतर प्रोटीन को क्रॉसलिंक कर सकता है। आंतरिक सेलुलर संरचना के इस संरक्षण के कारण, पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया कोई विकास या चयापचय गतिविधि प्रदर्शित नहीं करते हैं, लेकिन सी एलिगेंस16 के लिए एक खाद्य और पोषक तत्वों से भरपूर खाद्य स्रोत बने रहते हैं। यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है जो दिखाता है कि पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करके बैक्टीरिया को चयापचय रूप से कैसे निष्क्रिय किया जाए।

विधि आवश्यक सामग्री स्केलेबल? पोषण संबंधी? कीड़े पर प्रभाव?
यूवी यूवी-क्रॉसलिंकर द्वारा सीमित: हाँ एनजीएम12, 23, 24 पर जीवनकाल पर परिवर्तनीय प्रभाव।
यूवी-क्रॉसलिंकर में फिट होने वाली प्लेटों की संख्या FUdR24, 26, 27 पर जीवनकाल पर परिवर्तनीय प्रभाव।
विकिरण समय प्रति प्लेट भोजन वरीयता में कमी16
विकास के लिए हर प्लेट की जांच करने की क्षमता8
गर्मी >60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर हाँ नहीं: सेल की दीवार को नष्ट करता है, पोषण मूल्य में कमी आई है विकासात्मक गिरफ्तारी 13
भोजन वरीयता में कमी13
एनजीएम31 पर जीवनकाल बढ़ाता है
एंटीबायोटिक दवाओं एंटीबायोटिक्स (कनामाइसिन, कार्बेनिसिलिन, आदि) हाँ हाँ वृद्धि और विकास में देरी15
तरल मीडिया में जीवनकाल बढ़ाता है19
एनजीएम15 पर जीवनकाल बढ़ाता है
पीएफए 0.5% पैराफॉर्मलडिहाइड हाँ हाँ छोटे ब्रूड आकारमें कमी 16
छोटे विकास समय में वृद्धि16
भोजन वरीयता में कमी16

तालिका 1. ओपी 50 को मारने के तरीकों की तुलना। यूवी-किलिंग, हीट-किलिंग, एंटीबायोटिक-उपचार और पीएफए-उपचार का बैक्टीरिया की पोषण संबंधी स्थिति और उपचारित बैक्टीरिया को खिलाए गए कीड़े के स्वास्थ्य पर विभिन्न प्रभाव पड़ता है। ई कोलाई को निष्क्रिय करने के लिए ये विधियां उनकी आवश्यक सामग्री और स्केलेबिलिटी में भी भिन्न होती हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. बैक्टीरिया टीकाकरण

  1. 950 मिलीलीटर आसुत जल में 10 ग्राम ट्रिप्टोन, 5 ग्राम खमीर अर्क और 10 ग्राम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) को घोलकर लुरिया शोरबा (एलबी) तैयार करें।
  2. 5 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच) जोड़कर एलबी के पीएच को 7.0 में समायोजित करें। इसके लिए केवल लगभग 0.2 एमएल एनएओएच की आवश्यकता होनी चाहिए।
  3. 15 पीएसआई पर 45 मिनट के लिए तरल चक्र पर पीएच-समायोजित एलबी मीडिया को ऑटोक्लेव करें। घोल को ठंडा होने दें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  4. 500 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 100 एमएल एलबी में बैक्टीरिया की एक कॉलोनी को टीका लगाएं। बैक्टीरिया को 37 डिग्री सेल्सियस शेकर इनक्यूबेटर में रात भर कल्चर करें।
  5. बैक्टीरियल कॉलोनी के स्वास्थ्य के आधार पर, फ्लास्क का आकार और शेकर को सेट करने की गति, बैक्टीरिया को बढ़ने में लगने वाला समय भिन्न हो सकता है। ~ 14 घंटे के बाद, 600 एनएम (ओडी600) पर बैक्टीरिया के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) की जांच करें।
  6. जब OD600 3.0 (1 x 109 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयाँ (CFU)/mL) हो तो शेकर से बैक्टीरिया को हटा दें। यदि ओडी600 3.0 से कम है, तो वांछित ओडी तक पहुंचने तक फ्लास्क को शेकर इनक्यूबेटर में वापस कर दें।
  7. बैक्टीरिया को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में एलिकोट करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या अगले चरण में आगे बढ़ें।

2. पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ काम करना

नोट: उपयोग किए जाने वाले पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) की एकाग्रता, और एक्सपोजर की अवधि जलवायु, स्थान और इलाज किए जा रहे बैक्टीरिया के प्रकार के आधार पर कुछ हद तक भिन्न हो सकती है। ओपी 50 के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु 1 घंटे के लिए 0.5% पीएफए का जोखिम है, जबकि 1 घंटे के लिए 0.25% पीएफए एचटी 115 के लिए पर्याप्त हो सकता है।

  1. 32% पीएफए स्टॉक तैयार करें या व्यावसायिक रूप से खरीदे गए 32% पीएफए समाधान का उपयोग करें। पीएफए के साथ काम करते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें। दस्ताने और आंखों की सुरक्षा पहनें।
  2. उचित वेंटिलेशन के साथ एक रासायनिक फ्यूम हुड के अंदर पीएफए जोड़ें। फ्यूम हुड में उचित रासायनिक खतरे वाले कंटेनरों में वॉश और टिप्स युक्त पीएफए का निपटान करें।

3. पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ जीवाणु उपचार

  1. एक बार जब बैक्टीरिया 3.0 के ओडी600 तक पहुंच जाता है, तो 50 एमएल को एक नए 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में स्थानांतरित करने के लिए सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। बाकी को लाइव कंट्रोल, मॉक-ट्रीटेड कंट्रोल (चरण 4 देखें) के लिए सहेजें, या आवश्यकतानुसार पीएफए के साथ भी इलाज करें।
  2. एक फ्लास्क से दूसरे फ्लास्क पर डालने से बचें और सतर्क रहें कि बैक्टीरिया के साथ नए फ्लास्क के किनारों पर छींटे न डालें। फ्लास्क के किनारे की कॉलोनियों को पीएफए की कम खुराक मिल सकती है।
  3. रासायनिक हुड में, अंतिम एकाग्रता को 0.5% तक लाने के लिए 50 एमएल बैक्टीरिया में 32% पीएफए के 781 μL जोड़ें। एक ठोस अपशिष्ट रासायनिक खतरे कंटेनर में उपयोग की जाने वाली नोक का निपटान करें।
  4. फ्लास्क को पन्नी के साथ कवर करें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस शेकर इनक्यूबेटर पर लौटें। 1 घंटे के बाद, फ्लास्क को इनक्यूबेटर से हटा दें और चरण 5 पर आगे बढ़ें।

4. मॉक-ट्रीटेड कंट्रोल

  1. एक बार जब बैक्टीरिया 3.0 के ओडी600 तक पहुंच जाता है, तो 50 एमएल बैक्टीरिया को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
  2. पीएफए-उपचारित समूह के समान धोने के चरणों को पूरा करने के लिए चरण 5.3 पर आगे बढ़ें।

5. अवशिष्ट पीएफए को हटाने के लिए बैक्टीरिया को धोना

  1. रासायनिक हुड में, एर्लेनमेयर फ्लास्क से 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इलाज किए गए बैक्टीरिया को स्थानांतरित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। बैक्टीरिया डालने के बजाय एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग फ्लास्क के किनारे पर किसी भी जीवाणु कालोनियों से संदूषण को रोक देगा जो पीएफए के साथ सीधे उपचार से बच सकता है।
  2. सेंट्रीफ्यूज ने 20 मिनट के लिए लगभग 3000 x g पर बैक्टीरिया का इलाज किया। रासायनिक हुड में तरल अपशिष्ट रासायनिक खतरे कंटेनर में निपटान करके सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  3. बैक्टीरियल गोली को फिर से निलंबित करने के लिए 25 एमएल एलबी और भंवर जोड़ें (ट्यूब को पूरी तरह से भरने से गोली को फिर से निलंबित करना कठिन हो जाता है)। सेंट्रीफ्यूजेशन और पेलेट रिसस्पेंशन को 4 गुना दोहराएं।
  4. विभिन्न परखों के लिए इष्टतम मात्रा में गोली को पुन: निलंबित करें। जीवनकाल के लिए, बीज 60 मिमी प्लेटों में 200 μL बैक्टीरिया के साथ 10 mL LB में पुन: निलंबित किया जाता है। LB के 10 mL में बैक्टीरिया को निलंबित करने से मूल 50 mL संस्कृति से 5x सांद्रता होती है।
  5. बैक्टीरिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. बैक्टीरिया के विकास की गुणवत्ता की जांच

  1. अंतिम धोने और पुन: निलंबन के बाद, तैयार बैक्टीरिया के साथ एक एलबी प्लेट (बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करके) को लकीर करें। धोने और हटाने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले एलबी को एक अलग प्लेट पर लकीर करना अच्छा अभ्यास है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इस्तेमाल किया गया एलबी दूषित नहीं था।
  2. प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। किसी भी विकास की जांच करें। बैक्टीरिया को प्रतिकृति रूप से मृत माना जाता है जब एलबी प्लेट पर कॉलोनियां नहीं बढ़ती हैं।

7. श्वासयंत्र का उपयोग करके जीवाणु चयापचय के लिए गुणवत्ता की जांच

  1. चरण 5.4 से अंतिम धोने और पुन: निलंबन के बाद, पुष्टि करें कि बैक्टीरिया उपलब्ध उपकरणों जैसे श्वसनयंत्र19,20 और बेसल ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) को मापने का उपयोग करके चयापचय रूप से मृत हैं।
  2. एम 9 समाधान तैयार करें: 3 ग्राम पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबैसिक (केएच 2 पीओ 4), 6 ग्राम सोडियमफॉस्फेट डिबासिक (एनए2एचपीओ4), और 5 ग्राम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) को 950 एमएल आसुत जल में घोलें। 15 पीएसआई पर 45 मिनट के लिए तरल चक्र पर आटोक्लेव, फिर समाधान को कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें। 1 एम मैग्नीशियम सल्फेट (एमजीएसओ4) के 1 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  3. रेस्पिरोमीटर कारतूस को हाइड्रेट करें: 96-वेल प्लेट के सभी कुओं में 200 μL कैलिब्रांट जोड़ें। कारतूस को 96-वेल प्लेट में रखें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. परख अंशांकन: अगले दिन, मशीन में हाइड्रेटेड कारतूस रखें और अंशांकन शुरू करें।
  5. परख परीक्षण प्लेट सेटअप: एक नई 96-वेल प्लेट का उपयोग करके, कुओं का परीक्षण करने के लिए एम 9 के 160 μL और प्रीपेप्ड बैक्टीरिया (1 x 109 CFU / mL) के 40 μL जोड़ें। रिक्त कुओं के रूप में उपयोग करने के लिए 4 कोने कुओं में M9 के 200 μL जोड़ें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए धोने और निलंबित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले 160 μL M9 और 40 μL LB जोड़ें। बाकी कुओं में 200 μL M9 जोड़ें जिनका उपयोग नहीं किया जाएगा।
  6. परख चलाएं: एक बार कारतूस अंशांकन पूरा हो जाने के बाद, विश्लेषण के लिए मशीन में चरण 7.5 से परख प्लेट डालें। सेटिंग्स में मिश्रण, प्रतीक्षा करने, मापने और लूप करने के चरण शामिल हैं। परिणाम ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के रूप में दिखाए जाएंगे। बैक्टीरिया चयापचय रूप से मृत होते हैं और ओसीआर शून्य होने पर उपयोग करने के लिए तैयार होते हैं।

Figure 1
चित्र 1. पैराफॉर्मलडिहाइड उपचार के लिए वर्कफ़्लो। ई कोलाई ओपी 50 बैक्टीरिया की एक एकल कॉलोनी रातोंरात उगाई जाती है। पीएफए को 0.5% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ा जाता है, और पीएफए-उपचारित संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए हिलाया जाता है। अंत में, पीएफए को ताजा एलबी 5 एक्स के साथ संस्कृति को धोकर हटा दिया जाता है। यह पुष्टि करने के लिए कि इलाज किए गए बैक्टीरिया प्रतिकृति रूप से निष्क्रिय हैं, इलाज किए गए बैक्टीरिया की एक एलबी प्लेट को बाहर निकालें और रात भर बढ़ें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रोटोकॉल का एक विस्तृत वर्कफ़्लो चित्र 1 में दिखाया गया है। पैराफॉर्मलडिहाइड16 का उपयोग करके सी एलिगेंस अनुसंधान में चयापचय और दवा अध्ययन के लिए बैक्टीरिया प्रतिकृति (चित्रा 2 ए) और चयापचय (चित्रा 2 बी) को लगातार निष्क्रिय करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि विकसित और अनुकूलित की गई थी। लक्ष्य कीड़े में स्वास्थ्य के विभिन्न उपायों को प्रभावित किए बिना बैक्टीरिया को लगातार मारने के लिए आवश्यक पीएफए की सबसे कम सांद्रता और कम से कम समय निर्धारित करना था। ये मान प्रयोगशाला के वातावरण के आधार पर एक स्थान से दूसरे स्थान पर भिन्न हो सकते हैं, और एक जीवाणु तनाव से दूसरे में भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, 1 घंटे के लिए 0.25% तक एचबी 101 बैक्टीरिया का जोखिम इसे चयापचय रूप से निष्क्रिय करने के लिए पर्याप्त है (चित्रा 2 सी), जबकि एंटरोकोकस फिलिस (ईएफ) को लगातार प्रभाव के लिए 1.0% पीएफए एकाग्रता (चित्रा 2 डी) की आवश्यकता होती है। व्यक्तिगत प्रयोगशाला अनुकूलन के लिए एक दृष्टिकोण पहले16 स्थापित किया गया था और इस वर्तमान काम में विस्तृत है।

भोजन आकर्षण और खपत
जैसे-जैसे बैक्टीरिया बढ़ते हैं और प्रतिकृति करते हैं, वे विभिन्न मेटाबोलाइट्स और फेरोमोन जारी करते हैं जो कीड़े के लिए आकर्षक होते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कीड़े पीएफए-उपचारित ओपी 50 के प्रति आकर्षित रहते हैं, प्लेटों को पीएफए-उपचारित या मॉक-ट्रीटेड ओपी 50 के साथ बीज दिया गया था और लॉन की तुलना में खाद्य लॉन पर मौजूद कीड़े का प्रतिशत सारणीबद्ध किया गया था। डेटा से पता चलता है कि कीड़े पीएफए-उपचारित ओपी 50 की ओर आकर्षित होते हैं, क्योंकि अधिकांश कीड़े 1 घंटे (चित्रा 3 ए) के बाद बैक्टीरिया के लॉन में रहते हैं, जैसा कि मॉक-ट्रीटेड कंट्रोल (चित्रा 3 बी) के साथ देखा जाता है। हालांकि, जैसा कि अपेक्षित था, एक संवेदनशील जोड़ीवार परख21 से पता चलता है कि सी एलिगेंस को एक ही प्लेट पर पीएफए-उपचारित के साथ बीज होने पर मॉक-ट्रीटेड लाइव कंट्रोल (चित्रा 3 सी) के लिए एक मजबूत प्राथमिकता है। यह स्थापित करने के बाद कि कीड़े पीएफए-मारे गए बैक्टीरिया से आकर्षित होते हैं, हालांकि जीवित बैक्टीरिया से कम, यह स्थापित करना अनिवार्य था कि वे पीएफए-मारे गए भोजन खाते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कीड़े पीएफए-उपचारित ओपी 50 का उपभोग करते हैं, विभिन्न खाद्य प्रकारों पर कीड़े की पंपिंग दर को मापा गया था। जैसा कि चित्रा 3 डी में दिखाया गया है, पीएफए-उपचारित ओपी 50 पर कीड़े में मॉक-ट्रीटेड कंट्रोल पर कीड़े की तुलना में उच्च पंपिंग दर (+ 25%) है। यह इंगित करता है कि कीड़े पीएफए-मारे गए भोजन पर खाने की अपनी दर को जानबूझकर धीमा नहीं कर रहे हैं और या तो खाने की उच्च दर या उपचारित भोजन को पंप करने में आसानी में बदलाव के लिए प्रतिपूरक प्रतिक्रिया का संकेत दे सकते हैं।

पवित्रता, विकास और जीवनकाल।
भोजन की स्थिति में परिवर्तन कीड़े13,22 पर शारीरिक प्रभाव डाल सकता है। व्यापक प्रभावों के लिए परीक्षण करने के लिए, विकास की दर, उर्वरता और जीवनकाल में परिवर्तन को मापा गया था। पीएफए-उपचारित ओपी 50 वाइल्डटाइप एन 2 कीड़े के विकास समय (~ 4 घंटे) में थोड़ी देरी करता है जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है। विभिन्न जीवाणु स्थितियों पर उगाए गए कीड़े की अंडे देने की क्षमता की निगरानी पीएफए-उपचारित ओपी 50 (चित्रा 4 बी) खिलाए गए कीड़े में प्रजनन क्षमता (-21%) में मामूली लेकिन महत्वपूर्ण कमी दिखाती है। एलिगेंस उम्र बढ़ने में रुचि रखने वाली प्रयोगशालाओं के लिए, दीर्घायु पर पीएफए-उपचारित ओपी 50 का प्रभाव तब निर्धारित किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि पीएफए-उपचारित ओपी 50 खिलाए गए वाइल्डटाइप कीड़े का जीवनकाल मानक नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटों (चित्रा 4 सी) पर मॉक-ट्रीटेड ओपी 50 खिलाए गए कीड़े से काफी अलग नहीं था, हालांकि, पीएफए-उपचारित ओपी 50 वाइल्डटाइप जीवनकाल (+23%) बढ़ाता है जब एफयूडीआर मौजूद होता है (चित्रा 4 डी)। पीएफए-उपचारित ओपी 50 को लंबे समय तक जीवित रहने वाले एफएमओ -2 ओवरएक्सप्रेसिंग (ओई) स्ट्रेन20 को खिलाने से वाइल्डटाइप कीड़े की तुलना में इसकी दीर्घायु में बदलाव नहीं होता है (चित्रा 4 ई)। यूवी-, गर्मी-और एंटीबायोटिक-मारे गए ओपी 50 को भी सी एलिगेंस जीवनकाल को बदलने के लिए दिखाया गया है। विशेष रूप से, यूवी-उपचारित बैक्टीरिया को एनजीएम12,23 और एफयूडीआर 24 पर जीवनकाल बढ़ाने की सूचना दी गई है। हालांकि, एफयूडीआर और यूवी-मारे गए बैक्टीरिया25,26 की बातचीत पर परस्पर विरोधी डेटा है जो यूवी-हत्या के विभिन्न तरीकों और बैक्टीरिया में चयापचय निष्क्रियता के सत्यापन के कारण हो सकता है। इसके अतिरिक्त, गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया एनजीएम27 पर जीवनकाल बढ़ाते हैं, और एंटीबायोटिक्स एनजीएम15 और तरल संस्कृति28 पर जीवनकाल बढ़ाते हैं।

Figure 2
चित्र 2. पीएफए के साथ बैक्टीरिया का उपचार प्रसार और चयापचय को रोकता है। (ए) मॉक-ट्रीटेड और 0.5% पीएफए-उपचारित ओपी 50 की कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) में बैक्टीरिया की वृद्धि। (ख) मॉक-ट्रीटेड और 05% पीएफए-उपचारित ओपी 50 के एमपीएच/मिनट में बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर)। (ग) मॉक-ट्रीटेड, 0.25% पीएफए-उपचारित और 0.5% पीएफए-उपचारित एचबी 101 में बेसल ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर)। (घ) मॉक-ट्रीटेड के पीएमओएल/मिनट में बेसल ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर), 025% पीएफए-उपचारित, 0.5% पीएफए-उपचारित, और 1.0% पीएफए-उपचारित एंटरोकोकस फिकेलिस (ईएफ)। आंकड़ों में दिखाए गए सभी त्रुटि पट्टियाँ माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं; पी-मान प्राप्त करने के लिए एक दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। पी-वैल्यू < 0.0001 को दर्शाता है। इस आंकड़े को 16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. कीड़े पीएफए-उपचारित ओपी 50 की ओर आकर्षित होते हैं। (ए) पीएफए-उपचारित या (बी) नकली उपचारित ओपी 50 बैक्टीरियल लॉन की ओर आकर्षित कीड़े का प्रतिशत। (ग) नकली उपचारित और पीएफए-उपचारित ओपी 50 के लिए कृमि परीक्षण कृमि वरीयता के प्रति जोड़ीवार संवेदनशील परख परीक्षण। (डी) पीएफए-उपचारित या मॉक-ट्रीटेड ओपी 50 पर कीड़ों की पंपिंग दर (प्रति 30 एस पंप)। सभी तुलनाओं के लिए पी-मान प्राप्त करने के लिए एक दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट विश्लेषण का उपयोग किया गया था। आंकड़ों में दिखाए गए सभी त्रुटि पट्टियाँ माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं; पी-वैल्यू < 0.0001 को दर्शाता है। पैनल ए-सी को 16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. पीएफए-उपचारित ओपी 50 पर कीड़े बढ़ते हैं और विकसित होते हैं। (ए) मॉक-ट्रीटेड और पीएफए-ट्रीटेड ओपी 50 पर अंडे से अंडे देने वाले वयस्कों से कीड़े का विकास समय (एच)। (बी) मॉक-ट्रीटेड या पीएफए-उपचारित ओपी 50 खिलाए गए कीड़ों की औसत संतान (कीड़े की संख्या)। (C, D) (सी) एनजीएम और (डी) एफयूडीआर जीवनकाल प्लेटों पर मॉक-ट्रीटेड या पीएफए-उपचारित ओपी 50 खिलाए गए कीड़े का प्रतिशत जीवित है। (ई) पीएफए-उपचारित ओपी 50 खिलाए गए वाइल्डटाइप और एफएमओ -2 ओई कीड़े का प्रतिशत जीवित है। विकास और प्रजनन तुलना के लिए पी-मान प्राप्त करने के लिए एक दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट विश्लेषण का उपयोग किया गया था। लॉग-रैंक परीक्षण का उपयोग जीवनकाल तुलना के लिए पी-मान प्राप्त करने के लिए किया गया था। आंकड़ों में दिखाए गए सभी त्रुटि पट्टियाँ माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं; * पी-वैल्यू < 0.05 को दर्शाता है, *** पी-वैल्यू <0.001 को दर्शाता है, और **** पी-वैल्यू < 0.0001 को दर्शाता है। पैनल ए, बी और डी को16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अन्य जीवाणु-हत्या विधियों के सापेक्ष पीएफए-हत्या के लाभ
पीएफए-उपचार सी एलिगेंस के लिए एक पौष्टिक भोजन स्रोत बनाए रखते हुए बैक्टीरिया चयापचय को रोकने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि है। पीएफए-उपचार के माध्यम से बैक्टीरिया को मारने से अन्य तरीकों पर कई फायदे हैं। यूवी-उपचार के विपरीत, जहां सफल हत्या के लिए हर प्लेट का परीक्षण किया जाना चाहिए, बैच16 को मान्य करने के लिए पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया के एक बैच से एक प्लेट का परीक्षण किया जा सकता है। पीएफए-उपचार बैक्टीरिया चयापचय (चित्रा 2 बी) को खत्म करने में भी बहुत प्रभावी है, और पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया एंटीबायोटिक-उपचारित बैक्टीरिया19 के सापेक्ष चयापचय गतिविधि में कमी का प्रदर्शन करते हैं। पीएफए-उपचार का एक और लाभ यह है कि बैक्टीरिया अपनी सेलुलर संरचना और पोषण प्रोफ़ाइल को बनाए रखते हैं। नतीजतन, कीड़े पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया पर विकसित हो सकते हैं, जबकि अंडे से गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया को खिलाने से विकासात्मक गिरफ्तारी13,16 होती है।

महत्वपूर्ण कदम और समस्या निवारण
जबकि पीएफए-उपचार करने वाले बैक्टीरिया एक अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल है, यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण है कि बैक्टीरिया का प्रत्येक बैच प्रतिकृति और चयापचय रूप से मृत है (चरण 6 और 7) और यह सुनिश्चित करने के लिए कि पीएफए-उपचार के बाद धोने के चरण पूरी तरह से किए जाते हैं (चरण 5)। यदि उपनिवेश चरण 6 में बढ़ते हैं, यह दर्शाता है कि बैक्टीरिया पूरी तरह से मृत नहीं है, तो चरण 3 में पीएफए की एकाग्रता और पीएफए-उपचार की अवधि का निवारण करना संभव है। पीएफए-उपचार प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय, पीएफए की 0.5% एकाग्रता न्यूनतम दुष्प्रभावों के साथ ओपी 50 को सफलतापूर्वक मारने के लिए आदर्श थी। 0.25% पीएफए बैक्टीरिया के सभी उपभेदों को चयापचय रूप से मारने के लिए पर्याप्त नहीं था (चित्रा 2 सी-डी) और एकाग्रता को 0.5% पीएफए तक बढ़ाने से 0.25% पीएफए के सापेक्ष ओपी 50 पर कीड़े के विकास के समय, जीवनकाल या भोजन की प्राथमिकता में बदलाव नहीं हुआ। इसके अलावा, पीएफए के साथ टीकाकरण का 1 घंटा सभी जीवाणु विकास को रोकने के लिए पर्याप्त सबसे कम समय था। यदि 0.5% पीएफए के साथ 1 घंटे के टीकाकरण से बैक्टीरिया पूरी तरह से नहीं मारे जाते हैं, तो टीकाकरण समय और / या पीएफए एकाग्रता को मारने की क्षमता का निवारण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। प्रोटोकॉल में एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम पीएफए-उपचार (चरण 5) के बाद बैक्टीरिया को धोना है। सभी पांच धोने को पूरा करना और प्रत्येक धोने के साथ सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटाना बहुत महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि बैक्टीरिया में कोई फॉर्मलाडेहाइड न रहे। यदि कीड़े अच्छी तरह से नहीं बढ़ रहे हैं या पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया पर पंप नहीं कर रहे हैं, तो अतिरिक्त धुलाई की जा सकती है।

विधि की सीमाएँ
जबकि पीएफए-मारे गए बैक्टीरिया सी एलिगेंस अध्ययनों से बैक्टीरिया चयापचय (चित्रा 2 बी) के भ्रामक प्रभावों को खत्म करने के लिए आदर्श हैं, इस विधि की सीमाएं हैं। एलिगेंस में जीवित बैक्टीरिया के सापेक्ष पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया पर थोड़ा धीमा विकास होता है (चित्रा 4 ए)16। पीएफए-उपचार भी कृमि जीवनकाल को बढ़ाता है यदि एफयूडीआर मौजूद है (चित्रा 4 डी), लेकिन एनजीएम (चित्रा 4 सी)प्लेटों 16 पर नहीं। हालांकि, अन्य तरीके भी इन चुनौतियों को प्रस्तुत करते हैं; यूवी-मारे गए बैक्टीरिया सी एलिगेंस जीवनकाल को भी बदल देते हैं। अधिकांश रिपोर्टों से पता चलता है कि यूवी-उपचारित बैक्टीरिया एनजीएम12,23 और एफयूडीआर 24 पर कृमि जीवनकाल का विस्तार करते हैं, अन्य अध्ययनों से संकेत मिलता है कि यूवी-उपचार जीवनकाल 24 को प्रभावित नहीं करता है और सी एलिगेंस जीवनकाल25,26 पर यूवी-उपचार और एफयूडीआर के बीच बातचीत होती है। पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया के जीवनकाल प्रभावों के अलावा, कीड़े पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया (चित्रा 3 सी) 16 के सापेक्ष जीवित बैक्टीरिया पर समय बिताना पसंद करते हैं, लेकिन पीएफए-उपचारित भोजन (चित्रा 3 डी) पर उच्च पंपिंग दर होती है। इससे पता चलता है कि वे समान मात्रा में भोजन का उपभोग कर सकते हैं या पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया खाने में आसान या कठिन हैं। इनमें से कई प्रभाव बैक्टीरिया12,13,14 को मारने के अन्य तरीकों के साथ भी देखे जाते हैं, यह सुझाव देते हुए कि चयापचय रूप से सक्रिय बैक्टीरिया विकास के समय को कम करते हैं, जीवनकाल को कम करते हैं, और सी एलिगेंस के लिए अधिक आकर्षक होते हैं।

पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया के संभावित अनुप्रयोग
कुल मिलाकर, बैक्टीरिया के बड़े बैचों को जल्दी और मज़बूती से मारने की क्षमता में सी एलिगेंस अध्ययनों में बैक्टीरिया चयापचय के भ्रामक प्रभावों को खत्म करने की बहुत क्षमता है। यह क्षमता विशेष रूप से दवा स्क्रीन, पूरक प्रयोगों, विषाक्तता परख, मेटाबोलॉमिक्स अध्ययन और मेजबान व्यवहार पर माइक्रोबियल चयापचय के प्रभावों की जांच के लिए उपयोगी है। इन अनुप्रयोगों में से प्रत्येक में पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया के उपयोग के बारे में अधिक जानकारी नीचे दी गई है।

दवा, पूरक, और विषाक्तता प्रयोग: क्योंकि पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया के प्रति बैच केवल एक प्लेट को सफलता को मारने के लिए परीक्षण करने की आवश्यकता होती है, पीएफए-मारे गए बैक्टीरिया को उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए तरल संस्कृति में जोड़ा जा सकता है। पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया को एगर मीडिया में शामिल छोटे अणुओं या पोषक तत्वों के साथ ठोस प्लेटों पर भी बीज दिया जा सकता है। पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया के साथ बीज वाली ठोस प्लेटें विषाक्तता या तनाव-प्रतिक्रिया परख के लिए भी उपयोगी हो सकती हैं। अप्रकाशित आंकड़ों से पता चलता है कि पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया पैराक्वाट और ट्यूनिकामाइसिन प्रतिरोध में बैक्टीरिया तनाव-प्रतिक्रिया मार्गों और कृमि तनाव-प्रतिरोध मार्गों की भूमिका के बीच अंतर करने में मदद कर सकते हैं। इन दवा पूरकता और विषाक्तता अध्ययनों में पीएफए-मारे गए बैक्टीरिया का उपयोग बैक्टीरिया को रुचि के अणु को चयापचय करने से रोकता है और यह सुनिश्चित करेगा कि किसी भी फेनोटाइप को सीधे सी एलिगेंस पर कार्य करने वाले यौगिक से परिणाम मिले।दवा और पूरक प्रयोगों के लिए चयापचय रूप से मृत बैक्टीरिया का उपयोग खुराक में परिवर्तनशीलता को भी कम करता है, क्योंकि जीवित बैक्टीरिया प्रयोग से प्रयोग तक ब्याज के यौगिक की विभिन्न मात्रा को चयापचय कर सकते हैं।

एलिगेंस मेटाबोलॉमिक्स अध्ययन को बैक्टीरिया चयापचय द्वारा भी भ्रमित किया जा सकता है: कृमि चयापचय में परिवर्तन को देखने के लिए जीवाणुचयापचय गतिविधि की अनुपस्थिति की आवश्यकता होती है। यहां तक कि बैक्टीरिया के खाद्य स्रोत में छोटे बदलाव भी कृमि चयापचय को बदल सकते हैं। उदाहरण के लिए, जीवित धुले हुए बैक्टीरिया को खिलाए गए कीड़े का चयापचय जीवित बिना धोएगए बैक्टीरिया को खिलाए गए कीड़े के चयापचय से भिन्न होता है। पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया का सेवन करने से जीवित भोजन16 का सेवन करने के सापेक्ष कृमि चयापचय भी बदल जाता है, लेकिन बैक्टीरिया चयापचय से अलगाव में सी एलिगेंस चयापचय पर प्रयोगात्मक स्थितियों के प्रभावों के बीच तुलना की अनुमति देता है।

मेजबान-माइक्रोब व्यवहार अध्ययन: अंत में, पीएफए-उपचारित बैक्टीरिया का उपयोग बैक्टीरिया चयापचय और मेजबान व्यवहार के बीच बातचीत की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। रोगजनक और गैर-रोगजनक बैक्टीरिया दोनों द्वारा स्रावित मेटाबोलाइट्स कीड़े के लिए आकर्षक या विकर्षक हो सकते हैं जो उनके चारा और भोजन व्यवहार को प्रभावित करते हैं10,11,30। इसके अलावा, बैक्टीरिया न्यूरोमोड्यूलेटर का उत्पादन कर सकते हैं जो हरकत30 में परिवर्तन करते हैं। इसके अतिरिक्त, बैक्टीरिया के विभिन्न उपभेदों पर सी एलिगेंस बढ़ने से ब्रूड आकार, विकास का समय और शरीर विज्ञान31,32 बदल जाता है। पीएफए के साथ इन बैक्टीरिया का इलाज करने से यह निर्धारित करने में मदद मिल सकती है कि सी एलिगेंस पर किसी दिए गए बैक्टीरिया के प्रभाव को सक्रिय जीवाणु चयापचय की आवश्यकता है या नहीं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच R21AG059117 और मिशिगन विश्वविद्यालय में एजिंग रिसर्च के जीवविज्ञान के लिए पॉल एफ ग्लेन प्रयोगशालाओं द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एसबी को T32AG000114 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। ईएसके को एनएसएफ डीजीई 1841052 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum Foil Staples 2549291
Bunsen burner VWR 470121-700 
Cell Density Meter Denville 80-3000-45 
Centrifuge Eppendorg 5430
Chemical fume hood Labcono 975050411384RG
Conincal tubes (50 mL) Fisher 339652
Cuvettes  Fisher 14-955-127
E. coli OP50 CGC OP50
Erlenmyer flasks Fisher 250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Inoculation loop Fisher 22-363-605
LB Agar Fisher BP1425500
Liquid waste collection bottle Thomas Scientific 1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M7506
Paraformaldehyde (32%) Electron Microscopy Sciences 15714-S Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor Eppendorf Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm) Fisher FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher P2853
Seahorse XF Calibrant Agilent 100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate Agilent 101085-004
Serological pipettes (50 mL) Genesee Scientific 12-107
Shaker incubator Thermo 11 676 083
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Sigma S374-500
Solid waste collection bucket M&M Industries  5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone Genesee Scientific 20-251
Vortex Thermo 11676331
Weighing balance C Goldenwall HZ10K6B
Yeast Extract Genesee Scientific 20-255

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  3. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
  4. Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
  5. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  6. Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
  7. McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
  8. Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
  9. Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
  10. Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
  11. Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
  12. Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
  13. Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
  14. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  15. Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
  16. Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
  17. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  18. Felix, H. Permeabilized and immobilized cells. Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).
  19. Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
  20. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  21. Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
  22. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  23. Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
  24. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  25. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  26. Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
  27. Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
  28. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
  29. Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
  30. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  31. Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
  32. Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).

Tags

मेटाबोलिक रूप से निष्क्रिय बैक्टीरिया केनोरहाब्डिस एलिगेंस रिसर्च जेनेटिक रिसर्च डेवलपमेंट रिसर्च एजिंग रिसर्च मेटाबोलिज्म रिसर्च बिहेवियर रिसर्च बैक्टीरियल मेटाबोलिज्म यूवी-विकिरण हीट-किलिंग एंटीबायोटिक्स पीएफए ट्रीटमेंट पैराफॉर्मलडिहाइड ट्रीटमेंट हाई-थ्रूपुट मेथड
<em>केनोरहाब्डिस एलिगेंस</em> रिसर्च के लिए बैक्टीरिया को चयापचय रूप से निष्क्रिय करने की पद्धति
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., … More

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., Huang, S., Leiser, S. F. Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research. J. Vis. Exp. (197), e65775, doi:10.3791/65775 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter