Summary
La fonte di cibo per Caenorhabditis elegans in laboratorio è l'Escherichia coli vivo. Poiché i batteri sono metabolicamente attivi, presentano una variabile confondente negli studi metabolici e farmacologici in C. elegans. Un protocollo dettagliato per inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide è descritto qui.
Abstract
Caenorhabditis elegans è un organismo modello comune per la ricerca in genetica, sviluppo, invecchiamento, metabolismo e comportamento. Poiché i C. elegans consumano una dieta a base di batteri vivi, l'attività metabolica della loro fonte di cibo può confondere gli esperimenti che cercano gli effetti diretti di vari interventi sul verme. Per evitare gli effetti confondenti del metabolismo batterico, i ricercatori di C. elegans hanno utilizzato diversi metodi per inattivare metabolicamente i batteri, tra cui l'irradiazione ultravioletta (UV), l'uccisione del calore e gli antibiotici. Il trattamento UV è relativamente a bassa produttività e non può essere utilizzato in coltura liquida perché ogni piastra deve essere esaminata per verificare il successo dell'abbattimento batterico. Un secondo metodo di trattamento, l'uccisione termica, influisce negativamente sulla consistenza e sulla qualità nutrizionale dei batteri, portando all'arresto dello sviluppo di C. elegans. Infine, il trattamento antibiotico può alterare direttamente la fisiologia di C. elegans oltre a prevenire la crescita batterica. Questo manoscritto descrive un metodo alternativo per inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide (PFA). Il trattamento con PFA lega in modo incrociato le proteine all'interno delle cellule batteriche per prevenire l'attività metabolica preservando la struttura cellulare e il contenuto nutrizionale. Questo metodo è ad alta produttività e può essere utilizzato in coltura liquida o in piastre solide, poiché l'analisi della crescita di una piastra di batteri trattati con PFA convalida l'intero lotto. L'inattivazione metabolica attraverso il trattamento con PFA può essere utilizzata per eliminare gli effetti confondenti del metabolismo batterico sugli studi sull'integrazione di farmaci o metaboliti, sulla resistenza allo stress, sulla metabolomica e sul comportamento in C. elegans.
Introduction
Caenorhabditis elegans è stato originariamente proposto come organismo modello nel 19651 e da allora è stato ampiamente adottato negli studi di genetica, sviluppo, comportamento, invecchiamento e metabolismo2. Grazie alle grandi dimensioni della covata e alla cuticola trasparente, C. elegans è particolarmente adatto per lo screening ad alto rendimento con reporter fluorescenti3. Il loro breve ciclo di vita, la riproduzione ermafrodita e l'omologia genetica con l'uomo rendono C. elegans un prezioso sistema modello per gli studi sullo sviluppo4 e sulla biologia dell'invecchiamento5. Inoltre, i C. elegans sono relativamente facili da mantenere. I vermi possono essere coltivati in coltura liquida o su piastre di agar solide e consumano una dieta a base di batteri vivi Escherichia coli OP504.
Tuttavia, la fonte di cibo vivo di C. elegans può confondere gli studi sul metabolismo, l'integrazione di farmaci e il comportamento. Poiché i batteri vivi hanno un proprio metabolismo, le condizioni sperimentali che influenzano i batteri alterano anche i nutrienti e i metaboliti disponibili per i vermi. Ad esempio, le differenze nelle concentrazioni di ferro batterico, amminoacidi e folati hanno effetti diversi sullo sviluppo, sulla fisiologia e sulla durata della vitadi C. elegans 6. Molte pratiche di laboratorio comuni possono provocare tali cambiamenti nella composizione dei nutrienti e nei metaboliti prodotti da OP50. In particolare, l'esposizione alla 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUdR), un composto comunemente usato per prevenire la riproduzione in C. elegans, provoca ampi cambiamenti nell'espressione genica OP50, comprese le vie di biosintesi degli amminoacidi7. I batteri vivi possono anche confondere gli studi in cui C. elegans sono integrati con piccole molecole perché i batteri possono metabolizzare parzialmente o completamente i composti attivi. Inoltre, gli effetti di queste piccole molecole sui batteri possono, a loro volta, alterare la fisiologia di C. elegans, come è stato riportato con il farmaco che prolunga la durata della vita metformina8. Infine, i batteri vivi possono modificare l'ambiente del verme in modi che ne alterano il comportamento, come la secrezione di odoranti attraenti9, la produzione di neuromodulatori esogeni10 e la creazione di gradienti di ossigeno in un prato denso di batteri11.
Per mitigare gli effetti confondenti del metabolismo batterico sulla ricerca su C. elegans , sono stati sviluppati diversi metodi per uccidere i batteri (Tabella 1). Tre strategie comuni per uccidere l'OP50 sono l'irradiazione UV, l'uccisione del calore e il trattamento antibiotico. Sebbene semplici e relativamente a basso costo, ognuno di questi metodi può avere effetti indesiderati sia sui batteri che su C. elegans. L'eliminazione dei raggi UV tramite un reticolante UV12 è a bassa produttività e la velocità è limitata dal numero di piastre che possono essere inserite nel reticolante UV. Inoltre, l'efficacia dell'uccisione UV può variare da piastra a piastra all'interno di un lotto e i test per la crescita su tutte le piastre possono diventare difficili in esperimenti di grandi dimensioni. L'eliminazione del calore dell'OP50 esponendo la coltura a temperature di >60 °C comporta una serie di sfide separate. Il calore elevato può danneggiare i nutrienti essenziali per il verme e distruggere la struttura cellulare dei batteri, creando una consistenza più morbida che riduce la quantità di tempo che i vermi trascorrono sul cibo13. Inoltre, questo metodo non può essere utilizzato durante tutto il ciclo di vita di C. elegans perché i vermi alimentati con batteri uccisi dal calore possono arrestarsi all'inizio dello sviluppo13. Il trattamento antibiotico è un terzo metodo comune per sopprimere il metabolismo batterico14, ma gli antibiotici possono anche alterare la crescita e il metabolismo dei vermi15.
Una soluzione per eliminare gli effetti metabolici dei batteri vivi preservando la struttura batterica e i nutrienti essenziali è uccidere l'OP50 con la paraformaldeide (PFA)16. Il PFA è un polimero di formaldeide in grado di reticolare le proteine all'interno delle cellule17 per prevenire la replicazione batterica senza distruggere le strutture cellulari interne come la membrana plasmatica interna18. A causa di questa conservazione della struttura cellulare interna, i batteri trattati con PFA non mostrano crescita o attività metabolica, ma rimangono una fonte di cibo commestibile e ricca di sostanze nutritive per C. elegans16. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che mostra come inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide.
| Metodo | Materiali richiesti | Scalabile? | Nutritivo? | Effetti su Worm? | ||||
| UV | reticolante UV | Limitato da: | Sì | Effetti variabili sulla durata della vita su NGM12, 23, 24 | ||||
| Numero di piastre che si adattano al reticolante UV | Effetti variabili sulla durata della vita su FUdR24, 26, 27 | |||||||
| Tempo di irradiazione per piastra | Diminuzione delle preferenze alimentari16 | |||||||
| Capacità di controllare la crescita di ogni piastra8 | ||||||||
| Calore | incubatore >60 °C | Sì | No: distrugge la parete cellulare, diminuisce il valore nutrizionale | Arresto dello sviluppo 13 | ||||
| Diminuzione delle preferenze alimentari13 | ||||||||
| Prolunga la durata di NGM31 | ||||||||
| Antibiotici | Antibiotici (kanamicina, carbenicillina, ecc.) | Sì | Sì | Ritarda la crescita e lo sviluppo15 | ||||
| Prolunga la durata in mezzi liquidi19 | ||||||||
| Prolunga la durata di vita di NGM15 | ||||||||
| PFA | 0,5% Paraformaldeide | Sì | Sì | Diminuzione delle dimensioni della covata piccola16 | ||||
| Piccolo aumento dei tempi di sviluppo16 | ||||||||
| Diminuzione delle preferenze alimentari16 | ||||||||
Tabella 1. Confronti di metodi per uccidere OP50. L'uccisione dei raggi UV, l'uccisione del calore, il trattamento antibiotico e il trattamento PFA hanno vari effetti sullo stato nutrizionale dei batteri e sulla salute dei vermi nutriti con batteri trattati. Questi metodi per l'inattivazione replicativa di E. coli differiscono anche per i materiali richiesti e la scalabilità.
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Protocol
1. Inoculazione di batteri
- Preparare il brodo Luria (LB) sciogliendo 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio (NaCl) in 950 ml di acqua distillata.
- Regolare il pH del LB a 7,0 aggiungendo idrossido di sodio (NaOH) 5M. Questo dovrebbe richiedere solo circa 0,2 mL di NaOH.
- Sterilizzare in autoclave il terreno LB a pH regolato su un ciclo liquido per 45 minuti a 15 psi. Lasciare raffreddare la soluzione e conservarla a temperatura ambiente.
- Inoculare una singola colonia di batteri in 100 mL di LB in un pallone di Erlenmeyer da 500 mL. Coltivare i batteri per una notte in un incubatore shaker a 37 °C.
- A seconda dello stato di salute della colonia batterica, delle dimensioni del pallone e della velocità impostata sull'agitatore, il tempo necessario alla crescita dei batteri può variare. Dopo ~14 ore, controllare la densità ottica (OD) dei batteri a 600 nm (OD600).
- Rimuovere i batteri dall'agitatore quando l'OD600 è 3.0 (1 x 109 unità formanti colonie (CFU)/mL). Se il diametro esterno600 è inferiore a 3,0, rimettere il pallone nell'incubatore agitatore fino a raggiungere il diametro esterno desiderato.
- Aliquotare i batteri in provette coniche da 50 mL e conservare a 4 °C o procedere alla fase successiva.
2. Lavorare con la paraformaldeide
NOTA: La concentrazione di paraformaldeide (PFA) utilizzata e la durata dell'esposizione possono variare leggermente a seconda del clima, della posizione e del tipo di batteri trattati. Un buon punto di partenza per OP50 è l'esposizione allo 0,5% di PFA per 1 ora, mentre lo 0,25% di PFA per 1 ora può essere sufficiente per HT115.
- Preparare una scorta di PFA al 32% o utilizzare una soluzione di PFA al 32% acquistata in commercio. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati quando si lavora con PFA. Indossare guanti e proteggere gli occhi.
- Aggiungere PFA all'interno di una cappa chimica con un'adeguata ventilazione. Smaltire i lavaggi e le punte contenenti PFA in appositi contenitori per rischi chimici nella cappa aspirante.
3. Trattamento batterico con paraformaldeide
- Una volta che i batteri raggiungono un OD600 di 3,0, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire 50 mL in un nuovo matraccio Erlenmeyer da 250 mL. Conservare il resto per un controllo in tempo reale, un controllo con trattamento simulato (vedere il passaggio 4) o per trattare anche con PFA, se necessario.
- Evitare di versare da un pallone all'altro e fare attenzione a non spruzzare i lati del nuovo pallone con i batteri. Le colonie sul lato del pallone possono ricevere una dose inferiore di PFA.
- Nella cappa chimica, aggiungere 781 μL di PFA al 32% a 50 mL di batteri per portare la concentrazione finale allo 0,5%. Smaltire la punta utilizzata in un contenitore per rifiuti solidi a rischio chimico.
- Coprire il pallone con un foglio di alluminio e rimetterlo nell'incubatore agitatore a 37 °C per 1 ora. Dopo 1 ora, rimuovere il pallone dall'incubatrice e procedere al punto 5.
4. Controllo con trattamento simulato
- Una volta che i batteri raggiungono un OD600 di 3,0, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire 50 mL di batteri in una provetta conica da 50 mL.
- Procedere al passaggio 5.3 per completare le fasi di lavaggio in modo simile al gruppo trattato con PFA.
5. Lavaggio dei batteri per rimuovere i residui di PFA
- Nella cappa chimica, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire i batteri trattati dal matraccio di Erlenmeyer a una provetta conica da 50 ml. L'uso di una pipetta sierologica invece di versare i batteri impedirà la contaminazione da eventuali colonie batteriche sul bordo del pallone che potrebbero aver evitato il trattamento diretto con PFA.
- Centrifugare i batteri trattati a circa 3000 x g per 20 min. Rimuovere il surnatante gettandolo in un contenitore per rifiuti liquidi pericolosi nella cappa chimica.
- Aggiungere 25 mL di LB e vortice per risospendere il pellet batterico (il riempimento completo del tubo rende più difficile la risospensione del pellet). Ripetere la centrifugazione e la risospensione del pellet 4 volte.
- Risospendere il pellet in volumi ottimali per diversi saggi. Per i saggi sulla durata della vita, seminare piastre da 60 mm con 200 μL di batteri risospesi in 10 mL di LB. La risospensione dei batteri in 10 mL di LB si traduce in una concentrazione 5x rispetto alla coltura originale da 50 mL.
- Conservare i batteri a 4 °C.
6. Controllo di qualità della crescita batterica
- Dopo il lavaggio finale e la risospensione, strisciare una piastra LB (utilizzando un puntale sterile per pipetta) con i batteri preparati. È buona norma striare anche il LB utilizzato per il lavaggio e la risospensione su una piastra separata per assicurarsi che il LB utilizzato non sia contaminato.
- Mettere le piastre in un'incubatrice a 37 °C per una notte. Verificare la presenza di eventuali crescite. I batteri sono considerati replicativamente morti quando le colonie non crescono sulla piastra LB.
7. Controllo di qualità del metabolismo batterico con respirometro
- Dopo il lavaggio finale e la risospensione dal punto 5.4, verificare che i batteri siano metabolicamente morti utilizzando gli strumenti disponibili come i respirometri19,20 e misurando il tasso di consumo basale di ossigeno (OCR).
- Preparare la soluzione M9: sciogliere 3 g di fosfato di potassio monobasico (KH 2 PO4 ), 6 g di fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4 ) e 5 g di cloruro di sodio (NaCl) in 950 ml di acqua distillata. Autoclavare con un ciclo liquido per 45 minuti a 15 psi, quindi lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Aggiungere 1 mL di solfato di magnesio 1 M (MgSO4 ) e conservare a temperatura ambiente.
- Idratare la cartuccia del respirometro: aggiungere 200 μL di calibrante a tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Inserire la cartuccia nella piastra a 96 pozzetti e incubare per una notte in un'incubatrice a 37 °C.
- Calibrazione del saggio: Il giorno seguente, posizionare la cartuccia idratata nella macchina e iniziare la calibrazione.
- Configurazione della piastra di test del saggio: utilizzando una nuova piastra a 96 pozzetti, aggiungere 160 μL di M9 e 40 μL dei batteri preparati (1 x 109 CFU/mL) ai pozzetti di test. Aggiungere 200 μL di M9 ai 4 pozzetti angolari da utilizzare come pozzetti vuoti. Aggiungere 160 μL di M9 e 40 μL di LB utilizzati per il lavaggio e la risospensione da utilizzare come controlli negativi. Aggiungere 200 μL di M9 al resto dei pozzetti che non verranno utilizzati.
- Eseguire il test: una volta completata la calibrazione della cartuccia, inserire la piastra del saggio dal punto 7.5 nella macchina per l'analisi. Le impostazioni includono passaggi per mixare, aspettare, misurare e ripetere. I risultati verranno visualizzati come tasso di consumo di ossigeno (OCR). I batteri sono metabolicamente morti e pronti all'uso quando l'OCR è zero.
Figura 1. Flusso di lavoro per il trattamento con paraformaldeide. Una singola colonia di batteri E. coli OP50 viene coltivata durante la notte. Il PFA viene aggiunto a una concentrazione finale dello 0,5% e la coltura trattata con PFA viene agitata per 1 ora a 37 °C. Infine, il PFA viene rimosso lavando la coltura con LB 5x fresco. Per confermare che i batteri trattati sono replicativamente inattivi, strisci una piastra LB dei batteri trattati e cresci durante la notte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Un flusso di lavoro dettagliato del protocollo è mostrato nella Figura 1. È stato sviluppato e ottimizzato un metodo ad alto rendimento per inattivare in modo coerente la replicazione batterica (Figura 2A) e il metabolismo (Figura 2B) per studi metabolici e farmacologici nella ricerca su C. elegans utilizzando la paraformaldeide16. L'obiettivo era quello di determinare la concentrazione più bassa di PFA necessaria e il minor tempo necessario per uccidere costantemente i batteri senza influire su varie misure di salute nei vermi. Questi valori possono variare da un luogo all'altro a seconda dell'ambiente di laboratorio e da un ceppo batterico all'altro. Ad esempio, l'esposizione del batterio HB101 allo 0,25% per 1 ora è sufficiente a renderlo metabolicamente inattivo (Figura 2C), mentre l'Enterococcus faecalis (EF) richiede una concentrazione di PFA dell'1,0% (Figura 2D) per un effetto costante. Un approccio per l'ottimizzazione dei singoli laboratori è stato precedentemente stabilito16 ed è dettagliato in questo lavoro attuale.
Attrazione e consumo di cibo
Man mano che i batteri crescono e si replicano, rilasciano vari metaboliti e feromoni che sono attraenti per i vermi. Per determinare se i vermi rimangono attratti dall'OP50 trattato con PFA, le piastre sono state seminate con OP50 trattato con PFA o trattato con mock e la percentuale di vermi presenti sul prato alimentare rispetto a fuori dal prato è stata tabulata. I dati mostrano che i vermi sono attratti dall'OP50 trattato con PFA, poiché la maggior parte dei vermi rimane sul prato batterico dopo 1 ora (Figura 3A), in modo simile a quanto osservato con il controllo trattato con finta (Figura 3B). Tuttavia, come previsto, un saggio sensibile a coppie21 mostra che C. elegans ha una preferenza più forte per il controllo vivo trattato con finta (Figura 3C) quando seminato con il trattamento PFA sulla stessa piastra. Avendo stabilito che i vermi sono attratti dai batteri uccisi da PFA, anche se meno dei batteri vivi, era imperativo stabilire che mangiano il cibo ucciso da PFA. Per determinare se i vermi consumano l'OP50 trattato con PFA, è stata misurata la velocità di pompaggio dei vermi su diversi tipi di cibo. Come mostrato nella Figura 3D, i vermi su OP50 trattato con PFA hanno una velocità di pompaggio più elevata (+25%) rispetto ai vermi sul controllo trattato con simulazione. Ciò indica che i vermi non stanno intenzionalmente rallentando il loro tasso di mangiare con cibo ucciso da PFA e potrebbe indicare un tasso più elevato di mangiare o una risposta compensatoria a un cambiamento nella facilità di pompaggio del cibo trattato.
Fecondità, sviluppo e durata della vita
I cambiamenti nelle condizioni alimentari possono avere effetti fisiologici sui vermi 13,22. Per testare gli effetti generali, sono stati misurati i cambiamenti nel tasso di sviluppo, nella fecondità e nella durata della vita. L'OP50 trattato con PFA ritarda leggermente il tempo di sviluppo (~4 ore) dei vermi N2 wildtype, come mostrato nella Figura 4A. Il monitoraggio della capacità di deposizione delle uova dei vermi cresciuti in diverse condizioni batteriche mostra una leggera ma significativa diminuzione della fecondità (-21%) nei vermi alimentati con OP50 trattato con PFA (Figura 4B). Per i laboratori interessati all'invecchiamento di C. elegans, è stato quindi determinato l'effetto dell'OP50 trattato con PFA sulla longevità. È interessante notare che la durata della vita dei vermi wildtype alimentati con OP50 trattato con PFA non era significativamente diversa da quella dei vermi alimentati con OP50 trattato con mock su piastre standard di terreni di crescita dei nematodi (NGM) (Figura 4C), tuttavia, OP50 trattato con PFA aumenta la durata della vita del wildtype (+23%) quando è presente FUdR (Figura 4D). L'alimentazione di OP50 trattato con PFA a un ceppo20 a lunga durata che sovraesprime fmo-2 (OE) non ne altera la longevità rispetto ai vermi wildtype (Figura 4E). È stato anche dimostrato che l'OP50 ucciso dai raggi UV, dal calore e dagli antibiotici altera la durata della vita di C. elegans. In particolare, è stato riportato che i batteri trattati con UV prolungano la durata della vita su NGM12,23 e su FUdR24. Tuttavia, ci sono dati contrastanti sull'interazione tra FUdR e batteri uccisi dai raggi UV25,26 che possono essere dovuti a vari metodi di uccisione dei raggi UV e alla convalida dell'inattività metabolica nei batteri. Inoltre, i batteri uccisi dal calore prolungano la durata della vita su NGM27 e gli antibiotici prolungano la durata della vita su NGM15 e in coltura liquida28.
Figura 2. Il trattamento dei batteri con PFA inibisce la proliferazione e il metabolismo. (A) Crescita batterica in unità formanti colonie (CFU) di OP50 trattato con mock e trattato con PFA allo 0,5%. (B) Tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) in mpH/min di OP50 trattato con mock e trattato con PFA allo 0,5%. (C) Tasso di consumo basale di ossigeno (OCR) in pmol/min di HB101 trattato con PFA allo 0,25% e trattato con PFA allo 0,5%. (D) Tasso di consumo basale di ossigeno (OCR) in pmol/min di enterococcus faecalis (EF) trattato con PFA allo 0,25%, trattato con PFA allo 0,5% e trattato con PFA all'1,0%. Tutte le barre di errore mostrate nelle figure rappresentano l'errore standard della media (SEM); Per derivare i valori p è stato utilizzato un test t a due code. indica un valore p < 0,0001. Questa cifra è stata modificata da 16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. I vermi sono attratti dall'OP50 trattato con PFA. Percentuale di vermi attratti da (A) prato batterico OP50 trattato con PFA o (B) trattato con finto. (C) Preferenza del verme per test del test del test a coppie per OP50 trattato con mock e trattato con PFA. (D) Velocità di pompaggio (pompe per 30 s) di viti senza fine su OP50 trattato con PFA o trattato con simulazione. È stata utilizzata un'analisi del test t a due code per derivare i valori p per tutti i confronti. Tutte le barre di errore mostrate nelle figure rappresentano l'errore standard della media (SEM); indica un valore p < 0,0001. I pannelli A-C sono stati modificati da 16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. I vermi crescono e si sviluppano su OP50 trattato con PFA. (A) Tempo di sviluppo (h) di vermi da adulti che depongono uova a uova su OP50 trattato con mock e trattato con PFA. (B) Progenie media (numero di vermi) di vermi alimentati con OP50 trattato con mock o trattato con PFA. (C, D) Percentuale di vermi vivi alimentati con OP50 trattato con mock o PFA su piastre di durata della vita (C) NGM e (D) FUdR. (E) Percentuale di vermi OE wildtype e fmo-2 alimentati con OP50 trattato con PFA. È stata utilizzata un'analisi del test t a due code per derivare i valori p per i confronti di sviluppo e fecondità. Il test log-rank è stato utilizzato per derivare i valori p per i confronti della durata della vita. Tutte le barre di errore mostrate nelle figure rappresentano l'errore standard della media (SEM); * indica un valore p < 0,05, *** indica un valore p <0,001 e **** indica un valore p < 0,0001. I pannelli A, B e D sono stati modificati rispetto al16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vantaggi dell'uccisione dei PFA rispetto ad altri metodi di uccisione batterica
Il trattamento con PFA è un metodo ad alto rendimento per prevenire il metabolismo batterico mantenendo una fonte di cibo nutriente per C. elegans. L'uccisione dei batteri tramite il trattamento PFA presenta molteplici vantaggi rispetto ad altri metodi. A differenza del trattamento UV, in cui ogni piastra deve essere testata per il successo dell'uccisione, una singola piastra di un lotto di batteri trattati con PFA può essere testata per convalidare il lotto16. Il trattamento con PFA è anche molto efficace nell'eliminare il metabolismo batterico (Figura 2B) e i batteri trattati con PFA mostrano una ridotta attività metabolica rispetto ai batteri trattati con antibiotici19. Un altro vantaggio del trattamento con PFA è che i batteri mantengono la loro struttura cellulare e il loro profilo nutrizionale. Di conseguenza, i vermi possono svilupparsi su batteri trattati con PFA, mentre l'alimentazione di batteri uccisi dal calore dall'uovo provoca l'arresto dello sviluppo13,16.
Passaggi critici e risoluzione dei problemi
Sebbene il trattamento dei batteri PFA sia un protocollo relativamente semplice, è importante convalidare che ogni lotto di batteri sia replicativamente e metabolicamente morto (passaggi 6 e 7) e garantire che le fasi di lavaggio dopo il trattamento con PFA siano eseguite accuratamente (fase 5). Se le colonie crescono nella fase 6, indicando che i batteri non sono completamente morti, è possibile risolvere i problemi relativi alla concentrazione di PFA e alla durata del trattamento con PFA nella fase 3. Quando si ottimizza il protocollo di trattamento con PFA, una concentrazione dello 0,5% di PFA è stata l'ideale per uccidere con successo OP50 con effetti collaterali minimi. Lo 0,25% di PFA non è stato sufficiente per uccidere metabolicamente tutti i ceppi di batteri (Figura 2C-D) e l'aumento della concentrazione allo 0,5% di PFA non ha alterato il tempo di sviluppo, la durata della vita o le preferenze alimentari dei vermi su OP50 rispetto allo 0,25% di PFA. Inoltre, 1 ora di inoculazione con PFA è stato il tempo più breve sufficiente per prevenire tutta la crescita batterica. Se i batteri non vengono completamente uccisi da un'inoculazione di 1 ora con lo 0,5% di PFA, il tempo di inoculazione e/o la concentrazione di PFA possono essere aumentati per risolvere i problemi di efficienza dell'uccisione. Un secondo passaggio fondamentale del protocollo è il lavaggio dei batteri dopo il trattamento con PFA (fase 5). È molto importante completare tutti e cinque i lavaggi e rimuovere completamente il surnatante ad ogni lavaggio per garantire che non rimanga formaldeide nei batteri. Se i vermi non crescono bene o non pompano i batteri trattati con PFA, è possibile eseguire ulteriori lavaggi.
Limiti del metodo
Sebbene i batteri uccisi da PFA siano ideali per eliminare gli effetti confondenti del metabolismo batterico (Figura 2B) dagli studi su C. elegans, questo metodo presenta dei limiti. In particolare, C. elegans ha uno sviluppo leggermente più lento sui batteri trattati con PFA rispetto ai batteri vivi (Figura 4A)16. Il trattamento con PFA prolunga anche la durata della vite senza fine se è presente FUdR (Figura 4D), ma non sulle piastreNGM (Figura 4C) 16. Tuttavia, anche altri metodi presentano queste sfide; I batteri uccisi dai raggi UV alterano anche la durata della vita di C. elegans. La maggior parte dei rapporti suggerisce che i batteri trattati con UV prolungano la durata della vita dei vermi su NGM12,23 e su FUdR 24, con altri studi che indicano che il trattamento UV non influisce sulla durata della vita 24 e che esiste un'interazione tra il trattamento UV e FUdR sulla durata della vita di C. elegans 25,26. Oltre agli effetti sulla durata di vita dei batteri trattati con PFA, i vermi preferiscono trascorrere del tempo sui batteri vivi rispetto ai batteri trattati con PFA (Figura 3C)16, ma hanno una velocità di pompaggio più elevata sugli alimenti trattati con PFA (Figura 3D). Ciò suggerisce che possono consumare una quantità simile di cibo o che i batteri trattati con PFA sono più facili o più difficili da mangiare. Molti di questi effetti sono stati osservati anche con altri metodi di uccisione dei batteri12,13,14, suggerendo che i batteri metabolicamente attivi riducono il tempo di sviluppo, accorciano la durata della vita e sono più attraenti per C. elegans.
Potenziali applicazioni dei batteri trattati con PFA
Nel complesso, la capacità di uccidere in modo rapido e affidabile grandi lotti di batteri ha un grande potenziale per eliminare gli effetti confondenti del metabolismo batterico negli studi su C. elegans. Questa capacità è particolarmente utile per gli screening farmacologici, gli esperimenti di integrazione, i saggi di tossicità, gli studi di metabolomica e l'esame degli effetti del metabolismo microbico sul comportamento dell'ospite. Di seguito sono riportate ulteriori informazioni sull'uso di batteri trattati con PFA in ciascuna di queste applicazioni.
Esperimenti su farmaci, supplementazione e tossicità: poiché è necessario testare solo una piastra per lotto di batteri trattati con PFA per il successo dell'uccisione, i batteri uccisi da PFA possono essere aggiunti alla coltura liquida per lo screening dei farmaci ad alto rendimento. I batteri trattati con PFA possono anche essere seminati su piastre solide con piccole molecole o sostanze nutritive incorporate nel terreno di agar. Le piastre solide seminate con batteri trattati con PFA potrebbero anche essere utili per saggi di tossicità o di risposta allo stress. Dati non pubblicati suggeriscono che i batteri trattati con PFA possono aiutare a distinguere tra il ruolo delle vie di risposta allo stress batterico e le vie di resistenza allo stress dei vermi nella resistenza al paraquat e alla tunicamicina. L'utilizzo di batteri uccisi da PFA in questi studi di integrazione farmacologica e tossicità impedisce ai batteri di metabolizzare la molecola di interesse e garantirà che qualsiasi fenotipo osservato derivi da un composto che agisce direttamente su C. elegans. L'uso di batteri metabolicamente morti per esperimenti di farmaci e integratori riduce anche al minimo la variabilità nel dosaggio, poiché i batteri vivi possono metabolizzare diverse quantità del composto di interesse da esperimento a esperimento.
Studi di metabolomica: gli studi di metabolomica di C. elegans possono anche essere confusi dal metabolismo batterico: l'osservazione dei cambiamenti nel metabolismo dei vermi richiede l'assenza di attività metabolicabatterica 29. Anche piccoli cambiamenti nella fonte di cibo batterico possono alterare il metaboloma del verme. Ad esempio, il metaboloma dei vermi nutriti con batteri vivi lavati differisce dal metaboloma dei vermi nutriti con batteri vivi non lavati16. Il consumo di batteri trattati con PFA modifica anche il metaboloma dei vermi rispetto al consumo di cibo vivo16 , ma consente confronti tra gli effetti delle condizioni sperimentali sul metabolismo di C. elegans in isolamento dal metabolismo batterico.
Studi comportamentali ospite-microbo: Infine, i batteri trattati con PFA potrebbero essere utilizzati per identificare le interazioni tra il metabolismo batterico e il comportamento dell'ospite. I metaboliti secreti da batteri patogeni e non patogeni possono essere attraenti o repellenti per i vermi per influenzare il loro comportamento di foraggiamento e alimentazione10,11,30. Inoltre, i batteri possono produrre neuromodulatori che guidano i cambiamenti nella locomozione30. Inoltre, la crescita di C. elegans su diversi ceppi di batteri provoca un'alterazione delle dimensioni della covata, del tempo di sviluppo e della fisiologia31,32. Il trattamento di questi batteri con PFA può aiutare a determinare se gli effetti di un determinato batterio su C. elegans richiedono un metabolismo batterico attivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH R21AG059117 e dai Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research presso l'Università del Michigan. SB è stato finanziato da T32AG000114. ESK è stato finanziato da NSF DGE 1841052.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
- Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
- Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
- McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
- Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
- Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
- Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
- Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
- Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
- Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
- Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Felix, H.
- Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
- MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
- Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
- Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
- Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
- O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
- Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).
