Summary
Laboratuvarda Caenorhabditis elegans için besin kaynağı canlı Escherichia coli'dir. Bakteriler metabolik olarak aktif olduklarından, metabolik ve ilaç çalışmalarında karıştırıcı bir değişken sunarlar. Paraformaldehit kullanarak bakterileri metabolik olarak etkisiz hale getirmek için ayrıntılı bir protokol burada açıklanmaktadır.
Abstract
Caenorhabditis elegans , genetik, gelişim, yaşlanma, metabolizma ve davranış araştırmaları için yaygın bir model organizmadır. C. elegans canlı bakteri diyeti tükettiğinden, besin kaynaklarının metabolik aktivitesi, çeşitli müdahalelerin solucan üzerindeki doğrudan etkilerini arayan deneyleri karıştırabilir. Bakteriyel metabolizmanın kafa karıştırıcı etkilerinden kaçınmak için, C. elegans araştırmacıları, ultraviyole (UV) ışınlama, ısı öldürme ve antibiyotikler dahil olmak üzere bakterileri metabolik olarak etkisiz hale getirmek için birçok yöntem kullandılar. UV işlemi nispeten düşük verimlidir ve sıvı kültürde kullanılamaz çünkü her plakanın başarılı bakteri öldürme açısından incelenmesi gerekir. İkinci bir tedavi yöntemi olan ısı öldürme, bakterilerin dokusunu ve beslenme kalitesini olumsuz etkileyerek C. elegans'ın gelişimsel durmasına yol açar. Son olarak, antibiyotik tedavisi, bakteri üremesini önlemenin yanı sıra C. elegans fizyolojisini doğrudan değiştirebilir. Bu makale, paraformaldehit (PFA) kullanarak bakterileri metabolik olarak etkisiz hale getirmek için alternatif bir yöntemi açıklamaktadır. PFA tedavisi, hücresel yapıyı ve besin içeriğini korurken metabolik aktiviteyi önlemek için bakteri hücreleri içindeki proteinleri çapraz bağlar. Bu yöntem yüksek verimlidir ve bir PFA ile muamele edilmiş bakteri plakasının büyüme açısından test edilmesi tüm partiyi doğruladığından, sıvı kültürde veya katı plakalarda kullanılabilir. PFA tedavisi yoluyla metabolik inaktivasyon, bakteri metabolizmasının ilaç veya metabolit takviyesi, stres direnci, metabolomik ve davranış çalışmaları üzerindeki kafa karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırmak için kullanılabilir.
Introduction
Caenorhabditis elegans ilk olarak 1965'te bir model organizma olarak önerildi1 ve o zamandan beri genetik, gelişim, davranış, yaşlanma ve metabolizma çalışmalarında yaygın olarak benimsendi2. Büyük kuluçka boyutları ve şeffaf kütikülleri nedeniyle, C. elegans özellikle floresan raportörlerle yüksek verimli tarama için çok uygundur3. Kısa yaşam döngüleri, hermafrodit üremeleri ve insanlarla genetik homolojileri de C. elegans'ı gelişim4 ve yaşlanma biyolojisi5 üzerine yapılan çalışmalar için değerli bir model sistem haline getirmektedir. Ayrıca, C. elegans'ın bakımı nispeten kolaydır. Solucanlar sıvı kültürde veya katı agar plakalarında yetiştirilebilir ve canlı Escherichia coli OP50 bakterilerinden oluşan bir diyet tüketebilir4.
Bununla birlikte, canlı besin kaynağı C. elegans metabolizma, ilaç takviyesi ve davranış çalışmalarını karıştırabilir. Canlı bakterilerin kendi metabolizmaları olduğu için, bakterileri etkileyen deneysel koşullar, solucanlar için mevcut olan besinleri ve metabolitleri de değiştirir. Örneğin, bakteriyel demir, amino asit ve folat konsantrasyonlarındaki farklılıkların C. elegans'ın gelişimi, fizyolojisi ve ömrü üzerinde çeşitli etkileri vardır6. Birçok yaygın laboratuvar uygulaması, OP50 tarafından üretilen besin bileşiminde ve metabolitlerde bu tür değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Spesifik olarak, C. elegans'ta üremeyi önlemek için yaygın olarak kullanılan bir bileşik olan 5-floro-2'-deoksiüridine (FUdR) maruz kalma, amino asit biyosentez yolları7 dahil olmak üzere OP50 gen ekspresyonunda geniş değişiklikler ortaya çıkarır. Canlı bakteriler ayrıca C. elegans'ın küçük moleküllerle desteklendiği çalışmaları da karıştırabilir, çünkü bakteriler aktif bileşikleri kısmen veya tamamen metabolize edebilir. Dahası, bu küçük moleküllerin bakteriler üzerindeki etkileri, yaşam süresini uzatan ilaç metformin8 ile bildirildiği gibi, C. elegans fizyolojisini değiştirebilir. Son olarak, canlı bakteriler solucanın ortamını, çekici koku maddeleri 9 salgılamak, eksojen nöromodülatörler10 üretmek ve yoğun bir bakteri çiminde oksijen gradyanları oluşturmak11 gibi davranışları değiştirecek şekilde değiştirebilir.
Bakteri metabolizmasının C. elegans araştırmaları üzerindeki kafa karıştırıcı etkilerini azaltmak için, bakterileri öldürmek için birden fazla yöntem geliştirilmiştir (Tablo 1). OP50'yi öldürmek için üç yaygın strateji UV ışınlaması, ısı öldürme ve antibiyotik tedavisidir. Basit ve nispeten düşük maliyetli olsa da, bu yöntemlerin her birinin hem bakteriler hem de C. elegans üzerinde istenmeyen etkileri olabilir. UV çapraz bağlayıcı12 aracılığıyla UV öldürme düşük verimlidir ve hız, UV çapraz bağlayıcıya sığabilecek plaka sayısı ile sınırlıdır. Ayrıca, UV öldürmenin etkinliği bir parti içinde plakadan plakaya değişebilir ve büyük deneylerde tüm plakalarda büyüme testi yapmak zor olabilir. OP50'yi kültürü >60 °C'lik sıcaklıklara maruz bırakarak ısıyı öldürmek ayrı bir dizi zorlukla birlikte gelir. Yüksek ısı, solucan için gerekli olan besin maddelerine zarar verebilir ve bakterilerin hücresel yapısını tahrip edebilir, bu da solucanların gıdaya harcadığı süreyi azaltan daha yumuşak bir doku oluşturur13. Bu yöntem aynı zamanda C. elegans'ın yaşam döngüsü boyunca kullanılamaz çünkü ısıyla öldürülmüş bakterilerle beslenen solucanlar gelişimin erken dönemlerinde tutuklanabilir13. Antibiyotik tedavisi, bakteri metabolizmasını baskılamak için üçüncü bir yaygın yöntemdir14, ancak antibiyotikler solucan büyümesini ve metabolizmasınıda değiştirebilir 15.
Bakteri yapısını ve temel besin maddelerini korurken canlı bakterilerin metabolik etkilerini ortadan kaldırmanın bir çözümü, OP50'yi paraformaldehit (PFA)16 ile öldürmektir. PFA, iç plazma zarı18 gibi iç hücre yapılarını tahrip etmeden bakteriyel replikasyonu önlemek için hücreler17 içindeki proteinleri çapraz bağlayabilen bir formaldehit polimeridir. İç hücresel yapının bu şekilde korunması nedeniyle, PFA ile tedavi edilen bakteriler büyüme veya metabolik aktivite göstermez, ancak C. elegans16 için yenilebilir ve besin açısından zengin bir besin kaynağı olarak kalır. Burada, paraformaldehit kullanarak bakterilerin metabolik olarak nasıl etkisiz hale getirileceğini gösteren ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.
| Yöntem | Gerekli Malzemeler | Ölçeklenebilir? | Beslenme? | Solucan Üzerindeki Etkileri? | ||||
| UV | UV çapraz bağlayıcı | Şununla sınırlı: | Evet | NGM12, 23, 24'te yaşam süresi üzerindeki değişken etkiler | ||||
| UV çapraz bağlayıcıya uyan plaka sayısı | FUdR24, 26, 27 üzerindeki yaşam süresi üzerindeki değişken etkiler | |||||||
| Plaka başına ışınlama süresi | Yiyecek tercihinde azalma16 | |||||||
| Her plakayı büyüme açısından kontrol etme yeteneği8 | ||||||||
| Isı | >60 °C inkübatör | Evet | Hayır: hücre duvarını tahrip eder, besin değerini azaltır | Gelişimsel tutuklama 13 | ||||
| Yiyecek tercihinde azalma13 | ||||||||
| NGM31'in kullanım ömrünü uzatır | ||||||||
| Antibiyotik | Antibiyotikler (kanamisin, karbenisilin vb.) | Evet | Evet | Büyüme ve gelişmeyi geciktirir15 | ||||
| Sıvı ortamlarda kullanım ömrünü uzatır19 | ||||||||
| NGM15'in kullanım ömrünü uzatır | ||||||||
| PFA (Üstün Başarı T | % 0.5 Paraformaldehit | Evet | Evet | Küçük kuluçka boyutunun azalması16 | ||||
| Küçük geliştirme süresi artışı16 | ||||||||
| Yiyecek tercihinde azalma16 | ||||||||
Tablo 1. OP50'yi öldürme yöntemlerinin karşılaştırılması. UV öldürme, ısı öldürme, antibiyotik tedavisi ve PFA tedavisi, bakterilerin beslenme durumu ve tedavi edilen bakterilerle beslenen solucanların sağlığı üzerinde çeşitli etkilere sahiptir. E. coli'yi replikatif olarak inaktive etmek için kullanılan bu yöntemler, gerekli malzemeleri ve ölçeklenebilirlikleri bakımından da farklılık gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteri aşılaması
- 10 g tripton, 5 g maya özü ve 10 g sodyum klorürü (NaCl) 950 mL damıtılmış suda çözerek Luria suyunu (LB) hazırlayın.
- 5M sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek LB'nin pH'ını 7.0'a ayarlayın. Bu sadece yaklaşık 0.2 mL NaOH gerektirmelidir.
- pH ayarlı LB ortamını 15 psi'de 45 dakika boyunca bir sıvı döngüsünde otoklavlayın. Çözeltinin soğumasını ve oda sıcaklığında saklanmasını bekleyin.
- 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde 100 mL LB içinde tek bir bakteri kolonisini aşılayın. Bakterileri gece boyunca 37 °C'lik bir çalkalayıcı inkübatörde kültürleyin.
- Bakteri kolonisinin sağlığına, şişenin boyutuna ve çalkalayıcının ayarlandığı hıza bağlı olarak, bakterilerin büyümesi için geçen süre değişebilir. ~14 saat sonra, bakterilerin optik yoğunluğunu (OD) 600 nm'de (OD600) kontrol edin.
- OD600 3.0 (1 x 109 koloni oluşturan birim (CFU)/mL) olduğunda bakterileri çalkalayıcıdan çıkarın. OD600 3.0'dan düşükse, istenen OD'ye ulaşılana kadar şişeyi çalkalayıcı inkübatörüne geri koyun.
- Bakterileri 50 mL'lik konik tüplerde saklayın ve 4 °C'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin.
2. Paraformaldehit ile çalışma
NOT: Kullanılan paraformaldehit (PFA) konsantrasyonu ve maruz kalma süresi, iklime, konuma ve tedavi edilen bakteri türüne bağlı olarak biraz değişebilir. OP50 için iyi bir başlangıç noktası, 1 saat boyunca% 0,5 PFA'ya maruz kalmaktır, oysa HT115 için 1 saat% 0,25 PFA yeterli olabilir.
- %32 PFA stoğu hazırlayın veya ticari olarak satın alınan %32 PFA solüsyonu kullanın. PFA ile çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.
- Uygun havalandırmaya sahip bir kimyasal davlumbazın içine PFA ekleyin. PFA içeren yıkamaları ve uçları çeker ocaktaki uygun kimyasal tehlike kaplarına atın.
3. Paraformaldehit ile bakteri tedavisi
- Bakteriler 3.0'lık bir OD600'e ulaştığında, 50 mL'yi yeni bir 250 mL Erlenmeyer şişesine aktarmak için serolojik bir pipet kullanın. Geri kalanını canlı kontrol, sahte işlem görmüş bir kontrol (bkz. adım 4) veya gerektiğinde PFA ile tedavi etmek için saklayın.
- Bir şişeden diğerine dökmekten kaçının ve yeni şişenin kenarlarına bakteri sıçratmamaya dikkat edin. Şişenin yan tarafındaki koloniler daha düşük dozda PFA alabilir.
- Kimyasal başlıkta, nihai konsantrasyonu %0,5'e getirmek için 50 mL bakteriye 781 μL %32 PFA ekleyin. Kullanılan ucu katı atık kimyasal tehlike kabına atın.
- Şişeyi folyo ile örtün ve 37 °C çalkalayıcı inkübatöre 1 saat geri dönün. 1 saat sonra, şişeyi inkübatörden çıkarın ve 5. adıma geçin.
4. Sahte işlem görmüş kontrol
- Bakteriler 3.0 OD 600'e ulaştığında,50 mL bakteriyi 50 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.
- PFA ile muamele edilmiş gruba benzer yıkama adımlarını tamamlamak için adım 5.3'e geçin.
5. Kalıntı PFA'yı gidermek için bakterilerin yıkanması
- Kimyasal başlıkta, işlenmiş bakterileri Erlenmeyer şişesinden 50 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için serolojik bir pipet kullanın. Bakterileri dökmek yerine serolojik bir pipet kullanmak, şişenin kenarında PFA ile doğrudan tedaviden kaçınmış olabilecek herhangi bir bakteri kolonisinden kontaminasyonu önleyecektir.
- Santrifüj ile muamele edilmiş bakterileri 20 dakika boyunca yaklaşık 3000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı, kimyasal davlumbazdaki sıvı atık kimyasal tehlike kabına atarak çıkarın.
- Bakteri peletini yeniden süspanse etmek için 25 mL LB ve vorteks ekleyin (Tüpün tamamen doldurulması, peletin yeniden süspanse edilmesini zorlaştırır). Santrifüjleme ve pelet yeniden süspansiyonunu 4x tekrarlayın.
- Pelet, farklı tahliller için en uygun hacimlerde yeniden süspanse edin. Yaşam süresi tahlilleri için, 10 mL LB içinde yeniden süspanse edilmiş 200 μL bakteri içeren 60 mm'lik plakaları tohumlayın. Bakterilerin 10 mL LB'de yeniden süspanse edilmesi, orijinal 50 mL kültürden 5x konsantrasyonla sonuçlanır.
- Bakterileri 4 °C'de saklayın.
6. Bakteri üremesinin kalite kontrolü
- Son yıkama ve yeniden süspansiyondan sonra, hazırlanan bakterilerle bir LB plakası (steril bir pipet ucu kullanarak) çizin. Kullanılan LB'nin kontamine olmadığından emin olmak için yıkama ve yeniden süspanse etme için kullanılan LB'yi ayrı bir plakaya sürmek iyi bir uygulamadır.
- Plakaları gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Herhangi bir büyüme olup olmadığını kontrol edin. Koloniler LB plakasında büyümediğinde bakteriler replikatif olarak ölü kabul edilir.
7. Bir respirometre kullanarak bakteri metabolizması için kalite kontrolü
- Son yıkamadan ve adım 5.4'ten itibaren yeniden süspansiyondan sonra, respirometreler19,20 gibi mevcut araçları kullanarak ve bazal oksijen tüketim oranını (OCR) ölçerek bakterilerin metabolik olarak öldüğünü doğrulayın.
- M9 çözeltisini hazırlayın: 3 g potasyum fosfat monobazik (KH2PO4), 6 g sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4) ve 5 g sodyum klorürü(NaCl) 950 mL damıtılmış suda çözün. 15 psi'de 45 dakika boyunca bir sıvı döngüsünde otoklavlayın, ardından çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. 1 mL 1 M magnezyum sülfat (MgS04) ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın.
- Respirometre kartuşunu nemlendirin: 96 oyuklu bir plakanın tüm kuyucuklarına 200 μL kalibrant ekleyin. Kartuşu 96 oyuklu plakaya yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
- Test kalibrasyonu: Ertesi gün, hidratlı kartuşu makineye yerleştirin ve kalibrasyona başlayın.
- Test test plakası kurulumu: Yeni bir 96 oyuklu plaka kullanarak, kuyucukları test etmek için 160 μL M9 ve 40 μL hazırlanmış bakteri (1 x 109 CFU / mL) ekleyin. Boş kuyu olarak kullanmak için 4 köşe kuyucuğuna 200 μL M9 ekleyin. Negatif kontroller olarak kullanmak üzere yıkama ve yeniden süspanse etme için kullanılan 160 μL M9 ve 40 μL LB ekleyin. Kullanılmayacak kuyucukların geri kalanına 200 μL M9 ekleyin.
- Testi çalıştırın: Kartuş kalibrasyonu tamamlandıktan sonra, 7.5. adımdaki test plakasını analiz için makineye yerleştirin. Ayarlar, karıştırma, bekleme, ölçme ve döngü adımlarını içerir. Sonuçlar oksijen tüketim oranı (OCR) olarak gösterilecektir. Bakteriler metabolik olarak ölüdür ve OCR sıfır olduğunda kullanıma hazırdır.
Şekil 1. Paraformaldehit arıtımı için iş akışı. Tek bir E. coli OP50 bakteri kolonisi gece boyunca büyütülür. PFA, %0.5'lik bir nihai konsantrasyona eklenir ve PFA ile muamele edilen kültür, 37 °C'de 1 saat çalkalanır. Son olarak, PFA, kültürün taze LB 5x ile yıkanmasıyla uzaklaştırılır. Tedavi edilen bakterilerin replikatif olarak inaktif olduğunu doğrulamak için, tedavi edilen bakterilerin bir LB plakasını çizin ve gece boyunca büyür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün ayrıntılı bir iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir. Paraformaldehit16 kullanılarak C. elegans araştırmalarında metabolik ve ilaç çalışmaları için bakteriyel replikasyonu (Şekil 2A) ve metabolizmayı (Şekil 2B) sürekli olarak etkisiz hale getirmek için yüksek verimli bir yöntem geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Amaç, ihtiyaç duyulan en düşük PFA konsantrasyonunu ve solucanlardaki çeşitli sağlık önlemlerini etkilemeden bakterileri tutarlı bir şekilde öldürmek için gereken en kısa süreyi belirlemekti. Bu değerler, laboratuvar ortamına bağlı olarak bir yerden diğerine ve bir bakteri türünden diğerine değişebilir. Örneğin, HB101 bakterisinin 1 saat boyunca %0.25'e maruz kalması, onu metabolik olarak inaktif hale getirmek için yeterlidir (Şekil 2C), Enterococcus faecalis (EF) ise tutarlı bir etki için %1.0 PFA konsantrasyonu gerektirir (Şekil 2D). Bireysel laboratuvar optimizasyonu için bir yaklaşım daha önce oluşturulmuştur16 ve bu mevcut çalışmada detaylandırılmıştır.
Gıda çekiciliği ve tüketimi
Bakteriler büyüdükçe ve çoğaldıkça, solucanlar için çekici olan çeşitli metabolitler ve feromonlar salgılarlar. Solucanların PFA ile muamele edilmiş OP50'ye çekilmeye devam edip etmediğini belirlemek için, plakalar PFA ile muamele edilmiş veya sahte muamele edilmiş OP50 ile ekildi ve çimlere kıyasla gıda çimlerinde bulunan solucanların yüzdesi tablo haline getirildi. Veriler, solucanların PFA ile muamele edilmiş OP50'ye çekildiğini göstermektedir, çünkü solucanların çoğu 1 saat sonra bakteri çiminde kalır (Şekil 3A), sahte muamele edilmiş kontrolde gözlemlenene benzer (Şekil 3B). Bununla birlikte, beklendiği gibi, hassas bir ikili tahlil21 , C. elegans'ın aynı plaka üzerinde PFA ile muamele edildiğinde sahte muamele edilmiş canlı kontrol için daha güçlü bir tercihe sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 3C). Solucanların, canlı bakterilerden daha az da olsa, PFA ile öldürülen bakterilere çekildiğini tespit ettikten sonra, PFA ile öldürülen yiyecekleri yediklerini tespit etmek zorunluydu. Solucanların PFA ile muamele edilmiş OP50'yi tüketip tüketmediğini belirlemek için, solucanların farklı gıda türlerine pompalama hızı ölçüldü. Şekil 3D'de gösterildiği gibi, PFA ile muamele edilmiş OP50 üzerindeki solucanlar, sahte muamele görmüş kontroldeki solucanlardan daha yüksek bir pompalama hızına (+%25) sahiptir. Bu, solucanların PFA ile öldürülen yiyeceklerde yeme hızlarını kasıtlı olarak yavaşlatmadıklarını ve ya daha yüksek bir yeme oranını ya da işlenmiş yiyeceğin pompalanma kolaylığındaki bir değişikliğe telafi edici bir yanıtı gösterebileceğini gösterir.
Doğurganlık, gelişme ve yaşam süresi
Gıda koşullarındaki değişikliklerin solucanlar üzerinde fizyolojik etkileri olabilir13,22. Geniş etkileri test etmek için, gelişme hızı, doğurganlık ve yaşam süresindeki değişiklikler ölçüldü. PFA ile muamele edilmiş OP50, Şekil 4A'da gösterildiği gibi vahşi tip N2 solucanlarının geliştirme süresini (~ 4 saat) biraz geciktirir. Farklı bakteri koşullarında yetiştirilen solucanların yumurtlama kapasitesinin izlenmesi, PFA ile muamele edilmiş OP50 ile beslenen solucanlarda doğurganlıkta hafif ama önemli bir azalma (% -21) göstermektedir (Şekil 4B). C. elegans yaşlanması ile ilgilenen laboratuvarlar için, PFA ile tedavi edilen OP50'nin uzun ömür üzerindeki etkisi daha sonra belirlendi. İlginç bir şekilde, PFA ile muamele edilmiş OP50 ile beslenen vahşi tip solucanların ömrü, standart nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarında sahte muamele edilmiş OP50 ile beslenen solucanlardan önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 4C), ancak PFA ile muamele edilen OP50, FUdR mevcut olduğunda vahşi tip ömrünü (+%23) artırır (Şekil 4D). PFA ile muamele edilmiş OP50'nin uzun ömürlü bir fmo-2 aşırı eksprese (OE) suşuna20 beslenmesi, vahşi tip solucanlara kıyasla uzun ömürlülüğünü değiştirmez (Şekil 4E). UV, ısı ve antibiyotikle öldürülen OP50'nin de C. elegans'ın ömrünü değiştirdiği gösterilmiştir. Spesifik olarak, UV ile muamele edilmiş bakterilerin NGM12,23 ve FUdR24'te ömrünü uzattığı bildirilmiştir. Bununla birlikte, FUdR ve UV ile öldürülen bakterilerin25,26 etkileşimi hakkında, çeşitli UV öldürme yöntemlerinden ve bakterilerdeki metabolik hareketsizliğin doğrulanmasından kaynaklanabilecek çelişkili veriler vardır. Ek olarak, ısıyla öldürülen bakteriler NGM27'de ömrü uzatır ve antibiyotikler NGM15'te ve sıvı kültürde28'de ömrü uzatır.
Şekil 2. Bakterilerin PFA ile tedavisi proliferasyonu ve metabolizmayı inhibe eder. (A) Sahte işlem görmüş ve% 0.5 PFA ile işlenmiş OP50'nin koloni oluşturan birimlerinde (CFU) bakteri büyümesi. (B) Sahte işlem görmüş ve% 0.5 PFA ile işlenmiş OP50'nin mpH / dak cinsinden hücre dışı asitlenme oranı (ECAR). (C) Sahte işlem görmüş, %0.25 PFA ile işlenmiş ve %0.5 PFA ile işlenmiş HB101'in pmol / dak cinsinden bazal oksijen tüketim oranı (OCR). (D) Sahte işlem görmüş, %0.25 PFA ile tedavi edilmiş, %0.5 PFA ile tedavi edilmiş ve %1.0 PFA ile tedavi edilmiş enterococcus faecalis'in (EF) pmol/dk cinsinden bazal oksijen tüketim oranı (OCR). Şekillerde gösterilen tüm hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder; P değerlerini elde etmek için iki kuyruklu bir t-testi kullanıldı. p değerini < 0.0001 gösterir. Bu rakam 16'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Solucanlar, PFA ile muamele edilmiş OP50'ye çekilir. (A) PFA ile muamele edilmiş veya (B) sahte muamele edilmiş OP50 bakteri çimine çekilen solucanların yüzdesi. (C) Sahte muamele edilmiş ve PFA ile muamele edilmiş OP50 için ikili duyarlı test testi solucan tercihi. (D) PFA ile muamele edilmiş veya sahte muamele edilmiş OP50 üzerindeki solucanların pompalama hızı (30 saniyede pompalar). Tüm karşılaştırmalar için p değerleri elde etmek için iki kuyruklu t-testi analizi kullanılmıştır. Şekillerde gösterilen tüm hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder; p değerini < 0.0001 gösterir. A-C panelleri 16'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Solucanlar PFA ile tedavi edilmiş OP50'de büyür ve gelişir. (A) Sahte muamele edilmiş ve PFA ile muamele edilmiş OP50'de yumurtadan yumurtlayan yetişkinlerden solucanların gelişme süresi (h). (B) Sahte muamele edilmiş veya PFA ile muamele edilmiş OP50 ile beslenen solucanların ortalama dölleri (solucan sayısı). (C, D) (C) NGM ve (D) FUdR yaşam süresi plakalarında sahte muamele edilmiş veya PFA ile muamele edilmiş OP50 ile beslenen solucanların canlı yüzdesi. (E) PFA ile muamele edilmiş OP50 ile beslenen vahşi tip ve fmo-2 OE solucanlarının canlı yüzdesi. Gelişim ve doğurganlık karşılaştırmaları için p değerleri elde etmek için iki kuyruklu t-testi analizi kullanılmıştır. Yaşam süresi karşılaştırmaları için p değerleri elde etmek için log-rank testi kullanıldı. Şekillerde gösterilen tüm hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder; * < değeri 0,05, *** <0,001 p değerini ve **** 0,0001 < p değerini gösterir. A, B ve D panelleri16'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PFA öldürmenin diğer bakteri öldürme yöntemlerine göre faydaları
PFA tedavisi, C. elegans için besleyici bir besin kaynağı sağlarken bakteri metabolizmasını önlemek için yüksek verimli bir yöntemdir. PFA tedavisi ile bakterileri öldürmenin diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Her plakanın başarılı öldürme için test edilmesi gereken UV tedavisinden farklı olarak, parti16'yı doğrulamak için PFA ile muamele edilmiş bir bakteri partisinden tek bir plaka test edilebilir. PFA tedavisi ayrıca bakteri metabolizmasını ortadan kaldırmada çok etkilidir (Şekil 2B) ve PFA ile tedavi edilen bakteriler, antibiyotikle tedavi edilen bakterilere göre azalmış metabolik aktivite sergiler19. PFA tedavisinin bir başka yararı da bakterilerin hücresel yapılarını ve beslenme profillerini korumalarıdır. Sonuç olarak, PFA ile tedavi edilen bakteriler üzerinde solucanlar gelişebilirken, ısıyla öldürülen bakterileri yumurtadan beslemek gelişimsel durmayaneden olur 13,16.
Kritik adımlar ve sorun giderme
PFA ile tedavi edilen bakteriler nispeten basit bir protokol olsa da, her bir bakteri grubunun replikatif ve metabolik olarak ölü olduğunu doğrulamak (adım 6 ve 7) ve PFA işleminden sonra yıkama adımlarının iyice yapıldığından emin olmak önemlidir (adım 5). Koloniler 6. adımda büyürse, bakterilerin tamamen ölmediğini gösterirse, 3. adımda PFA konsantrasyonunu ve PFA tedavisinin süresini gidermek mümkündür. PFA tedavi protokolünü optimize ederken, OP50'yi minimum yan etki ile başarılı bir şekilde öldürmek için %0.5'lik bir PFA konsantrasyonu idealdi. % 0.25 PFA, tüm bakteri suşlarını metabolik olarak öldürmek için yeterli değildi (Şekil 2C-D) ve konsantrasyonun% 0.5 PFA'ya yükseltilmesi, OP50'deki solucanların% 0.25 PFA'ya göre gelişim süresini, ömrünü veya gıda tercihini değiştirmedi. Ayrıca, PFA ile 1 saatlik aşılama, tüm bakteri üremesini önlemek için yeterli olan en kısa süreydi. Bakteriler %0,5 PFA ile 1 saatlik bir aşılama ile tamamen öldürülmezse, öldürme verimliliğini gidermek için aşılama süresi ve/veya PFA konsantrasyonu artırılabilir. Protokoldeki ikinci önemli adım, PFA işleminden sonra bakterilerin yıkanmasıdır (5. adım). Bakterilerde formaldehit kalmadığından emin olmak için beş yıkamanın tümünü tamamlamak ve her yıkamada süpernatanı tamamen çıkarmak çok önemlidir. Solucanlar iyi büyümüyorsa veya PFA ile tedavi edilmiş bakterileri pompalamıyorsa, ek yıkamalar yapılabilir.
Yöntemin sınırlamaları
PFA ile öldürülen bakteriler, bakteri metabolizmasının kafa karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırmak için ideal olsa da (Şekil 2B) C. elegans çalışmaları, bu yöntemin sınırlamaları vardır. Spesifik olarak, C. elegans, canlı bakterilere göre PFA ile tedavi edilen bakteriler üzerinde biraz daha yavaş gelişir (Şekil 4A)16. PFA tedavisi, FUdR varsa (Şekil 4D) solucan ömrünü de uzatır, ancak NGM (Şekil 4C) plakalarında (Şekil 4C)değildir 16. Bununla birlikte, diğer yöntemler de bu zorlukları ortaya koymaktadır; UV ile öldürülen bakteriler ayrıca C. elegans'ın ömrünü de değiştirir. Raporların çoğu, UV ile muamele edilen bakterilerin NGM12,23 ve FUdR 24'te solucan ömrünü uzattığını, diğer çalışmaların UV tedavisinin kullanım ömrünü 24 etkilemediğini ve UV tedavisi ile FUdR arasında bir etkileşim olduğunu göstermektedir. PFA ile tedavi edilen bakterilerin yaşam boyu etkilerine ek olarak, solucanlar, PFA ile tedavi edilen bakterilere göre canlı bakteriler üzerinde zaman geçirmeyi tercih eder (Şekil 3C)16, ancak PFA ile muamele edilen gıda üzerinde daha yüksek bir pompalama hızına sahiptir (Şekil 3D). Bu, benzer miktarda yiyecek tüketebileceklerini veya PFA ile tedavi edilen bakterilerin yemesinin daha kolay veya daha zor olduğunu düşündürmektedir. Bu etkilerin çoğu, diğer bakteri öldürme yöntemlerindede gözlenir 12,13,14, bu da metabolik olarak aktif bakterilerin gelişme süresini kısalttığını, ömrünü kısalttığını ve C. elegans için daha çekici olduğunu düşündürür.
PFA ile tedavi edilen bakterilerin potansiyel uygulamaları
Genel olarak, büyük bakteri gruplarını hızlı ve güvenilir bir şekilde öldürme yeteneği, C. elegans çalışmalarında bakteri metabolizmasının karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu yetenek özellikle ilaç taramaları, takviye deneyleri, toksisite deneyleri, metabolomik çalışmalar ve mikrobiyal metabolizmanın konakçı davranışı üzerindeki etkilerinin incelenmesi için yararlıdır. Bu uygulamaların her birinde PFA ile tedavi edilmiş bakterilerin kullanımı hakkında daha fazla bilgi aşağıdadır.
İlaç, takviye ve toksisite deneyleri: PFA ile tedavi edilmiş bakteri partisi başına yalnızca bir plakanın öldürme başarısı için test edilmesi gerektiğinden, PFA ile öldürülen bakteriler, yüksek verimli ilaç taraması için sıvı kültüre eklenebilir. PFA ile muamele edilmiş bakteriler, agar ortamına dahil edilen küçük moleküller veya besinler içeren katı plakalara da ekilebilir. PFA ile muamele edilmiş bakterilerle tohumlanmış katı plakalar, toksisite veya stres-tepki testleri için de yararlı olabilir. Yayınlanmamış veriler, PFA ile tedavi edilen bakterilerin, parakuat ve tunikamisin direncinde bakteriyel stres-tepki yollarının ve solucan stres-direnç yollarının rolü arasında ayrım yapmaya yardımcı olabileceğini düşündürmektedir. Bu ilaç takviyesi ve toksisite çalışmalarında PFA ile öldürülen bakterilerin kullanılması, bakterilerin ilgilenilen molekülü metabolize etmesini önler ve gözlemlenen herhangi bir fenotipin doğrudan C. elegans üzerinde etkili olan bir bileşikten kaynaklanmasını sağlar.İlaç ve takviye deneyleri için metabolik olarak ölü bakterilerin kullanılması, canlı bakteriler deneyden deneye ilgilenilen bileşiğin farklı miktarlarını metabolize edebildiğinden, dozlamadaki değişkenliği de en aza indirir.
Metabolomik çalışmalar: C. elegans metabolomik çalışmaları bakteri metabolizması ile de karıştırılabilir: solucan metabolizmasındaki değişiklikleri gözlemlemek, bakteriyel metabolik aktivitenin olmamasını gerektirir29. Bakteriyel besin kaynağındaki küçük değişiklikler bile solucan metabolomunu değiştirebilir. Örneğin, canlı yıkanmış bakterilerle beslenen solucanların metabolomu, canlı yıkanmamış bakterilerle beslenen solucanların metabolomundan farklıdır16. PFA ile tedavi edilmiş bakterilerin tüketilmesi, canlı gıda16 tüketimine göre solucan metabolomunu da değiştirir, ancak deneysel koşulların bakteri metabolizmasından izole olarak C. elegans metabolizması üzerindeki etkileri arasında karşılaştırmalara izin verir.
Konak-mikrop davranışsal çalışmaları: Son olarak, PFA ile tedavi edilen bakteriler, bakteri metabolizması ve konakçı davranışı arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanılabilir. Hem patojenik hem de patojenik olmayan bakteriler tarafından salgılanan metabolitler, yiyecek arama ve beslenme davranışlarını etkilemek için solucanlar için çekici veya itici olabilir10,11,30. Ayrıca, bakteriler hareketteki değişiklikleri yönlendiren nöromodülatörler üretebilir30. Ek olarak, farklı bakteri suşları üzerinde büyüyen C. elegans, kuluçka boyutunun, gelişme süresinin ve fizyolojisinin değişmesine neden olur31,32. Bu bakterilerin PFA ile tedavi edilmesi, belirli bir bakterinin C. elegans üzerindeki etkilerinin aktif bakteri metabolizması gerektirip gerektirmediğini belirlemeye yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH R21AG059117 ve Michigan Üniversitesi'ndeki Paul F. Glenn Yaşlanma Araştırmaları Biyolojisi Laboratuvarları tarafından finanse edildi. SB, T32AG000114 tarafından finanse edildi. ESK, NSF DGE 1841052 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
- Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
- Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
- McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
- Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
- Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
- Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
- Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
- Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
- Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
- Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Felix, H.
- Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
- MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
- Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
- Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
- Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
- O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
- Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).
