Summary
Beskrevet her er en simpel arbejdsgang til at differentiere endotelceller fra humane pluripotente stamceller efterfulgt af en detaljeret protokol for deres mekaniske stimulering. Dette giver mulighed for undersøgelse af endotelcellernes udviklingsmekanobiologi. Denne fremgangsmåde er kompatibel med downstream-analyser af levende celler indsamlet fra kulturchippen efter mekanisk stimulering.
Abstract
Hjertet er det første organ, der funktionelt etableres under udviklingen, hvilket initierer blodcirkulationen meget tidligt i svangerskabet. Udover at transportere ilt og næringsstoffer for at sikre fostervækst, styrer fostercirkulationen mange afgørende udviklingsbegivenheder, der finder sted i endotellaget gennem mekaniske signaler. Biomekaniske signaler inducerer strukturelle ændringer i blodkarrene, etablerer arteriovenøs specifikation og styrer udviklingen af hæmatopoietiske stamceller. Utilgængeligheden af de udviklende væv begrænser forståelsen af cirkulationens rolle i tidlig menneskelig udvikling; Derfor er in vitro-modeller centrale værktøjer til undersøgelse af karmekanobiologi. Dette papir beskriver en protokol til differentiering af endotelceller fra humane inducerede pluripotente stamceller og deres efterfølgende såning i en fluidisk enhed for at studere deres reaktion på mekaniske signaler. Denne fremgangsmåde muliggør langsigtet dyrkning af endotelceller under mekanisk stimulering efterfulgt af hentning af endotelcellerne til fænotypisk og funktionel karakterisering. In vitro-modellen , der er etableret her, vil være medvirkende til at belyse de intracellulære molekylære mekanismer, der transducerer signaleringen medieret af mekaniske signaler, som i sidste ende orkestrerer karudvikling under menneskets fosterliv.
Introduction
Under embryonal udvikling er hjertet det første organ, der etablerer funktionalitet1 med påviselige sammentrækninger fra det tidligste stadium af endokardierørdannelse2. Cirkulation, sammen med de mekaniske signaler medieret af blodstrømmen i karret, styrer mange afgørende aspekter af tidlig udvikling. Før fostrets cirkulationsetablering er vaskulaturen organiseret i en primær kapillær plexus; Efter hjertefunktion omorganiseres denne plexus til venøs og arteriel vaskulatur3. Mekaniske signalers rolle i arteriovenøs specifikation afspejles af den panendotelekspression af arterielle og venøse markører før initiering af blodgennemstrømning4.
Hemodynamiske kræfter styrer ikke kun udviklingen af selve vaskulaturen, men spiller også en grundlæggende rolle i kontrollen af blodcelledannelsen. Hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC'er) stammer fra specialiserede endotelceller kaldet hæmogent endotel 5,6,7,8, der udelukkende findes i forskellige anatomiske regioner af embryonerne i det tidlige udviklingsstadium. Hjerte-mangelfulde modeller, sammen med in vitro modeller, har vist, at mekaniske signaler instruerer og øger HSPC produktion fra det hæmogene endotel 9,10,11,12,13,14.
Forskellige typer strømningsdynamik har vist sig at differentiere kontrol af cellecyklus15, kendt for at være vigtig i både hæmogent endotel 16,17 og arteriel cellespecifikation18. Alt i alt er mekaniske signaler kritiske determinanter for celleidentitet og funktion under udvikling. Nye in vitro fluidiske anordninger giver os mulighed for at overvinde de begrænsninger, der er forbundet med at studere udviklingsmekanobiologi under human blodudvikling in vivo.
Det overordnede mål med protokollen i dette manuskript er trin for trin at beskrive den eksperimentelle pipeline for at studere effekten af forskydningsstress på humane endotelceller afledt in vitro fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er). Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner om differentiering af hiPSC'er i endotelceller og deres efterfølgende såning i fluidiske chips til stimuleringsprotokollen. Ved hjælp af dette kan forskellige in vitro-afledte endotelceller testes for deres evne til at mærke forskydningsspændingen ved at analysere deres orientering som reaktion på strømmen. Dette vil gøre det muligt for andre laboratorier at behandle spørgsmål om responsen på forskydningsstress og dens funktionelle konsekvenser for forskellige endotelcelleidentiteter.
Protocol
BEMÆRK: Alle cellekulturteknikker skal udføres under sterile forhold i en laminar strømningshætte, og cellerne skal inkuberes ved 37 °C i en humificeret atmosfære med 5% CO2. Instruktioner for alt cytokinpræparat til både vedligeholdelse (rhbFGF) og for differentieringsprotokollen (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) findes i supplerende tabel S1.
1. Dyrkning af hiPSC'er - optøning, vedligeholdelse og frysning af celler
- Fremstilling af vedligeholdelsesmedium, vækstfaktorer og andre reagenser
- Forbered dyrkningsmediet ved at tilsætte hele hESC's serumfrie mediumtilskud, 36 ml 25% bovint serumalbumin (BSA) og 1 ml 55 mM β-mercaptoethanol til Dulbeccos modificerede ørnemedium/F12 (DMEM/F-12) basale medium (se materialetabel).
- Resuspender 1 mg Rho Kinase-hæmmer (iRock) i 1 ml DMSO, lav alikvoter på 50 μL og opbevar dem ved -20 °C.
BEMÆRK: Disse alikvoter kan opbevares ved -20 °C i 1 år. Når de er optøet, kan de opbevares ved 4 °C i 1 uge. - Opløsningen af vitronectin (VTN-N) optøs på is og alikvote 60 μL pr. hætteglas inden opbevaring ved -80 °C. Lige før belægning af pladerne fortyndes 60 μL lager i 6 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS); den endelige koncentration på 5 μg/ml.
- optøning af hiPSC-cellelinje
BEMÆRK: Den humane pluripotente stamcellelinje SFCi55 blev tidligere afledt internt og i vid udstrækning anvendt til differentiering i forskellige celletyper og forskellige embryonale slægter 19,20,21,22.- Overtræk et hul i en plade med 6 brønde med 1 ml VTN-N-opløsning i 1 time ved 37 °C.
BEMÆRK: Efter inkubation kan coatede plader opbevares ved 4 °C i op til 1 uge. - VTN-N-opløsningen suges med en aspirationspipette, og der tilsættes 1 ml forvarmet dyrkningsmedium suppleret med 20 ng/ml rhbFGF (supplerende tabel S1).
- Optø hurtigt hætteglasset med hiPSC'erne i et vandbad, og overfør cellen til 5 ml forvarmet dyrkningsmedium.
- Drej cellerne ned i 3 minutter ved 300 × g ved stuetemperatur.
- Resuspender cellepellet i 0,5 ml dyrkningsmedium suppleret med 20 ng / ml rhbFGF.
- Overfør cellerne til en belagt brønd, der allerede indeholder 1 ml medium.
- Tilsæt 5 μL iRock i hullerne, der indeholder cellerne i i alt 1,5 ml medium.
- Dyrk cellerne i inkubatoren, skift mediet dagligt i løbet af ugen, og dobbeltfød cellerne, og tilsæt dobbelt så meget som normalt medium til cellerne for at sikre fodring i weekenden.
BEMÆRK: Celler dyrkes kun i nærværelse af iRock i 24 timer.
- Overtræk et hul i en plade med 6 brønde med 1 ml VTN-N-opløsning i 1 time ved 37 °C.
- Vedligeholdelse og overførsel af hiPSC'er
- Skift mediet dagligt med frisk forvarmet dyrkningsmedium suppleret med 20 ng/ml rhbFGF.
- Passage cellerne, når de når ca. 80% sammenløb, generelt to gange om ugen.
- For at passere cellerne skal du belægge en plade med VTN-N som beskrevet før i trin 1.2.1 og 1.2.2.
- Opsug mediet fra brøndene med celler og vask dem med DPBS.
- DPBS suges til syn, og der tilsættes 1 ml dissociationsreagens (se materialetabel) og inkuberes i 1 min.
- Dissociationsreagenset suges og inkuberes i yderligere 3 min. Bank pladen fast 10 gange på hver side.
BEMÆRK: Dissociationstrinnet skal muligvis celletypespecifik optimering i inkubationstiden og tappeproceduren. - Tilsæt 1 ml dyrkningsmedium til cellerne, og vask en gang med en Pasteur-pipette med mediet for at sikre, at de fleste kolonier opsamles.
- Der tilsættes 150 μL af cellesuspensionen til hvert hul for at tilvejebringe et passageforhold på 1 brønd ind i 6.
BEMÆRK: Umiddelbart efter optøning af et nyt hætteglas er det bedre at passere cellerne i et lavere forhold, såsom 1: 1 eller 1: 2 i en eller to passager for at give dem mulighed for at nå en stabil vækstfase, før de passerer i et forhold på 1: 6. - Dyrk cellerne i inkubatoren, skift mediet dagligt i løbet af ugen, og dobbeltfød cellerne en gang i weekenden.
- hiPSC'er frysning af cellelinje
BEMÆRK: Frys celler inden for deres første to passager efter optøning for at sikre at opretholde en konstant lav passage batch af frosne hætteglas for at starte kulturen. Frys cellerne, når de når en sammenløb på ca. 80%.- Substratet ændres til frisk, forvarmet dyrkningsmedium suppleret med 20 ng/ml rhbFGF og 5 μL iRock, og inkuberes i mindst 1 time.
- Cellerne afmonteres som beskrevet i trin 1.3.2.2-1.3.2.5.
- De løsrevne celler opsamles i et 15 ml centrifugeglas indeholdende 5 ml dyrkningsmedium.
- Centrifuger i 3 min ved 300 × g ved stuetemperatur.
- Sug supernatanten til syng, og tilsæt 1 ml kryopræserveringsopløsning (se Materialetabel).
- Brug en Pasteur-pipette til forsigtigt at pipette cellerne op og ned for at blande dem i kryopræserveringsopløsningen.
BEMÆRK: Undgå overdreven pipettering, som kan resultere i adskillelse af celleklyngerne. - Del cellesuspensionen i to hætteglas med kryopræservering med hver 0,5 ml.
- Overfør hætteglassene med kryopræservering til en kryopræserveringsbeholder, der er forkølet ved 4 °C.
- Overfør beholderen med cellerne til en -80 °C fryser i 24 timer, før hætteglassene overføres til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
2. Differentiering af hiPSC'er i endotelceller
- Fremstilling af differentieringsmedium, cytokiner og vækstfaktorer
- Der fremstilles serumfrit differentieringsmedium (SFD) i henhold til tabel 1. Brug dette medium fra dag 0 til dag 5 af differentiering.
- Forbered serumfrit medium til CD34+ celler (SFM-34) ved at tilføje 34 næringsstoftilskud og 5 ml L-glutamintilskud til 34 SFM Basalmediet (se materialetabel). Brug dette medium fra dag 6 af differentiering og fremefter.
- 1 mg CHIR99021 i 716 μliter DMSO resuspenderes for at opnå en 3 mM opløsning. Inkuber ved stuetemperatur, indtil den er helt resuspenderet; opvarmes om nødvendigt hurtigt ved 37 °C. Der fremstilles 20 μL alikvoter og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder. Brug straks efter optøning og frys ikke igen eller opbevar.
- Cytokinerne resuspenderes i henhold til instruktionerne i supplerende tabel S1. Alle cytokiners alikvoter opbevares ved -80 °C.
- Differentiering af endotelceller
BEMÆRK: For hver dag med differentieringen skal du forberede 18 ml (3 ml medium / brønd) forvarmet SFD-medium i henhold til cytokinernes blandinger beskrevet i Tabel 2.- Dag 0 - dannelse af embryoide kroppe (EB'er)
- Forbered 18 ml SFD-medium med Bland 1 cytokin i henhold til tabel 2 for hver 6-brøndplade (3 ml / brønd).
- Tilsæt 2 ml forvarmet SFD-medium med Bland 1 cytokin i hver brønd i en celleafvisende 6-brønds plade (se materialetabel).
- Følg trinnene beskrevet i trin 1.3.2.2-1.3.2.4 for at danne EB'er.
BEMÆRK: Sørg for, at hiPSC'er er 70-80% sammenflydende for at starte differentieringen. - Tilsæt 1 ml forvarmet SFD-medium med Mix 1 cytokiner til hver brønd med løsrevne celleklynger.
- Brug en Pasteur-pipette til forsigtigt at overføre celleklyngerne til et enkelt hul med celleafvisende brønd til EB-dannelse i forholdet 1:1.
- Når du har placeret pladen i inkubatoren, skal du flytte den frem og tilbage, højre og venstre for at sprede EB'erne jævnt i brønden.
- Dag 1 - medium ændring af EB'erne
BEMÆRK: Dette trin er kun nødvendigt, hvis der på dag 1 af differentiering er mange enkeltceller i suspension sammen med EB'erne.- Forbered 18 ml SFD-medium med Bland 1 cytokin i henhold til tabel 2 for hver 6-brøndplade (3 ml / brønd).
- Drej pladen med EB'erne for at flytte dem ind i midten og saml dem ved hjælp af en Pasteur-pipette i et 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Hvis EB'erne ser klumpede sammen som i strenge, adskilles de ved at pipettere dem op og ned med en P1000, før du samler dem i 15 ml centrifugerøret. - Vent 5-10 minutter på, at EB'erne sætter sig i bunden af røret.
BEMÆRK: Hvis EB'erne er for små, centrifugeres de i 5 minutter ved 100 × g for at hjælpe dem med at sætte sig. - Vask de celleafvisende plader med sterilt vand eller DPBS for at fjerne enkelte celler eller snavs.
- Opsug forsigtigt og langsomt supernatanten fra EB'erne uden at løsne dem.
- Tilsæt 2 ml SFD med Bland 1 cytokiner til hver brønd af de celleafvisende plader.
- Resuspender EB'erne ved hjælp af 1 ml SFD-medium med Mix 1-cytokiner for hver startbrønd - til en 6-brøndsplade tilsættes 6 ml medium.
- Overfør EB'erne til de celleafvisende plader i 1 ml volumen pr. hul, som allerede indeholder 2 ml SFD-medium.
- Når du har placeret pladen i inkubatoren, skal du flytte den frem og tilbage, højre og venstre for at sprede EB'erne jævnt i brønden.
- Dag 2 - tilføjelse af CHIR99021
- Drej EB'erne ind i midten af pladen og tilsæt CHIR99021 i henhold til tabel 2 på siden af brønden for at undgå direkte kontakt med cellerne.
BEMÆRK: Hvis mediet ikke blev ændret på dag 1, skal du udskifte hele mediet i stedet for at tilføje CHIR alene. Forbered 18 ml SFD-medium med blanding 2 i henhold til tabel 2 for hver 6-brøndplade (3 ml / brønd). - Når du har placeret pladen i inkubatoren, skal du flytte den frem og tilbage, højre og venstre for at sprede EB'erne jævnt i brønden.
- Drej EB'erne ind i midten af pladen og tilsæt CHIR99021 i henhold til tabel 2 på siden af brønden for at undgå direkte kontakt med cellerne.
- Dag 3 - medium ændring af EB'erne og tilsætning af mix 3 cytokiner
- Forbered 18 ml SFD-medium med Bland 3 cytokiner i henhold til tabel 2 for hver 6-brøndplade (3 ml / brønd).
- EB'erne indsamles som beskrevet i trin 2.2.2.2-2.2.2.4.
- Tilsæt forvarmede 2 ml SFD-medium med Bland 3 cytokiner til de celleafvisende plader.
- Supernatanten suges forsigtigt ud af EB'erne. Tilsæt 1 ml / hul SFD med Mix 3 cytokiner.
- EB'erne fordeles mellem brøndene som beskrevet i trin 2.2.2.8-2.2.2.9.
- Dag 6 - medium ændring for SFM-34 og tilsætning af Mix 4 cytokiner
- Forbered 18 ml SFD-medium med Bland 4 cytokiner i henhold til tabel 2 for hver 6-brøndplade (3 ml / brønd).
- EB'erne indsamles som beskrevet i trin 2.2.2.2-2.2.2.4.
- Tilsæt 2 ml forvarmet SFM-34-medium med Mix 4 cytokiner til de celleafvisende plader.
- Supernatanten suges forsigtigt ud af EB'erne. Tilsæt 1 ml / hul SFM-34 med Mix 4 cytokiner.
- EB'erne fordeles mellem brøndene som beskrevet i trin 2.2.2.8-2.2.2.9.
- Dag 0 - dannelse af embryoide kroppe (EB'er)
3. CD34+ celler isolering og såning i chippen
BEMÆRK: CD34+ celler isoleres via en positiv isolationsmetode med et CD34 mikroperlesæt (se materialetabel), der indeholder CD34-mikroperler konjugeret med monoklonale museantistoffer, anti-humane CD34-antistoffer og FcR-blokerende reagens (Human IgG). Det er vigtigt at validere effektiviteten af søjleisoleringen ved farvning af celler før og efter isoleringen til flowcytometrianalyse, Nedenfor er det angivet, hvornår celler skal tages til denne analyse.
- Forbered materialer og reagenser.
- Forbered vaskebuffer ved at tilsætte 5 ml 5% BSA-opløsning og 200 μL EDTA 0,5 M til 45 ml DPBS for at opnå PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA. Forbered frisk til hver isolering, filtrer-steriliser og opbevares nedkølet indtil brug.
- Overtræk fluidiske chips med lamininopløsning fremstillet ved fortynding af rhLaminin 521 1:50 i DPBS Ca 2+ Mg2+. Coat hver chip med det passende volumen til chippen i brug og inkuber i inkubatoren i 2 timer før såning.
BEMÆRK: Andre matricer kan anvendes til belægningen og bør testes for den specifikke celletype / eksperiment. - Forbered Mix 4 SFM-34 medium ved at supplere 18 ml SFM-34 medium med Mix 4 cytokiner i henhold til tabel 2 og anbring blandingen i et 50 ml rør i inkubatoren med låget let skruet af for at lette gasudvekslingen.
- Anbring de valgte perfusionssæt og eventuelle andre slanger, der skal bruges i inkubatoren til afgasning.
- Dag 8 - dissociation af EB'er og CD34+ isolation
- EB'erne indsamles som beskrevet i trin 2.2.2.2-2.2.2.5.
- Der tilsættes 1 ml celledissociationsreagens pr. starthul af EB'er indsamlet (hvis der blev opsamlet 6 huller, tilsættes 6 ml).
- Der overføres 1 ml af EB-suspensionen i celledissociationsreagenset til hvert hul i den celleafvisende plade.
- Inkuber i 10 min i inkubatoren.
- Pipette forsigtigt EB'erne op og ned mod brønden med en P1000, ikke mere end 10 gange.
- Gentag trin 3.2.4-3.2.5.for i alt 3x.
BEMÆRK: Hvis EB'erne er vanskelige at adskille, skal du gentage ovenstående trin 4x i alt. - Tilsæt 5 ml vaskebuffer for hvert hul med dissocierede EB'er.
- Saml cellerne i et 50 ml centrifugerør ved at føre dem gennem en 40 μm si. Tag 10 μL af cellesuspensionen for at tælle cellerne.
BEMÆRK: For at teste isolationens effektivitet overføres 105 celler/rør til to forskellige reagensglas (ufarvet kontrol og forsorteret testprøve), som senere vil blive anvendt til flowcytometri (som beskrevet i trin 4.3.9-4.3.13). For en 6-brønds plade skal ~ 106 celler opsamles efter filtrering. - Drej cellerne ned i 10 minutter ved 300 × g.
- Resuspender cellerne i 300 μL vaskebuffer, og pipetter forsigtigt et par gange for at sikre, at der ikke er klumper til stede. Fortsæt med at følge producentens protokol (se materialetabellen).
- CD34+ cellesåning i fluidiske chips
BEMÆRK: Den fluidiske chip, der anvendes i protokollen, har en kanalhøjde på 0,6 mm og en længde på 50 mm for et samlet vækstareal på 2,5 cm2 (supplerende figur S1). Denne type chip er podet med et samlet volumen cellesuspension på 150 μL. Forskellige chips kan anvendes, og mængden af såning og celledensiteten skal tilpasses i henhold til vækstområdet. Yderligere optimering kan være nødvendig afhængigt af den anvendte cellelinje og dens vækst.- Resuspender de isolerede CD34+ celler i 300 μL forvarmet SFM-34 medium med Mix 4 cytokiner.
- Tag 10 μL af cellesuspensionen og tæl cellerne.
- Resuspender 2,5 × 105 celler i et slutvolumen på 150 μL suppleret SFM-34; tilsættes 0,5 μL iRock.
BEMÆRK: For at teste isolationens effektivitet overføres 105 celler/rør til et rør (postsorteret prøve), som senere anvendes til flowcytometri (som beskrevet i trin 4.3.9-4.3.13). - Opsug langsomt laminin fra flydende chips ved at sætte spidsen af en P200 inde i reservoiret på kanten af kanalen.
BEMÆRK: Hvis væsken er vanskelig at opsamle, skal du langsomt løfte den ene side af chippen for at hjælpe væsken med at bevæge sig til det modsatte reservoir. - Tilsæt cellesuspensionen støt ind i kanalen for at sikre, at der ikke dannes bobler.
BEMÆRK: Udfør trin 3.3.4-3.3.5 hurtigt, men forsigtigt for at undgå, at laminin tørrer ud og danner bobler i chippens kanaler. Hvis der dannes bobler, skal du løfte den ene side af chippen og forsigtigt trykke på diaset for at mobilisere boblerne; Når de når reservoiret, stiger de til luftgrænsefladen og bør ikke være i stand til at leje kanalen. - Overfør chippen til inkubatoren og lad dem stå natten over, så cellerne er helt fastgjort til kanalen og ser langstrakte ud.
- Når cellerne er fuldt fastgjort, aspireres mediet som i trin 3.3.4 og erstattes med 200 μL cytokinsuppleret SFM-34.
- Fra nu af skal du udskifte mediet dagligt, indtil cellerne har nået 90% -100% sammenløb.
4. Anvendelse af kontinuerlig strømning til endotelceller - Aorta-on-a-chip
- Forbered materialer og reagenser.
- Forbered Mix 4 SFM-34 medium ved at supplere 18 ml SFM-34 medium med Mix 4 cytokiner i henhold til tabel 2 og læg det i et 50 ml rør i inkubatoren med låget let skruet af for at lette gasudvekslingen.
- Anbring de valgte perfusionssæt og eventuelle slanger, der skal bruges til den flydende opsætning i inkubatoren for at afgasse.
- Fluidic system samling
- Installer perfusionssættet i enheden i henhold til producentens protokol.
OBS: Husk at bruge klemmer i systemet. Hvis der anvendes glideklemmer til dette trin, skal de skubbes på slangen, før de tilsluttes chippen. - Fastgør en ny fluidisk chip, og tilsæt det cytokin-supplerede SFM-34-medium, og sørg for at fylde begge reservoirer under sterile forhold i emhætten.
- Udfør programmet til fjernelse af bobler og kalibreringstrinnet.
- Fjern fluidenheden med det tilsluttede sæt fra inkubatoren og overfør den til emhætten; Tag også chipsene indeholdende cellerne fra inkubatoren.
- Klem slangen på begge sider af testchippen.
- Fjern slangen fra testchippen.
BEMÆRK: Kontroller, at der ikke er bobler i Luer-stikket for enden af slangen. Hvis bobler er synlige, skal du forsigtigt aspirere dem ved hjælp af en P200-pipette og om nødvendigt tilføje mere medium for at sikre, at stikket er fyldt med medium. - Forbind chippen, der indeholder cellerne, med slangen.
- Fjern eller åbn klemmerne.
- Overfør systemet til inkubatoren og tilslut luftpumpen til fluidenheden.
- Start det forudvalgte program ved hjælp af den pumpededikerede software (supplerende figur S2) med den gradvise forøgelse af forskydningsspændingen, der er beskrevet i tabel 3.
BEMÆRK: Afhængigt af det specifikke eksperiment, der er nødvendigt, skal stimuleringsprogrammet muligvis optimeres. Her beskrives en gradvis forskydningsspændingsforøgelse, der fører til den endelige værdi på 5 dyn/cm2, som efterligner forskydningsspændingen, der er beregnet til at blive oplevet af væggen i dorsal aorta ved begyndelsen af fostercirkulationen 9. Uafhængigt af den endelige forskydningsspænding, der vil blive anvendt, er det nødvendigt gradvist at øge over tid for at give cellerne mulighed for at tilpasse sig kraften uden at få cellerne til at løsne sig fra chippen. Hvis den valgte stimuleringsprotokol er længere end 3 dage, skal cytokiner fyldes op i systemet ved at tilføje 1 ml SFM-34 indeholdende Mix 4-cytokinerne, der normalt ville blive tilsat i 18 ml. For at gøre dette sættes pumpeprogrammet hurtigt på pause, og der tilsættes 500 μL suppleret medium til hver af de to sprøjter i væskesættet.
- Installer perfusionssættet i enheden i henhold til producentens protokol.
- Celleopsamling til analyse
- Forvarm dissociationsbufferen i et vandbad.
- Fjern fluidenheden fra inkubatoren og flyt den ind i emhætten.
- Klem slangen, der flankerer chippen på begge sider, og fjern slangen fra reservoirerne på chippen.
- Fjern forsigtigt mediet fra chippen og erstat det med DPBS Ca 2+ Mg2+ for at vaske cellerne.
BEMÆRK: Dette trin med vask med PBS kan springes over, hvis cellerne begynder at løsne sig. - Der tilsættes forsigtigt 150 μL dissociationsbuffer og inkuberes i 3 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Kontroller under mikroskopet, om cellerne er enkelte og løsrevne; Ellers inkuberes i yderligere 2 min. Det er vigtigt, at cellerne løsnes fuldstændigt fra kanalen, før mediet aspireres, da chippen ikke tillader at hjælpe cellefrigørelse ved pipettering. Andre løsninger kan anvendes til at løsne cellerne, såsom trypsin eller EDTA-baserede buffere. - Opsaml dissociationsbufferen, der indeholder cellerne, fra et reservoir og overfør til et 15 ml centrifugerør, og vask kanalen en gang med DPBS for at opsamle alle de løsrevne celler.
- Tilsæt 1 ml vaskebuffer til 15 ml røret med cellerne, og tag 10 μL for at tælle cellerne.
- Opdel cellesuspensionen i flowcytometrirør for at have 105 celler pr. Reagensglas.
- Drej rørene i 5 min ved 300 × g.
- Forbered farvningsopløsningen til at have 50 μL for hvert reagensglas til farvning. Der tilsættes CD34 PerCP-efluor710 eller CD34-PE ved henholdsvis 1:100 og 1:200 fortynding.
- Cellerne resuspenderes i 50 μL farvningsopløsning og inkuberes i 30 minutter ved 4 °C.
- Vask cellerne ved at tilsætte 2 ml vaskebuffer og drej i 5 minutter ved 300 × g.
- Resuspender pellets i 100 μL farvningsopløsning, og hent dataene ved hjælp af et flowcytometer.
BEMÆRK: Cellerne kan også lyseres direkte i chippen til RNA-ekstraktion ved hjælp af 150 μL RNA-lysisbuffer eller fikseres til billeddannelse ved hjælp af 4% paraformaldehyd i DPBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Analyse af celleorientering
- Analysér billederne for at kvantificere ændringer i celleorientering ved hjælp af FIJI23 (supplerende figur S3).
- Åbn lederen af interesseområde (ROI) fra Analysér | Værktøjer | ROI manager menu.
- Tegn cellekonturerne manuelt ved hjælp af polygonmarkeringsværktøjet , og føj dem til ROI-styringen ved at klikke på Tilføj eller bruge CTRL+T-genvejen .
- Mål retningen af hvert investeringsafkast ved at vælge ellipsemålingen Tilpas i Analysér | Indstil menuen Målinger .
- Anvend målingen på alle ROI'er gennem Mere... Multi measure kommando i ROI manager.
BEMÆRK: Dette trin passer en ellipse til hvert ROI og genererer en tabel, der indeholder længden af de større og mindre ellipseakser samt vinklen. - Eksporter tabellen til en CSV-fil, der skal importeres til anden software for at afbilde.
BEMÆRK: Scriptet, der bruges til plottene, er tilgængeligt på https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf885
0DDC.
- Analysér billederne for at kvantificere ændringer i celleorientering ved hjælp af FIJI23 (supplerende figur S3).
Representative Results
Vi beskriver her en protokol til differentiering og mekanostimulering af endotelceller afledt af hiPSC'er, der tillader undersøgelse af deres respons på mekaniske signaler (figur 1). Denne protokol resulterer i produktion af funktionelt mekanofølsomme endotelceller. Vi giver her repræsentative resultater og beskriver den forventede fænotype for at vurdere, hvordan cellerne reagerer på cytokinstimuleringen under differentieringen.
Figur 1: Skematisk oversigt over differentierings- og mekanisk stimuleringsprotokol. Skematisk over differentieringsprotokollen, der viser timingen af de forskellige blandinger af cytokiner, CD34+ celleisolation, fluidisk chipsåning og endelig analyse af de mekanisk stimulerede celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Kultur af hiPSC'er
Det er vigtigt at starte protokollen fra hiPSC'er, der vokser korrekt under selvfornyelsesforhold. En god indikation af kulturens kvalitet er hastigheden af deres vækst. Efter optøning kan cellerne have brug for 2-3 uger for at nå den korrekte vækstfase, der sikrer god differentiering. Når cellerne kan passeres to gange om ugen i forholdet 1:6 og nå næsten fuld sammenløb, er det den tid, de er klar til at blive differentieret samme dag, som de skal passeres.
Differentiering af hiPSC'er i endotelceller
Det første trin i differentieringen, der består af dannelsen af embryoide kroppe (EB'er), er cellelinjeafhængig og kan have brug for en vis optimering til den specifikke cellelinje, der er i brug. Dissociationen beskrevet i protokoltrin 1.3.2.2-1.3.2.4 kan ændres ved enten at reducere eller udvide inkubationen med dissociationsreagenset og den efterfølgende dissociation med Pasteur-pipetten. Desuden kan andre dissociationsreagenser anvendes til dette trin ud over den fysiske dissociation af kolonierne med et skæreværktøj eller en P100-pipettespids. EB'er af god kvalitet viser en defineret kant på dag 2 af differentieringen og fremstår klare og lyse, når de observeres ved hjælp af et mikroskop; mørkere områder kan indikere celledød inden for EB'erne (figur 2).
Figur 2: Morfologi for embryoide legemer. A) Dag 2-embryonoidlegemer med veldefinerede yderkanter og ensartet størrelse. B) Dag 2: embryoide legemer af dårlig kvalitet, der udviser omfattende celledød, hvilket fører til disaggregering af strukturen. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
På dag 2 hæmmer tilsætningen af CHIR99021 til EB'erne GSK-3-proteinet, hvilket resulterer i aktivering af Wnt-vejen. Forskellige cellelinjer har forskellig respons på CHIR-behandling, og dette bør testes ved at kvantificere antallet af CD34+ celler opnået på dag 8 ved hjælp af forskellige koncentrationer (figur 3).
Figur 3: Endotelcelledifferentiering med forskellige CHIR-behandlinger. Endotelcelleforpligtelse kvantificeret ved flowcytometri på dag 8 af differentiering ved CD34-membranekspression efter CHIR-behandling på dag 2 ved (A) 3 μM, (B) 5 μM og (C) 7 μM. Flowcytometridata blev opnået ved hjælp af femlasercytometre og dedikeret software (se materialetabel). Klik her for at se en større version af denne figur.
CD34+ celleisolering
Det er vigtigt at validere, at CD34+ berigelsen ved hjælp af magnetperlerne giver mindst 80% CD34+ efter eluering af søjlen. For at sikre tilstrækkelig renhed kan en delprøve af celler opnået fra den magnetiske isolering analyseres ved flowcytometri, idet man sørger for at bruge en anden antistofklon end den, der anvendes til magnetisk berigelse. Her blev 4H11-klonen brugt, og ~ 85% renhed blev opnået efter berigelse (figur 4).
Figur 4: Membranekspression af CD34 før og efter berigelse ved magnetisk sortering. Dag 8 dissocierede embryoidlegemer (grå) og celler efter magnetisk berigelse (grøn) blev farvet til CD34-ekspression og analyseret ved flowcytometri, hvilket viste vellykket berigelse efter sortering. Flowcytometridata blev opnået ved hjælp af fem-lasercytometre og dedikeret software (se materialetabel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Såning af celler i den flydende kanal
Ved såning af cellerne i den flydende kanal er det afgørende at spore vedhæftningen og spredningen af endotelcellerne. Efter såning tager cellerne ~ 5 timer for fuldt ud at klæbe til kanalen (figur 5A). En alternativ belægningsopløsning kan også testes for at forbedre vedhæftningen på dette stadium. For at bekræfte, at de testede celler er mekanofølsomme og dermed i stand til at reagere på mekanisk stimulering, kan celleorienteringen testes over tid. Celler før stimuleringen viser tilfældig orientering (figur 5A og figur 5C), og de omorienterer parallelt med strømningsretningen (figur 5B, C). Den her beskrevne protokol tillader indsamling af cellerne fra kanalen til udførelse af nedstrømsanalyse, for eksempel flowcytometri, til undersøgelse af deres membranimmunofænotype, hvilket giver endotelidentiteten af de stimulerede celler (figur 5D,E).
Figur 5: Mekanoresponsivitet af hiPSC-afledte endotelceller . (A) Konfluentlag af isolerede CD34+ celler 48 timer efter såning. (B) Omorienteret lag af endotelceller 3 dage under dynamisk kultur. (C) Orienteringsanalyse af endotelcellerne efter 5 dages dynamisk kultur. D) CD34-ekspressionsprofil for celler, der er dyrket under flow i 5 dage. (E) Procentdel af CD34+ celler i cellepopulationen hentet fra den flydende kanal. Billeder blev taget ved hjælp af et omvendt inkubatormikroskop; flowcytometridata blev opnået ved hjælp af fem-lasercytometre og dedikeret software (se materialetabel). Skalastænger = 100 μm (A,B). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagenser | Lagerkoncentration | Volumen tilføjet | Endelig koncentration |
| Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) | - | 333 ml | - |
| Skinkens F-12 næringsstofblanding (F-12) | - | 167 ml | - |
| N-2 supplement (100x) | 100 x | 5 ml | 1x |
| B-27 tillæg (50x) | 50 x | 10 ml | 1x |
| Askorbinsyre | 10 mg/ml | 1,25 ml | 25 μg/ml |
| α-monothioglycerol (MTG) | 11,5 m | 19,5 μL | 448,5 μM |
| Humant serumalbumin | 100 mg/ml | 2,5 ml | 0,5 mg/ml |
| Holo-Transferrin | 100 mg/ml | 0,75 ml | 150 μg/ml |
Tabel 1: Sammensætning og opskrift på 500 ml serumfri differentiering (SFD) medium.
| Dage med differentiering | Cytokin Mix | Cytokin | Endelig koncentration |
| Dag 0 - 2 | Bland 1 | BMP4 | 20 ng/ml |
| Dag 2 | Bland 2 | CHIR99021 | 7 μM |
| Fra dag 3 og fremefter | Bland 3 og 4 | VEGF | 15 ng/ml |
| bFGF | 5 ng/ml | ||
| Fra dag 6 og fremefter | Bland 4 | IL6 | 10 ng/ml |
| FLT3L | 10 ng/ml | ||
| IGF1 | 25 ng/ml | ||
| IL11 | 5 ng/ml | ||
| SCF | 50 ng/ml | ||
| EPO | 3 U/ml | ||
| TPO | 30 ng/ml | ||
| IL3 | 30 ng/ml |
Tabel 2: Blandinger af cytokiner anvendt til endotelcelledifferentiering, dage, hvor de tilsættes til SFD-mediet, og endelig koncentration.
| Forskydningsspænding (dyn/cm2) | Tidspunkt (h) |
| 0.5 | 1 |
| 1 | 1 |
| 1.5 | 1 |
| 2 | 1 |
| 2.5 | 1 |
| 3 | 1 |
| 3.5 | 1 |
| 4 | 1 |
| 4.5 | 1 |
| 5 | Indtil eksperimentets afslutning |
Tabel 3: Forskydningsspændingsværdier for den dynamiske kultur og længden af deres anvendelse.
Supplerende figur S1: Geometri og dimensioner af den chip og slange, der anvendes til denne protokol. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Trinvis vejledning til softwaren, der styrer luftpumpen, med en beskrivelse af hvert trin. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Vejledning til orienteringsanalyse ved hjælp af FIJI, der viser tegningen af celleformen, elliptisk tilpasning og endelig måling. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Enhedsstørrelse, resuspensionsvolumen og stamkoncentrationer for cytokiner anvendt i differentieringsprotokol. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Protokollen, som vi beskriver her, giver mulighed for generering af mekanofølsomme endotelceller fra humane pluripotente stamceller og undersøgelse af deres respons på mekanisk stimulering medieret af kontrolleret forskydningsspænding. Denne protokol er fuldstændig cytokinbaseret og fuldt kompatibel med GMP-reagenser til potentiel oversættelse til produktion af celler til celleterapi.
Afledningen af hiPSC'er giver forskere en instrumentel model for de tidlige stadier af embryonal udvikling, der gør det muligt at studere processer, der ellers er vanskelige at studere in vivo24. Faktisk indsamles humant embryonalt væv, der er tilgængeligt til forskning, fra embryoner, der mangler cirkulation, og dette kan have en betydelig indvirkning på den molekylære signatur, der styres af mekaniske signaler. Den her beskrevne tilgang muliggør live-imaging og realtidsundersøgelse af cellerespons på forskydningsstress. Kombinationen af hiPSC'er med fluidik giver en undersøgelsesmodel, der overvinder den begrænsede tilgængelighed og utilgængeligheden af det udviklende fostervæv, når initieringen af cirkulation ombygger og styrer etableringen af det kardiovaskulære system og blodsystemet 3,9,10,25.
En begrænsning af protokollen er, at endotelcellerne afledt af denne protokol muligvis ikke afspejler de forskellige identiteter af forskellige endotelceller, der er til stede i det udviklende væv. For at overvinde denne begrænsning kan en specifik kombination af cytokiner være nødvendig under differentieringsprocessen forud for den flydende stimulering for at opnå den ønskede identitet eller vævsspecifikke fænotype26. Isoleringen af endotelundergrupper kan opnås under anvendelse af en mere raffineret immunofænotype under isolationstrinnet. Denne protokol isolerer endotelceller udelukkende baseret på ekspressionen af CD34, hvilket muliggør kolonneisolering i stedet for fluorescensaktiveret cellesortering (FACS); Dette reducerer celledød og risikoen for kontaminering. Desuden er denne protokol specielt designet til at studere rollen som forskydningsspænding medieret af laminær strømning. Alternative fluidiske tilgange skal anvendes til at undersøge virkningen af andre mekaniske signaler, såsom strækning eller kompression, eller andre typer strømning såsom forstyrret eller forstyrret strømning.
Vi har tidligere vist, at iPSC-afledte endotelceller efterligner de heterogene arteriovenøse cellulære identiteter27 svarende til den, der observeres i føtal dorsal aorta28,29,30. Dette er af særlig betydning i forbindelse med karudvikling og cellulær specifikation, der vides at være kontrolleret af blodcirkulationen. Undersøgelser i forskellige modeller viste, at manglende cirkulation resulterer i ændret arteriovenøs specifikation11,14,31. De mekanismer, der forbinder mekaniske signaler med cellespecifikation, er stadig ukendte, og rørledningen beskrevet her giver mulighed for raffinerede funktionelle undersøgelser, der ikke kunne testes in vivo.
Denne pipeline beskriver produktionen og stimuleringen af endotelceller afledt af hiPSC'er ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluidiske kanaler, hvorved behovet for støbning af udstyret undgås som for de almindeligt anvendte polydimethylsiloxananordninger (PDMS)12. Desuden gør brugen af PDMS-chips indsamlingen af de stimulerede celler særligt udfordrende, mens cellerne med denne protokol let kan hentes fra kanalen. Dette forbedrer analysekraften betydeligt, hvilket muliggør efterfølgende analyse, såsom proteomiske og transkriptomiske analyser, flowcytometri og funktionelle assays, som muligvis kræver yderligere dyrkning eller in vivo-assays .
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Research Advanced Grant 2021 fra European Hematology Association, Global Research Award 2021 fra American Society of Hematology og Internal Strategy Support Fund ISSF3 finansieret af Welcome Trust og University of Edinburgh. Vi takker Fiona Rossi fra Flow Cytometry Facility for støtte i flowcytometrianalysen. Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY) licens til enhver forfatteraccepteret manuskriptversion, der opstår som følge af denne indsendelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
| 25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
| 6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
| Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
| Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
| BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
| BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
| bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
| CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
| CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
| CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
| Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
| CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
| Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
| DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
| EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
| EDTA | Life technologies | 15575020 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
| Fiji | Version 1.53c | ||
| Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
| Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
| Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
| Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
| Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
| Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
| IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
| Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
| Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
| MTG | Merck | M6145-25ML | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
| Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
| Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
| Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
| Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
| Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
| Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
| ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
| rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
| rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
| rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
| rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
| rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
| rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
| rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
| rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
| rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
| RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
| StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
| StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
| StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
| StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
| Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Copp, A. J. Death before birth: clues from gene knockouts and mutations. Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).
- Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. Hemodynamic control of endothelial cell fates in development. Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).
- Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis. Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).
- Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny. Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).
- Zovein, A. C., et al. Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
- Adamo, L., et al. Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis. Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).
- Diaz, M. F., et al. Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis. Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Lundin, V., et al. YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow. Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).
- Li, J., et al. Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development. Cell Reports. 40 (11), 111339 (2022).
- Azzoni, E., et al. The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition. Cell Reports. 37 (11), 110103 (2021).
- Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Batsivari, A., et al. Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture. Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).
- Canu, G., et al. Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation. Genome Biology. 21 (1), 157 (2020).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).
- Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219 (2018).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).
- Fidanza, A., et al. Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs. Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs. Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).
- Petazzi, P., et al. Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2. bioRxiv. , (2022).
- Crosse, E. I., et al. Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 27 (5), 822 (2020).
- Calvanese, V., et al. Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth. Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).
- Zeng, Y., et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).
- Hwa, J. J., et al. Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow. Scientific Reports. 7 (1), 11965 (2017).
