Summary
Denne metode giver en tilgængelig og fleksibel protokol til fremstilling af elektronmikroskopi (EM) gitter til in situ cellulær kryotomografi og korrelativt lys og elektronmikroskopi (CLEM).
Abstract
In situ cellulær kryotomografi er en kraftfuld teknik til at studere komplekse objekter i deres oprindelige frosne hydrerede cellulære kontekst, hvilket gør det yderst relevant for cellulær biologi og virologi. Potentialet ved at kombinere kryotomografi med andre mikroskopimetoder gør det til en perfekt teknik til integrativ og korrelativ billeddannelse. Imidlertid er prøveforberedelse til in situ cellulær tomografi ikke ligetil, da celler ikke let fastgør og strækker sig over elektronmikroskopigitteret. Derudover er selve gitterene skrøbelige og kan gå i stykker, hvis de håndteres for kraftigt, hvilket resulterer i tab af billedområder. Geometrien af vævskulturskåle kan også udgøre en udfordring, når man manipulerer gitterene med pincet. Her beskriver vi tips og tricks til at overvinde disse (og andre) udfordringer og forberede prøver af god kvalitet til in situ cellulær kryotomografi og korreleret billeddannelse af klæbende pattedyrceller. Med fortsatte fremskridt inden for kryomikroskopiteknologi rummer denne teknik et enormt løfte om at fremme vores forståelse af komplekse biologiske systemer.
Introduction
In situ cellulær kryotomografi er en kraftfuld teknik, der giver mulighed for undersøgelse af biologisk relevante strukturer i celler uden kemisk fiksering. Ved at binde celler til EM-gitre og dykfryse gitterene i et kryogen, fastfryses objekter af interesse i deres naturlige cellulære sammenhænge uden dannelse af krystallinsk is fra intracellulært vand 1,2. Både kemisk fiksering og krystallinsk isdannelse kan forstyrre strukturerne af relevante molekyler, såsom proteiner og lipider, hvilket reducerer den biologiske nøjagtighed af billeder opnået ved hjælp af disse teknikker 3,4. I tomografi afbildes gitre i inkrementelle vinkler ved hjælp af elektronmikroskopi, og disse billeder bruges derefter til at konstruere tredimensionelle repræsentationer af målområdet afbildet5. In situ kryotomografi kan anvendes sammen med andre mikroskopiteknikker til integrativ og korrelativ billeddannelse, såsom kryofluorescensbilleddannelse, blød røntgentomografi og kryoFIB/SEM (kryogen fokuseret ionstråle/scanningelektronmikroskopi)6,7,8,9,10,11 . Integration af flere teknikker gør det muligt at opnå mere information om en struktur eller proces, end nogen enkelt mikroskopiteknik kunne opnå.
På trods af alle fordelene ved in situ cellulær kryotomografi kan prøveforberedelse vise sig at være udfordrende af forskellige årsager. På grund af deres skrøbelighed kan kraftig manipulation af elektronmikroskopigitter føre til skade, hvor især det tynde kulstoflag er delikat og tilbøjeligt til at rive, hvilket reducerer gitterets billedområde. Elektronmikroskopigitter er også vanskelige at manipulere på grund af deres lille størrelse og er tilbøjelige til at løsne sig fra overfladen af brøndene eller mikrodias, der bruges til at dyrke celler. Manipulation af gitterene i brøndene eller mikrodiasene kan vise sig vanskelig på grund af geometrien af disse. Forkert forberedelse af gitterene (f.eks. At lade dem flyde) kan føre til lav celletæthed og reducere antallet af potentielle billeddannelsesområder, især når celler ikke er tilbøjelige til at binde sig til selve gitterene. For direkte cellulær kryotomografi skal celler spredes meget tyndt, hvilket kan forstyrres af mange grunde, herunder forkerte temperaturer eller grov håndtering af gitterene.
Gennem en række optimeringer er teknikkerne præsenteret i denne artikel beregnet til at håndtere disse mest almindelige faldgruber, der opstår under forberedelsen af elektronmikroskopigitter til kryotomografi. Brugen af 5/15 vinklede pincetter muliggør manipulation af gitter inden for brøndplader eller mikrodias. En fibronectinopløsning, der påføres begge sider af gitterene inden plettering, gør flydende gitter mindre sandsynlige, hvilket er gavnligt for at sikre, at gitter har tilstrækkelig celletæthed, og at gitterene er mindre tilbøjelige til at blive beskadiget på grund af manipulation. Ved at holde gitterene udruget ved 37 °C indtil lige før frysepunktet, sikrer vi også, at cellerne holdes i et behageligt miljø for at forhindre cellerne i at trække deres tynde kanter tilbage. Blotting af gitterene fra bagsiden forhindrer også beskadigelse af cellerne fra mekanisk kraft. Samlet set øger disse foranstaltninger succesraten for prøveforberedelse til in situ-cellulære kryotomografiundersøgelser, hvilket øger tilgængeligheden af denne billeddannelsesmetode.
Protocol
1. Forberedelse af gitter
BEMÆRK: I forsøgsdesignet skal du planlægge maksimalt 8-12 gitre i alt pr. dykfrysningssession og 4-5 gitre pr. brønd. Mere end det vil føre til en meget lang dykfrysningssession, hvilket kan forårsage øget cellestress, isforurening og brugerfejl.
- Glødudladning
- Fyld et passende antal gitre med en perforeret kulstofstøttefilm, der skal glødes ved 15 mA i 45 s ved 0,39 mBar atmosfære i en glødudladningsanordning.
- Sørg for, at kulstofsiden af gitteret vender opad. Når ristene er færdige, overføres de til en ren beholder beklædt med filtrerpapir (figur 1A1).
BEMÆRK: Andre gitre kan anvendes, så længe materialet ikke er giftigt for celler (hvilket udelukker kobbergitter). Finder gitre er nyttige til korrelative undersøgelser. Gitter lavet af andre materialer er også mulige. Mange laboratorier har haft gode resultater med at dyrke celler oven på SiO2 supportnet 8,9.
- Vedhæftende behandling
- Overfør gitter, fibronectin, PBS, plader og pincet til et biosikkerhedsskab. Behandl begge sider af gitterene med 20 μg / ml bovin fibronectin ved mikropipettering af to generøst store prikker klæbende opløsning på en steril overflade, såsom låget på en 6-brøndplade. Sørg for, at prikkerne er store nok til at omslutte hele gitteret (ca. 100 μL anbefales).
BEMÆRK: Før behandling med den valgte vedhængende løsning er der mulighed for fotomikromønster af gitteret her for at optimere fastgørelsen af celler i midten af gitterkvadrater. Hvis du reducerer cellernes evne til at fastgøre til søjlerne, øges antallet af billedceller. Dette er ideelt til eksperimenter, der involverer kryoFIB-fræsning. - Brug 5/15 pincet til at manipulere gitterene. Sørg for at behandle begge sider af gitteret i opløsning.
BEMÆRK: Andre klæbemiddelopløsninger kan anvendes (fibrinogen, kollagen, andre ekstracellulære matrixkomponenter osv.). Fibronectin bruges her, da det giver gode resultater med en lang række cellelinjer. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). 5/15 pincetten er nyttig, da dens geometri giver forbedret manøvredygtighed omkring 6-brøndspladerne, 35 mm skåle og mikrodias. Dette resulterer i mindre mekanisk belastning på gitterene og en mere intakt kulstoffilm. Sørg for, at alle nødvendige materialer placeres i biosikkerhedsskabet inden start, da dette reducerer muligheden for netforurening.
- Overfør gitter, fibronectin, PBS, plader og pincet til et biosikkerhedsskab. Behandl begge sider af gitterene med 20 μg / ml bovin fibronectin ved mikropipettering af to generøst store prikker klæbende opløsning på en steril overflade, såsom låget på en 6-brøndplade. Sørg for, at prikkerne er store nok til at omslutte hele gitteret (ca. 100 μL anbefales).
- Montering af gitre
- Når det er behandlet med bovin fibronectin, bliver gitteret klæbrigt. Brug en 5/15 pincet til forsigtigt at røre gitterets ikke-kulstoffrie overflade mod bunden af en tom skål/tallerken og åbne pincetten. Gitteret skal let fastgøres til den nye overflade (figur 1A2).
BEMÆRK: Prøv at undgå at placere gitre i det direkte centrum eller kanterne af fadet / tallerkenen. Når der tilføjes celler, er der en tendens til, at celletæthed akkumuleres i midten af pladen. Dette kan resultere i gitre med overdreven cellulær tæthed. Alternativt kan 3D-printede gitterholdere anvendes her i stedet for at fastgøre celler direkte til overfladen af skålen/tallerkenen12.
- Når det er behandlet med bovin fibronectin, bliver gitteret klæbrigt. Brug en 5/15 pincet til forsigtigt at røre gitterets ikke-kulstoffrie overflade mod bunden af en tom skål/tallerken og åbne pincetten. Gitteret skal let fastgøres til den nye overflade (figur 1A2).
- Inkubation
- Inkuber gitterene i 30 minutter i fibronectin-klæbeopløsningen (20 μg / ml). For at sikre, at ristene ikke bliver tørre under denne proces, mikropipetter 1-2 dråber mere klæbende opløsning direkte oven på gitter hvert 15. minut (figur 1A3).
BEMÆRK: Inkubationsperioden varierer afhængigt af den anvendte klæbende opløsning. For bovin fibronectin er den anbefalede tid 30 min.
- Inkuber gitterene i 30 minutter i fibronectin-klæbeopløsningen (20 μg / ml). For at sikre, at ristene ikke bliver tørre under denne proces, mikropipetter 1-2 dråber mere klæbende opløsning direkte oven på gitter hvert 15. minut (figur 1A3).
- Vask
- Efter inkubationsperioden fjernes overskydende klæbende opløsning via mikropipettering. Ristene vaskes ved at mikropipettere PBS-dråber direkte oven på ristene. Gentag dette 2-3 gange. (Figur 1A4).
- Sterilisering
- Brug UV-lys til at sterilisere ristene i biosikkerhedsskabet i 1 time. Placer ristene så tæt på UV-kilden som muligt for at maksimere steriliseringen (figur 1A5). For at sikre, at nettene ikke bliver tørre under denne proces, mikropipetterer 1-2 dråber PBS direkte oven på ristene hvert 10. minut.
BEMÆRK: Trin 1.4-1.6 kan udføres samtidigt.
- Brug UV-lys til at sterilisere ristene i biosikkerhedsskabet i 1 time. Placer ristene så tæt på UV-kilden som muligt for at maksimere steriliseringen (figur 1A5). For at sikre, at nettene ikke bliver tørre under denne proces, mikropipetterer 1-2 dråber PBS direkte oven på ristene hvert 10. minut.
2. Såning af gitter
- Tæl celler:
- Fjern og tæl cellerne ved hjælp af mekaniske eller enzymatiske metoder. Bestem det optimale antal celler, der skal bruges til såning inden tælling. For U2OS, der er podet i en plade med 6 brønde, skal du bruge et sted mellem 6 x 104 og 1,6 x 105 celler pr. brønd (figur 1B1).
BEMÆRK: Antallet af celler, der sås, varierer afhængigt af celletypen, overfladearealet af den anvendte brønd, skål eller mikrodias, tiden mellem såning og frysning og det eksperimentelle design. Test et interval af cellenumre for at identificere forhold, der vil resultere i 0,25-1 celler pr. gitterkvadrat på tidspunktet for frysning. Det er vigtigt at bemærke, at høj celletæthed reducerer varmeoverførselshastigheden og kan påvirke forglasningsprocessen. For at bekæmpe dette har nogle laboratorier fundet succes ved hjælp af cellefiltre, som virker for at forhindre celleklumper i at danne13. Endelig resulterer denne protokol i tilfældig fastgørelse af celler til carbonlaget. Hvis en målrettet fastgørelse er nødvendig, kan der anvendes fotomikromønster (se trin 1.3)14.
- Fjern og tæl cellerne ved hjælp af mekaniske eller enzymatiske metoder. Bestem det optimale antal celler, der skal bruges til såning inden tælling. For U2OS, der er podet i en plade med 6 brønde, skal du bruge et sted mellem 6 x 104 og 1,6 x 105 celler pr. brønd (figur 1B1).
- Tilføjelse af celler og vækstmedium : Tilføj celler via mikropipette til brøndene, undgå bobler (figur 1B2). I en 6-brønds plade anbefales et samlet brøndvolumen på 1,5-2,0 ml.
BEMÆRK: Det anbefales at våde forsigtigt omkring gitterene, før du tilføjer hele lydstyrken. Dette vil hjælpe med at forhindre gitre i at løsne sig og flyde i løsningen. Flyt forsigtigt pladen fra side til side for at lette homogen cellefordeling på brønden. Hvirvl ikke pladen i en cirkulær bevægelse, da dette vil resultere i overdreven celletæthed, der allokeres i midten af brønden. - Inkubation: Inkubation af objektglas ved 37 °C i et passende tidsrum i henhold til forsøgsdesignet, som afhænger af downstream-anvendelserne. For dette eksempel (transfektion af HIV-molekylære kloner) inkuberes mellem 16-24 timer (figur 1B3).
BEMÆRK: Længere inkubationstider vil resultere i flere celledelingscyklusser. Juster derfor startantallet af celler til såning i overensstemmelse hermed.
3. Transfektion
- Fremstilling af transfektionsblanding:
- Forbered et passende kationisk liposomreagens til plasmidtransfektion i den valgte cellelinje.
- I dette transfektionseksempel skal du bruge 1 μg total plasmid-DNA pr. Brønd (i en 6-brøndplade), der skal transfekteres i forholdet 1: 3 mellem HIViΔEnv-plasmid og psPAX2-plasmid. For hvert hul fortyndes 1 μg DNA i 50 μL serumfrit DMEM. Homogeniser blandingen via gentagne gange mikropipettering eller blid hvirvling af pladen.
- For hvert hul fortyndes 3 μL transfektionsreagens i serumfri DMEM, og homogeniseres derefter blandingen igen ved mikropipettering eller forsigtig hvirvling. Hele den fortyndede transfektionsreagensblanding tilsættes til den fortyndede DNA-blanding (trin 3.1.2) og inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 15 minutter (figur 1C1).
BEMÆRK: Mens denne blanding inkuberer, udskiftes mediet i brøndene med 1,5 ml frisk DMEM. Pas på ikke at løsne gitterene fra bunden af brønden.
- For at påføre transfektionsblandingen pipetteres 100 μL af blandingen fra trin 3.1.3 dråbevis til hvert hul, idet dråberne koncentreres over ristene for at sikre kontakt (figur 1C2). Skift vækstmediet 16-24 timer efter transfektion (figur 1C3).
4. Dyk frysning
BEMÆRK: Opbevar cellerne ved 37 °C, indtil de skal bruges til blotting. Derudover skal du sørge for at notere kulstofsiden af gitterene gennem hele processen.
- Celletæthed
- Kontroller gitterene i et omvendt optisk mikroskop, og noter celletætheder på hvert gitter.
BEMÆRK: Gitre med mindre end 0,25 celler pr. gitterkvadrat (eller en celle for hver 4. gitterkvadrat) betragtes som 'tomme'. Gitre med 0,25-1 celler pr. gitterkvadrat betragtes som 'normale'. Gitre med mere end 1 celle pr. gitterkvadrat betragtes som "fulde". - Vær opmærksom på celletætheden på hvert gitter for at tillade opkald af blottingtider senere under frysning. Der tilsættes 2-3 ml PBS til en tom tallerken/fad og opvarmes til 37 °C.
- Kontroller gitterene i et omvendt optisk mikroskop, og noter celletætheder på hvert gitter.
- Forberedelse af fiducials
- For at forberede guldfiducialer til downstream-kryotometriapplikationer pipetteres 50 μL 10 nm kolloid guldperleopløsning i et rent 1,5 ml rør. Der tilsættes 2 μL 1 mg/ml BSA til glasset og homogeniseres gentagne gange ved mikropipettering.
- Centrifuger røret ved 15.000-20.000 x g i 15 min. Mikropipette for at fjerne så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre pelletsen.
BEMÆRK: Pillen vil være meget løs. - Der tilsættes 50 μL PBS til pellet og resuspenderes. Centrifuger slangen igen ved 15.000-20.000 x g i 15 min.
- Brug en 10 μL spids til direkte at aspirere 4 μL af pelleten og overfør den til et rent 1,5 ml rør (figur 1D1). Brug 1 μL vasket og koncentreret guld pr. gitter.
BEMÆRK: Den anvendte type fiducials afhænger af downstream-applikationer. Til TEM-tomografi skal du bruge 10 nm guldperler. Til blød røntgentomografi skal du bruge 200 nm guldperler. Til korrelationsmikroskopi skal du bruge fluorescerende latexperler. Fiducialer er normalt ikke nødvendige for eksperimenter, der involverer kryoFIB-fræsning, da fræseprocessen vil ødelægge dem.
- Blotting
- Indstil miljøkammeret til 95 % fugtighed og 30 °C (figur 1D1). Vælg et gitter ved hjælp af 5/15 pincetten.
- Vask gitterene med PBS og overfør dem til en pincet (figur 1D2). Når den er fastgjort, skal du fjerne 5/15 pincetten og skubbe klemmen på den dybe pincet.
- Sæt gitteret i dykfryseren, og hold klemmen sikker (figur 1D3). Der tilsættes 1 μL guldfiducialer på bagsiden af gitteret (figur 1D4). Der tilsættes 2-3 μL PBS til kulstofsiden af nettet. Brug automatisk blotting til at blotte bagsiden af gitteret og dykke frysning ned i flydende ethan (figur 1D5).
BEMÆRK: Det anbefales at have mellem 3-4 μL volumen pr. gitter for optimal blotting. Gitre kan tilbageholde en variabel mængde PBS efter vask. Juster den ekstra mængde PBS for at tage højde for allerede eksisterende væskeretention på nettet. Det anbefales, at guldfiducialerne tilføjes bag på gitteret. Tilsætning til forsiden kan resultere i puljer af guldfiducialer nær indsættelsespunktet, mens tilsætning bagfra resulterer i en mere homogeniseret opløsning. Blotting varighed afhænger af cellen tandpleje af gitteret. 2 s for tomme, 3 s for normale og 4 s for fulde gitre. Den tilgængelige type dykfryser kan bestemme, hvordan blotting gribes an: Leica GP2-dykfryseren er den, der bruges i denne protokol, og er som standard i stand til automatisk enkeltsidet blotting. Thermo Fisher Vitrobot udfører automatiseret dobbeltsidet blotting, selvom dette ofte beskadiger cellerne, der er fastgjort til kulstofsiden. Manuel blotting i Vitrobot er også mulig, såvel som manuelle tyngdekraftsstempler.
Representative Results
Efter cotransfektionen af HIViGFPΔEnv og psPAX2 havde alle gitterene minimal rivning i kulstoflaget. Gitre blev afbildet ved hjælp af faselysmikroskopi og fluorescerende lysmikroskopi 24 timer efter inkubation med transfektionsreagenset (figur 2). Celler på både mock grids og de co-transfekterede gitter indeholdt levedygtige celler i flere gitterkvadrater.
psPAX2 koder for alle strukturelle og enzymatiske proteiner af HIV-1 uden fluorescensmærkning. HIViGFPΔEnv ligner psPAX2, men med koder for et GFP-mærket HIV Gag-protein. Begge plasmider er ΔEnvelope. Cotransfektionen resulterer i native-lignende samling og spirende fluorescerende HIV-1-partikler, hvilket gør dette til et godt system til CLEM-undersøgelser af HIV i Biosafety Level 1-tilstand. De co-transfekterede gitter viste en delmængde af celler, der udviser grøn fluorescens, hvilket indikerer vellykket cotransfektion. Ingen celler på mock-gitteret udviste fluorescens, hvilket yderligere validerede cotransfektionen ved hjælp af HIViGFPΔEnv og psPAX2. Efter at have set gitterene ved hjælp af lysbaseret mikroskopi, blev gitter dykket frosne og flyttet til langtidsopbevaring i flydende nitrogen.
Figur 3 viser resultater fra gitre produceret ved hjælp af den samme eksperimentelle metode, men ved hjælp af lidt forskellige plasmidkonstruktioner. U2OS-holdige net blev co-transfekteret ved hjælp af forskellige HIV-kloner (HIVmCherryΔEnv og NL4-3ΔEnvGFP i forholdet 1:6). Da der blev anvendt en højere masse fluorescerende mærkede plasmider, muliggjorde disse gitre observation af et større antal transfekterede celler, hvilket gav en fordel under optagelse af billeder ved hjælp af cryoCLEM og cryoET. Ved hjælp af cryoCLEM blev der genereret komplette gitteratlaser for hvert gitter ved hjælp af kryofluorescensmikroskopi for at registrere placeringen af alle co-transfekterede celler. Med placeringen af celler kendt, blev cryoET udført. Et komplet gitteratlas med lav forstørrelse blev indsamlet og overlejret med det fluorescerende atlas indsamlet ved kryofluorescens (figur 3A). Kryomologrammer blev indsamlet på cellulære steder, der fangede indviklede detaljer om den virale livscyklus, herunder samling og spirende HIV fra celler (figur 3B).
Figur 1: Cellesåning på gitterarbejdsgang. Et skema, der viser den overordnede procedure for frøceller på kryoEM-gitter. Processen er opdelt i fire hovedtrin, herunder (A) forberedelse af gitter i brøndene til såning, (B) tilføjelse af den passende mængde celler til hver brønd, (C) valgfri transfektion af celler til fluorescerende billeddannelse og (D) nedfrysning af gitter for at muliggøre forglasning af prøven. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Cotransfektion af U2OS ved hjælp af HIViGFPΔEnv og psPAX2. U2OS-celler blev co-transfekteret med GFP-holdige HIViGFPΔEnv og psPAX2 i forholdet 1: 3. Gitre blev afbildet ved fasekontrast og fluorescensmikroskopi. Celler, der viser sig at have GFP-ekspression, indikerer vellykket cotransfektion. Skala bar: 500 μm. Skalabjælke (indsatser): 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Potentielle downstream-kryobaserede metoder . (A) Et cryoCLEM-billede med co-transfekterede U2OS-celler. Celler i grønt repræsenterer HIV-producerende celler og bruges til at måle cotransfection succes. Rød puncta repræsenterer mCherry mærket HIV-1 Gag. Skalabjælke: 250 μm. Skalabjælke (indsats): 25 μm (B) Et cryoET-billede af flere HIV-partikler, der spirer fra plasmamembranen i U2OS-celler. Skalabjælke: 50 nm Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Her har vi leveret en tilgængelig, fleksibel og reproducerbar protokol til frøceller på elektronmikroskopigitter til in situ kryoelektronotomografiapplikationer. Denne metode kan let tilpasses, så den passer til behovene i downstream-applikationer og/eller eksperimentelle krav. Ud over stor fleksibilitet har vi beskrevet en arbejdsgang, der optimerer og reducerer almindelige faldgruber i grid-såning, især omfattende skader på kulstoflaget, lav celletæthed og dårlig strukturel integritet af tyndcelleprojektioner.
Selvom protokollen beskrevet her giver flere alternativer, er der nogle kritiske trin, der skal følges for at optimere generelle resultater. Et af de største problemer med gittercellesåning er frigørelse og flydende gitter fra brønden eller mikrodiaset. Derfor er det vigtigt at vådte gitteret fuldt ud med en klæbende opløsning på begge sider og forhindre, at den tørrer i inkubationsperioden. Hvis du bruger 3D-printede netholdere, skal du være opmærksom på, at flere medieændringer til disse holdere har potentialet til at producere flydende gitre, da luften, der er fanget under gitteret, kan tvinge den ud af holderen.
Vores valg af pincet forbedrer også gitterkvaliteten i form af en geometrisk gunstig måde at manipulere gitterene på uden omfattende gitterbøjning, der ville skade kulstoflaget. At holde cellerne ved 37 °C så længe som muligt, før de kastes, reducerer cellelidelsen og forbedrer antallet af tynde billedceller på gitteret. Endelig vil blotting fra guldsiden beskytte cellerne mod hårde mekaniske kræfter, der kan føre til skade på skrøbelige cellulære strukturer.
Selvom det ikke er inkluderet i denne protokol, har gitterfotomikromønster vist sig at øge antallet af billedceller ved at optimere deres vedhæftning til midten af gitterkvadrater14. Endelig er 3D-printede netholdere for nylig blevet brugt til at reducere netskader ved at begrænse direkte netmanipulation12.
Det kan være vigtigt at bemærke, at denne protokol er optimeret til billeddannelse af tynde kanter og fremspring fra celler til anvendelse af kryotomografi. Vi foreslår fejlfinding af en række betingelser fra vores anbefalinger i protokollen for at finde det bedste resultat for de valgte downstream-applikationer. Samlet set giver denne protokol en pålidelig, men alsidig metode til såning af celler på gitter, der kan finjusteres til specifikke behov.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Mansky-laboratoriet for adgang til dykfrysningsudstyr. Dele af dette arbejde blev udført i karakteriseringsfaciliteten ved University of Minnesota, som modtager delvis støtte fra National Science Foundation (NSF) gennem Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC; Prisnummer DMR-2011401) og National Neuroscience Curriculum Initiative (NNCI; Prisnummer ECCS-2025124) programmer. Vi vil gerne takke finansiering fra Behavior of HIV in Viral Environments Center (B-HIVE; 1U54AI170855-01) og Duke Center for HIV Structural Biology (DCHSB; U54AI170752) centrum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
| 6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
| Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
| Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
| Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium - high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
| Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
| EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
| Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
| GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
| GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
| Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
| Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
| Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
| Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
| Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
| Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |
References
- Zhang, P., Mendonça, L. Analysis of Viruses in the Cellular Context by Electron Tomography. Encyclopedia of Virology. 1, Elsevier, Academic Press. 242-247 (2021).
- Fäßler, F., Dimchev, G., Hodirnau, V. -V., Wan, W., Schur, F. K. M. Cryo-electron tomography structure of Arp2/3 complex in cells reveals new insights into the branch junction. Nature Communications. 11, 6437 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. Journal of Microscopy. 131 (Pt 1), 1-9 (1983).
- Stewart, M., Vigers, G. Electron microscopy of frozen-hydrated biological material. Nature. 319 (6055), 631-636 (1986).
- Gan, L., Jensen, G. J.
- Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).
- Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
- Klumpe, S., et al. A modular platform for automated cryo-FIB workflows. eLife. 10, e70506 (2021).
- Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
- Klein, S., et al. IFITM3 blocks influenza virus entry by sorting lipids and stabilizing hemifusion. Cell Host & Microbe. 31 (4), 616.e20-633.e20 (2023).
- Shah, P. N. M., et al. Characterization of the rotavirus assembly pathway in situ using cryoelectron tomography. Cell Host & Microbe. 31 (4), 604.e4-615.e4 (2023).
- Fäßler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. 3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).
- Hoffmann, P. C., et al. Electron cryo-tomography reveals the subcellular architecture of growing axons in human brain organoids. eLife. 10, e70269 (2021).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
