Summary
A fonte de alimento para Caenorhabditis elegans no laboratório é Escherichia coli viva. Como as bactérias são metabolicamente ativas, elas apresentam uma variável de confusão em estudos metabólicos e de drogas em C. elegans. Um protocolo detalhado para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído é descrito aqui.
Abstract
Caenorhabditis elegans é um organismo modelo comum para pesquisa em genética, desenvolvimento, envelhecimento, metabolismo e comportamento. Como C. elegans consomem uma dieta de bactérias vivas, a atividade metabólica de sua fonte alimentar pode confundir experimentos que procuram os efeitos diretos de várias intervenções sobre o verme. Para evitar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano, os pesquisadores de C. elegans usaram vários métodos para inativar metabolicamente as bactérias, incluindo irradiação ultravioleta (UV), morte por calor e antibióticos. O tratamento UV é relativamente baixo rendimento e não pode ser usado em cultura líquida porque cada placa deve ser examinada para matar bactérias com sucesso. Um segundo método de tratamento, o termo-matança, afeta negativamente a textura e a qualidade nutricional das bactérias, levando à parada do desenvolvimento de C. elegans. Finalmente, o tratamento com antibióticos pode alterar diretamente a fisiologia de C. elegans , além de prevenir o crescimento bacteriano. Este manuscrito descreve um método alternativo para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído (PFA). O tratamento com PFA faz ligações cruzadas de proteínas dentro das células bacterianas para prevenir a atividade metabólica, preservando a estrutura celular e o conteúdo nutricional. Este método é de alto rendimento e pode ser usado em cultura líquida ou placas sólidas, pois o teste de uma placa de bactérias tratadas com PFA para crescimento valida todo o lote. A inativação metabólica através do tratamento com PFA pode ser usada para eliminar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano em estudos de suplementação de drogas ou metabólitos, resistência ao estresse, metabolômica e comportamento em C. elegans.
Introduction
Caenorhabditis elegans foi originalmente proposto como organismo modelo em 19651 e desde então tem sido amplamente adotado em estudos de genética, desenvolvimento, comportamento, envelhecimento e metabolismo2. Devido ao seu grande tamanho de ninhada e cutícula transparente, C. elegans é particularmente adequada para triagem de alto rendimento com repórteres fluorescentes3. Seu curto ciclo de vida, reprodução hermafrodita e homologia genética com humanos também fazem de C. elegans um valioso sistema modelo para estudos sobre o desenvolvimento4 e biologia do envelhecimento5. Além disso, C. elegans são relativamente fáceis de manter. Os vermes podem ser cultivados em cultura líquida ou em placas sólidas de ágar e consumir uma dieta de bactérias vivas de Escherichia coli OP504.
No entanto, a fonte de alimento vivo de C. elegans pode confundir estudos de metabolismo, suplementação de drogas e comportamento. Como as bactérias vivas têm seu próprio metabolismo, as condições experimentais que afetam as bactérias também alteram os nutrientes e metabólitos disponíveis para os vermes. Por exemplo, diferenças nas concentrações bacterianas de ferro, aminoácidos e folato têm diversos efeitos sobre o desenvolvimento, fisiologia e vida útil de C. elegans 6. Muitas práticas comuns de laboratório podem provocar tais mudanças na composição de nutrientes e metabólitos produzidos pelo OP50. Especificamente, a exposição à 5-fluor-2'-desoxiuridina (FUdR), um composto comumente usado para prevenir a reprodução em C. elegans, provoca amplas alterações na expressão gênica do gene OP50, incluindo vias de biossíntese de aminoácidos7. Bactérias vivas também podem confundir estudos em que C. elegans são suplementados com pequenas moléculas porque as bactérias podem metabolizar parcial ou completamente os compostos ativos. Além disso, os efeitos dessas pequenas moléculas sobre as bactérias podem, por sua vez, alterar a fisiologia de C. elegans, como foi relatado com o fármaco que prolonga a vida útil da metformina8. Finalmente, bactérias vivas podem alterar o ambiente do verme de maneiras que alteram o comportamento, como secretar odorantes atraentes9, produzir neuromoduladores exógenos10 e criar gradientes de oxigênio em um gramado bacteriano denso11.
Para atenuar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano na pesquisa de C. elegans , vários métodos para matar bactérias foram desenvolvidos (Tabela 1). Três estratégias comuns para matar OP50 são irradiação UV, morte por calor e tratamento com antibióticos. Embora simples e relativamente de baixo custo, cada um desses métodos pode ter efeitos indesejáveis sobre bactérias e C. elegans. A eliminação por UV através de um reticulador UV12 é de baixo rendimento e a taxa é limitada pelo número de placas que podem caber no reticulante UV. Além disso, a eficácia da eliminação por UV pode variar de placa para placa dentro de um lote, e o teste de crescimento em todas as placas pode se tornar difícil em grandes experimentos. Matar o calor OP50 expondo a cultura a temperaturas de >60 °C vem com um conjunto separado de desafios. O calor elevado pode danificar nutrientes essenciais para o verme e destruir a estrutura celular das bactérias, criando uma textura mais macia que diminui a quantidade de tempo que os vermes passam no alimento13. Este método também não pode ser usado durante todo o ciclo de vida de C. elegans , pois vermes alimentados com bactérias mortas pelo calor podem parar no início do desenvolvimento13. O tratamento com antibióticos é um terceiro método comum para suprimir o metabolismo bacteriano14, mas os antibióticos também podem alterar o crescimento e o metabolismo do verme15.
Uma solução para eliminar os efeitos metabólicos de bactérias vivas, preservando a estrutura bacteriana e nutrientes essenciais, é matar a OP50 com paraformaldeído (PFA)16. O PFA é um polímero de formaldeído que pode fazer ligações cruzadas entre proteínas dentro das células17 para impedir a replicação bacteriana sem destruir estruturas celulares internas, como a membrana plasmática interna18. Devido a essa preservação da estrutura celular interna, as bactérias tratadas com PFA não exibem crescimento ou atividade metabólica, mas permanecem como fonte alimentar comestível e rica em nutrientes para C. elegans16. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido que mostra como inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído.
| Método | Materiais necessários | Escalonável? | Nutricional? | Efeitos sobre o verme? | ||||
| UV | Reticulante UV | Limitado por: | Sim | Efeitos variáveis na vida útil de NGM12, 23, 24 | ||||
| Número de placas que se encaixam no reticulante UV | Efeitos variáveis na vida útil do FUdR24, 26, 27 | |||||||
| Tempo de irradiação por placa | Diminuição da preferência alimentar16 | |||||||
| Capacidade de verificar o crescimento de cada placa8 | ||||||||
| Calor | Incubadora >60 °C | Sim | Não: destrói a parede celular, diminuição do valor nutricional | Prisão preventiva 13 | ||||
| Diminuição da preferência alimentar13 | ||||||||
| Prolonga a vida útil no NGM31 | ||||||||
| Antibióticos | Antibióticos (canamicina, carbenicilina, etc.) | Sim | Sim | Atrasa o crescimento e o desenvolvimento15 | ||||
| Prolonga a vida útil em meios líquidos19 | ||||||||
| Prolonga a vida útil no NGM15 | ||||||||
| PFA | 0,5% Paraformaldeído | Sim | Sim | Diminuição do tamanho da ninhadapequena 16 | ||||
| Aumento do tempo de desenvolvimentopequeno 16 | ||||||||
| Diminuição da preferência alimentar16 | ||||||||
Tabela 1. Comparações de métodos para matar OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotico-treatment, e PFA-treatment têm efeitos variados sobre o estado nutricional das bactérias e a saúde dos vermes alimentados com bactérias tratadas. Esses métodos para inativar replicativamente E. coli também diferem em seus materiais necessários e escalabilidade.
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Protocol
1. Inoculação de bactérias
- Preparar o caldo Luria (LB) dissolvendo 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio (NaCl) em 950 mL de água destilada.
- Ajustar o pH do LB para 7,0 adicionando hidróxido de sódio (NaOH) 5M. Isso deve exigir apenas cerca de 0,2 mL de NaOH.
- Autoclave o meio LB ajustado ao pH em um ciclo líquido por 45 min a 15 psi. Deixe a solução arrefecer e armazenar à temperatura ambiente.
- Inocular uma única colônia de bactérias em 100 mL de LB em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL. Cultivar as bactérias durante a noite em uma incubadora de agitação a 37 °C.
- Dependendo da saúde da colônia bacteriana, do tamanho do frasco e da velocidade com que o agitador está configurado, o tempo que leva para a bactéria crescer pode variar. Após ~14 h, verifique a densidade óptica (OD) das bactérias a 600 nm (OD600).
- Remova as bactérias do agitador quando o OD600 for 3,0 (1 x 109 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL). Se o OD600 for inferior a 3,0, devolva o balão à incubadora do agitador até que o OD desejado seja atingido.
- Aliquot as bactérias em tubos cônicos de 50 mL e armazenar a 4 °C ou prosseguir para a próxima etapa.
2. Trabalhando com paraformaldeído
NOTA: A concentração de paraformaldeído (PFA) utilizada e a duração da exposição podem variar um pouco dependendo do clima, localização e tipo de bactéria a ser tratada. Um bom ponto de partida para OP50 é a exposição a PFA 0,5% por 1 h, enquanto PFA 0,25% por 1 h pode ser suficiente para HT115.
- Prepare 32% de estoque de PFA ou use solução de PFA de 32% comprada comercialmente. Use equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados ao trabalhar com PFA. Use luvas e proteção ocular.
- Adicione PFA dentro de um exaustor de fumaça química com ventilação adequada. Descarte as lavagens e pontas de PFA contendo em recipientes apropriados para riscos químicos no exaustor.
3. Tratamento bacteriano com paraformaldeído
- Quando as bactérias atingirem um OD600 de 3,0, utilizar uma pipeta sorológica para transferir 50 mL para um novo frasco de Erlenmeyer de 250 mL. Guarde o resto para um controle ao vivo, um controle simulado (consulte a etapa 4) ou para tratar também com PFA, conforme necessário.
- Evite derramar de um frasco para outro e tenha cuidado para não salpicar as laterais do novo frasco com bactérias. As colónias do lado do frasco podem receber uma dose mais baixa de PFA.
- Na capa química, adicionar 781 μL de PFA 32% a 50 mL de bactérias para elevar a concentração final a 0,5%. Descarte a ponta utilizada em recipiente para resíduos sólidos de risco químico.
- Cobrir o balão com papel alumínio e regressar à incubadora de agitação a 37 °C durante 1 h. Após 1 h, retirar o balão da incubadora e prosseguir para o passo 5.
4. Controle simulado
- Quando as bactérias atingirem um OD600 de 3,0, use uma pipeta sorológica para transferir 50 mL da bactéria para um tubo cônico de 50 mL.
- Prossiga para o passo 5.3 para concluir os passos de lavagem semelhantes ao grupo tratado com PFA.
5. Lavar as bactérias para remover PFA residual
- Na capa química, utilizar uma pipeta sorológica para transferir as bactérias tratadas do frasco de Erlenmeyer para um tubo cônico de 50 mL. O uso de uma pipeta sorológica em vez de derramar as bactérias evitará a contaminação de quaisquer colônias bacterianas na borda do frasco que possam ter evitado o tratamento direto com PFA.
- Centrifuga tratou bactérias a aproximadamente 3000 x g por 20 min. Remova o sobrenadante descartando-o em um recipiente de risco químico de resíduos líquidos na coifa química.
- Adicione 25 mL de LB e vórtice para ressuspender o pellet bacteriano (Encher o tubo totalmente dificulta a ressuspensão do pellet). Repita a centrifugação e a ressuspensão do pellet 4x.
- Ressuspenda o pellet em volumes ideais para diferentes ensaios. Para os ensaios de vida útil, sementes de placas de 60 mm com 200 μL de bactérias ressuspendidas em 10 mL de LB. A ressuspensão das bactérias em 10 mL de LB resulta em uma concentração de 5x da cultura original de 50 mL.
- Conservar as bactérias a 4 °C.
6. Verificação da qualidade do crescimento bacteriano
- Após a lavagem final e ressuspensão, passe uma placa LB (usando uma ponta de pipeta estéril) com as bactérias preparadas. É uma boa prática riscar o LB usado para lavar e ressuspender em uma placa separada, bem como certificar-se de que o LB usado não foi contaminado.
- Coloque as placas em uma incubadora de 37 °C durante a noite. Verifique se há algum crescimento. As bactérias são consideradas replicativamente mortas quando as colônias não crescem na placa LB.
7. Verificação de qualidade do metabolismo bacteriano usando um respirômetro
- Após a lavagem final e ressuspensão do passo 5.4, confirmar se as bactérias estão metabolicamente mortas usando ferramentas disponíveis, como respirômetros19,20 e medindo a taxa basal de consumo de oxigênio (OCR).
- Preparar solução M9: Dissolver 3 g de fosfato de potássio monobásico (KH 2 PO 4), 6 g de fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) e 5 g de cloreto de sódio (NaCl) em 950 ml de água destilada. Autoclave em ciclo líquido por 45 min a 15 psi e, em seguida, deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente. Adicionar 1 mL de sulfato de magnésio 1 M (MgSO4) e armazenar à temperatura ambiente.
- Hidratar o cartucho do respirômetro: Adicione 200 μL de calibrador a todos os poços de uma placa de 96 poços. Coloque o cartucho na placa de 96 poços e incube durante a noite em uma incubadora de 37 °C.
- Calibração do ensaio: No dia seguinte, coloque o cartucho hidratado na máquina e inicie a calibração.
- Configuração da placa de teste de ensaio: Usando uma nova placa de 96 poços, adicione 160 μL de M9 e 40 μL das bactérias preparadas (1 x 109 UFC/mL) para testar poços. Adicione 200 μL de M9 aos 4 poços de canto para usar como poços em branco. Adicionar 160 μL de M9 e 40 μL de LB utilizados para lavagem e ressuspensão para utilização como controlos negativos. Adicionar 200 μL de M9 ao restante dos poços que não serão utilizados.
- Execute o ensaio: Quando a calibração do cartucho estiver concluída, insira a placa de ensaio da etapa 7.5 na máquina para análise. As configurações incluem etapas para misturar, esperar, medir e fazer loop. Os resultados serão apresentados como taxa de consumo de oxigênio (OCR). As bactérias estão metabolicamente mortas e prontas para uso quando o OCR é zero.
Gráfico 1. Fluxo de trabalho para tratamento com paraformaldeído. Uma única colônia de bactérias E. coli OP50 é cultivada durante a noite. PFA é adicionado a uma concentração final de 0,5%, e a cultura tratada com PFA é agitada por 1 h a 37 °C. Finalmente, o PFA é removido lavando a cultura com LB fresco 5x. Para confirmar que as bactérias tratadas são replicativamente inativas, retire uma placa LB das bactérias tratadas e cresça durante a noite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Um fluxo de trabalho detalhado do protocolo é mostrado na Figura 1. Um método de alto rendimento foi desenvolvido e otimizado para inativar consistentemente a replicação bacteriana (Figura 2A) e o metabolismo (Figura 2B) para estudos metabólicos e de drogas em pesquisas de C. elegans usando paraformaldeído16. O objetivo era determinar a menor concentração de PFA necessária e o menor tempo necessário para matar consistentemente as bactérias sem impactar várias medidas de saúde nos vermes. Esses valores podem variar de um local para outro, dependendo do ambiente de laboratório e de uma cepa bacteriana para outra. Por exemplo, a exposição da bactéria HB101 a 0,25% por 1 h é suficiente para torná-la metabolicamente inativa (Figura 2C), enquanto o Enterococcus faecalis (EF) requer uma concentração de PFA de 1,0% (Figura 2D) para um efeito consistente. Uma abordagem para otimização de laboratório individual foi previamente estabelecida16 e é detalhada neste trabalho atual.
Atração e consumo de alimentos
À medida que as bactérias crescem e se replicam, elas liberam vários metabólitos e feromônios que são atraentes para os vermes. Para determinar se as minhocas permanecem atraídas pelo OP50 tratado com PFA, as placas foram semeadas com OP50 tratadas com PFA ou tratadas simuladamente e a porcentagem de vermes presentes no gramado do alimento em comparação com fora do gramado foi tabulada. Os dados mostram que os vermes são atraídos para o OP50 tratado com PFA, uma vez que a maioria dos vermes permanece no gramado bacteriano após 1 h (Figura 3A), semelhante ao observado com o controle tratado com simulação (Figura 3B). No entanto, como esperado, um ensaio pareado sensível21 mostra que C. elegans tem uma preferência mais forte pelo controle vivo tratado com simulação (Figura 3C) quando semeado com o PFA tratado na mesma placa. Tendo estabelecido que os vermes são atraídos por bactérias mortas por PFA, embora menos do que as bactérias vivas, era imperativo estabelecer que eles comem o alimento morto por PFA. Para determinar se os vermes consomem o OP50 tratado com PFA, a taxa de bombeamento dos vermes em diferentes tipos de alimentos foi medida. Como mostrado na Figura 3D, vermes no OP50 tratado com PFA têm uma taxa de bombeamento maior (+25%) do que os vermes no controle tratado simulado. Isso indica que os vermes não estão diminuindo propositalmente sua taxa de ingestão em alimentos mortos por PFA e pode indicar uma taxa mais alta de ingestão ou uma resposta compensatória a uma mudança na facilidade de bombear o alimento tratado.
Fecundidade, desenvolvimento e vida útil
Alterações nas condições alimentares podem ter efeitos fisiológicos sobre verminoses13,22. Para testar efeitos amplos, mudanças na taxa de desenvolvimento, fecundidade e expectativa de vida foram medidas. O OP50 tratado com PFA atrasa ligeiramente o tempo de desenvolvimento (~4 h) de vermes N2 selvagens, como mostrado na Figura 4A. O monitoramento da capacidade de oviposição de vermes cultivados em diferentes condições bacterianas mostra uma ligeira, mas significativa diminuição da fecundidade (-21%) nos vermes alimentados com OP50 tratado com PFA (Figura 4B). Para laboratórios interessados no envelhecimento de C. elegans, o efeito do OP50 tratado com PFA sobre a longevidade foi então determinado. Curiosamente, o tempo de vida dos vermes selvagens alimentados com OP50 tratado com PFA não foi significativamente diferente dos vermes alimentados com OP50 tratados simuladamente em placas padrão de meio de crescimento de nematoides (NGM) (Figura 4C), no entanto, OP50 tratado com PFA aumenta a expectativa de vida selvagem (+23%) quando FUdR está presente (Figura 4D). A alimentação de OP50 tratado com PFA para uma cepa fmo-2 superexpressiva (OE) de vida longa20 não altera sua longevidade em comparação com vermes selvagens (Figura 4E). OP50 UV-, calor-, e antibiótico-morto também foram mostrados para alterar a vida útil de C. elegans. Especificamente, bactérias tratadas com UV têm sido relatadas para prolongar a vida útil em NGM12,23 e em FUdR 24. No entanto, há dados conflitantes sobre a interação de FUdR e bactérias mortas por UV25,26 que podem ser devidos a métodos variados de eliminação UV e validação da inatividade metabólica nas bactérias. Além disso, bactérias mortas pelo calor prolongam a vida útil em NGM27, e antibióticos prolongam a vida útil em NGM15 e em cultura líquida28.
Gráfico 2. O tratamento de bactérias com PFA inibe a proliferação e o metabolismo. (A) Crescimento de bactérias em unidades formadoras de colônias (UFC) de OP50 tratadas com APF e 0,5%. (B) Taxa de acidificação extracelular (ECAR) em mpH/min de OP50 tratados com simulação e 0,5% com PFA. (C) Taxa basal de consumo de oxigênio (OCR) em pmol/min do HB101 tratado com FOF, 0,25% tratado com PFA e 0,5% tratado com PFA. (D) Taxa basal de consumo de oxigênio (OCR) em pmol/min de enterococcus faecalis (FE) tratados com 0,25%, 0,5% com PFA e 1,0% com PFA. Todas as barras de erro apresentadas nas figuras representam o erro padrão da média (EPM); Um teste t bicaudal foi usado para derivar os valores de p. denota valor de p < 0,0001. Este número foi modificado de 16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 3. Os vermes são atraídos pelo OP50 tratado com PFA. Porcentagem de vermes atraídos para (A) gramado bacteriano tratado com PFA ou (B) tratado com simulação OP50. (C) Ensaio sensibilizado pareado testando a preferência de vermes por OP50 tratado com simulação e tratado com PFA. (D) Taxa de bombeamento (bombas por 30 s) de minhocas em OP50 tratadas com PFA ou com tratamento simulado. Uma análise bicaudal do teste t foi usada para derivar valores de p para todas as comparações. Todas as barras de erro apresentadas nas figuras representam o erro padrão da média (EPM); denota valor de p < 0,0001. Os painéis A-C foram modificados de 16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 4. Os vermes crescem e se desenvolvem em OP50 tratado com PFA. (A) Tempo de desenvolvimento (h) de vermes de adultos poedouros em OP50 tratados com simulação e PFA. (B) Progênie média (número de vermes) de vermes alimentados com OP50 tratado com simulação ou PFA. (C, D) Porcentagem de vermes vivos alimentados com OP50 tratados com simulado ou PFA em placas de vida útil (C) NGM e (D) FUdR. (E) Porcentagem de vivos de vermes OE selvagens e fmo-2 alimentados com OP50 tratados com PFA. Um teste t bicaudal foi usado para derivar valores de p para comparações de desenvolvimento e fecundidade. O teste de log-rank foi usado para derivar valores de p para comparações de tempo de vida. Todas as barras de erro apresentadas nas figuras representam o erro padrão da média (EPM); * denota p-valor < 0,05, *** denota p-valor <0,001, e **** denota p-valor < 0,0001. Os painéis A, B e D foram modificados de16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Benefícios da morte por PFA em relação a outros métodos de eliminação bacteriana
O tratamento com PFA é um método de alto rendimento para prevenir o metabolismo bacteriano, mantendo uma fonte de alimento nutritivo para C. elegans. Matar bactérias através do tratamento com PFA tem múltiplas vantagens sobre outros métodos. Ao contrário do tratamento UV, onde cada placa deve ser testada para matar com sucesso, uma única placa de um lote de bactérias tratadas com PFA pode ser testada para validar o lote16. O tratamento com PFA também é muito eficaz na eliminação do metabolismo bacteriano (Figura 2B), e as bactérias tratadas com PFA exibem atividade metabólica diminuída em relação às bactérias tratadas com antibiótico19. Outro benefício do tratamento com PFA é que as bactérias mantêm sua estrutura celular e perfil nutricional. Consequentemente, vermes podem se desenvolver em bactérias tratadas com PFA, enquanto a alimentação de bactérias mortas pelo calor a partir do ovo resulta em parada do desenvolvimento13,16.
Etapas críticas e solução de problemas
Embora o tratamento de bactérias com PFA seja um protocolo relativamente simples, é importante validar que cada lote de bactérias está replicativa e metabolicamente morto (etapas 6 e 7) e garantir que as etapas de lavagem após o tratamento com PFA sejam feitas completamente (etapa 5). Se as colônias crescerem na etapa 6, indicando que a bactéria não está completamente morta, é possível solucionar problemas com a concentração de PFA e a duração do tratamento com PFA na etapa 3. Ao otimizar o protocolo de tratamento com PFA, uma concentração de 0,5% de PFA foi ideal para matar com sucesso OP50 com efeitos colaterais mínimos. PFA a 0,25% não foi suficiente para matar metabolicamente todas as cepas de bactérias (Figura 2C-D) e o aumento da concentração para 0,5% de PFA não alterou o tempo de desenvolvimento, a expectativa de vida ou a preferência alimentar dos vermes no OP50 em relação ao PFA a 0,25%. Além disso, 1 h de inoculação com PFA foi o menor tempo suficiente para prevenir todo o crescimento bacteriano. Se as bactérias não forem completamente mortas por uma inoculação de 1 h com PFA a 0,5%, o tempo de inoculação e/ou a concentração de PFA podem ser aumentados para solucionar problemas de eficiência de matança. Um segundo passo fundamental no protocolo é lavar as bactérias após o tratamento com PFA (passo 5). É muito importante completar todas as cinco lavagens e remover completamente o sobrenadante a cada lavagem para garantir que nenhum formol permaneça nas bactérias. Se os vermes não estiverem crescendo bem ou não bombeando sobre as bactérias tratadas com PFA, lavagens adicionais podem ser realizadas.
Limitações do método
Embora as bactérias mortas por PFA sejam ideais para eliminar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano (Figura 2B) dos estudos com C. elegans, há limitações nesse método. Especificamente, C. elegans tem desenvolvimento ligeiramente mais lento em bactérias tratadas com PFA em relação a bactérias vivas (Figura 4A)16. O tratamento com PFA também prolonga a vida útil do verme se o FUdR estiver presente (Figura 4D), mas não em placas NGM (Figura 4C)16. No entanto, outros métodos também apresentam esses desafios; As bactérias mortas por UV também alteram o tempo de vida de C. elegans. A maioria dos relatos sugere que as bactérias tratadas com UV prolongam a vida útil dos vermes em NGM12,23 e em FUdR 24, com outros estudos indicando que o tratamento UV não afeta a expectativa de vida 24 e que há uma interação entre o tratamento UV e FUdR na vida útil de C. elegans 25,26. Além dos efeitos ao longo da vida das bactérias tratadas com PFA, os vermes preferem gastar tempo com bactérias vivas em relação às bactérias tratadas com PFA (Figura 3C)16, mas têm uma taxa de bombeamento maior nos alimentos tratados com PFA (Figura 3D). Isso sugere que eles podem consumir uma quantidade semelhante de alimentos ou que as bactérias tratadas com PFA são mais fáceis ou mais difíceis de comer. Muitos desses efeitos também são observados com outros métodos de matar bactérias12,13,14, sugerindo que bactérias metabolicamente ativas diminuem o tempo de desenvolvimento, encurtam o tempo de vida e são mais atraentes para C. elegans.
Aplicações potenciais de bactérias tratadas com PFA
Em geral, a capacidade de matar de forma rápida e confiável grandes lotes de bactérias tem grande potencial para eliminar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano em estudos de C. elegans. Esta capacidade é particularmente útil para telas de drogas, experimentos de suplementação, ensaios de toxicidade, estudos metabolômicos, e examinar os efeitos do metabolismo microbiano no comportamento do hospedeiro. Mais informações sobre o uso de bactérias tratadas com PFA em cada uma dessas aplicações estão abaixo.
Experimentos de drogas, suplementação e toxicidade: Como apenas uma placa por lote de bactérias tratadas com PFA precisa ser testada para matar o sucesso, as bactérias mortas por PFA podem ser adicionadas à cultura líquida para triagem de drogas de alto rendimento. As bactérias tratadas com PFA também podem ser semeadas em placas sólidas com pequenas moléculas ou nutrientes incorporados ao meio ágar. Placas sólidas semeadas com bactérias tratadas com PFA também podem ser úteis para ensaios de toxicidade ou resposta ao estresse. Dados não publicados sugerem que as bactérias tratadas com PFA podem ajudar a distinguir entre o papel das vias bacterianas de resposta ao estresse e das vias de resistência ao estresse de vermes na resistência ao paraquat e à tunicamicina. O uso de bactérias mortas por PFA nesses estudos de suplementação e toxicidade de drogas impede que as bactérias metabolizem a molécula de interesse e garantirá que qualquer fenótipo observado resulte de um composto agindo diretamente sobre C. elegans. O uso de bactérias metabolicamente mortas para experimentos de drogas e suplementação também minimiza a variabilidade na dosagem, pois bactérias vivas podem metabolizar diferentes quantidades do composto de interesse de experimento para experimento.
Estudos metabolômicos: estudos metabolômicos de C. elegans também podem ser confundidos pelo metabolismo bacteriano: observar alterações no metabolismo de vermes requer a ausência de atividade metabólica bacteriana29. Mesmo pequenas mudanças na fonte de alimento bacteriana podem alterar o metaboloma do verme. Por exemplo, o metaboloma de vermes alimentados com bactérias vivas lavadas difere do metaboloma de vermes alimentados com bactérias vivas não lavadas16. O consumo de bactérias tratadas com PFA também altera o metaboloma do verme em relação ao consumo de alimentos vivos16 , mas permite comparações entre os efeitos das condições experimentais sobre o metabolismo de C. elegans isolado do metabolismo bacteriano.
Estudos comportamentais do micróbio hospedeiro: Finalmente, bactérias tratadas com PFA podem ser usadas para identificar interações entre o metabolismo bacteriano e o comportamento do hospedeiro. Metabólitos secretados por bactérias patogênicas e não patogênicas podem ser atrativos ou repelentes a vermes para afetar seu comportamento de forrageamento e alimentação10,11,30. Além disso, as bactérias podem produzir neuromoduladores que impulsionam mudanças na locomoção30. Além disso, o crescimento de C. elegans em diferentes linhagens de bactérias resulta em alteração no tamanho, tempo de desenvolvimento e fisiologia da ninhada31,32. O tratamento dessas bactérias com PFA pode ajudar a determinar se os efeitos de uma determinada bactéria sobre C. elegans requerem metabolismo bacteriano ativo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH R21AG059117 e pelo Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research da Universidade de Michigan. O SB foi financiado pela T32AG000114. O ESK foi financiado pela NSF DGE 1841052.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
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