Summary
Matkilden til Caenorhabditis elegans i laboratoriet er levende Escherichia coli. Siden bakterier er metabolsk aktive, presenterer de en konfunderende variabel i metabolske og medikamentelle studier i C. elegans. En detaljert protokoll for metabolsk inaktivering av bakterier ved bruk av paraformaldehyd er beskrevet her.
Abstract
Caenorhabditis elegans er en vanlig modellorganisme for forskning innen genetikk, utvikling, aldring, metabolisme og atferd. Fordi C. elegans forbruker en diett av levende bakterier, kan den metabolske aktiviteten til matkilden forvirre eksperimenter på jakt etter de direkte effektene av ulike inngrep på ormen. For å unngå forvirrende effekter av bakteriell metabolisme har C. elegans forskere brukt flere metoder for metabolsk inaktivere bakterier, inkludert ultrafiolett (UV) -bestråling, varmedrap og antibiotika. UV-behandling har relativt lav gjennomstrømning og kan ikke brukes i flytende kultur fordi hver plate må undersøkes for vellykket bakteriedrepping. En annen behandlingsmetode, varmedrepende, påvirker bakteriens tekstur og ernæringsmessige kvalitet negativt, noe som fører til utviklingsstans av C. elegans. Endelig kan antibiotikabehandling direkte endre C. elegans fysiologi i tillegg til å forhindre bakterievekst. Dette manuskriptet beskriver en alternativ metode for metabolsk inaktivering av bakterier ved hjelp av paraformaldehyd (PFA). PFA-behandling kryssbinder proteiner i bakterieceller for å forhindre metabolsk aktivitet samtidig som cellulær struktur og næringsinnhold opprettholdes. Denne metoden har høy gjennomstrømning og kan brukes i flytende kultur eller faste plater, da testing av en plate av PFA-behandlede bakterier for vekst validerer hele batchen. Metabolsk inaktivering gjennom PFA-behandling kan brukes til å eliminere de forstyrrende effektene av bakteriell metabolisme på studier av legemiddel- eller metabolitttilskudd, stressmotstand, metabolomikk og oppførsel i C. elegans.
Introduction
Caenorhabditis elegans ble opprinnelig foreslått som en modellorganisme i 19651 og har siden blitt mye brukt i studier av genetikk, utvikling, atferd, aldring og metabolisme2. På grunn av sin store brødstørrelse og gjennomsiktige kutikula, er C. elegans spesielt godt egnet for høy gjennomstrømningsscreening med fluorescerende reportere3. Deres korte livssyklus, hermafrodittiske reproduksjon og genetiske homologi hos mennesker gjør også C. elegans til et verdifullt modellsystem for studier på utvikling4 og aldringsbiologi5. Dessuten er C. elegans relativt enkle å vedlikeholde. Ormer kan dyrkes i flytende kultur eller på faste agarplater og konsumere en diett av levende Escherichia coli OP50 bakterier4.
Imidlertid kan den levende matkilden til C. elegans forvirre studier av metabolisme, legemiddeltilskudd og oppførsel. Fordi levende bakterier har sin egen metabolisme, endrer eksperimentelle forhold som påvirker bakteriene også næringsstoffene og metabolittene som er tilgjengelige for ormene. For eksempel har forskjeller i bakteriell jern-, aminosyre- og folatkonsentrasjoner forskjellige effekter på C. elegans utvikling, fysiologi og levetid6. Mange vanlige laboratoriepraksis kan fremkalle slike endringer i næringssammensetningen og metabolitter produsert av OP50. Spesielt fremkaller eksponering for 5-fluor-2'-deoksyuridin (FUdR), en forbindelse som vanligvis brukes til å forhindre reproduksjon i C. elegans, store endringer i OP50-genuttrykk, inkludert aminosyrebiosynteseveier7. Levende bakterier kan også forvirre studier der C. elegans er supplert med små molekyler fordi bakterier kan delvis eller fullstendig metabolisere de aktive forbindelsene. Videre kan effekten av disse små molekylene på bakteriene i sin tur endre C. elegans fysiologi, som ble rapportert med det livsforlengende legemidlet metformin8. Endelig kan levende bakterier endre ormens miljø på måter som endrer atferd, for eksempel å utskille attraktive luktstoffer9, produsere eksogene nevromodulatorer10 og skape oksygengradienter i en tett bakterieplen11.
For å redusere de forvirrende effektene av bakteriell metabolisme på C. elegans forskning, har flere metoder for å drepe bakterier blitt utviklet (tabell 1). Tre vanlige strategier for å drepe OP50 er UV-bestråling, varmedrap og antibiotikabehandling. Selv om det er enkelt og relativt billig, kan hver av disse metodene ha uønskede effekter på både bakterier og C. elegans. UV-drap via en UV-kryssbinder12 er lav gjennomstrømning og hastigheten begrenses av antall plater som får plass i UV-tverrbinderen. Videre kan effekten av UV-drap variere fra plate til plate i en batch, og testing for vekst på alle plater kan bli vanskelig i store eksperimenter. Varmedrepende OP50 ved å utsette kultur for temperaturer på >60 °C kommer med et eget sett med utfordringer. Høy varme kan skade næringsstoffer som er essensielle for ormen og ødelegge den cellulære strukturen av bakterier, og skape en mykere tekstur som reduserer mengden tid ormer bruker på maten13. Denne metoden kan heller ikke brukes gjennom hele livssyklusen til C. elegans fordi ormer matet varmedrepte bakterier kan arrestere tidlig i utviklingen13. Antibiotikabehandling er en tredje vanlig metode for å undertrykke bakteriell metabolisme14, men antibiotika kan også endre ormevekst og metabolisme15.
En løsning for å eliminere de metabolske effektene av levende bakterier samtidig som bakteriestrukturen og essensielle næringsstoffer bevares, er å drepe OP50 med paraformaldehyd (PFA)16. PFA er en polymer av formaldehyd som kan kryssbinde proteiner i celle17 for å forhindre bakteriell replikasjon uten å ødelegge indre cellestrukturer som den indre plasmamembranen18. På grunn av denne bevaringen av indre cellulær struktur viser PFA-behandlede bakterier ingen vekst eller metabolsk aktivitet, men forblir en spiselig og næringsrik matkilde for C. elegans16. Her er det gitt en detaljert protokoll som viser hvordan man metabolsk inaktiverer bakterier ved hjelp av paraformaldehyd.
| Metode | Nødvendige materialer | Skalerbar? | Ernæringsmessig? | Effekter på orm? | ||||
| UV | UV-tverrbinder | Begrenset av: | Ja | Variable effekter på levetid på NGM12, 23, 24 | ||||
| Antall plater som passer i UV-tverrbinder | Variable effekter på levetid på FUdR24, 26, 27 | |||||||
| Bestrålingstid per plate | Redusert matpreferanse16 | |||||||
| Evne til å sjekke hver plate for vekst8 | ||||||||
| Varme | >60 °C inkubator | Ja | Nei: ødelegger cellevegg, redusert næringsverdi | Utviklingsstans 13 | ||||
| Redusert matpreferanse13 | ||||||||
| Forlenger levetiden på NGM31 | ||||||||
| Antibiotika | Antibiotika (kanamycin, karbenicillin, etc.) | Ja | Ja | Utsetter vekst og utvikling15 | ||||
| Forlenger levetiden i flytende medier19 | ||||||||
| Forlenger levetiden på NGM15 | ||||||||
| PFA | 0,5% paraformaldehyd | Ja | Ja | Liten brødstørrelse reduseres16 | ||||
| Liten tidsøkning16 | ||||||||
| Redusert matpreferanse16 | ||||||||
Tabell 1. Sammenligninger av metoder for å drepe OP50. UV-drepende, varmedrepende, antibiotikabehandling og PFA-behandling har varierende effekter på bakteriens ernæringsstatus og helsen til ormer som får behandlede bakterier. Disse metodene for replikativ inaktivering av E. coli varierer også i deres nødvendige materialer og skalerbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakterier inokulering
- Forbered Luria-buljong (LB) ved å oppløse 10 g trypton, 5 g gjærekstrakt og 10 g natriumklorid (NaCl) i 950 ml destillert vann.
- Juster pH i LB til 7,0 ved å tilsette 5M natriumhydroksid (NaOH). Dette bør bare kreve ca. 0,2 ml NaOH.
- Autoklav det pH-justerte LB-mediet på en væskesyklus i 45 minutter ved 15 psi. La oppløsningen avkjøles og oppbevares ved romtemperatur.
- Inokuler en enkelt koloni av bakterier i 100 ml LB i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe. Dyrk bakteriene over natten i en 37 °C shakerinkubator.
- Avhengig av helsen til bakteriekolonien, størrelsen på kolben og hastigheten som shakeren er satt til, kan tiden det tar for bakteriene å vokse variere. Etter ~14 timer, kontroller den optiske tettheten (OD) av bakteriene ved 600 nm (OD600).
- Fjern bakteriene fra shakeren når OD600 er 3,0 (1 x 109 kolonidannende enheter (CFU) / ml). Hvis OD600 er mindre enn 3,0, returner kolben til shakerinkubatoren til ønsket OD er nådd.
- Aliquot bakteriene i 50 ml koniske rør og oppbevar ved 4 °C eller fortsett til neste trinn.
2. Arbeid med paraformaldehyd
MERK: Konsentrasjonen av paraformaldehyd (PFA) som brukes, og varigheten av eksponeringen kan variere noe avhengig av klima, sted og type bakterier som behandles. Et godt utgangspunkt for OP50 er eksponering for 0,5% PFA i 1 time, mens 0,25% PFA i 1 time kan være tilstrekkelig for HT115.
- Forbered 32% PFA-lager eller bruk kommersielt kjøpt 32% PFA-løsning. Bruk riktig personlig verneutstyr (PPE) når du arbeider med PFA. Bruk hansker og øyevern.
- Tilsett PFA i en kjemisk avtrekkshette med riktig ventilasjon. Kast PFA som inneholder vask og spisser i forsvarlige kjemikaliefarebeholdere i avtrekkshetten.
3. Bakteriell behandling med paraformaldehyd
- Når bakteriene når en OD600 på 3,0, bruk en serologisk pipette til å overføre 50 ml til en ny 250 ml Erlenmeyer-kolbe. Lagre resten for en direkte kontroll, en mock-behandlet kontroll (se trinn 4), eller for å behandle så godt med PFA som nødvendig.
- Unngå å helle fra en kolbe til en annen, og vær forsiktig så du ikke spruter sidene av den nye kolben med bakterier. Kolonier på siden av kolben kan få en lavere dose PFA.
- I den kjemiske hetten, tilsett 781 μL 32% PFA til 50 ml bakterier for å bringe den endelige konsentrasjonen til 0,5%. Kast spissen som brukes i en kjemikaliefarebeholder for fast avfall.
- Dekk kolben med folie og sett den tilbake til shakerinkubatoren på 37 °C i 1 time. Etter 1 time, fjern kolben fra inkubatoren og fortsett til trinn 5.
4. Liksom-behandlet kontroll
- Når bakteriene når en OD600 på 3,0, bruk en serologisk pipette for å overføre 50 ml av bakteriene til et 50 ml konisk rør.
- Gå videre til trinn 5.3 for å fullføre vasketrinnene som ligner på den PFA-behandlede gruppen.
5. Vask bakteriene for å fjerne gjenværende PFA
- I den kjemiske hetten, bruk en serologisk pipette for å overføre de behandlede bakteriene fra Erlenmeyer-kolben til et 50 ml konisk rør. Bruk av serologisk pipette i stedet for å helle bakteriene vil forhindre forurensning fra bakteriekolonier på kanten av kolben som kan ha unngått direkte behandling med PFA.
- Sentrifuge behandlet bakterier ved ca. 3000 x g i 20 minutter. Fjern supernatanten ved å kaste den i en beholder for kjemisk fare for flytende avfall i kjemikaliehetten.
- Tilsett 25 ml LB og virvel for å resuspendere bakteriepelleten (Fylling av røret gjør det vanskeligere å resuspendere pelleten). Gjenta sentrifugering og pelletresuspensjon 4x.
- Resuspender pelleten i volumer som er optimale for forskjellige analyser. For levetidsanalyser, frø 60 mm plater med 200 μL bakterier resuspendert i 10 ml LB. Resuspendering av bakteriene i 10 ml LB resulterer i en 5x konsentrasjon fra den opprinnelige 50 ml kulturen.
- Oppbevar bakteriene ved 4 °C.
6. Kvalitetskontroll av bakterievekst
- Etter den siste vasken og suspensjonen, fest en LB-plate (ved hjelp av en steril pipettespiss) med de tilberedte bakteriene. Det er god praksis å stripe LB som brukes til vask og resuspendering på en egen plate også for å sikre at LB som brukes ikke var forurenset.
- Legg platene i en 37 °C kuvøse over natten. Se etter vekst. Bakteriene regnes som replikativt døde når kolonier ikke vokser på LB-platen.
7. Kvalitetskontroll av bakteriell metabolisme ved hjelp av et respirometer
- Etter siste vask og resuspensjon fra trinn 5.4, bekreft at bakteriene er metabolsk døde ved hjelp av tilgjengelige verktøy som respirometre19,20 og måling av basal oksygenforbruk (OCR).
- Forbered M9-oppløsning: Oppløs 3 g kaliumfosfat monobasisk (KH 2 PO 4),6 g natriumfosfatdibasisk (Na2HPO4) og 5 g natriumklorid (NaCl) i 950 ml destillert vann. Autoklav på en væskesyklus i 45 minutter ved 15 psi, og la deretter løsningen avkjøles til romtemperatur. Tilsett 1 ml 1 M magnesiumsulfat (MgSO4) og oppbevar ved romtemperatur.
- Hydrater respirometerkassetten: Tilsett 200 μL kalibrant til alle brønner på en 96-brønnsplate. Plasser sylinderampullen i 96-brønnsplaten og rug over natten i en 37 °C inkubator.
- Analysekalibrering: Dagen etter plasserer du den hydrerte kassetten i maskinen og begynner kalibreringen.
- Testplateoppsett for analyse: Bruk en ny 96-brønnsplate, tilsett 160 μL M9 og 40 μL av de preppede bakteriene (1 x 109 CFU / ml) for å teste brønner. Tilsett 200 μL M9 til de 4 hjørnebrønnene som skal brukes som tomme brønner. Tilsett 160 μL M9 og 40 μL LB som brukes til vask og resuspendering for bruk som negative kontroller. Tilsett 200 μL M9 til resten av brønnene som ikke skal brukes.
- Kjør analysen: Når kassettkalibreringen er fullført, setter du analyseplaten fra trinn 7.5 inn i maskinen for analyse. Innstillingene inkluderer trinn for å blande, vente, måle og sløyfe. Resultatene vil bli vist som oksygenforbruk (OCR). Bakteriene er metabolsk døde og klare til bruk når OCR er null.
Figur 1. Arbeidsflyt for paraformaldehydbehandling. En enkelt koloni av E. coli OP50 bakterier dyrkes over natten. PFA tilsettes en sluttkonsentrasjon på 0,5 %, og den PFA-behandlede kulturen ristes i 1 time ved 37 °C. Til slutt fjernes PFA ved å vaske kulturen med fersk LB 5x. For å bekrefte at de behandlede bakteriene er replikativt inaktive, strek ut en LB-plate av de behandlede bakteriene og vokse over natten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En detaljert arbeidsflyt for protokollen er vist i figur 1. En høykapasitetsmetode ble utviklet og optimalisert for konsekvent å inaktivere bakteriell replikasjon (figur 2A) og metabolisme (figur 2B) for metabolske og medikamentelle studier i C. elegans forskning ved bruk av paraformaldehyd16. Målet var å bestemme den laveste konsentrasjonen av PFA som trengs og den korteste tiden som kreves for å konsekvent drepe bakteriene uten å påvirke ulike helsetiltak i ormene. Disse verdiene kan variere fra ett sted til et annet, avhengig av laboratoriemiljø, og fra en bakteriestamme til en annen. For eksempel er eksponering av HB101-bakterier til 0,25 % i 1 time tilstrekkelig til å gjøre den metabolsk inaktiv (figur 2C), mens Enterococcus faecalis (EF) krever en 1,0 % PFA-konsentrasjon (figur 2D) for en konsistent effekt. En tilnærming for individuell laboratorieoptimalisering ble tidligere etablert16 og er detaljert i dette nåværende arbeidet.
Matattraksjon og forbruk
Etter hvert som bakterier vokser og replikerer, frigjør de forskjellige metabolitter og feromoner som er attraktive for ormene. For å avgjøre om ormene forblir tiltrukket av den PFA-behandlede OP50, ble platene sådd med PFA-behandlet eller mock-behandlet OP50, og prosentandelen ormer som var tilstede på matplenen sammenlignet med plenen ble tabulert. Data viser at ormer tiltrekkes av den PFA-behandlede OP50, siden de fleste ormene forblir på bakterieplenen etter 1 time (figur 3A), lik det som observeres med den mockbehandlede kontrollen (figur 3B). Som forventet viser imidlertid en sensitiv parvis analyse21 at C. elegans har en sterkere preferanse for den mock-behandlede levende kontrollen (figur 3C) når den er seedet med PFA-behandlet på samme plate. Etter å ha fastslått at ormer tiltrekkes av PFA-drepte bakterier, om enn mindre enn levende bakterier, var det viktig å fastslå at de spiser den PFA-drepte maten. For å avgjøre om ormene bruker den PFA-behandlede OP50, ble pumpehastigheten til ormene på forskjellige mattyper målt. Som vist i figur 3D har ormer på PFA-behandlet OP50 en høyere pumpehastighet (+25%) enn ormer på den mockbehandlede kontrollen. Dette indikerer at ormer ikke med vilje reduserer hastigheten på å spise på PFA-drept mat og kan enten indikere en høyere spisefrekvens eller en kompenserende respons på en endring i det enkle å pumpe den behandlede maten.
Fecundity, utvikling og levetid
Endringer i matforhold kan ha fysiologiske effekter på ormer13,22. For å teste for brede effekter ble endringer i utviklingshastighet, fruktbarhet og levetid målt. PFA-behandlet OP50 forsinker utviklingstiden (~4 timer) for villtype N2-ormer som vist i figur 4A. Overvåking av eggleggingskapasiteten til ormer dyrket på forskjellige bakterielle forhold viser en liten, men signifikant reduksjon i fruktbarhet (-21%) i ormene som får PFA-behandlet OP50 (figur 4B). For laboratorier som er interessert i C. elegans aldring, ble effekten av PFA-behandlet OP50 på lang levetid bestemt. Interessant nok var levetiden til villtypeormer matet PFA-behandlet OP50 ikke signifikant forskjellig fra ormene som ble matet mock-behandlet OP50 på standard nematodevekstmedier (NGM) plater (figur 4C), men PFA-behandlet OP50 øker levetiden til villtype (+ 23%) når FUdR er tilstede (figur 4D). Fôring av PFA-behandlet OP50 til en langlivet fmo-2 overuttrykkende (OE) stamme20 endrer ikke levetiden sammenlignet med villtype ormer (figur 4E). UV-, varme- og antibiotikadrept OP50 har også vist seg å endre C. elegans levetid. Spesielt har UV-behandlede bakterier blitt rapportert å forlenge levetiden på NGM12,23 og på FUdR 24. Imidlertid er det motstridende data om samspillet mellom FUdR og UV-drepte bakterier25,26 som kan skyldes varierte metoder for UV-drap og validering av metabolsk inaktivitet i bakteriene. I tillegg forlenger varmedrepte bakterier levetiden på NGM27, og antibiotika forlenger levetiden på NGM15 og i flytende kultur28.
Figur 2. Behandling av bakterier med PFA hemmer spredning og metabolisme. (A) Bakterievekst i kolonidannende enheter (CFU) av mock-behandlet og 0,5% PFA-behandlet OP50. (B) Ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) i mpH/min av mock-behandlet og 0,5% PFA-behandlet OP50. (C) Basal oksygenforbruk (OCR) i pmol/min av mockbehandlet, 0,25 % PFA-behandlet og 0,5 % PFA-behandlet HB101. (D) Basal oksygenforbruk (OCR) i pmol/min av mockbehandlet, 0,25 % PFA-behandlet, 0,5 % PFA-behandlet og 1,0 % PFA-behandlet enterococcus faecalis (EF). Alle feilfelt vist i figurer representerer standardfeilen til gjennomsnittet (SEM); Tosidig t-test ble brukt for å utlede p-verdier. angir p-verdi < 0,0001. Dette tallet er endret fra 16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Ormer tiltrekkes av PFA-behandlet OP50. Prosent av ormer tiltrukket av (A) PFA-behandlet eller (B) mock-behandlet OP50 bakteriell plen. (C) Parvis sensitivisert analysetestormpreferanse for mock-behandlet og PFA-behandlet OP50. (D) Pumpehastighet (pumper per 30 s) av ormer på PFA-behandlet eller mock-behandlet OP50. Tosidig t-testanalyse ble brukt for å utlede p-verdier for alle sammenlikninger. Alle feilfelt vist i figurer representerer standardfeilen til gjennomsnittet (SEM); angir p-verdi < 0,0001. Panelene A-C er modifisert fra 16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Ormer vokser og utvikler seg på PFA-behandlet OP50. (A) Utviklingstid (h) for ormer fra egg til eggleggende voksne på mock-behandlet og PFA-behandlet OP50. (B) Gjennomsnittlig avkom (antall ormer) av ormer matet mock-behandlet eller PFA-behandlet OP50. (C, D) Prosent i live av ormer matet mock-behandlet eller PFA-behandlet OP50 på (C) NGM og (D) FUdR levetidsplater. (E) Prosent i live av villtype og fmo-2 OE ormer matet PFA-behandlet OP50. En tosidig t-testanalyse ble brukt for å utlede p-verdier for utviklings- og fruktbarhetssammenligninger. Log-rank-testen ble brukt til å utlede p-verdier for levetidssammenligninger. Alle feilfelt vist i figurer representerer standardfeilen til gjennomsnittet (SEM); * angir p-verdi < 0,05, *** angir p-verdi <0,001, og **** angir p-verdi < 0,0001. Panel A, B og D er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordeler med PFA-drap i forhold til andre bakteriedrepende metoder
PFA-behandling er en gjennomstrømningsmetode for å forhindre bakteriell metabolisme samtidig som den opprettholder en næringsrik matkilde for C. elegans. Å drepe bakterier via PFA-behandling har flere fordeler i forhold til andre metoder. I motsetning til UV-behandling, hvor hver plate må testes for vellykket drap, kan en enkelt plate fra et parti PFA-behandlede bakterier testes for å validere batch16. PFA-behandling er også svært effektivt for å eliminere bakteriell metabolisme (figur 2B), og PFA-behandlede bakterier viser redusert metabolsk aktivitet i forhold til antibiotikabehandlede bakterier19. En annen fordel med PFA-behandling er at bakteriene opprettholder sin cellulære struktur og ernæringsprofil. Følgelig kan ormer utvikle seg på PFA-behandlede bakterier, mens fôring av varmedrepte bakterier fra egg resulterer i utviklingsstans13,16.
Kritiske trinn og feilsøking
Mens PFA-behandling av bakterier er en relativt enkel protokoll, er det viktig å validere at hver batch av bakterier er repliktivt og metabolsk død (trinn 6 og 7) og for å sikre at vasketrinnene etter PFA-behandling gjøres grundig (trinn 5). Hvis kolonier vokser i trinn 6, noe som indikerer at bakteriene ikke er helt døde, er det mulig å feilsøke konsentrasjonen av PFA og varigheten av PFA-behandlingen i trinn 3. Ved optimalisering av PFA-behandlingsprotokollen var en 0,5% konsentrasjon av PFA ideell for vellykket drap av OP50 med minimale bivirkninger. 0,25% PFA var ikke tilstrekkelig til metabolsk å drepe alle bakteriestammer (figur 2C-D) og økning av konsentrasjonen til 0,5% PFA endret ikke utviklingstid, levetid eller matpreferanse for ormer på OP50 i forhold til 0,25% PFA. Dessuten var 1 time inokulering med PFA den korteste tiden som var tilstrekkelig til å forhindre all bakterievekst. Hvis bakterier ikke blir fullstendig drept av en 1 timers inokulasjon med 0,5% PFA, kan inokulasjonstiden og / eller PFA-konsentrasjonen økes for å feilsøke drapseffektiviteten. Et annet viktig trinn i protokollen er å vaske bakteriene etter PFA-behandling (trinn 5). Det er svært viktig å fullføre alle fem vaskene og fjerne supernatanten helt ved hver vask for å sikre at det ikke forblir formaldehyd i bakteriene. Hvis ormer ikke vokser godt eller ikke pumper på PFA-behandlede bakterier, kan ytterligere vasker utføres.
Begrensninger av metoden
Mens PFA-drepte bakterier er ideelle for å eliminere de forstyrrende effektene av bakteriell metabolisme (figur 2B) fra C. elegans-studier, er det begrensninger for denne metoden. Spesielt har C. elegans litt langsommere utvikling på PFA-behandlede bakterier i forhold til levende bakterier (figur 4A) 16. PFA-behandling forlenger også ormens levetid dersom FUdR foreligger (figur 4D), men ikke på NGM (figur 4C) plate16. Men også andre metoder byr på disse utfordringene; UV-drepte bakterier endrer også C. elegans levetid. De fleste rapporter tyder på at UV-behandlede bakterier forlenger ormens levetid på NGM12,23 og på FUdR 24, med andre studier som indikerer at UV-behandling ikke påvirker levetiden 24 og at det er et samspill mellom UV-behandling og FUdR på C. elegans levetid 25,26. I tillegg til levetidseffektene av PFA-behandlede bakterier, foretrekker ormer å bruke tid på levende bakterier i forhold til PFA-behandlede bakterier (figur 3C)16, men har en høyere pumpehastighet på den PFA-behandlede maten (figur 3D). Dette antyder at de kan konsumere en lignende mengde mat eller at PFA-behandlede bakterier er lettere eller vanskeligere å spise. Mange av disse effektene er også observert med andre metoder for å drepe bakterier12,13,14, noe som tyder på at metabolsk aktive bakterier reduserer utviklingstiden, forkorter levetiden og er mer attraktive for C. elegans.
Potensielle anvendelser av PFA-behandlede bakterier
Samlet sett har evnen til raskt og pålitelig å drepe store mengder bakterier stort potensial for å eliminere de forvirrende effektene av bakteriell metabolisme i C. elegans-studier. Denne evnen er spesielt nyttig for narkotikaskjermer, tilskuddseksperimenter, toksisitetsanalyser, metabolomics-studier og undersøkelse av effekten av mikrobiell metabolisme på vertsadferd. Mer informasjon om bruk av PFA-behandlede bakterier i hver av disse applikasjonene er nedenfor.
Narkotika-, tilskudds- og toksisitetseksperimenter: Fordi bare en plate per batch av PFA-behandlede bakterier må testes for å drepe suksess, kan PFA-drepte bakterier legges til flytende kultur for høy gjennomstrømningsscreening. PFA-behandlede bakterier kan også frøes på faste plater med små molekyler eller næringsstoffer innlemmet i agarmediet. Faste plater frøet med PFA-behandlede bakterier kan også være nyttige for toksisitets- eller stressresponsanalyser. Upubliserte data tyder på at PFA-behandlede bakterier kan bidra til å skille mellom rollen som bakterielle stressresponsveier og ormspenningsmotstandsveier i paraquat og tunicamycinresistens. Bruk av PFA-drepte bakterier i disse legemiddeltilskudds- og toksisitetsstudiene forhindrer bakterier i å metabolisere molekylet av interesse og vil sikre at enhver fenotype observert resulterer fra en forbindelse som virker direkte på C. elegans. Bruk av metabolisk døde bakterier for legemiddel- og tilskuddseksperimenter minimerer også variasjonen i dosering, da levende bakterier kan metabolisere forskjellige mengder av forbindelsen av interesse fra eksperiment til eksperiment.
Metabolomics studier: C. elegans metabolomics studier kan også bli forvirret av bakteriell metabolisme: observere endringer i orm metabolisme krever fravær av bakteriell metabolsk aktivitet29. Selv små endringer i bakteriell matkilde kan endre ormen metabolom. For eksempel er metabolomet av ormer matet levende vasket bakterier forskjellig fra metabolomet av ormer matet levende uvaskede bakterier16. Forbruk av PFA-behandlede bakterier endrer også ormmetabolomet i forhold til inntak av levende mat16 , men tillater sammenligninger mellom effekten av eksperimentelle forhold på C. elegans metabolisme isolert fra bakteriell metabolisme.
Vertsmikrobe atferdsstudier: Endelig kan PFA-behandlede bakterier brukes til å identifisere interaksjoner mellom bakteriell metabolisme og vertsadferd. Metabolitter utskilt av både patogene og ikke-patogene bakterier kan være attraktive eller frastøtende mot ormer for å påvirke deres foraging og fôringatferd 10,11,30. Videre kan bakterier produsere nevromodulatorer som driver endringer i bevegelse30. I tillegg resulterer voksende C. elegans på forskjellige bakteriestammer i endret brødstørrelse, utviklingstid og fysiologi31,32. Behandling av disse bakteriene med PFA kan bidra til å avgjøre om effekten av en gitt bakterie på C. elegans krever aktiv bakteriell metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH R21AG059117 og Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research ved University of Michigan. SB ble finansiert av T32AG000114. ESK ble finansiert av NSF DGE 1841052.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
- Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
- Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
- McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
- Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
- Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
- Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
- Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
- Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
- Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
- Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Felix, H.
- Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
- MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
- Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
- Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
- Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
- O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
- Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).
