Summary
Deze methode biedt een toegankelijk en flexibel protocol voor de voorbereiding van elektronenmicroscopieroosters (EM) voor in situ cellulaire cryotomografie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM).
Abstract
In situ cellulaire cryotomografie is een krachtige techniek voor het bestuderen van complexe objecten in hun oorspronkelijke bevroren-gehydrateerde cellulaire context, waardoor het zeer relevant is voor cellulaire biologie en virologie. Het potentieel van het combineren van cryotomografie met andere microscopiemodaliteiten maakt het een perfecte techniek voor integratieve en correlatieve beeldvorming. De monstervoorbereiding voor in situ cellulaire tomografie is echter niet eenvoudig, omdat cellen zich niet gemakkelijk hechten en zich uitstrekken over het elektronenmicroscopierooster. Bovendien zijn de roosters zelf kwetsbaar en kunnen ze breken als ze te krachtig worden gehanteerd, wat resulteert in het verlies van beeldbare gebieden. De geometrie van weefselkweekschaaltjes kan ook een uitdaging vormen bij het manipuleren van de roosters met een pincet. Hier beschrijven we de tips en trucs om deze (en andere) uitdagingen te overwinnen en monsters van goede kwaliteit voor te bereiden voor in situ cellulaire cryotomografie en correlatieve beeldvorming van aanhangende zoogdiercellen. Met de voortdurende vooruitgang in cryomicroscopietechnologie is deze techniek veelbelovend voor het bevorderen van ons begrip van complexe biologische systemen.
Introduction
In situ cellulaire cryotomografie is een krachtige techniek die het mogelijk maakt om biologisch relevante structuren in cellen te bestuderen zonder chemische fixatie. Door cellen aan EM-roosters te hechten en de roosters in een cryogeen te bevriezen, worden interessante objecten bevroren in hun natuurlijke cellulaire context zonder de vorming van kristallijn ijs uit intracellulair water 1,2. Zowel chemische fixatie als kristallijne ijsvorming kunnen de structuren van relevante moleculen, zoals eiwitten en lipiden, verstoren, waardoor de biologische nauwkeurigheid van beelden die met deze technieken worden verkregen, afneemt 3,4. Bij tomografie worden rasters onder incrementele hoeken afgebeeld met behulp van elektronenmicroscopie, en deze beelden worden vervolgens gebruikt om driedimensionale representaties te construeren van het doelgebied dat wordt afgebeeld5. In situ cryotomografie kan worden gebruikt naast andere microscopietechnieken voor integratieve en correlatieve beeldvorming, zoals cryofluorescentiebeeldvorming, zachte röntgentomografie en cryoFIB/SEM (cryogene gefocusseerde ionenbundel/scanningelektronenmicroscopie)6,7,8,9,10,11 . Integratie van meerdere technieken maakt het mogelijk om meer informatie over een structuur of proces te verkrijgen dan een enkele microscopietechniek zou kunnen bereiken.
Ondanks alle voordelen van in situ cellulaire cryotomografie, kan monstervoorbereiding om verschillende redenen een uitdaging blijken te zijn. Vanwege hun kwetsbaarheid kan krachtige manipulatie van elektronenmicroscopieroosters tot schade leiden, waarbij met name de dunne koolstoflaag delicaat is en vatbaar voor scheuren, waardoor het beeldbare gebied van de roosters wordt verkleind. Elektronenmicroscopieroosters zijn ook moeilijk te manipuleren vanwege hun kleine formaat en zijn vatbaar voor losraken van het oppervlak van de putjes of microslide die worden gebruikt om cellen te laten groeien. Manipulatie van de roosters in de putten of microglijbanen kan moeilijk zijn vanwege de geometrie hiervan. Onjuiste voorbereiding van de roosters (bijv. ze laten zweven) kan leiden tot een lage celdichtheid en vermindering van het aantal potentiële beeldvormingsgebieden, vooral wanneer cellen niet geneigd zijn zich aan de roosters zelf te hechten. Voor directe cellulaire cryotomografie moeten cellen zich zeer dun verspreiden, wat om vele redenen kan worden verstoord, waaronder onjuiste temperaturen of ruwe behandeling van de roosters.
Door middel van een verscheidenheid aan optimalisaties zijn de technieken die in dit artikel worden gepresenteerd bedoeld om deze meest voorkomende valkuilen aan te pakken die zich voordoen tijdens de voorbereiding van elektronenmicroscopieroosters voor cryotomografie. Het gebruik van een 5/15 haaks pincet maakt het mogelijk om roosters in putplaten of microglaasjes te manipuleren. Een fibronectine-oplossing die voorafgaand aan het plateren aan beide zijden van de roosters wordt aangebracht, maakt drijvende roosters minder waarschijnlijk, wat gunstig is om ervoor te zorgen dat roosters voldoende celdichtheid hebben en dat de roosters minder snel worden beschadigd door manipulatie. Door de roosters op 37°C te laten incuberen tot vlak voor het invriezen, zorgen we er ook voor dat de cellen in een comfortabele omgeving worden bewaard om te voorkomen dat de cellen hun dunne randen terugtrekken. Door de roosters aan de achterkant te deppen, wordt ook schade aan de cellen door mechanische kracht voorkomen. Al met al verhogen deze maatregelen het slagingspercentage van monstervoorbereiding voor in situ cellulaire cryotomografiestudies, waardoor de toegankelijkheid van deze beeldvormingsbenadering toeneemt.
Protocol
1. Voorbereiding van het rooster
OPMERKING: Plan in het experimentele ontwerp voor maximaal 8-12 roosters in totaal per invriessessie en 4-5 roosters per put. Meer dan dat zal leiden tot een zeer lange vriessessie, wat kan leiden tot verhoogde celstress, ijsverontreiniging en gebruikersfouten.
- Gloed ontlading
- Laad een geschikt aantal roosters met een geperforeerde koolstofsteunfilm die moet worden ontladen bij 15 mA gedurende 45 s bij een atmosfeer van 0.39 mBar in een gloeiontladingsapparaat.
- Zorg ervoor dat de koolstofzijde van het rooster naar boven wijst. Als u klaar bent, plaatst u de roosters in een schone bak bekleed met filtreerpapier (Figuur 1A1).
OPMERKING: Andere roosters mogen worden gebruikt zolang het materiaal niet giftig is voor cellen (wat elk koperen rooster uitsluit). Finder grids zijn handig voor correlatieve studies. Roosters van andere materialen zijn ook mogelijk. Veel laboratoria hebben goede resultaten behaald met het kweken van cellen bovenop SiO 2-ondersteuningsrasters 8,9.
- Hechte behandeling
- Breng de roosters, fibronectine, PBS, platen en pincetten over naar een bioveiligheidskast. Behandel beide zijden van de roosters met 20 μg/ml runderfibronectine door twee ruime stippen hechtende oplossing te micropipetteren op een steriel oppervlak, zoals het deksel van een plaat met 6 putjes. Zorg ervoor dat de stippen groot genoeg zijn om het hele rooster te omhullen (ongeveer 100 μL wordt aanbevolen).
OPMERKING: Voorafgaand aan de behandeling met de geselecteerde hechtende oplossing, is er de mogelijkheid om het raster hier te micro-micropatronen te geven om de bevestiging van cellen in het midden van rastervierkanten te optimaliseren. Door het vermogen van cellen om zich aan de staven te hechten te verminderen, neemt het aantal beeldbare cellen toe. Dit is ideaal voor experimenten met cryoFIB-frezen. - Gebruik een 5/15 pincet om de roosters te manipuleren. Zorg ervoor dat u beide zijden van het rooster in oplossing behandelt.
OPMERKING: Er kunnen andere zelfklevende oplossingen worden gebruikt (fibrinogeen, collageen, andere extracellulaire matrixcomponenten, enz.). Fibronectine wordt hier gebruikt, omdat het goede resultaten geeft met een grote verscheidenheid aan cellijnen. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). De 5/15 pincet is handig omdat de geometrie een betere manoeuvreerbaarheid mogelijk maakt rond de 6-wells platen, 35 mm schalen en microglaasjes. Dit resulteert in minder mechanische belasting van de roosters en een meer intacte koolstoffilm. Zorg ervoor dat alle benodigde materialen voor aanvang in de bioveiligheidskast zijn geplaatst, omdat dit de kans op netverontreiniging verkleint.
- Breng de roosters, fibronectine, PBS, platen en pincetten over naar een bioveiligheidskast. Behandel beide zijden van de roosters met 20 μg/ml runderfibronectine door twee ruime stippen hechtende oplossing te micropipetteren op een steriel oppervlak, zoals het deksel van een plaat met 6 putjes. Zorg ervoor dat de stippen groot genoeg zijn om het hele rooster te omhullen (ongeveer 100 μL wordt aanbevolen).
- Roosters bevestigen
- Eenmaal behandeld met runderfibronectine, wordt het rooster plakkerig. Raak met een 5/15 pincet voorzichtig het koolstofvrije oppervlak van het rooster aan tegen de bodem van een lege schaal/bord en open het pincet. Het rooster moet gemakkelijk aan het nieuwe oppervlak kunnen worden bevestigd (Figuur 1A2).
NOTITIE: Probeer te voorkomen dat u roosters in het midden of aan de randen van de schaal/het bord plaatst. Bij het toevoegen van cellen is er een tendens dat de celdichtheid zich ophoopt in het midden van de plaat. Dit kan resulteren in roosters met een te hoge celdichtheid. Als alternatief kunnen hier 3D-geprinte roosterhouders worden gebruikt in plaats van cellen rechtstreeks op het oppervlak van de schaal/plaat12 te bevestigen.
- Eenmaal behandeld met runderfibronectine, wordt het rooster plakkerig. Raak met een 5/15 pincet voorzichtig het koolstofvrije oppervlak van het rooster aan tegen de bodem van een lege schaal/bord en open het pincet. Het rooster moet gemakkelijk aan het nieuwe oppervlak kunnen worden bevestigd (Figuur 1A2).
- Incubatie
- Incubeer de roosters gedurende 30 minuten in de fibronectine-adherente oplossing (20 μg/ml). Om ervoor te zorgen dat de roosters tijdens dit proces niet droog worden, moet u elke 15 minuten 1-2 druppels van de meer hechtende oplossing rechtstreeks op de roosters pipetten (Figuur 1A3).
NOTITIE: De incubatietijd is afhankelijk van de gebruikte hechtende oplossing. Voor runderfibronectine is de aanbevolen tijd 30 minuten.
- Incubeer de roosters gedurende 30 minuten in de fibronectine-adherente oplossing (20 μg/ml). Om ervoor te zorgen dat de roosters tijdens dit proces niet droog worden, moet u elke 15 minuten 1-2 druppels van de meer hechtende oplossing rechtstreeks op de roosters pipetten (Figuur 1A3).
- Was
- Verwijder na de incubatietijd overtollige aanhangende oplossing via micropipetteren. Was de roosters door PBS-druppels direct op de roosters te micropipetteren. Herhaal dit 2-3 keer. (Figuur 1A4).
- Sterilisatie
- Gebruik UV-licht om de roosters in de bioveiligheidskast gedurende 1 uur te steriliseren. Plaats de roosters zo dicht mogelijk bij de UV-bron om de sterilisatie te maximaliseren (Figuur 1A5). Om ervoor te zorgen dat de roosters tijdens dit proces niet droog worden, micropipetteer u elke 10 minuten 1-2 druppels PBS rechtstreeks op de roosters.
OPMERKING: Stappen 1.4-1.6 kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd.
- Gebruik UV-licht om de roosters in de bioveiligheidskast gedurende 1 uur te steriliseren. Plaats de roosters zo dicht mogelijk bij de UV-bron om de sterilisatie te maximaliseren (Figuur 1A5). Om ervoor te zorgen dat de roosters tijdens dit proces niet droog worden, micropipetteer u elke 10 minuten 1-2 druppels PBS rechtstreeks op de roosters.
2. Zaairoosters
- Cellen tellen:
- Maak de cellen los en tel ze met behulp van mechanische of enzymatische methoden. Bepaal het optimale aantal cellen dat moet worden gebruikt voor het zaaien voordat u gaat tellen. Gebruik voor U2OS gezaaid in een plaat met 6 putjes ergens tussen 6 x 104 tot 1.6 x 105 cellen per putje (Figuur 1B1).
OPMERKING: Het aantal cellen dat wordt gezaaid, is afhankelijk van het celtype, de oppervlakte van de gebruikte put, schaal of microglijbaan, de tijd tussen zaaien en invriezen en het experimentele ontwerp. Test een reeks celnummers om omstandigheden te identificeren die resulteren in 0.25-1 cellen per rastervierkant op het moment van invriezen. Het is belangrijk op te merken dat een hoge celdichtheid de snelheid van warmteoverdracht vermindert en het verglazingsproces kan beïnvloeden. Om dit tegen te gaan, hebben sommige laboratoria succes geboekt met het gebruik van celzeven, die voorkomen dat celklonten zich vormen13. Ten slotte resulteert dit protocol in de willekeurige aanhechting van cellen aan de koolstoflaag. Als een gerichte bevestiging nodig is, kan foto-micropatroonvorming worden gebruikt (zie stap 1.3)14.
- Maak de cellen los en tel ze met behulp van mechanische of enzymatische methoden. Bepaal het optimale aantal cellen dat moet worden gebruikt voor het zaaien voordat u gaat tellen. Gebruik voor U2OS gezaaid in een plaat met 6 putjes ergens tussen 6 x 104 tot 1.6 x 105 cellen per putje (Figuur 1B1).
- Toevoegen van cellen en groeimedium : Voeg cellen via een micropipet toe aan de putjes en vermijd luchtbellen (figuur 1B2). In een plaat met 6 putjes wordt een totaal putvolume van 1,5-2,0 ml aanbevolen.
NOTITIE: Het wordt aanbevolen om de roosters zorgvuldig nat te maken voordat u het volledige volume toevoegt. Dit helpt voorkomen dat roosters losraken en in de oplossing zweven. Beweeg de plaat voorzichtig heen en weer om een homogene celverdeling op de put te vergemakkelijken. Draai de plaat niet in een cirkelvormige beweging, omdat dit zal resulteren in een overmatige celdichtheid in het midden van de put. - Incubatie: Incubeer de objectglaasjes bij 37 °C gedurende een geschikte tijd volgens het experimentele ontwerp, dat afhankelijk is van de stroomafwaartse toepassingen. Voor dit voorbeeld (transfectie van moleculaire klonen van HIV) incubeer tussen 16-24 uur (Figuur 1B3).
OPMERKING: Langere incubatietijden resulteren in meer celdelingscycli. Pas daarom het startaantal cellen voor het zaaien dienovereenkomstig aan.
3. Transfectie
- Bereiding van het transfectiemengsel:
- Bereid een geschikt kationisch liposoomreagens voor plasmidetransfectie in de geselecteerde cellijn.
- Gebruik in dit transfectievoorbeeld 1 μg totaal plasmide-DNA per putje (in een plaat met 6 putjes) om te worden getransfecteerd in een verhouding van 1:3 van HIViΔEnv-plasmide tot psPAX2-plasmide. Verdun voor elk putje 1 μg DNA tot 50 μL serumvrije DMEM. Homogeniseer het mengsel door herhaaldelijk te micropipetteren of de plaat zachtjes rond te draaien.
- Verdun voor elk putje 3 μL transfectiereagens in serumvrije DMEM en homogeniseer het mengsel vervolgens opnieuw door middel van micropipetteren of zachtjes ronddraaien. Voeg het volledige verdunde transfectiereagensmengsel toe aan het verdunde DNA-mengsel (stap 3.1.2) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) (figuur 1C1).
OPMERKING: Terwijl dit mengsel aan het broeden is, vervangt u de media in de putjes door 1,5 ml verse DMEM. Pas op dat u de roosters niet losmaakt van de bodem van de put.
- Om het transfectiemengsel aan te brengen, pipetteer u 100 μl van het mengsel uit stap 3.1.3 druppelsgewijs op elk putje, waarbij u de druppels concentreert op de roosters om contact te maken (figuur 1C2). Vervang het groeimedium 16-24 uur na transfectie (Figuur 1C3).
4. Invriezen
NOTITIE: Houd de cellen op 37 °C totdat ze nodig zijn om te deppen. Zorg er bovendien voor dat u tijdens het hele proces de koolstofkant van de roosters noteert.
- Celdichtheid
- Controleer de roosters in een omgekeerde optische microscoop en noteer de celdichtheden op elk rooster.
OPMERKING: Rasters met minder dan 0,25 cellen per rastervierkant (of één cel per 4 rastervierkanten) worden als 'leeg' beschouwd. Roosters met 0,25-1 cellen per rastervierkant worden als 'normaal' beschouwd. Rasters met meer dan 1 cel per rastervierkant worden als 'vol' beschouwd. - Let op de celdichtheid op elk rooster om de deppingstijden later tijdens het invriezen te kunnen invriezen. Voeg 2-3 ml PBS toe aan een leeg bord/schaal en verwarm tot 37 °C.
- Controleer de roosters in een omgekeerde optische microscoop en noteer de celdichtheden op elk rooster.
- Fiducials voorbereiden
- Om goudfiducials voor te bereiden op stroomafwaartse cryotomografietoepassingen, pipetteer 50 μl colloïdale goudpareloplossing van 10 nm in een schoon buisje van 1,5 ml. Voeg 2 μL van 1 mg/ml BSA toe aan de buis en homogeniseer door herhaaldelijk te micropipetteren.
- Centrifugeer de buis bij 15.000-20.000 x g gedurende 15 minuten. Micropipet om zoveel mogelijk van het supernatans te verwijderen zonder de pellet te verstoren.
OPMERKING: De pellet zal erg los zitten. - Voeg 50 μL PBS toe aan de pellet en resuspendeer. Centrifugeer de buis opnieuw bij 15.000-20.000 x g gedurende 15 minuten.
- Zuig met een tip van 10 μL direct 4 μL van de pellet op en breng deze over in een schone buis van 1.5 ml (Figuur 1D 1). Gebruik 1 μL van het gewassen en geconcentreerde goud per rooster.
OPMERKING: Het type fiducials dat wordt gebruikt, is afhankelijk van downstream-toepassingen. Gebruik voor TEM-tomografie 10 nm gouden kralen. Gebruik voor zachte röntgentomografie gouden kralen van 200 nm. Gebruik voor correlatiemicroscopie fluorescerende latexparels. Fiducials zijn normaal gesproken niet nodig voor experimenten met cryoFIB-frezen, omdat het maalproces ze zal vernietigen.
- Bevlekken
- Stel de klimaatkamer in op een luchtvochtigheid van 95% en 30°C (Figuur 1D 1). Selecteer een raster met behulp van het 5/15 pincet.
- Was de roosters met PBS en leg ze op een pincet (Figuur 1D2). Eenmaal vastgezet, verwijdert u het 5/15 pincet en schuift u de klem op het insteekpincet.
- Plaats het rooster in de vrieskou en houd de klem stevig vast (Figuur 1D3). Voeg 1 μL gouden fiducials toe aan de achterkant van het rooster (Figuur 1D4). Voeg 2-3 μL PBS toe aan de koolstofzijde van het rooster. Gebruik geautomatiseerd deppen om de achterkant van het rooster te deppen en vries het in vloeibaar ethaan onder (Figuur 1D5).
NOTITIE: Het wordt aanbevolen om tussen de 3-4 μL volume per rooster te hebben voor een optimale depping. Roosters kunnen na het wassen een variabele hoeveelheid PBS behouden. Pas het toegevoegde volume van PBS aan om rekening te houden met reeds bestaande vloeistofretentie op het rooster. Het wordt aanbevolen om de gouden fiducials aan de achterkant van het rooster toe te voegen. Toevoeging aan de voorkant kan resulteren in pools van gouden fiducials in de buurt van het punt van inbrengen, terwijl toevoeging van de achterkant resulteert in een meer gehomogeniseerde oplossing. De duur van het deppen is afhankelijk van de tandheelkunde van de cel. 2 s voor lege, 3 s voor normale en 4 s voor volle roosters. Het type dompelvriezer dat beschikbaar is, kan bepalen hoe blotting wordt benaderd: de Leica GP2 plunge freezer wordt in dit protocol gebruikt en is standaard in staat tot geautomatiseerd enkelzijdig blotting. Thermo Fisher Vitrobot voert geautomatiseerde dubbelzijdige blotting uit, hoewel dit vaak de cellen beschadigt die aan de koolstofzijde zijn bevestigd. Handmatig blotting in de Vitrobot is ook mogelijk, evenals handmatige zwaartekrachtplunjers.
Representative Results
Na de cotransfectie van HIViGFPΔEnv en psPAX2 hadden alle roosters minimale scheuren in de koolstoflaag. Rasters werden 24 uur na incubatie met het transfectiereagens in beeld gebracht met behulp van faselichtmicroscopie en fluorescentielichtmicroscopie (Figuur 2). Cellen op zowel de mock grids als de co-transfected grids bevatten levensvatbare cellen in meerdere rastervierkanten.
psPAX2 codeert voor alle structurele en enzymatische eiwitten van HIV-1 zonder enige fluorescentielabeling. HIViGFPΔEnv is vergelijkbaar met psPAX2, maar met codes voor een GFP-gelabeld HIV Gag-eiwit. Beide plasmiden zijn ΔEnvelope. De cotransfectie resulteert in native-achtige assemblage en ontluiking van fluorescerende HIV-1-deeltjes, waardoor dit een geweldig systeem is voor CLEM-onderzoeken naar HIV in bioveiligheidsniveau 1-conditie. De co-getransfecteerde roosters toonden een subset van cellen die groene fluorescentie vertoonden, wat wijst op succesvolle cotransfectie. Geen enkele cel op het neprooster vertoonde fluorescentie, wat de cotransfectie verder valideerde met behulp van HIViGFPΔEnv en psPAX2. Na het bekijken van de roosters met behulp van op licht gebaseerde microscopie, werden de roosters ondergedompeld en verplaatst naar langdurige opslag in vloeibare stikstof.
Figuur 3 toont de resultaten van rasters die met dezelfde experimentele methode zijn geproduceerd, maar met behulp van enigszins verschillende plasmideconstructies. U2OS-bevattende roosters werden geco-transfecteerd met behulp van verschillende HIV-klonen (HIVmCherryΔEnv en NL4-3ΔEnvGFP in een verhouding van 1:6). Omdat een hogere massa fluorescerend gelabelde plasmiden werd gebruikt, maakten deze roosters de observatie van een groter aantal getransfecteerde cellen mogelijk, wat een voordeel opleverde bij het vastleggen van beelden met behulp van cryoCLEM en cryoET. Met behulp van cryoCLEM werden volledige rasteratlassen gegenereerd voor elk raster met behulp van cryofluorescentiemicroscopie om de locaties van alle co-getransfecteerde cellen vast te leggen. Toen de locaties van cellen bekend waren, werd cryoET uitgevoerd. Er werd een volledige rasteratlas met een lage vergroting verzameld en bedekt met de fluorescerende atlas die bij cryofluorescentie werd verzameld (Figuur 3A). Cryotomogrammen werden verzameld op cellulaire locaties die ingewikkelde details van de virale levenscyclus vastlegden, inclusief de assemblage en het ontluiken van HIV uit cellen (Figuur 3B).
Afbeelding 1: Workflow voor het zaaien van cellen op rasters. Een schema dat de algemene procedure weergeeft om cellen op cryoEM-roosters te zaaien. Het proces is verdeeld in vier hoofdstappen, waaronder (A) het voorbereiden van roosters in de putjes voor het zaaien, (B) het toevoegen van de juiste hoeveelheid cellen aan elk putje, (C) de optionele transfectie van cellen voor fluorescerende beeldvorming, en (D) het invriezen van roosters om verglazing van het monster mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Cotransfectie van U2OS met behulp van HIViGFPΔEnv en psPAX2. U2OS-cellen werden geco-transfecteerd met GFP-bevattende HIViGFPΔEnv en psPAX2 in een verhouding van 1:3. Rasters werden in beeld gebracht door middel van fasecontrast en fluorescentiemicroscopie. Cellen waarvan is aangetoond dat ze GFP-expressie hebben, duiden op succesvolle cotransfectie. Schaalbalk: 500 μm. Schaalbalk (inzet): 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Mogelijke downstream cryo-gebaseerde methoden . (A) Een cryoCLEM-beeld met co-getransfecteerde U2OS-cellen. Cellen in het groen vertegenwoordigen HIV-producerende cellen en worden gebruikt om het succes van cotransfectie te meten. Rode puncta vertegenwoordigen mCherry gelabeld HIV-1 Gag. Schaalbalk: 250 μm. Schaalbalk (inzet): 25 μm (B) Een cryoET-beeld van meerdere HIV-deeltjes die ontluiken uit het plasmamembraan van U2OS-cellen. Schaalbalk: 50 nm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier hebben we een toegankelijk, flexibel en reproduceerbaar protocol geleverd om cellen op elektronenmicroscopieroosters te zaaien voor in situ cryo-elektronentomografietoepassingen. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van stroomafwaartse toepassingen en/of experimentele vereisten. Naast een grote flexibiliteit hebben we een workflow beschreven die veelvoorkomende valkuilen bij het zaaien van rasters optimaliseert en vermindert, met name uitgebreide schade aan de koolstoflaag, lage celdichtheid en slechte structurele integriteit van dunne celprojecties.
Hoewel het hier beschreven protocol verschillende alternatieven biedt, zijn er enkele cruciale stappen die moeten worden gevolgd om de algemene resultaten te optimaliseren. Een van de grootste problemen bij het zaaien van rastercellen is het losmaken en drijven van roosters van de put of microslide. Daarom is het belangrijk om het rooster aan beide zijden volledig nat te maken met een hechtende oplossing en te voorkomen dat het tijdens de incubatietijd uitdroogt. Als u 3D-geprinte rasterhouders gebruikt, moet u er rekening mee houden dat meerdere wisselingen van media naar deze houders het potentieel hebben om zwevende roosters te produceren, aangezien de lucht die onder het rooster zit, deze uit de houder kan dwingen.
Onze keuze voor een pincet verbetert ook de kwaliteit van het rooster door een geometrisch gunstige manier te bieden om de roosters te manipuleren zonder uitgebreide roosterbuiging die de koolstoflaag zou beschadigen. Door de cellen zo lang mogelijk op 37 °C te houden voordat ze naar beneden storten, wordt het lijden van de cellen verminderd en wordt het aantal dunne beeldbare cellen op het rooster verbeterd. Ten slotte zal deppen van de gouden kant de cellen beschermen tegen zware mechanische krachten die kunnen leiden tot schade aan fragiele cellulaire structuren.
Hoewel niet opgenomen in dit protocol, is aangetoond dat rasterfoto-micropatronen het aantal afbeeldbare cellen verhogen door hun hechting aan het midden van rastervierkantente optimaliseren 14. Ten slotte zijn onlangs 3D-geprinte rasterhouders gebruikt om roosterschade te verminderen door directe roostermanipulatie te beperken12.
Het kan belangrijk zijn op te merken dat dit protocol is geoptimaliseerd voor het afbeelden van dunne randen en uitsteeksels van cellen voor de toepassing van cryotomografie. We raden u aan een aantal problemen op te lossen uit onze aanbevelingen in het protocol om het beste resultaat te vinden voor de downstreamtoepassingen van uw keuze. Over het algemeen biedt dit protocol een betrouwbare maar veelzijdige methode om cellen op roosters te zaaien die kunnen worden aangepast aan specifieke behoeften.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Acknowledgments
We willen het Mansky-lab bedanken voor de toegang tot apparatuur voor het invriezen van invallen. Delen van dit werk werden uitgevoerd in de karakteriseringsfaciliteit van de Universiteit van Minnesota, die gedeeltelijke steun krijgt van de National Science Foundation (NSF) via het Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC; Awardnummer DMR-2011401) en het National Neuroscience Curriculum Initiative (NNCI; Awardnummer ECCS-2025124) programma's. We willen graag de financiering bedanken van het centrum voor het gedrag van hiv in virale omgevingen (B-HIVE; 1U54AI170855-01) en het Duke Center for HIV Structural Biology (DCHSB; U54AI170752) midden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
| 6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
| Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
| Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
| Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium - high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
| Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
| EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
| Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
| GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
| GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
| Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
| Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
| Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
| Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
| Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
| Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |
References
- Zhang, P., Mendonça, L. Analysis of Viruses in the Cellular Context by Electron Tomography. Encyclopedia of Virology. 1, Elsevier, Academic Press. 242-247 (2021).
- Fäßler, F., Dimchev, G., Hodirnau, V. -V., Wan, W., Schur, F. K. M. Cryo-electron tomography structure of Arp2/3 complex in cells reveals new insights into the branch junction. Nature Communications. 11, 6437 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. Journal of Microscopy. 131 (Pt 1), 1-9 (1983).
- Stewart, M., Vigers, G. Electron microscopy of frozen-hydrated biological material. Nature. 319 (6055), 631-636 (1986).
- Gan, L., Jensen, G. J.
- Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).
- Mendonça, L., et al. Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress. Nature Communications. 12 (1), 4629 (2021).
- Klumpe, S., et al. A modular platform for automated cryo-FIB workflows. eLife. 10, e70506 (2021).
- Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
- Klein, S., et al. IFITM3 blocks influenza virus entry by sorting lipids and stabilizing hemifusion. Cell Host & Microbe. 31 (4), 616.e20-633.e20 (2023).
- Shah, P. N. M., et al. Characterization of the rotavirus assembly pathway in situ using cryoelectron tomography. Cell Host & Microbe. 31 (4), 604.e4-615.e4 (2023).
- Fäßler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. 3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).
- Hoffmann, P. C., et al. Electron cryo-tomography reveals the subcellular architecture of growing axons in human brain organoids. eLife. 10, e70269 (2021).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
