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Biochemistry

स्तनधारी कोशिकाओं के सीटू क्रायोटोमोग्राफी के लिए नमूना तैयारी

Published: December 15, 2023 doi: 10.3791/65697
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 2, 2,3, 2
1College of Liberal Arts, University of Minnesota, 2Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, Medical School, University of Minnesota, 3College of Biological Sciences, University of Minnesota
* These authors contributed equally

Summary

यह विधि सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी और कोररिलेटिव लाइट एंड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (सीएलईएम) के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) ग्रिड की तैयारी के लिए एक सुलभ और लचीला प्रोटोकॉल प्रदान करती है।

Abstract

सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी अपने मूल जमे हुए-हाइड्रेटेड सेलुलर संदर्भ में जटिल वस्तुओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, जिससे यह सेलुलर जीव विज्ञान और वायरोलॉजी के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है। अन्य माइक्रोस्कोपी तौर-तरीकों के साथ क्रायोटोमोग्राफी के संयोजन की क्षमता इसे एकीकृत और सहसंबंधित इमेजिंग के लिए एक आदर्श तकनीक बनाती है। हालांकि, सीटू सेलुलर टोमोग्राफी के लिए नमूना तैयारी सीधी नहीं है, क्योंकि कोशिकाएं इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर आसानी से संलग्न और फैली नहीं होती हैं। इसके अतिरिक्त, ग्रिड स्वयं नाजुक होते हैं और यदि बहुत बलपूर्वक संभाला जाता है तो टूट सकता है, जिसके परिणामस्वरूप छवि योग्य क्षेत्रों का नुकसान होता है। चिमटी के साथ ग्रिड में हेरफेर करते समय ऊतक संवर्धन व्यंजनों की ज्यामिति भी एक चुनौती पैदा कर सकती है। यहां, हम इन (और अन्य) चुनौतियों को दूर करने के लिए युक्तियों और चालों का वर्णन करते हैं और सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी और अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं के कोररिलेटिव इमेजिंग के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले नमूने तैयार करते हैं। क्रायोमाइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी में निरंतर प्रगति के साथ, यह तकनीक जटिल जैविक प्रणालियों की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए बहुत वादा करती है।

Introduction

सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी एक शक्तिशाली तकनीक है जो रासायनिक निर्धारण के बिना कोशिकाओं में जैविक रूप से प्रासंगिक संरचनाओं के अध्ययन की अनुमति देती है। ईएम ग्रिड में कोशिकाओं को संलग्न करके और क्रायोजेन में ग्रिड को फ्रीज करके,इंट्रासेल्युलर पानी 1,2 से क्रिस्टलीय बर्फ के गठन के बिना रुचि की वस्तुओं को उनके प्राकृतिक सेलुलर संदर्भों में जमे हुए हैं। रासायनिक निर्धारण और क्रिस्टलीय बर्फ गठन दोनों प्रासंगिक अणुओं की संरचनाओं को बाधित कर सकते हैं, जैसे प्रोटीन और लिपिड,इन तकनीकों का उपयोग करके प्राप्त छवियों की जैविक सटीकता को कम कर सकते हैं। टोमोग्राफी में, ग्रिड को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वृद्धिशील कोणों पर चित्रित किया जाता है, और इन छवियों का उपयोग तब लक्षित क्षेत्र के त्रि-आयामी प्रतिनिधित्व के निर्माण के लिए किया जाताहै। सीटू क्रायोटोमोग्राफी का उपयोग एकीकृत और कोररिलेटिव इमेजिंग के लिए अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ किया जा सकता है, जैसे क्रायोफ्लोरेसेंस इमेजिंग, सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी, और क्रायोएफआईबी / एसईएम (क्रायोजेनिक फोकस्ड आयन बीम / स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) 6,7,8,9,10,11।. कई तकनीकों का एकीकरण किसी भी एकल माइक्रोस्कोपी तकनीक की तुलना में एक संरचना या प्रक्रिया के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है।

सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी के सभी लाभों के बावजूद, नमूना तैयार करना विभिन्न कारणों से चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है। उनकी नाजुकता के कारण, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के बलपूर्वक हेरफेर से नुकसान हो सकता है, विशेष रूप से पतली कार्बन परत नाजुक और फटने का खतरा होता है, जिससे ग्रिड के छवि क्षेत्र कम हो जाते हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड को उनके छोटे आकार के कारण हेरफेर करना भी मुश्किल होता है और कोशिकाओं को विकसित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कुओं या माइक्रोस्लाइड की सतह से अलग होने का खतरा होता है। कुओं या माइक्रोस्लाइड्स के भीतर ग्रिड का हेरफेर इनकी ज्यामिति के कारण मुश्किल साबित हो सकता है। ग्रिड की अनुचित तैयारी (उदाहरण के लिए, उन्हें तैरने की अनुमति देना) कम सेल घनत्व और संभावित इमेजिंग क्षेत्रों की संख्या को कम कर सकता है, खासकर जब कोशिकाएं स्वयं ग्रिड से जुड़ने के लिए प्रवण नहीं होती हैं। प्रत्यक्ष सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी के लिए, कोशिकाओं को बहुत पतला फैलना चाहिए, जो कई कारणों से बाधित हो सकता है, जिसमें अनुचित तापमान या ग्रिड की खुरदरी हैंडलिंग शामिल है।

विभिन्न प्रकार के अनुकूलन के माध्यम से, इस लेख में प्रस्तुत तकनीकें इन सबसे आम नुकसानों को संभालने के लिए हैं जो क्रायोटोमोग्राफी के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड की तैयारी के दौरान उत्पन्न होती हैं। 5/15 कोण वाले चिमटी का उपयोग अच्छी तरह से प्लेटों या माइक्रोस्लाइड के भीतर ग्रिड के हेरफेर की अनुमति देता है। चढ़ाना से पहले ग्रिड के दोनों किनारों पर लागू एक फाइब्रोनेक्टिन समाधान फ्लोटिंग ग्रिड को कम संभावना बनाता है, जो यह सुनिश्चित करने में फायदेमंद है कि ग्रिड में पर्याप्त सेल घनत्व है और हेरफेर के कारण ग्रिड क्षतिग्रस्त होने की संभावना कम है। ठंड से ठीक पहले तक ग्रिड को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके, हम यह भी सुनिश्चित करते हैं कि कोशिकाओं को एक आरामदायक वातावरण में रखा जाए ताकि कोशिकाओं को अपने पतले किनारों को वापस लेने से रोका जा सके। पीछे की तरफ से ग्रिड को ब्लॉटिंग करना यांत्रिक बल से कोशिकाओं को नुकसान को भी रोकता है। कुल मिलाकर, ये उपाय सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी अध्ययनों के लिए नमूना तैयारी की सफलता दर को बढ़ाते हैं, जिससे इस इमेजिंग दृष्टिकोण की पहुंच बढ़ जाती है।

Protocol

1. ग्रिड की तैयारी

नोट: प्रायोगिक डिजाइन में, प्रति प्लज-फ्रीजिंग सत्र में अधिकतम 8-12 ग्रिड और प्रति कुएं 4-5 ग्रिड की योजना बनाएं। इससे अधिक एक बहुत लंबे डुबकी-फ्रीजिंग सत्र का कारण बनेगा, जिससे सेल तनाव, बर्फ संदूषण और उपयोगकर्ता त्रुटियां बढ़ सकती हैं।

  1. ग्लो डिस्चार्ज
    1. एक छिद्रित कार्बन समर्थन फिल्म के साथ उचित संख्या में ग्रिड लोड करें ताकि एक चमक निर्वहन डिवाइस में 0.39 एमबार वातावरण में 45 सेकंड के लिए 15 एमए पर चमक डिस्चार्ज की जा सके।
    2. सुनिश्चित करें कि ग्रिड का कार्बन पक्ष ऊपर की ओर है। समाप्त होने पर, ग्रिड को फ़िल्टर पेपर (चित्रा 1 ए 1) के साथ पंक्तिबद्ध एक साफ कंटेनर में स्थानांतरित करें।
      नोट: अन्य ग्रिड का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक कि सामग्री कोशिकाओं के लिए विषाक्त नहीं है (जिसमें कोई तांबा ग्रिड शामिल नहीं है)। फाइंडर ग्रिड सहसंबंधित अध्ययन के लिए उपयोगी हैं। अन्य सामग्रियों से बने ग्रिड भी संभव हैं। कई प्रयोगशालाओं में एसआईओ2 सपोर्ट ग्रिड 8,9 के शीर्ष पर कोशिकाओं को बढ़ाने के अच्छे परिणाम मिले हैं।
  2. अनुगामी उपचार
    1. ग्रिड, फाइब्रोनेक्टिन, पीबीएस, प्लेटों और चिमटी को जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें। ग्रिड के दोनों किनारों को 20 μg / mL गोजातीय फाइब्रोनेक्टिन के साथ एक बाँझ सतह पर अनुगामी समाधान के दो उदार आकार के बिंदुओं को माइक्रोपाइपटिंग करके इलाज करें, जैसे कि 6 वेल प्लेट का ढक्कन। सुनिश्चित करें कि डॉट्स पूरे ग्रिड को ढंकने के लिए पर्याप्त बड़े हैं (लगभग 100 μL की सिफारिश की जाती है)।
      नोट: चयनित अनुयायी समाधान के साथ उपचार से पहले, ग्रिड वर्गों के केंद्र पर कोशिकाओं के लगाव को अनुकूलित करने के लिए यहां ग्रिड को फोटो-माइक्रोपैटर्निंग का विकल्प है। सलाखों से जुड़ने के लिए कोशिकाओं की क्षमता को कम करने से छवि योग्य कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि होगी। यह क्रायोएफआईबी मिलिंग से जुड़े प्रयोगों के लिए आदर्श है।
    2. ग्रिड में हेरफेर करने के लिए 5/15 चिमटी का उपयोग करें। समाधान में ग्रिड के दोनों किनारों का इलाज करना सुनिश्चित करें।
      नोट: अन्य चिपकने वाले समाधान (फाइब्रिनोजेन, कोलेजन, अन्य बाह्य मैट्रिक्स घटक, आदि) का उपयोग किया जा सकता है। फाइब्रोनेक्टिन का उपयोग यहां किया जाता है, क्योंकि यह विभिन्न प्रकार की सेल लाइनों के साथ अच्छे परिणाम देता है। (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl)। 5/15 चिमटी उपयोगी है क्योंकि इसकी ज्यामिति 6-वेल प्लेटों, 35 मिमी व्यंजन और माइक्रो स्लाइड के आसपास बेहतर गतिशीलता की अनुमति देती है। इसके परिणामस्वरूप ग्रिड पर कम यांत्रिक तनाव और अधिक बरकरार कार्बन फिल्म होती है। सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक सामग्रियों को शुरुआत से पहले जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखा गया है, क्योंकि इससे ग्रिड संदूषण की संभावना कम हो जाती है।
  3. ग्रिड संलग्न करना
    1. एक बार गोजातीय फाइब्रोनेक्टिन के साथ इलाज करने के बाद, ग्रिड चिपचिपा हो जाएगा। 5/15 चिमटी का उपयोग करके, ग्रिड की गैर-कार्बन सतह को धीरे से एक खाली डिश / प्लेट के नीचे स्पर्श करें और चिमटी खोलें। ग्रिड को आसानी से नई सतह से जुड़ना चाहिए (चित्रा 1 ए2)।
      नोट: ग्रिड को सीधे केंद्र या डिश / प्लेट के किनारों में रखने से बचने की कोशिश करें। कोशिकाओं को जोड़ते समय, प्लेट के केंद्र में सेल घनत्व जमा होने की प्रवृत्ति होती है। इसके परिणामस्वरूप अत्यधिक सेलुलर घनत्व वाले ग्रिड हो सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, 3 डी-मुद्रित ग्रिड धारकों का उपयोग यहां डिश / प्लेट12 की सतह पर सीधे कोशिकाओं को संलग्न करने के बजाय किया जा सकता है।
  4. अंडे सेना
    1. फाइब्रोनेक्टिन अनुगामी समाधान (20 μg / mL) में 30 मिनट के लिए ग्रिड को इनक्यूबेट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि इस प्रक्रिया के दौरान ग्रिड सूखे न हों, माइक्रोपिपेट हर 15 मिनट में ग्रिड के शीर्ष पर सीधे अधिक अनुयायी समाधान की 1-2 बूंदें (चित्रा 1 ए3)।
      नोट: उपयोग किए गए अनुगामी समाधान के आधार पर इनक्यूबेशन अवधि अलग-अलग होगी। गोजातीय फाइब्रोनेक्टिन के लिए, अनुशंसित समय 30 मिनट है।
  5. धुलाई
    1. इनक्यूबेशन अवधि के बाद, माइक्रोपाइपिंग के माध्यम से अतिरिक्त अनुगामी समाधान को हटा दें। ग्रिड के शीर्ष पर सीधे पीबीएस की बूंदों को माइक्रोपाइटिंग करके ग्रिड को धोएं। इसे 2-3 बार दोहराएं। (चित्र 1 ए4)।
  6. नसबंदी
    1. 1 घंटे के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में ग्रिड को निष्फल करने के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग करें। नसबंदी को अधिकतम करने के लिए ग्रिड को यूवी स्रोत के जितना संभव हो उतना करीब रखें (चित्रा 1 ए5)। यह सुनिश्चित करने के लिए कि इस प्रक्रिया के दौरान ग्रिड सूखे न हों, हर 10 मिनट में ग्रिड के शीर्ष पर सीधे पीबीएस की 1-2 बूंदें माइक्रोपिपेट लें।
      नोट: चरण 1.4-1.6 समवर्ती रूप से किया जा सकता है।

2. सीडिंग ग्रिड

  1. कक्षों की गणना करें:
    1. यांत्रिक या एंजाइमेटिक तरीकों का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग और गिनें। गिनती से पहले सीडिंग के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की इष्टतम संख्या निर्धारित करें। 6-वेल प्लेट में बीजित यू 2 ओएस के लिए, 6 x 104 से 1.6 x 105 कोशिकाओं प्रति कुएं के बीच कहीं भी उपयोग करें (चित्रा 1 बी 1)।
      नोट: बीज वाली कोशिकाओं की संख्या सेल प्रकार, कुएं के सतह क्षेत्र, उपयोग किए गए डिश या माइक्रोस्लाइड, सीडिंग और डुबकी ठंड के बीच का समय और प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार भिन्न होगी। उन स्थितियों की पहचान करने के लिए सेल नंबरों की एक श्रृंखला का परीक्षण करें जिनके परिणामस्वरूप डुबकी ठंड के समय प्रति ग्रिड वर्ग में 0.25-1 कोशिकाएं होंगी। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि उच्च सेल घनत्व गर्मी हस्तांतरण की गति को कम करता है और विट्रीफिकेशन प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है। इसका मुकाबला करने के लिए, कुछ प्रयोगशालाओं ने सेल स्ट्रेनर्स का उपयोग करके सफलता पाई है, जो सेल क्लंप को13 बनाने से रोकने के लिए कार्य करते हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप कार्बन परत के लिए कोशिकाओं का यादृच्छिक लगाव होता है। यदि एक लक्षित अनुलग्नक आवश्यक है, तो फोटो-माइक्रोपैटर्निंग का उपयोग किया जा सकता है (चरण 1.3)14 देखें।
  2. कोशिकाओं और विकास माध्यम को जोड़ना: बुलबुले से बचते हुए, कुओं में माइक्रोपिपेट के माध्यम से कोशिकाओं को जोड़ें (चित्रा 1 बी2)। 6-वेल प्लेट में, 1.5-2.0 एमएल की कुल अच्छी मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    नोट: पूरी मात्रा जोड़ने से पहले ग्रिड के चारों ओर सावधानी से गीला करने की सिफारिश की जाती है। यह ग्रिड को समाधान में अलग होने और तैरने से रोकने में मदद करेगा। कुएं पर सजातीय सेल वितरण की सुविधा के लिए प्लेट को धीरे से साथ-साथ ले जाएं। प्लेट को गोलाकार गति में न घुमाएं, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप कुएं के केंद्र में अत्यधिक सेल घनत्व आवंटित होगा।
  3. इनक्यूबेशन: प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार उचित समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड ्स को इनक्यूबेट करें, जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर निर्भर करेगा। इस उदाहरण के लिए (एचआईवी आणविक क्लोन का अभिकर्मक), 16-24 घंटे (चित्रा 1 बी3) के बीच इनक्यूबेट करें।
    नोट: लंबे इनक्यूबेशन समय के परिणामस्वरूप अधिक कोशिका विभाजन चक्र होंगे। इसलिए, तदनुसार सीडिंग के लिए कोशिकाओं की शुरुआती संख्या को समायोजित करें।

3. अभिकर्मक

  1. अभिकर्मक मिश्रण तैयार करना:
    1. चयनित सेल लाइन में प्लास्मिड अभिकर्मक के लिए एक उपयुक्त धनिक लिपोसोम अभिकर्मक तैयार करें।
    2. इस अभिकर्मक उदाहरण में, प्रति कुएं (6 वेल प्लेट में) कुल प्लास्मिड डीएनए के 1 μg का उपयोग करें, जिसे HIVIiU�nv प्लास्मिड से psPAX2 प्लास्मिड के 1: 3 अनुपात में स्थानांतरित किया जा सके। प्रत्येक कुएं के लिए, 1 μg DNA को सीरम मुक्त DMEM के 50 μL में पतला करें। प्लेट के बार-बार माइक्रोपाइटिंग या कोमल घूमने के माध्यम से मिश्रण को समरूप करें।
    3. प्रत्येक कुएं के लिए, सीरम-मुक्त डीएमईएम में अभिकर्मक के 3 μL को पतला करें, फिर मिश्रण को फिर से माइक्रोपाइपिंग या कोमल चक्करदार द्वारा समरूप करें। पतला डीएनए मिश्रण (चरण 3.1.2) में पूरे पतला अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करें (चित्रा 1 सी 1)।
      नोट: जब यह मिश्रण इनक्यूबेटिंग हो रहा है, तो कुओं में मीडिया को 1.5 एमएल ताजा डीएमईएम के साथ बदलें। सावधान रहें कि ग्रिड को कुएं के तल से न हटाएं।
  2. अभिकर्मक मिश्रण को लागू करने के लिए, चरण 3.1.3 से प्रत्येक कुएं में मिश्रण के पिपेट 100 μL, संपर्क सुनिश्चित करने के लिए ग्रिड पर बूंदों को केंद्रित करें (चित्रा 1 सी2)। अभिकर्मक के बाद 16-24 घंटे के विकास माध्यम को बदलें (चित्रा 1 सी3)।

4. ठंड में डुबकी लगाएं

नोट: सोख्ता के लिए आवश्यक होने तक कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इसके अतिरिक्त, पूरी प्रक्रिया के दौरान ग्रिड के कार्बन पक्ष का एक नोट बनाना सुनिश्चित करें।

  1. सेल घनत्व
    1. एक उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में ग्रिड की जांच करें और प्रत्येक ग्रिड पर सेल घनत्व नोट करें।
      नोट: प्रति ग्रिड वर्ग में 0.25 कोशिकाओं से कम वाले ग्रिड (या हर 4 ग्रिड वर्गों में एक सेल), 'खाली' माना जाता है। प्रति ग्रिड वर्ग में 0.25-1 सेल वाले ग्रिड को 'सामान्य' माना जाता है। प्रति ग्रिड वर्ग में 1 से अधिक सेल वाले ग्रिड को 'पूर्ण' माना जाता है।
    2. प्रत्येक ग्रिड पर सेल घनत्व पर ध्यान दें ताकि डुबकी-फ्रीजिंग के दौरान बाद में ब्लॉटिंग समय की डायलिंग की अनुमति मिल सके। एक खाली प्लेट / डिश में पीबीएस के 2-3 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. फिड्यूशियल ्स तैयार करना
    1. डाउनस्ट्रीम क्रायोटोमोग्राफी अनुप्रयोगों के लिए सोने के फिड्यूशियल तैयार करने के लिए, 10 एनएम कोलाइडल गोल्ड बीड समाधान के पिपेट 50 μL को एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब में बदलें। ट्यूब में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के 2 μL जोड़ें और बार-बार माइक्रोपाइटिंग द्वारा होमोजिनाइज़ करें।
    2. 15 मिनट के लिए ट्यूब को 15,000-20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट को हटाने के लिए माइक्रोपिपेट।
      नोट: गोली बहुत ढीली होगी।
    3. गोली में पीबीएस के 50 μL जोड़ें और पुन: निलंबित करें। ट्यूब को 15 मिनट के लिए 15,000-20,000 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. 10 μL टिप का उपयोग करके, सीधे गोली के 4 μL को एस्पिरेट करें, और इसे एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें (चित्रा 1 डी 1)। प्रति ग्रिड धुले और केंद्रित सोने के 1 μL का उपयोग करें।
      नोट: उपयोग किए जाने वाले फिड्यूशियल का प्रकार डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर निर्भर करता है। टीईएम टोमोग्राफी के लिए, 10 एनएम सोने के मोतियों का उपयोग करें। नरम एक्स-रे टोमोग्राफी के लिए, 200 एनएम सोने के मोतियों का उपयोग करें। सहसंबंध माइक्रोस्कोपी के लिए, फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती का उपयोग करें। क्रायोएफआईबी मिलिंग से जुड़े प्रयोगों के लिए फिड्यूशियल आमतौर पर आवश्यक नहीं होते हैं, क्योंकि मिलिंग प्रक्रिया उन्हें नष्ट कर देगी।
  3. ब्लोटिंग
    1. पर्यावरण कक्ष को 95% आर्द्रता और 30 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 डी 1) के लिए स्थापित करें। 5/15 चिमटी का उपयोग करके ग्रिड का चयन करें।
    2. पीबीएस के साथ ग्रिड धोएं और उन्हें प्लंजिंग चिमटी में स्थानांतरित करें (चित्रा 1 डी2)। एक बार सुरक्षित होने के बाद, 5/15 चिमटी को हटा दें और गिरते चिमटी पर क्लैंप स्लाइड करें।
    3. क्लैंप को सुरक्षित रखते हुए ग्रिड को डुबकी फ्रीजर में डालें (चित्रा 1 डी3)। ग्रिड के पीछे की तरफ 1 μL सोने के फिड्यूशियल जोड़ें (चित्रा 1 डी4)। ग्रिड के कार्बन पक्ष में पीबीएस के 2-3 μL जोड़ें। ग्रिड के पिछले हिस्से को धब्बा लगाने के लिए स्वचालित सोख्ता का उपयोग करें और फ्रीज को तरल ईथेन में डुबोएं (चित्रा 1 डी5)।
      नोट: इष्टतम सोख्ता के लिए प्रति ग्रिड 3-4 μL मात्रा के बीच होने की सिफारिश की जाती है। धोने के बाद ग्रिड पीबीएस की एक परिवर्तनीय मात्रा को बनाए रख सकते हैं। ग्रिड पर पहले से मौजूद तरल प्रतिधारण के लिए पीबीएस की अतिरिक्त मात्रा को समायोजित करें। यह सिफारिश की जाती है कि सोने के फिड्यूशियल को ग्रिड के पीछे जोड़ा जाए। सामने के अलावा सम्मिलन के बिंदु के पास सोने के फिड्यूशियल के पूल हो सकते हैं, जबकि पीछे से जोड़ने से अधिक समरूप समाधान होता है। सोख्ता अवधि ग्रिड के सेल दंत चिकित्सा पर निर्भर करती है। खाली के लिए 2 एस, सामान्य के लिए 3 एस, और पूर्ण ग्रिड के लिए 4 एस, क्रमशः। उपलब्ध डुबकी फ्रीजर का प्रकार यह निर्धारित कर सकता है कि ब्लॉटिंग कैसे किया जाता है: लीका जीपी 2 प्लांक फ्रीजर इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है और डिफ़ॉल्ट रूप से स्वचालित एकल-पक्षीय सोख्ता में सक्षम है। थर्मो फिशर विटरोबोट स्वचालित डबल-साइडेड ब्लॉटिंग करता है, हालांकि यह अक्सर कार्बन पक्ष से जुड़ी कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाता है। विटरोबोट में मैनुअल ब्लॉटिंग भी संभव है, साथ ही मैनुअल गुरुत्वाकर्षण प्लंजर भी।

Representative Results

HIVIGFPΔENV और psPAX2 के सह-संक्रमण के बाद, सभी ग्रिडों में कार्बन परत में न्यूनतम फटना था। अभिकर्मक अभिकर्मक (चित्रा 2) के साथ इनक्यूबेशन के 24 घंटे बाद चरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट लाइट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ग्रिड को चित्रित किया गया था। मॉक ग्रिड और सह-संक्रमित ग्रिड दोनों पर कोशिकाओं में कई ग्रिड वर्गों में व्यवहार्य कोशिकाएं थीं।

किसी भी प्रतिदीप्ति टैगिंग के बिना एचआईवी -1 के सभी संरचनात्मक और एंजाइमेटिक प्रोटीन के लिए पीएसपीएएक्स 2 कोड। HIVIGFP2 psPAX2 के समान है, लेकिन जीएफपी-टैग किए गए एचआईवी गैग प्रोटीन के लिए कोड के साथ। दोनों प्लास्मिड त्रिभुज हैं। सह-अभिकर्मक के परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट एचआईवी -1 कणों का मूल-जैसे संयोजन और उभरता है, जिससे यह जैव सुरक्षा स्तर 1 की स्थिति में एचआईवी के सीएलईएम अध्ययन के लिए एक महान प्रणाली बन जाती है। सह-संक्रमित ग्रिड ने हरे रंग की प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाओं का एक उप-समूह दिखाया, जो सफल सह-संक्रमण का संकेत देता है। मॉक ग्रिड पर किसी भी कोशिका ने प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन नहीं किया, आगे HIVIGFPΔENV और psPAX2 का उपयोग करके सह-अभिकर्मक को मान्य किया। प्रकाश-आधारित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ग्रिड को देखने के बाद, ग्रिड को फ्रीज कर दिया गया और तरल नाइट्रोजन में दीर्घकालिक भंडारण में ले जाया गया।

चित्रा 3 एक ही प्रयोगात्मक विधि का उपयोग करके उत्पादित ग्रिड से परिणामों को दर्शाता है लेकिन थोड़ा अलग प्लास्मिड संरचनाओं का उपयोग करता है। यू 2 ओएस युक्त ग्रिड को विभिन्न एचआईवी क्लोनों (एचआईवीएमचेरी और एनएल 4-3 एन वी जीएफपी 1: 6 अनुपात में) का उपयोग करके सह-संक्रमित किया गया था। चूंकि फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्लास्मिड के एक उच्च द्रव्यमान का उपयोग किया गया था, इसलिए इन ग्रिडों ने बड़ी संख्या में ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं के अवलोकन को सक्षम किया, जिससे क्रायोक्लेम और क्रायोएट का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करते समय एक लाभ प्रदान किया गया। क्रायोक्लेम का उपयोग करते हुए, सभी सह-संक्रमित कोशिकाओं के स्थानों को रिकॉर्ड करने के लिए क्रायोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रत्येक ग्रिड के लिए पूर्ण ग्रिड एटलस उत्पन्न किए गए थे। ज्ञात कोशिकाओं के स्थानों के साथ, क्रायोएट का प्रदर्शन किया गया था। क्रायोफ्लोरेसेंस (चित्रा 3 ए) में एकत्र किए गए फ्लोरोसेंट एटलस के साथ एक पूर्ण कम-आवर्धन ग्रिड एटलस एकत्र और ओवरलेड किया गया था। क्रायोटोमोग्राम सेलुलर साइटों पर एकत्र किए गए थे, जिसमें वायरल जीवन चक्र के जटिल विवरण शामिल थे, जिसमें कोशिकाओं से एचआईवी का संयोजन और उभरना शामिल था (चित्रा 3 बी)।

Figure 1
चित्र 1: ग्रिड वर्कफ़्लो पर सेल सीडिंग। क्रायोईएम ग्रिड पर बीज कोशिकाओं के लिए समग्र प्रक्रिया को दर्शाने वाला एक योजनाबद्ध। इस प्रक्रिया को चार प्रमुख चरणों में विभाजित किया गया है, जिसमें (ए) बीज बोने के लिए कुओं में ग्रिड तैयार करना, (बी) प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं की उचित मात्रा जोड़ना, (सी) फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए कोशिकाओं का वैकल्पिक अभिकर्मक, और (डी) नमूने के विट्रीफिकेशन की अनुमति देने के लिए ग्रिड की डुबकी फ्रीजिंग शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: HIVIGFPΔEnv और psPAX2 का उपयोग करके U2OS का सह-संक्रमण। U2OS कोशिकाओं को 1: 3 अनुपात में GFP-युक्त HIViGFPΩenv और psPAX2 के साथ सह-संक्रमित किया गया था। ग्रिड को चरण कंट्रास्ट और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया था। जिन कोशिकाओं को जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए दिखाया जाता है, वे सफल सह-अभिकर्मक का संकेत देते हैं। स्केल बार: 500 μm. स्केल बार (इनसेट): 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: संभावित डाउनस्ट्रीम क्रायो-आधारित तरीके । (ए) सह-संक्रमित यू 2 ओएस कोशिकाओं के साथ एक क्रायोसीएलईएम छवि। हरे रंग में कोशिकाएं एचआईवी उत्पादक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं और इसका उपयोग सह-अभिकर्मक सफलता को मापने के लिए किया जाता है। लाल पंक्टा एमचेरी टैग किए गए एचआईवी -1 गैग का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार: 250 μm. स्केल बार (इनसेट): 25 μm (B) U2OS कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली से उभरते कई एचआईवी कणों की एक क्रायोएट छवि। स्केल बार: 50 एनएम कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां, हमने सीटू क्रायोइलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी अनुप्रयोगों के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर बीज कोशिकाओं के लिए एक सुलभ, लचीला और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रदान किया है। इस विधि को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों और / या प्रयोगात्मक आवश्यकताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। महान लचीलेपन के अलावा, हमने एक वर्कफ़्लो का वर्णन किया है जो ग्रिड सीडिंग में आम नुकसान को अनुकूलित और कम करता है, विशेष रूप से कार्बन परत को व्यापक क्षति, कम सेल घनत्व, और पतले सेल अनुमानों की खराब संरचनात्मक अखंडता।

यद्यपि यहां वर्णित प्रोटोकॉल कई विकल्प प्रदान करता है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका सामान्य परिणामों को अनुकूलित करने के लिए पालन किया जाना चाहिए। ग्रिड सेल सीडिंग के साथ सबसे बड़ी समस्याओं में से एक कुएं या माइक्रोस्लाइड से ग्रिड की टुकड़ी और फ्लोटिंग है। इसलिए, दोनों तरफ एक अनुगामी समाधान के साथ ग्रिड को पूरी तरह से गीला करना और इनक्यूबेशन अवधि के दौरान इसे सूखने से रोकना महत्वपूर्ण है। यदि 3 डी-मुद्रित ग्रिड धारकों का उपयोग कर रहे हैं, तो ध्यान रखें कि इन धारकों के लिए मीडिया के कई परिवर्तनों में फ्लोटिंग ग्रिड का उत्पादन करने की क्षमता है क्योंकि ग्रिड के नीचे फंसी हवा इसे धारक से बाहर निकाल सकती है।

चिमटी की हमारी पसंद व्यापक ग्रिड झुकने के बिना ग्रिड में हेरफेर करने का ज्यामितीय रूप से अनुकूल तरीका प्रदान करने के तरीके में ग्रिड की गुणवत्ता में भी सुधार करती है जो कार्बन परत को नुकसान पहुंचाएगी। गिरने से पहले कोशिकाओं को यथासंभव 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने से सेल पीड़ा कम हो जाती है और ग्रिड पर पतली छवि योग्य कोशिकाओं की संख्या में सुधार होता है। अंत में, सोने की तरफ से सोख्ता कोशिकाओं को कठोर यांत्रिक बलों से बचाएगा जो नाजुक सेलुलर संरचनाओं को नुकसान पहुंचा सकता है।

जबकि इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, ग्रिड फोटो-माइक्रोपैटर्निंग को ग्रिड वर्ग14 के केंद्र में उनके लगाव को अनुकूलित करके छवि योग्य कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। अंत में, 3 डी-मुद्रित ग्रिड धारकों का उपयोग हाल ही में प्रत्यक्ष ग्रिड हेरफेर12 को सीमित करके ग्रिड क्षति को कम करने के लिए किया गया है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण हो सकता है कि यह प्रोटोकॉल क्रायोटोमोग्राफी के आवेदन के लिए कोशिकाओं से पतले किनारों और प्रोट्रूशियंस की इमेजिंग के लिए अनुकूलित है। हम प्रोटोकॉल में हमारी सिफारिशों से विभिन्न स्थितियों का समस्या निवारण करने का सुझाव देते हैं ताकि पसंद के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए सर्वोत्तम परिणाम मिल सके। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल ग्रिड पर कोशिकाओं को सीडिंग करने की एक विश्वसनीय लेकिन बहुमुखी विधि प्रदान करता है जिसे विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए ट्विक किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम प्लांक-फ्रीजिंग उपकरण तक पहुंच के लिए मैंस्की प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम के कुछ हिस्सों को मिनेसोटा विश्वविद्यालय की लक्षण वर्णन सुविधा में किया गया था, जिसे सामग्री अनुसंधान विज्ञान और इंजीनियरिंग केंद्र (एमआरएसईसी) के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) से आंशिक समर्थन प्राप्त होता है; पुरस्कार संख्या DMR-2011401) और राष्ट्रीय तंत्रिका विज्ञान पाठ्यक्रम पहल (NNCI; पुरस्कार संख्या ईसीसीएस -2025124) कार्यक्रम। हम वायरल वातावरण केंद्र (बी-एचआईवीई; 1यू54एआई170855-01) और ड्यूक सेंटर फॉर एचआईवी स्ट्रक्चरल बायोलॉजी (डीसीएचएसबी) में एचआईवी के व्यवहार से वित्त पोषण को धन्यवाद देना चाहते हैं; U54AI170752) केंद्र।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 nm colloidal gold bead solution Sigma-Aldrich 741957
6 well multidish, 100/CS Fisher Scientific FB012927
Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz Beckman-Coulter C63125
Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon Quantifoil TEM-G300F1-AU
Bovine serum albumin MilliporeSigma A9647
BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved Sigma-Aldrich BR717805-1EA
DMi1 Inverted Microscope Leica 22A00G119
Dulbecco's modified eagle's medium - high glucose, no glutamine Gibco 11-960-044
Dumont 5/15 tweezer Electron Microscopy Sciences 0103-5/15-PO
EM GP2 Leica 587085 Automated plunge freezer
Fetal Bovine Serum Gibco A5209
Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade MilliporeSigma F1141
GenJet version II in vitro DNA transfection reagent SignaGen Laboratories SL100489
GlutaMAX I 100x Fisher Scientific 35050061 Media supplement
Neslab EX-211 Heating Circulator Neslab Out of production Water bath for media warming
Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller Drummond Scientific 4-000-100
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
Pelco easyGlow device Pelco 91000S Glow discharge device
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Media supplement
Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector Gilson F144059M
Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector Gilson F144054M
Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector Gilson F144056M
Whatman number 2 filter paper, 55 mm Whatman 28455-041 Blotting paper

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References

  1. Zhang, P., Mendonça, L. Analysis of Viruses in the Cellular Context by Electron Tomography. Encyclopedia of Virology. 1, Elsevier, Academic Press. 242-247 (2021).
  2. Fäßler, F., Dimchev, G., Hodirnau, V. -V., Wan, W., Schur, F. K. M. Cryo-electron tomography structure of Arp2/3 complex in cells reveals new insights into the branch junction. Nature Communications. 11, 6437 (2020).
  3. McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. Journal of Microscopy. 131 (Pt 1), 1-9 (1983).
  4. Stewart, M., Vigers, G. Electron microscopy of frozen-hydrated biological material. Nature. 319 (6055), 631-636 (1986).
  5. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (1), 27-56 (2012).
  6. Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).
  7. Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
  8. Klumpe, S., et al. A modular platform for automated cryo-FIB workflows. eLife. 10, e70506 (2021).
  9. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  10. Klein, S., et al. IFITM3 blocks influenza virus entry by sorting lipids and stabilizing hemifusion. Cell Host & Microbe. 31 (4), 616.e20-633.e20 (2023).
  11. Shah, P. N. M., et al. Characterization of the rotavirus assembly pathway in situ using cryoelectron tomography. Cell Host & Microbe. 31 (4), 604.e4-615.e4 (2023).
  12. Fäßler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. 3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).
  13. Hoffmann, P. C., et al. Electron cryo-tomography reveals the subcellular architecture of growing axons in human brain organoids. eLife. 10, e70269 (2021).
  14. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).

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स्तनधारी कोशिकाओं <em>के सीटू</em> क्रायोटोमोग्राफी के लिए नमूना तैयारी
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Weber, N., Hinks, B., Jensen, J.,… More

Weber, N., Hinks, B., Jensen, J., Lidahl, T., Mendonça, L. Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (202), e65697, doi:10.3791/65697 (2023).

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