Automatically Generated

Summary

Denne metoden gir en tilgjengelig og fleksibel protokoll for fremstilling av elektronmikroskopi (EM) rutenett for in situ cellulær kryotomografi og korrelativ lys og elektronmikroskopi (CLEM).

Abstract

In situ cellulær kryotomografi er en kraftig teknikk for å studere komplekse objekter i deres opprinnelige frosnehydrerte cellulære kontekst, noe som gjør den svært relevant for cellulær biologi og virologi. Potensialet for å kombinere kryotomografi med andre mikroskopimodaliteter gjør det til en perfekt teknikk for integrativ og korrelativ avbildning. Prøvepreparering for in situ cellulær tomografi er imidlertid ikke enkel, da celler ikke lett fester seg og strekker seg over elektronmikroskopigitteret. I tillegg er ristene selv skjøre og kan bryte hvis de håndteres for kraftig, noe som resulterer i tap av bildeområder. Geometrien til vevskulturskåler kan også utgjøre en utfordring når du manipulerer ristene med pinsett. Her beskriver vi tips og triks for å overvinne disse (og andre) utfordringer og forberede prøver av god kvalitet for in situ cellulær kryotomografi og korrelativ avbildning av adherente pattedyrceller. Med fortsatte fremskritt innen kryomikroskopiteknologi, holder denne teknikken enormt løfte om å fremme vår forståelse av komplekse biologiske systemer.

Introduction

In situ cellulær kryotomografi er en kraftig teknikk som muliggjør studier av biologisk relevante strukturer i celler uten kjemisk fiksering. Ved å feste celler til EM-gitter og stupefryse ristene i et kryogen, fryses objekter av interesse i deres naturlige cellulære sammenhenger uten dannelse av krystallinsk is fra intracellulært vann ^1,2. Både kjemisk fiksering og krystallinsk isdannelse kan forstyrre strukturer av relevante molekyler, som proteiner og lipider, og redusere den biologiske nøyaktigheten av bilder oppnådd ved hjelp av disse teknikkene ^3,4. I tomografi avbildes rutenett i inkrementelle vinkler ved hjelp av elektronmikroskopi, og disse bildene brukes deretter til å konstruere tredimensjonale representasjoner av målområdet som er avbildet⁵. In situ-kryotomografi kan brukes sammen med andre mikroskopiteknikker for integrativ og korrelativ avbildning, som kryofluorescensavbildning, myk røntgentomografi og kryoFIB/SEM (kryogen fokusert ionstråle/skanningselektronmikroskopi)6,7,8,9,10,11 . Integrering av flere teknikker gjør det mulig å få mer informasjon om en struktur eller prosess enn noen enkelt mikroskopiteknikk kan oppnå.

Til tross for alle fordelene med in situ cellulær kryotomografi, kan prøvepreparering vise seg å være utfordrende av en rekke årsaker. På grunn av deres skjøthet kan kraftig manipulering av elektronmikroskopigitter føre til skade, med spesielt det tynne karbonlaget som er delikat og utsatt for å rive, noe som reduserer det bildebare området av rutenettene. Elektronmikroskopigitter er også vanskelige å manipulere på grunn av sin lille størrelse og er tilbøyelige til å løsne fra overflaten av brønnene eller mikrolysbildet som brukes til å dyrke celler. Manipulering av ristene i brønnene eller mikroskliene kan vise seg vanskelig på grunn av geometrien til disse. Feil forberedelse av rutenettene (f.eks. Tillater dem å flyte) kan føre til lav celletetthet og redusere antall potensielle bildeområder, spesielt når cellene ikke er tilbøyelige til å feste seg til rutenettene selv. For direkte cellulær kryotomografi må cellene spre seg veldig tynt, noe som kan forstyrres av mange grunner, inkludert feil temperaturer eller grov håndtering av rutenettene.

Gjennom en rekke optimaliseringer er teknikkene som presenteres i denne artikkelen ment å håndtere disse vanligste fallgruvene som oppstår under utarbeidelsen av elektronmikroskopigitter for kryotomografi. Bruken av 5/15 vinklet pinsett muliggjør manipulering av rister i brønnplater eller mikrolysbilder. En fibronektinløsning påført begge sider av rutenettet før plating gjør flytende rister mindre sannsynlig, noe som er gunstig for å sikre at rutenett har tilstrekkelig celletetthet og at ristene er mindre sannsynlig å bli skadet på grunn av manipulering. Ved å holde ristene inkubert ved 37 °C til like før stupet fryser, sikrer vi også at cellene holdes i et komfortabelt miljø for å forhindre at cellene trekker tilbake sine tynne kanter. Blotting ristene fra baksiden forhindrer også skade på cellene fra mekanisk kraft. Samlet sett øker disse tiltakene suksessraten for prøvepreparering for in situ cellulære kryotomografistudier, og øker tilgjengeligheten til denne bildebehandlingsmetoden.

Protocol

1. Klargjøring av rutenett MERK: I det eksperimentelle designet, planlegg for maksimalt 8-12 rutenett totalt per stupfryseøkt og 4-5 rutenett per brønn. Mer enn det vil føre til en veldig lang stupfryseøkt, noe som kan føre til økt cellestress, isforurensning og brukerfeil. Glød utslippLegg i et passende antall rister med en perforert karbonstøttefilm som skal lades ut ved 15 mA i 45 s ved 0,39 mBar atmosfære i en glødeutladningsenhet. Forsikre deg om at karbonsiden av rutenettet vender oppover. Når du er ferdig, overfør ristene til en ren beholder foret med filterpapir (figur 1A 1).MERK: Andre rister kan brukes så lenge materialet ikke er giftig for celler (som utelukker kobbergitter). Finder-rutenett er nyttige for korrelative studier. Rister laget av andre materialer er også mulig. Mange laboratorier har hatt gode resultater med å dyrke celler på toppen av SiO2 støttegitter 8,9. Vedkommende behandlingOverfør rister, fibronektin, PBS, plater og pinsett til et biosikkerhetsskap. Behandle begge sider av ristene med 20 μg / ml bovint fibronektin ved mikropipettering to sjenerøst store prikker av adherent løsning på en steril overflate, for eksempel lokket på en 6 brønnplate. Sørg for at punktene er store nok til å omslutte hele rutenettet (rundt 100 μL anbefales).MERK: Før behandling med den valgte adherentløsningen, er det mulighet for fotomikropatterning rutenettet her for å optimalisere vedlegget av celler på midten av rutene. Hvis du reduserer cellenes evne til å feste seg til stolpene, øker antallet bildeceller. Dette er ideelt for eksperimenter som involverer kryoFIB-fresing. Bruk 5/15 pinsett for å manipulere rutenettene. Pass på å behandle begge sider av rutenettet i oppløsning.MERK: Andre limløsninger kan brukes (fibrinogen, kollagen, andre ekstracellulære matrikskomponenter, etc.). Fibronectin brukes her, da det gir gode resultater med et bredt utvalg av cellelinjer. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). 5/15-pinsetten er nyttig da geometrien gir forbedret manøvrerbarhet rundt 6-brønnsplater, 35 mm tallerkener og mikrolysbilder. Dette resulterer i mindre mekanisk belastning på ristene og en mer intakt karbonfilm. Forsikre deg om at alle nødvendige materialer er plassert i biosikkerhetsskapet før du begynner, da dette reduserer muligheten for forurensning av nettet. Feste risterNår det er behandlet med bovint fibronektin, blir rutenettet klebrig. Bruk 5/15 pinsett, berør forsiktig den ikke-karbon overflaten av rutenettet til bunnen av en tom tallerken / tallerken og åpne pinsetten. Gitteret skal enkelt festes til den nye overflaten (figur 1A2).MERK: Prøv å unngå å plassere rister i direkte senter eller kantene på fatet/tallerkenen. Når du legger til celler, er det en tendens til at celletetthet akkumuleres i midten av platen. Dette kan resultere i rutenett med overdreven cellulær tetthet. Alternativt kan 3D-printede gitterholdere brukes her i stedet for å feste celler direkte til overflaten av fatet/tallerkenen12. InkubasjonInkuber ristene i 30 minutter i fibronektinets adherente løsning (20 μg / ml). For å sikre at ristene ikke blir tørre under denne prosessen, slipper mikropipett 1-2 mer klebende løsning direkte på toppen av ristene hvert 15. minutt (figur 1A3).MERK: Inkubasjonsperioden vil variere avhengig av hvilken løsning som brukes. For bovin fibronektin er anbefalt tid 30 minutter. KlesvaskEtter inkubasjonsperioden, fjern overflødig klebende oppløsning via mikropipettering. Vask ristene med mikropipetteringsdråper PBS direkte på toppen av ristene. Gjenta dette 2-3 ganger. (Figur 1A4). SteriliseringBruk UV-lys til å sterilisere ristene i biosikkerhetsskapet i 1 time. Plasser ristene så nær UV-kilden som mulig for å maksimere steriliseringen (figur 1A5). For å sikre at ristene ikke blir tørre under denne prosessen, mikropipett 1-2 dråper PBS direkte på toppen av rister hvert 10. minutt.MERK: Trinn 1.4-1.6 kan utføres samtidig. 2. Såing rister Telle celler:Løsne og telle cellene ved hjelp av mekaniske eller enzymatiske metoder. Bestem det optimale antall celler som skal brukes til såing før telling. For U2OS sådd i en 6-brønnsplate, bruk hvor som helst mellom 6 x 104 til 1,6 x 105 celler per brønn (figur 1B1).MERK: Antall sådde celler vil variere i henhold til celletype, overflaten av brønnen, tallerken eller mikrolysbildet som brukes, tiden mellom såing og stupefrysing og eksperimentell design. Test en rekke cellenumre for å identifisere forhold som vil resultere i 0,25-1 celler per rutenett kvadrat på tidspunktet for stupefrysing. Det er viktig å merke seg at høy celletetthet reduserer hastigheten på varmeoverføring og kan påvirke vitrifikasjonsprosessen. For å bekjempe dette har noen laboratorier funnet suksess ved hjelp av cellesiler, som virker for å forhindre at celleklumper dannes13. Til slutt resulterer denne protokollen i tilfeldig vedlegg av celler til karbonlaget. Hvis et målrettet vedlegg er nødvendig, kan fotomikromønster brukes (se trinn 1.3)14. Legge til celler og vekstmedium: Legg til celler via mikropipette til brønnene, unngå bobler (figur 1B2). I en 6-brønns plate anbefales et totalt brønnvolum på 1,5-2,0 ml.NOTAT: Det anbefales å våte rundt ristene forsiktig før du legger til hele volumet. Dette vil bidra til å forhindre at rister løsner og flyter i løsningen. Beveg platen forsiktig fra side til side for å lette homogen cellefordeling på brønnen. Ikke virvle platen i en sirkulær bevegelse, da dette vil resultere i overdreven celletetthet allokering i midten av brønnen. Inkubasjon: Inkuber lysbildene ved 37 °C i en passende tid i henhold til eksperimentell design, som vil avhenge av nedstrøms applikasjoner. For dette eksemplet (transfeksjon av HIV-molekylære kloner), inkuber mellom 16-24 timer (figur 1B3).MERK: Lengre inkubasjonstider vil resultere i flere celledelingssykluser. Juster derfor startnummeret på cellene for såing tilsvarende. 3. Transfeksjon Forbereder transfeksjonsblanding:Klargjør et passende kationisk liposomreagens for plasmidtransfeksjon i den valgte cellelinjen. I dette transfeksjonseksemplet, bruk 1 μg totalt plasmid-DNA per brønn (i en 6-brønnplate) som skal transfekteres ved et 1:3-forhold mellom HIViΔEnv-plasmid og psPAX2-plasmid. For hver brønn, fortynn 1 μg DNA til 50 μL serumfri DMEM. Homogeniser blandingen ved gjentatte mikropipetteringer eller forsiktig virvling av platen. For hver brønn, fortynn 3 μL transfeksjonsreagens i serumfri DMEM, og homogeniser deretter blandingen igjen ved mikropipettering eller forsiktig virvling. Tilsett hele den fortynnede transfeksjonsreagensblandingen til den fortynnede DNA-blandingen (trinn 3.1.2) og inkuber ved romtemperatur (RT) i 15 minutter (figur 1C1).MERK: Mens denne blandingen ruger, erstatt mediet i brønnene med 1,5 ml fersk DMEM. Vær forsiktig så du ikke løsner ristene fra bunnen av brønnen. For å påføre transfeksjonsblandingen, pipett 100 μL av blandingen fra trinn 3.1.3 dråpevis til hver brønn, konsentrer dråpene over ristene for å sikre kontakt (figur 1C2). Endre vekstmediet 16-24 timer etter transfeksjon (figur 1C3). 4. Dykk frysing MERK: Hold cellene ved 37 °C til det er nødvendig for blotting. I tillegg må du huske å notere karbonsiden av ristene gjennom hele prosessen. CelletetthetSjekk rutenettene i et invertert optisk mikroskop og noter celletettheter på hvert rutenett.MERK: Rutenett med mindre enn 0,25 celler per rutenettkvadrat (eller én celle hver 4. rutenett), regnes som “tomme”. Rutenett med 0,25-1 celler per rutenett regnes som “normalt”. Rutenett med mer enn 1 celle per rutenett regnes som “fulle”. Legg merke til celletettheten på hvert rutenett for å tillate oppringing av blottingstider senere under stupfrysing. Tilsett 2-3 ml PBS på en tom tallerken/tallerken og varm opp til 37 °C. Forbereder fiducialsFor å forberede gullfiducialer for nedstrøms kryotomografiapplikasjoner, pipett 50 μL av 10 nm kolloidal gullperleløsning i et rent 1,5 ml rør. Tilsett 2 μL 1 mg/ml BSA til slangen og homogeniser ved mikropipettering gjentatte ganger. Sentrifuger røret ved 15 000-20 000 x g i 15 minutter. Mikropipette for å fjerne så mye av supernatanten som mulig uten å forstyrre pelleten.MERK: Pelleten vil være veldig løs. Tilsett 50 μL PBS til pelleten og resuspender. Sentrifuger røret igjen ved 15 000-20 000 x g i 15 min. Bruk en 10 μL-spiss til å aspirere 4 μL av pelleten direkte, og overfør den til et rent 1,5 ml rør (figur 1D 1). Bruk 1 μL av vasket og konsentrert gull per rute.MERK: Typen fiducials som brukes, avhenger av nedstrøms applikasjoner. For TEM-tomografi, bruk 10 nm gullperler. For myk røntgentomografi, bruk 200 nm gullperler. For korrelasjonsmikroskopi, bruk fluorescerende latexperler. Fiducials er normalt ikke nødvendig for eksperimenter som involverer kryoFIB-fresing, da freseprosessen vil ødelegge dem. BlottingSett opp miljøkammeret til 95 % fuktighet og 30 °C (figur 1D 1). Velg et rutenett ved hjelp av 5/15 pinsett. Vask ristene med PBS og overfør dem til stupende pinsett (figur 1D2). Når den er sikret, fjern 5/15-pinsetten og skyv klemmen på pinsetten. Sett risten inn i stupefryseren, og hold klemmen sikker (figur 1D3). Legg til 1 μL gullfiducials på baksiden av rutenettet (figur 1D4). Tilsett 2-3 μL PBS til karbonsiden av rutenettet. Bruk automatisert blotting for å fjerne baksiden av risten og dyppe frysing i flytende etan (figur 1D5).MERK: Det anbefales å ha mellom 3-4 μL volum per rutenett for optimal blotting. Rister kan beholde en variabel mengde PBS etter vask. Juster det ekstra volumet av PBS for å ta hensyn til eksisterende væskeretensjon på rutenettet. Det anbefales at gullfiducials legges på baksiden av rutenettet. Tillegg til fronten kan resultere i bassenger av gullfiducials nær innføringspunktet, mens addisjon fra baksiden resulterer i en mer homogenisert løsning. Blotting varighet avhenger av celle tannbehandling av rutenettet. 2 s for tom, 3 s for normal og 4 s for full rist, henholdsvis. Hvilken type dykkfryser som er tilgjengelig, kan avgjøre hvordan blotting tilnærmes: Leica GP2 stupefryser er den som brukes i denne protokollen og er i stand til automatisert ensidig blotting som standard. Thermo Fisher Vitrobot gjør automatisert dobbeltsidig blotting, selv om dette ofte skader cellene festet til karbonsiden. Manuell blotting i Vitrobot er også mulig, så vel som manuelle tyngdekraftstempler.

Representative Results

Etter kotransfeksjonen av HIViGFPΔEnv og psPAX2 hadde alle ristene minimal rive i karbonlaget. Ristene ble avbildet med faselysmikroskopi og fluorescerende lysmikroskopi 24 timer etter inkubasjon med transfeksjonsreagenset (figur 2). Celler på både mock-rutene og de co-transfected rutene inneholdt levedyktige celler i flere rutenett firkanter. psPAX2-koder for alle strukturelle og enzymatiske proteiner av HIV-1 uten fluorescensmerking. HIViGFPΔEnv ligner psPAX2, men med koder for et GFP-merket HIV Gag protein. Begge plasmidene er ΔEnvelope. Kotransfeksjonen resulterer i innfødt-lignende montering og spirende av fluorescerende HIV-1-partikler, noe som gjør dette til et flott system for CLEM-studier av HIV i Biosafety Level 1-tilstand. De samtransfektede rutene viste en delmengde av celler som viste grønn fluorescens, noe som indikerer vellykket kotransfeksjon. Ingen celler på mock-rutenettet viste fluorescens, noe som ytterligere validerte kotransfeksjonen ved bruk av HIViGFPΔEnv og psPAX2. Etter å ha sett på nettene ved hjelp av lysbasert mikroskopi, ble ristene stupfrosset og flyttet til langtidslagring i flytende nitrogen. Figur 3 viser resultater fra rutenett produsert med samme eksperimentelle metode, men med litt forskjellige plasmidkonstruksjoner. U2OS-holdige rutenett ble co-transfektet ved hjelp av forskjellige HIV-kloner (HIVmCherryΔEnv og NL4-3ΔEnvGFP i forholdet 1:6). Siden en høyere masse fluorescerende merkede plasmider ble brukt, gjorde disse rutene det mulig å observere et større antall transfekterte celler, noe som ga en fordel når man tok bilder ved hjelp av cryoCLEM og cryoET. Ved hjelp av kryoCLEM, ble full grid atlas generert for hvert rutenett ved hjelp av kryofluorescens mikroskopi for å registrere plasseringen av alle co-transfected celler. Med plasseringen av celler kjent, ble cryoET utført. Et fullstendig lavforstørrelsesatlas ble samlet inn og lagt sammen med fluorescerende atlas samlet ved kryofluorescens (figur 3A). Kryotomogrammer ble samlet på cellulære steder som fanget intrikate detaljer om virusets livssyklus, inkludert montering og spirning av HIV fra celler (figur 3B). Figur 1: Cellesåing på arbeidsflyt for rutenett. Et skjema som viser den generelle prosedyren for frøceller på cryoEM-nett. Prosessen er delt inn i fire hovedtrinn, inkludert (A) klargjøring av rister i brønnene for såing, (B) tilsetning av riktig mengde celler til hver brønn, (C) valgfri transfeksjon av celler for fluorescerende avbildning, og (D) stupefrysing av rister for å tillate vitrifisering av prøven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Kotransfeksjon av U2OS ved bruk av HIViGFPΔEnv og psPAX2. U2OS-celler ble co-transfektet med GFP-inneholdende HIViGFPΔEnv og psPAX2 i forholdet 1:3. Rutenett ble avbildet ved fasekontrast og fluorescensmikroskopi. Celler som er vist å ha GFP-uttrykk, indikerer vellykket kotransfeksjon. Skala bar: 500 μm. Skalastang (innsats): 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Potensielle nedstrøms kryobaserte metoder . (A) Et cryoCLEM-bilde med co-transfektede U2OS-celler. Celler i grønt representerer HIV-produserende celler og brukes til å måle kotransfeksjonssuksess. Red puncta representerer mCherry merket HIV-1 Gag. Skala bar: 250 μm. Skalastang (innfelt): 25 μm (B) Et kryoET-bilde av flere HIV-partikler som spirer fra plasmamembranen til U2OS-celler. Skala bar: 50 nm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Her har vi gitt en tilgjengelig, fleksibel og reproduserbar protokoll til frøceller på elektronmikroskopigitter for in situ kryoelektrontomografiapplikasjoner. Denne metoden kan enkelt tilpasses behovene til nedstrømsapplikasjoner og/eller eksperimentelle krav. I tillegg til stor fleksibilitet har vi beskrevet en arbeidsflyt som optimaliserer og reduserer vanlige fallgruver i rutenettsåing, spesielt omfattende skader på karbonlaget, lav celletetthet og dårlig strukturell integritet av tynncelleprojeksjoner.

Selv om protokollen beskrevet her gir flere alternativer, er det noen kritiske trinn som bør følges for å optimalisere generelle resultater. Et av de største problemene med såing av gitterceller er løsrivelse og flyting av rister fra brønnen eller mikrolysbildet. Derfor er det viktig å våte rutenettet helt med en vedheftende løsning på begge sider og forhindre at den tørker i inkubasjonsperioden. Hvis du bruker 3D-printede gitterholdere, må du være oppmerksom på at flere endringer av medier til disse holderne har potensial til å produsere flytende rister, siden luften fanget under rutenettet kan tvinge den ut av holderen.

Vårt valg av pinsett forbedrer også rutenettkvaliteten ved å gi en geometrisk gunstig måte å manipulere ristene på uten omfattende rutenettbøyning som vil skade karbonlaget. Å holde cellene ved 37 °C så lenge som mulig før de stuper, reduserer cellenes lidelse og forbedrer antallet tynne bildeceller på rutenettet. Til slutt vil blotting fra gullsiden beskytte cellene mot sterke mekaniske krefter som kan føre til skade på skjøre cellulære strukturer.

Selv om det ikke er inkludert i denne protokollen, har gridfotomikromønster vist seg å øke antall bildebare celler ved å optimalisere vedlegget til midten av rutenettet¹⁴. Endelig har 3D-printede nettholdere nylig blitt brukt til å redusere nettskader ved å begrense direkte nettmanipulering¹².

Det kan være viktig å merke seg at denne protokollen er optimalisert for avbildning av tynne kanter og fremspring fra celler for anvendelse av kryotomografi. Vi foreslår at du feilsøker en rekke forhold fra anbefalingene våre i protokollen for å finne det beste resultatet for nedstrømsprogrammene du velger. Samlet sett gir denne protokollen en pålitelig, men allsidig metode for såing av celler på rutenett som kan justeres for spesifikke behov.

Materials

10 nm colloidal gold bead solution	Sigma-Aldrich	741957
6 well multidish, 100/CS	Fisher Scientific	FB012927
Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz	Beckman-Coulter	C63125
Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon	Quantifoil	TEM-G300F1-AU
Bovine serum albumin	MilliporeSigma	A9647
BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
DMi1 Inverted Microscope	Leica	22A00G119
Dulbecco's modified eagle's medium – high glucose, no glutamine	Gibco	11-960-044
Dumont 5/15 tweezer	Electron Microscopy Sciences	0103-5/15-PO
EM GP2	Leica	587085	Automated plunge freezer
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5209
Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade	MilliporeSigma	F1141
GenJet version II in vitro DNA transfection reagent	SignaGen Laboratories	SL100489
GlutaMAX I 100x	Fisher Scientific	35050061	Media supplement
Neslab EX-211 Heating Circulator	Neslab	Out of production	Water bath for media warming
Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-100
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Pelco easyGlow device	Pelco	91000S	Glow discharge device
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	Media supplement
Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector	Gilson	F144054M
Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector	Gilson	F144056M
Whatman number 2 filter paper, 55 mm	Whatman	28455-041	Blotting paper