Summary
Denna metod ger ett tillgängligt och flexibelt protokoll för beredning av elektronmikroskopinät (EM) för in situ cellulär kryotomografi och korrelativ ljus- och elektronmikroskopi (CLEM).
Abstract
In situ cellulär kryotomografi är en kraftfull teknik för att studera komplexa objekt i deras ursprungliga frysta hydratiserade cellulära sammanhang, vilket gör den mycket relevant för cellbiologi och virologi. Potentialen att kombinera kryotomografi med andra mikroskopimodaliteter gör det till en perfekt teknik för integrativ och korrelativ avbildning. Provberedning för in situ celltomografi är dock inte okomplicerad, eftersom celler inte lätt fäster och sträcker sig över elektronmikroskopinätet. Dessutom är själva rutnäten ömtåliga och kan gå sönder om de hanteras för kraftfullt, vilket resulterar i förlust av bildbara områden. Geometrin hos vävnadsodlingsskålar kan också utgöra en utmaning när man manipulerar gallren med pincett. Här beskriver vi tips och tricks för att övervinna dessa (och andra) utmaningar och förbereda prover av god kvalitet för in situ cellulär kryotomografi och korrelativ avbildning av vidhäftande däggdjursceller. Med fortsatta framsteg inom kryomikroskopiteknik är denna teknik enormt lovande för att främja vår förståelse av komplexa biologiska system.
Introduction
In situ cellulär kryotomografi är en kraftfull teknik som möjliggör studier av biologiskt relevanta strukturer i celler utan kemisk fixering. Genom att fästa celler vid EM-galler och djupfrysa gallren i en kryogen fryses objekt av intresse i sina naturliga cellulära sammanhang utan att det bildas kristallin is från intracellulärt vatten 1,2. Både kemisk fixering och kristallin isbildning kan störa strukturerna hos relevanta molekyler, såsom proteiner och lipider, vilket minskar den biologiska noggrannheten hos bilder som erhålls med dessa tekniker 3,4. I tomografi avbildas rutnät i inkrementella vinklar med hjälp av elektronmikroskopi, och dessa bilder används sedan för att konstruera tredimensionella representationer av målområdet avbildat5. In situ kryotomografi kan användas tillsammans med andra mikroskopitekniker för integrativ och korrelativ avbildning, såsom kryofluorescensavbildning, mjukröntgentomografi och kryoFIB/SEM (kryogen fokuserad jonstråle/svepelektronmikroskopi)6,7,8,9,10,11 . Integrering av flera tekniker gör det möjligt att få mer information om en struktur eller process än vad någon enskild mikroskopiteknik kan uppnå.
Trots alla fördelar med cellulär kryotomografi in situ kan provberedning visa sig vara utmanande av olika anledningar. På grund av deras bräcklighet kan kraftfull manipulation av elektronmikroskopigaller leda till skador, där det tunna kolskiktet i synnerhet är känsligt och benäget att rivas sönder, vilket minskar den bildbara ytan av gallren. Elektronmikroskopinät är också svåra att manipulera på grund av sin lilla storlek och är benägna att lossna från ytan av brunnarna eller mikroglaset som används för att odla celler. Manipulation av gallren i brunnarna eller mikroobjekten kan visa sig vara svårt på grund av geometrin hos dessa. Felaktig förberedelse av gallren (t.ex. genom att låta dem flyta) kan leda till låg celltäthet och minska antalet potentiella avbildningsområden, särskilt när cellerna inte är benägna att fästa vid själva gallren. För direkt cellulär kryotomografi måste cellerna spridas mycket tunt, vilket kan störas av många anledningar, inklusive felaktiga temperaturer eller grov hantering av gallren.
Genom en mängd olika optimeringar är teknikerna som presenteras i den här artikeln avsedda att hantera dessa vanligaste fallgropar som uppstår vid framställning av elektronmikroskopinät för kryotomografi. Användningen av 5/15 vinklade pincetter gör det möjligt att manipulera galler i brunnsplattor eller mikroobjekt. En fibronektinlösning som appliceras på båda sidor av gallren före plätering gör flytande galler mindre sannolika, vilket är fördelaktigt för att säkerställa att gallren har tillräcklig celltäthet och att gallren är mindre benägna att skadas på grund av manipulation. Genom att hålla gallren inkuberade vid 37 °C fram till strax före nedfrysning ser vi också till att cellerna förvaras i en behaglig miljö för att förhindra att cellerna drar tillbaka sina tunna kanter. Att torka gallren från baksidan förhindrar också skador på cellerna från mekanisk kraft. Sammantaget ökar dessa åtgärder framgångsgraden för provberedning för in situ cellulära kryotomografistudier, vilket ökar tillgängligheten för denna avbildningsmetod.
Protocol
1. Förberedelse av galler
OBS: I den experimentella designen, planera för maximalt 8-12 galler totalt per djupfrysningssession och 4-5 galler per brunn. Mer än så kommer att leda till en mycket lång djupfrysningssession, vilket kan orsaka ökad cellstress, iskontaminering och användarfel.
- Glöd urladdning
- Ladda ett lämpligt antal galler med en perforerad kolstödfilm som ska glödavges vid 15 mA i 45 s vid 0,39 mBar atmosfär i en glödurladdningsanordning.
- Se till att kolsidan av gallret är vänd uppåt. När du är klar, överför gallren till en ren behållare klädd med filterpapper (Figur 1A 1).
OBS: Andra galler kan användas så länge materialet inte är giftigt för celler (vilket utesluter koppargaller). Finder-rutnät är användbara för korrelativa studier. Galler av andra material är också möjliga. Många laboratorier har haft goda resultat när det gäller att odla celler ovanpå SiO 2-stödgaller 8,9.
- Följsam behandling
- Överför galler, fibronektin, PBS, plattor och pincett till ett biosäkerhetsskåp. Behandla båda sidor av gallren med 20 μg/ml bovint fibronektin genom att mikropipettera två generöst tilltagna prickar av vidhäftande lösning på en steril yta, t.ex. locket på en 6-hålsplatta. Se till att prickarna är tillräckligt stora för att omsluta hela gallret (cirka 100 μL rekommenderas).
OBS: Före behandling med den valda vidhäftande lösningen finns det möjlighet att fotomikromönstra rutnätet här för att optimera vidhäftningen av celler i mitten av rutnätsrutorna. Om du minskar cellernas förmåga att fästa vid staplarna ökar antalet utbildbara celler. Detta är idealiskt för experiment som involverar kryoFIB-fräsning. - Använd 5/15 pincett för att manipulera gallren. Var noga med att behandla båda sidor av gallret i lösning.
OBS: Andra självhäftande lösningar kan användas (fibrinogen, kollagen, andra extracellulära matriskomponenter, etc.). Fibronektin används här, eftersom det ger bra resultat med en mängd olika cellinjer. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). 5/15-pincetten är användbar eftersom dess geometri möjliggör förbättrad manövrerbarhet runt 6-brunnsplattorna, 35 mm skålarna och mikroglasen. Detta resulterar i mindre mekanisk belastning på gallren och en mer intakt kolfilm. Se till att allt nödvändigt material placeras i biosäkerhetsskåpet innan du börjar, eftersom detta minskar risken för kontaminering av nätet.
- Överför galler, fibronektin, PBS, plattor och pincett till ett biosäkerhetsskåp. Behandla båda sidor av gallren med 20 μg/ml bovint fibronektin genom att mikropipettera två generöst tilltagna prickar av vidhäftande lösning på en steril yta, t.ex. locket på en 6-hålsplatta. Se till att prickarna är tillräckligt stora för att omsluta hela gallret (cirka 100 μL rekommenderas).
- Fästa galler
- När gallret har behandlats med bovint fibronektin blir det klibbigt. Använd 5/15 pincett, rör försiktigt gallrets icke-kolyta till botten av en tom skål/tallrik och öppna pincetten. Gallret ska lätt kunna fästas på den nya ytan (Figur 1A2).
OBS: Försök att undvika att placera galler i mitten eller kanterna på skålen/tallriken. När man lägger till celler finns det en tendens att celltätheten ackumuleras i mitten av plattan. Detta kan resultera i nät med överdriven cellulär densitet. Alternativt kan 3D-printade gallerhållare användas här istället för att fästa celler direkt på ytan av skålen/tallriken12.
- När gallret har behandlats med bovint fibronektin blir det klibbigt. Använd 5/15 pincett, rör försiktigt gallrets icke-kolyta till botten av en tom skål/tallrik och öppna pincetten. Gallret ska lätt kunna fästas på den nya ytan (Figur 1A2).
- Inkubation
- Inkubera gallren i 30 minuter i den fibronektinvidhäftande lösningen (20 μg/ml). För att säkerställa att gallren inte blir torra under denna process, pipettera 1-2 droppar mer vidhäftande lösning direkt ovanpå gallren var 15:e minut (Figur 1A3).
OBS: Inkubationstiden varierar beroende på vilken vidhäftande lösning som används. För bovint fibronektin är den rekommenderade tiden 30 minuter.
- Inkubera gallren i 30 minuter i den fibronektinvidhäftande lösningen (20 μg/ml). För att säkerställa att gallren inte blir torra under denna process, pipettera 1-2 droppar mer vidhäftande lösning direkt ovanpå gallren var 15:e minut (Figur 1A3).
- Tvätt
- Efter inkubationstiden avlägsnas överflödig vidhäftande lösning med hjälp av mikropipettering. Tvätta gallren genom att mikropipettera droppar PBS direkt ovanpå gallren. Upprepa detta 2-3 gånger. (Figur 1A4).
- Sterilisering
- Använd UV-ljus för att sterilisera gallren i biosäkerhetsskåpet i 1 timme. Placera gallren så nära UV-källan som möjligt för att maximera steriliseringen (Figur 1A5). För att säkerställa att gallren inte blir torra under denna process, pipettera 1-2 droppar PBS direkt ovanpå gallren var 10:e minut.
OBS : Steg 1.4-1.6 kan utföras samtidigt.
- Använd UV-ljus för att sterilisera gallren i biosäkerhetsskåpet i 1 timme. Placera gallren så nära UV-källan som möjligt för att maximera steriliseringen (Figur 1A5). För att säkerställa att gallren inte blir torra under denna process, pipettera 1-2 droppar PBS direkt ovanpå gallren var 10:e minut.
2. Sådd av galler
- Räkna celler:
- Lösgör och räkna cellerna med hjälp av mekaniska eller enzymatiska metoder. Bestäm det optimala antalet celler som ska användas för sådd innan du räknar. För U2OS sådd i en 6-hålsplatta, använd var som helst mellan 6 x 104 till 1,6 x 105 celler per brunn (figur 1B1).
OBS: Antalet celler som sås kommer att variera beroende på celltyp, ytan på brunnen, skålen eller mikroglaset som används, tiden mellan sådd och djupfrysning och den experimentella designen. Testa ett intervall av cellnummer för att identifiera förhållanden som kommer att resultera i 0,25-1 celler per rutnätsruta vid tidpunkten för nedfrysning. Det är viktigt att notera att hög celldensitet minskar värmeöverföringshastigheten och kan påverka förglasningsprocessen. För att bekämpa detta har vissa laboratorier funnit framgång med hjälp av cellsilar, som verkar för att förhindra att cellklumpar bildas13. Slutligen resulterar detta protokoll i den slumpmässiga bindningen av celler till kolskiktet. Om en riktad infästning är nödvändig kan fotomikromönstring användas (se steg 1.3)14.
- Lösgör och räkna cellerna med hjälp av mekaniska eller enzymatiska metoder. Bestäm det optimala antalet celler som ska användas för sådd innan du räknar. För U2OS sådd i en 6-hålsplatta, använd var som helst mellan 6 x 104 till 1,6 x 105 celler per brunn (figur 1B1).
- Tillsats av celler och odlingsmedium: Tillsätt celler via mikropipett till brunnarna och undvik bubblor (figur 1B2). I en 6-hålsplatta rekommenderas en total brunnsvolym på 1,5-2,0 ml.
OBS: Det rekommenderas att blöta runt gallren försiktigt innan du lägger till hela volymen. Detta hjälper till att förhindra att galler lossnar och flyter i lösningen. Flytta försiktigt plattan från sida till sida för att underlätta homogen cellfördelning på brunnen. Snurra inte plattan i en cirkulär rörelse, eftersom detta kommer att resultera i överdriven celltäthet i mitten av brunnen. - Inkubation: Inkubera objektglasen vid 37 °C under en lämplig tid i enlighet med försöksplanen, som beror på tillämpningarna nedströms. I detta exempel (transfektion av molekylära HIV-kloner) inkuberas de mellan 16 och 24 timmar (figur 1B3).
OBS: Längre inkubationstider kommer att resultera i fler celldelningscykler. Justera därför startantalet celler för sådd i enlighet med detta.
3. Transfektion
- Beredning av transfektionsblandning:
- Bered ett lämpligt katjoniskt liposomreagens för plasmidtransfektion till den valda cellinjen.
- I detta transfektionsexempel används 1 μg totalt plasmid-DNA per brunn (i en 6-hålsplatta) som ska transfekteras i förhållandet 1:3 mellan HIViΔEnv-plasmiden och psPAX2-plasmiden. För varje brunn späds 1 μg DNA till 50 μl serumfritt DMEM. Homogenisera blandningen genom upprepad mikropipettering eller försiktig virvling av plattan.
- För varje brunn, späd 3 μl transfektionsreagens i serumfri DMEM och homogenisera sedan blandningen igen genom mikropipettering eller försiktig virvling. Tillsätt hela den utspädda transfektionsreagensblandningen till den utspädda DNA-blandningen (steg 3.1.2) och inkubera i rumstemperatur (RT) i 15 minuter (figur 1C1).
OBS: Medan denna blandning inkuberar, byt ut mediet i brunnarna mot 1.5 ml färsk DMEM. Var försiktig så att du inte lossnar gallren från botten av brunnen.
- För att applicera transfektionsblandningen, pipettera 100 μL av blandningen från steg 3.1.3 droppvis till varje brunn och koncentrera dropparna över gallren för att säkerställa kontakt (figur 1C2). Byt odlingsmedium 16-24 timmar efter transfektion (Figur 1C3).
4. Frysning av djupvatten
OBS: Håll cellerna vid 37 °C tills de behövs för blotting. Se dessutom till att anteckna kolsidan av gallren under hela processen.
- Celltäthet
- Kontrollera rutnäten i ett omvänt optiskt mikroskop och notera celldensiteten på varje rutnät.
Rutnät med mindre än 0,25 celler per rutnätsruta (eller en cell var 4:e rutnätsruta) anses vara "tomma". Rutnät med 0,25-1 celler per rutnätsruta anses vara "normala". Rutnät med mer än 1 cell per rutnätsruta anses vara "fulla". - Notera celltätheten på varje rutnät för att möjliggöra uppringning av blottningstider senare under nedsänkningsfrysning. Tillsätt 2-3 ml PBS på en tom tallrik/fat och värm till 37 °C.
- Kontrollera rutnäten i ett omvänt optiskt mikroskop och notera celldensiteten på varje rutnät.
- Förbereda fiducials
- För att förbereda guldfiducialer för nedströms kryotomografiapplikationer, pipettera 50 μL 10 nm kolloidal guldpärllösning i ett rent 1,5 ml rör. Tillsätt 2 μl 1 mg/ml BSA till röret och homogenisera genom mikropipettering upprepade gånger.
- Centrifugera röret vid 15 000-20 000 x g i 15 minuter. Mikropipett för att ta bort så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa pelleten.
OBS: Pelleten kommer att vara mycket lös. - Tillsätt 50 μL PBS till pelleten och återuppliva. Centrifugera röret igen med 15 000-20 000 x g i 15 minuter.
- Använd en 10 μL-spets, aspirera direkt 4 μL av pelleten och överför den till ett rent 1.5 ml-rör (Figur 1D 1). Använd 1 μL av det tvättade och koncentrerade guldet per galler.
OBS: Vilken typ av fiducials som används beror på nedströmsapplikationer. För TEM-tomografi, använd 10 nm guldpärlor. För mjukröntgentomografi, använd 200 nm guldpärlor. För korrelationsmikroskopi, använd fluorescerande latexpärlor. Fiducials är normalt inte nödvändiga för experiment som involverar kryoFIB-fräsning, eftersom malningsprocessen kommer att förstöra dem.
- Blotting
- Ställ in miljökammaren på 95 % luftfuktighet och 30°C (Figur 1D 1). Välj ett rutnät med 5/15 pincett.
- Tvätta gallren med PBS och överför dem till en pincett (Figur 1D2). När den är säkrad, ta bort 5/15 pincetten och skjut clamp på den nedsänkta pincetten.
- Sätt in gallret i frysboxen, håll clamp säker (Figur 1D3). Tillsätt 1 μl guldfiducialer på baksidan av rutnätet (figur 1D4). Tillsätt 2-3 μL PBS till kolsidan av gallret. Använd automatisk blotting för att torka av gallrets baksida och doppa frysen i flytande etan (Figur 1D5).
OBS: Det rekommenderas att ha mellan 3-4 μL volym per galler för optimal blotting. Galler kan behålla en varierande mängd PBS efter tvätt. Justera den extra volymen av PBS för att ta hänsyn till befintlig vätskeretention på nätet. Det rekommenderas att guldfiducialerna läggs till på baksidan av rutnätet. Tillsats på framsidan kan resultera i pooler av guldfiducialer nära insättningspunkten, medan tillsats från baksidan resulterar i en mer homogeniserad lösning. Blottingens varaktighet beror på gallrets celltandvård. 2 s för tom, 3 s för normal respektive 4 s för fulla rutnät. Vilken typ av djupfrys som finns tillgänglig kan avgöra hur man går tillväga: Leica GP2 är den som används i detta protokoll och kan som standard utföra automatiserad enkelsidig blotting. Thermo Fisher Vitrobot gör automatiserad dubbelsidig blotting, även om detta ofta skadar cellerna som är fästa på kolsidan. Manuell blotting i Vitrobot är också möjlig, liksom manuella gravitationskolvar.
Representative Results
Efter kotransfektionen av HIViGFPΔEnv och psPAX2 hade alla galler minimal rivning i kollagret. Rutnäten avbildades med fasljusmikroskopi och fluorescerande ljusmikroskopi 24 timmar efter inkubation med transfektionsreagenset (Figur 2). Cellerna på både de simulerade rutnäten och de samtransfekterade rutnäten innehöll livskraftiga celler i flera rutnätsrutor.
psPAX2 kodar för alla strukturella och enzymatiska proteiner i hiv-1 utan någon fluorescensmärkning. HIViGFPΔEnv liknar psPAX2 men med koder för ett GFP-märkt HIV Gag-protein. Båda plasmiderna är ΔEnvelope. Kotransfektionen resulterar i naturlig sammansättning och knoppning av fluorescerande HIV-1-partiklar, vilket gör detta till ett utmärkt system för CLEM-studier av HIV i Biosafety Level 1-tillstånd. De co-transfekterade rutnäten visade en undergrupp av celler som uppvisade grön fluorescens, vilket indikerar framgångsrik kotransfektion. Inga celler på skennätet uppvisade fluorescens, vilket ytterligare validerade kotransfektionen med hiviGFPΔEnv och psPAX2. Efter att ha tittat på gallren med ljusbaserad mikroskopi sänkfrystes gallren och flyttades till långtidsförvaring i flytande kväve.
Figur 3 visar resultat från rutnät som producerats med samma experimentella metod men med något olika plasmidkonstruktioner. U2OS-innehållande rutnät samtransfekterades med hjälp av olika HIV-kloner (HIVmCherryΔEnv och NL4-3ΔEnvGFP i förhållandet 1:6). Eftersom en högre massa av fluorescerande märkta plasmider användes, möjliggjorde dessa rutnät observation av ett större antal transfekterade celler, vilket gav en fördel vid fotografering med kryoCLEM och kryoET. Med hjälp av cryoCLEM genererades fullgrid-atlaser för varje rutnät med hjälp av kryofluorescensmikroskopi för att registrera platserna för alla co-transfekterade celler. Med cellernas placering känd utfördes kryoET. En fullständig rutnätsatlas med låg förstoring samlades in och överlagrades med den fluorescerande atlasen som samlades in vid kryofluorescens (figur 3A). Kryotomogram samlades in på cellulära platser och fångade intrikata detaljer om virusets livscykel, inklusive sammansättning och knoppning av HIV från celler (Figur 3B).
Bild 1: Arbetsflöde för cellseeding i rutnät. Ett schema som visar den övergripande proceduren för att sådda celler på kryoEM-rutnät. Processen är uppdelad i fyra huvudsteg, inklusive (A) förberedelse av galler i brunnarna för sådd, (B) tillsats av lämplig mängd celler till varje brunn, (C) valfri transfektion av celler för fluorescerande avbildning och (D) djupfrysning av galler för att möjliggöra förglasning av provet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kotransfektion av U2OS med hiviGFPΔEnv och psPAX2. U2OS-celler samtransfekterades med GFP-innehållande HIViGFPΔEnv och psPAX2 i förhållandet 1:3. Rutnäten avbildades med faskontrast- och fluorescensmikroskopi. Celler som har visat sig ha GFP-uttryck indikerar framgångsrik kotransfektion. Skalstapel: 500 μm. Skalstapel (infällda): 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Potentiella nedströms kryobaserade metoder . (A) En kryoCLE-bild med co-transfekterade U2OS-celler. Celler i grönt representerar HIV-producerande celler och används för att mäta kotransfektionsframgång. Röd puncta representerar mCherry taggad HIV-1 Gag. Skalstreck: 250 μm. Skalstreck (infällt): 25 μm (B) En kryoET-bild av flera HIV-partiklar som knoppas av från plasmamembranet i U2OS-celler. Skalstapel: 50 nm Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Här har vi tillhandahållit ett tillgängligt, flexibelt och reproducerbart protokoll för fröceller på elektronmikroskopinät för in situ kryoelektrontomografiapplikationer. Denna metod kan enkelt anpassas för att passa behoven hos nedströmstillämpningar och/eller experimentella krav. Förutom stor flexibilitet har vi beskrivit ett arbetsflöde som optimerar och minskar vanliga fallgropar i rutnätssådd, särskilt omfattande skador på kollagret, låg celldensitet och dålig strukturell integritet hos tunncellsprojektioner.
Även om protokollet som beskrivs här ger flera alternativ, finns det några viktiga steg som bör följas för att optimera allmänna resultat. Ett av de största problemen med frösådd av rutnätsceller är att rutnät lossnar och flyter från brunnen eller mikroobjektglaset. Därför är det viktigt att blöta gallret helt med en vidhäftande lösning på båda sidor och förhindra att det torkar under inkubationstiden. Om du använder 3D-printade gallerhållare ska du vara medveten om att flera byten av media till dessa hållare har potential att producera flytande galler eftersom luften som fångas under gallret kan tvinga ut den ur hållaren.
Vårt val av pincett förbättrar också gallerkvaliteten genom att ge ett geometriskt gynnsamt sätt att manipulera gallren utan omfattande rutnätsböjning som skulle skada kolskiktet. Att hålla cellerna vid 37 °C så länge som möjligt innan de störtar minskar cellernas lidande och förbättrar antalet tunna avbildbara celler i gallret. Slutligen kommer blotting från guldsidan att skydda cellerna från hårda mekaniska krafter som kan leda till skador på ömtåliga cellulära strukturer.
Även om det inte ingår i detta protokoll, har rutnätsfotomikromönstring visat sig öka antalet bildbara celler genom att optimera deras bindning till mitten av rutnätsrutor14. Slutligen har 3D-printade gallerhållare nyligen använts för att minska skador på nätet genom att begränsa direkt gallermanipulation12.
Det kan vara viktigt att notera att detta protokoll är optimerat för avbildning av tunna kanter och utsprång från celler för applicering av kryotomografi. Vi föreslår att du felsöker en mängd olika villkor från våra rekommendationer i protokollet för att hitta det bästa resultatet för de underordnade program som du väljer. Sammantaget ger detta protokoll en pålitlig men ändå mångsidig metod för att seeda celler på rutnät som kan justeras för specifika behov.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Mansky-labbet för tillgången till djupfrysningsutrustning. Delar av detta arbete utfördes i karakteriseringsanläggningen vid University of Minnesota, som delvis får stöd från National Science Foundation (NSF) genom Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC; Utmärkelsenummer DMR-2011401) och National Neuroscience Curriculum Initiative (NNCI; Utmärkelsenummer ECCS-2025124) program. Vi vill tacka finansieringen från Behavior of HIV in Viral Environments center (B-HIVE; 1U54AI170855-01) och Duke Center for HIV Structural Biology (DCHSB; U54AI170752) centrum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
| 6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
| Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
| Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
| Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium - high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
| Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
| EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
| Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
| GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
| GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
| Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
| Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
| Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
| Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
| Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
| Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |
References
- Zhang, P., Mendonça, L. Analysis of Viruses in the Cellular Context by Electron Tomography. Encyclopedia of Virology. 1, Elsevier, Academic Press. 242-247 (2021).
- Fäßler, F., Dimchev, G., Hodirnau, V. -V., Wan, W., Schur, F. K. M. Cryo-electron tomography structure of Arp2/3 complex in cells reveals new insights into the branch junction. Nature Communications. 11, 6437 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. Journal of Microscopy. 131 (Pt 1), 1-9 (1983).
- Stewart, M., Vigers, G. Electron microscopy of frozen-hydrated biological material. Nature. 319 (6055), 631-636 (1986).
- Gan, L., Jensen, G. J.
- Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).
- Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
- Klumpe, S., et al. A modular platform for automated cryo-FIB workflows. eLife. 10, e70506 (2021).
- Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
- Klein, S., et al. IFITM3 blocks influenza virus entry by sorting lipids and stabilizing hemifusion. Cell Host & Microbe. 31 (4), 616.e20-633.e20 (2023).
- Shah, P. N. M., et al. Characterization of the rotavirus assembly pathway in situ using cryoelectron tomography. Cell Host & Microbe. 31 (4), 604.e4-615.e4 (2023).
- Fäßler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. 3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).
- Hoffmann, P. C., et al. Electron cryo-tomography reveals the subcellular architecture of growing axons in human brain organoids. eLife. 10, e70269 (2021).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
