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Developmental Biology

अंतःपात्र विकासात्मक मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए भ्रूण मानव पोत ऑन-चिप का मॉडल

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65492
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Centre for Regenerative Medicine, Institute for Regeneration and Repair, University of Edinburgh, 2Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh

Summary

यहाँ वर्णित उनके यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के बाद मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल कार्यप्रवाह है. यह एंडोथेलियल कोशिकाओं के विकासात्मक मेकेनोबायोलॉजी के अध्ययन की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण यांत्रिक उत्तेजना के बाद संस्कृति चिप से एकत्र जीवित कोशिकाओं के डाउनस्ट्रीम assays के साथ संगत है।

Abstract

हृदय विकास के दौरान कार्यात्मक रूप से स्थापित होने वाला पहला अंग है, इस प्रकार गर्भधारण में बहुत पहले रक्त परिसंचरण शुरू होता है। भ्रूण के विकास को सुनिश्चित करने के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के परिवहन के अलावा, भ्रूण परिसंचरण यांत्रिक संकेतों के माध्यम से एंडोथेलियल परत के भीतर होने वाली कई महत्वपूर्ण विकास संबंधी घटनाओं को नियंत्रित करता है। बायोमैकेनिकल सिग्नल रक्त वाहिका संरचनात्मक परिवर्तनों को प्रेरित करते हैं, धमनीशिरापरक विनिर्देश स्थापित करते हैं, और हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं के विकास को नियंत्रित करते हैं। विकासशील ऊतकों की दुर्गमता प्रारंभिक मानव विकास में परिसंचरण की भूमिका की समझ को सीमित करती है; इसलिए, इन विट्रो मॉडल पोत मेकेनोबायोलॉजी के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यह पत्र मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और यांत्रिक संकेतों के प्रति उनकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक तरल पदार्थ में उनके बाद के बीजारोपण का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण यांत्रिक उत्तेजना के तहत एंडोथेलियल कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुमति देता है, इसके बाद फेनोटाइपिकल और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं की पुनर्प्राप्ति होती है। यहां स्थापित इन विट्रो मॉडल इंट्रासेल्युलर आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण होगा जो यांत्रिक संकेतों द्वारा मध्यस्थता वाले सिग्नलिंग को स्थानांतरित करता है, जो अंततः मानव भ्रूण जीवन के दौरान पोत विकास को ऑर्केस्ट्रेट करता है।

Introduction

भ्रूण के विकास के दौरान, हृदय कार्यक्षमता1 स्थापित करने वाला पहला अंग है, जिसमें एंडोकार्डियल ट्यूब गठन2 के शुरुआती चरण से पता लगाने योग्य संकुचन होते हैं। परिसंचरण, पोत के भीतर रक्त के प्रवाह द्वारा मध्यस्थता यांत्रिक संकेतों के साथ, प्रारंभिक विकास के कई महत्वपूर्ण पहलुओं को नियंत्रित करता है। भ्रूण परिसंचरण स्थापना से पहले, वास्कुलचर को प्राथमिक केशिका जाल में व्यवस्थित किया जाता है; हृदय के कामकाज पर, यह प्लेक्सस शिरापरक और धमनी वास्कुलचर3 में पुनर्गठित होता है। धमनीशिरापरक विनिर्देश में यांत्रिक संकेतों की भूमिका रक्त प्रवाह दीक्षा से पहले धमनी और शिरापरक मार्करों की पैन-एंडोथेलियल अभिव्यक्ति द्वारा परिलक्षित होती है4.

हेमोडायनामिक बल न केवल वास्कुलचर के विकास को नियंत्रित करते हैं, बल्कि रक्त कोशिका निर्माण के नियंत्रण में भी मौलिक भूमिका निभाते हैं। हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं (एचएसपीसी) हेमोजेनिक एंडोथेलियम 5,6,7,8 नामक विशेष एंडोथेलियल कोशिकाओं से निकलती हैं, जो विशेष रूप से विकास के प्रारंभिक चरण में भ्रूण के विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों में मौजूद होती हैं। दिल की कमी वाले मॉडल, इन विट्रो मॉडल के साथ, यह प्रदर्शित किया है कि यांत्रिक संकेत हेमोजेनिक एंडोथेलियम 9,10,11,12,13,14 से एचएसपीसी उत्पादन को निर्देश देते हैं और बढ़ाते हैं।

विभिन्न प्रकार के प्रवाह गतिशीलता को अलग-अलग सेल चक्र15 को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया है, जिसे हेमोजेनिक एंडोथेलियम 16,17 और धमनी सेल विनिर्देश18 दोनों में महत्वपूर्ण माना जाता है। कुल मिलाकर, यांत्रिक संकेत विकास के दौरान सेल पहचान और कार्य के महत्वपूर्ण निर्धारक हैं। इन विट्रो फ्लुइडिक उपकरणों में उपन्यास हमें विवो में मानव रक्त विकास के दौरान विकासात्मक मैकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने से जुड़ी सीमाओं को दूर करने की अनुमति देता है।

इस पांडुलिपि में प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य का वर्णन करने के लिए है, कदम दर कदम, प्रयोगात्मक पाइपलाइन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से इन विट्रो में व्युत्पन्न मानव endothelial कोशिकाओं पर कतरनी तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए (hiPSCs). इस प्रोटोकॉल endothelial कोशिकाओं में hiPSCs के भेदभाव और उत्तेजना प्रोटोकॉल के लिए तरल पदार्थ चिप्स में उनके बाद के बोने पर विस्तृत निर्देश शामिल हैं. इसका उपयोग करते हुए, इन विट्रो-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं में अलग-अलग प्रवाह के जवाब में उनके अभिविन्यास का विश्लेषण करके कतरनी तनाव को समझने की उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किया जा सकता है। यह अन्य प्रयोगशालाओं को कतरनी तनाव की प्रतिक्रिया और विभिन्न एंडोथेलियल सेल पहचान पर इसके कार्यात्मक परिणामों के बारे में सवालों को संबोधित करने की अनुमति देगा।

Protocol

नोट: सभी सेल संस्कृति तकनीकों को एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ परिस्थितियों के तहत किया जाना चाहिए और कोशिकाओं को 5% सीओ2 के साथ एक humified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जाना चाहिए। रखरखाव (rhbFGF) और भेदभाव प्रोटोकॉल (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) दोनों के लिए सभी साइटोकिन तैयारी के निर्देश पूरक तालिका S1 में हैं।

1. HiPSCs की खेती - विगलन, रखरखाव, और कोशिकाओं की ठंड

  1. रखरखाव माध्यम, विकास कारक और अन्य अभिकर्मकों की तैयारी
    1. पूरे एचईएससी सीरम मुक्त मध्यम पूरक, गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के 25% के 36 एमएल, और β-मर्कैप्टोथेनॉल के 55 एमएम के 1 एमएल को डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम / एफ 12 (डीएमईएम / एफ -12) बेसल माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़कर संस्कृति माध्यम तैयार करें।
    2. डीएमएसओ के 1 एमएल में 1 मिलीग्राम Rho Kinase अवरोधक (iRock) को फिर से निलंबित करें, 50 μL के एलिकोट बनाएं, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: इन विभाज्य को 1 वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। एक बार पिघलने के बाद, उन्हें 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले बर्फ और विभाज्य 60 माइक्रोन प्रति शीशी पर विट्रोनेक्टिन (वीटीएन-एन) समाधान पिघलाएं। प्लेटों को कोटिंग करने से ठीक पहले, डुलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) के 6 एमएल में 60 माइक्रोन स्टॉक को पतला करें; 5 μg/mL की अंतिम एकाग्रता।
  2. hiPSC सेल लाइन विगलन
    नोट: मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल लाइन SFCi55 पहले घर में व्युत्पन्न किया गया था और बड़े पैमाने पर विभिन्न सेल प्रकारों और विभिन्न भ्रूण वंश 19,20,21,22 में भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए वीटीएन-एन समाधान के 1 एमएल के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं को कोट करें।
      नोट: इनक्यूबेशन बाद, लेपित प्लेटों को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. एक आकांक्षा विंदुक के साथ वीटीएन-एन समाधान महाप्राण और rhbFGF (पूरक तालिका S1) के 20 एनजी/एमएल के साथ पूरक prewarmed संस्कृति माध्यम के 1 एमएल जोड़ें.
    3. जल्दी से एक पानी के स्नान में hiPSCs युक्त शीशी defrost और prewarmed संस्कृति माध्यम के 5 एमएल में सेल हस्तांतरण.
    4. कमरे के तापमान पर 300 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए नीचे कोशिकाओं स्पिन.
    5. संस्कृति माध्यम के 0.5 एमएल में सेल गोली को आरएचबीएफजीएफ के 20 एनजी/एमएल के साथ पूरक करें।
    6. कोशिकाओं को एक लेपित अच्छी तरह से स्थानांतरित करें जिसमें पहले से ही 1 एमएल माध्यम हो।
    7. मध्यम के कुल 1.5 एमएल में कोशिकाओं वाले कुओं में आईरॉक के 5 माइक्रोन जोड़ें।
    8. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति दें, सप्ताह के दौरान दैनिक माध्यम को बदलें, और कोशिकाओं को डबल-फीड करें, सप्ताहांत में खिलाने के लिए कोशिकाओं को मध्यम की सामान्य मात्रा में दो बार जोड़ें।
      नोट: कोशिकाओं को केवल 24 घंटे के लिए iRock की उपस्थिति में उगाया जाता है।
  3. रखरखाव और hiPSCs के गुजर
    1. आरएचबीएफजीएफ के 20 एनजी/एमएल के साथ पूरक ताजा प्रीवार्म्ड कल्चर माध्यम के साथ दैनिक माध्यम बदलें।
    2. कोशिकाओं को पारित करें जब वे लगभग 80% संगम तक पहुंचते हैं, आम तौर पर सप्ताह में दो बार।
      1. कोशिकाओं को पारित करने के लिए, वीटीएन-एन के साथ एक प्लेट कोट करें जैसा कि चरण 1.2.1 और 1.2.2 में पहले वर्णित है।
      2. कोशिकाओं के साथ कुओं से माध्यम को महाप्राण करें और उन्हें डीपीबीएस से धोएं।
      3. डीपीबीएस को महाप्राण करें और 1 एमएल पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      4. पृथक्करण अभिकर्मक महाप्राण और एक और 3 मिनट के लिए सेते हैं. प्लेट को हर तरफ 10 बार मजबूती से टैप करें।
        नोट: पृथक्करण चरण को इनक्यूबेशन समय और टैपिंग प्रक्रिया में सेल-प्रकार विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
      5. कोशिकाओं के लिए संस्कृति माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और एक पाश्चर विंदुक के साथ, एक बार माध्यम के साथ धो लें सुनिश्चित करें कि कालोनियों के सबसे एकत्र कर रहे हैं.
      6. 6 में अच्छी तरह से 1 का मार्ग अनुपात प्रदान करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 150 माइक्रोन जोड़ें।
        नोट: इसके तुरंत बाद एक नई शीशी पिघलने के बाद, यह इस तरह के 1:1 या 1:2 के अनुपात में पारित करने के लिए उन्हें 1:6 के अनुपात में पारित करने से पहले एक स्थिर बढ़ती चरण तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए एक या दो मार्ग के लिए एक कम अनुपात में कोशिकाओं पारित करने के लिए बेहतर है.
      7. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति दें, सप्ताह के दौरान दैनिक माध्यम को बदलें, और सप्ताहांत में एक बार कोशिकाओं को डबल-फीड करें।
  4. HiPSCs सेल लाइन फ्रीजिंग
    नोट: संस्कृति शुरू करने के लिए जमे हुए शीशियों के एक निरंतर कम मार्ग बैच को बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करने के लिए विगलन के बाद अपने पहले दो मार्ग के भीतर कोशिकाओं को फ्रीज करें। कोशिकाओं को फ्रीज करें जब वे लगभग 80% के संगम तक पहुंचते हैं।
    1. माध्यम को ताजा prewarmed संस्कृति माध्यम rhbFGF के 20 एनजी/एमएल और iRock के 5 माइक्रोन के साथ पूरक और कम से कम 1 घंटे के लिए सेते बदलें.
    2. चरणों 1.3.2.2-1.3.2.5 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को अलग करें।
    3. संस्कृति माध्यम के 5 एमएल युक्त एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलग कोशिकाओं लीजिए.
    4. कमरे के तापमान पर 300 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    5. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और cryopreservation समाधान के 1 एमएल जोड़ने ( सामग्री की तालिकादेखें).
    6. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, धीरे कोशिकाओं ऊपर और नीचे उन्हें cryopreservation समाधान में मिश्रण करने के लिए विंदुक.
      नोट: अत्यधिक पाइपिंग से बचें, जिसके परिणामस्वरूप सेल क्लस्टर अलग हो सकते हैं।
    7. सेल निलंबन को 0.5 एमएल प्रत्येक के साथ दो क्रायोप्रिजर्वेशन शीशियों में विभाजित करें।
    8. क्रायोप्रेज़र्वेशन शीशियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रीकूल्ड क्रायोप्रेज़र्वेशन कंटेनर में स्थानांतरित करें।
    9. लंबी अवधि के भंडारण के लिए शीशियों को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करने से पहले 24 घंटे के लिए कोशिकाओं के साथ कंटेनर को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।

2. एंडोथेलियल कोशिकाओं में hiPSCs का भेदभाव

  1. भेदभाव माध्यम, साइटोकिन्स और विकास कारकों की तैयारी
    1. तालिका 1 के अनुसार सीरम मुक्त भेदभाव माध्यम (एसएफडी) तैयार करें। भेदभाव के दिन 0 से दिन 5 तक इस माध्यम का उपयोग करें।
    2. 34 एसएफएम बेसल माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) में 34 पोषक तत्व पूरक और एल-ग्लूटामाइन पूरक के 5 एमएल जोड़कर सीडी 34 + कोशिकाओं (एसएफएम -34) के लिए सीरम मुक्त माध्यम तैयार करें। भेदभाव के दिन 6 से इस माध्यम का उपयोग करें।
    3. 3 मिमी समाधान प्राप्त करने के लिए डीएमएसओ के 716 माइक्रोन में 1 मिलीग्राम CHIR99021 को फिर से निलंबित करें। पूरी तरह से resuspended जब तक कमरे के तापमान पर सेते हैं; यदि आवश्यक हो, तो 37 डिग्री सेल्सियस पर जल्दी से गर्म हो जाएं। 20 माइक्रोन एलिकोट बनाएं और उन्हें 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पिघलने के तुरंत बाद उपयोग करें और फिर से फ्रीज न करें या स्टोर न करें।
    4. पूरक तालिका S1 में निर्देश के अनुसार साइटोकिन्स को फिर से निलंबित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर सभी साइटोकिन्स एलिकोट स्टोर करें।
  2. एंडोथेलियल कोशिकाओं का भेदभाव
    नोट: भेदभाव के प्रत्येक दिन के लिए, में वर्णित साइटोकिन्स के मिश्रणों के अनुसार, पहले से गरम एसएफडी माध्यम के 18 एमएल (3 एमएल मध्यम/अच्छी तरह से) तैयार करें तालिका 2.
    1. दिन 0 - भ्रूण निकायों (ईबीएस) का गठन
      1. तालिका 2 के अनुसार मिश्रण 1 साइटोकिन के साथ एसएफडी माध्यम के 18 एमएल तैयार करें, प्रत्येक 6-अच्छी प्लेट (3 एमएल / अच्छी तरह से) के लिए।
      2. एक सेल-विकर्षक 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में मिक्स 1 साइटोकिन के साथ प्रीवार्म्ड एसएफडी माध्यम के 2 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      3. EB बनाने के लिए, चरण 1.3.2.2-1.3.2.4 में वर्णित चरणों का पालन करें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि hiPSCs भेदभाव शुरू करने के लिए 70-80% संगम कर रहे हैं.
      4. अलग सेल समूहों के प्रत्येक कुएं में मिक्स 1 साइटोकिन्स के साथ प्रीवार्म्ड एसएफडी माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
      5. धीरे 1:1 के अनुपात में ईबी गठन के लिए सेल विकर्षक अच्छी तरह से सेल समूहों के एक ही अच्छी तरह से हस्तांतरण करने के लिए एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें.
      6. इनक्यूबेटर में थाली रखने के बाद, यह आगे और पीछे, सही और बाएं, अच्छी तरह से ईबीएस समान रूप से फैलाने के लिए ले जाएँ.
    2. दिन 1 - EBs में मध्यम परिवर्तन
      नोट: यह कदम केवल तभी आवश्यक है जब भेदभाव के दिन 1 तक, ईबीएस के साथ निलंबन में कई एकल कोशिकाएं हों।
      1. तालिका 2 के अनुसार मिश्रण 1 साइटोकिन के साथ एसएफडी माध्यम के 18 एमएल तैयार करें, प्रत्येक 6-अच्छी प्लेट (3 एमएल / अच्छी तरह से) के लिए।
      2. ईबीएस के साथ प्लेट भंवर उन्हें केंद्र में ले जाने के लिए और उन्हें एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक पाश्चर विंदुक का उपयोग कर इकट्ठा.
        नोट: यदि ईबीएस स्ट्रिंग्स के रूप में एक साथ क्लंप दिखते हैं, तो उन्हें 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा करने से पहले उन्हें पी 1000 के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके अलग करें।
      3. ईबीएस ट्यूब के तल पर बसने के लिए 5-10 मिनट रुको.
        नोट: यदि ईबीएस बहुत छोटे हैं, तो उन्हें बसने में मदद करने के लिए 100 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें।
      4. किसी भी एकल कोशिकाओं या मलबे को हटाने के लिए बाँझ पानी या DPBS के साथ सेल विकर्षक प्लेटों धो लें.
      5. ध्यान से और धीरे-धीरे उन्हें विस्थापित किए बिना EBs से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण.
      6. सेल से बचाने से बचाने वाली क्रीम प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण 1 साइटोकिन्स के साथ SFD के 2 एमएल जोड़ें.
      7. प्रत्येक अच्छी तरह से शुरू करने के लिए मिक्स 1 साइटोकिन्स के साथ एसएफडी माध्यम के 1 एमएल का उपयोग करके ईबीएस को फिर से निलंबित करें - 6-अच्छी प्लेट के लिए, मध्यम के 6 एमएल जोड़ें।
      8. ईबीएस को 1 एमएल वॉल्यूम प्रति अच्छी तरह से सेल-रिपेलेंट प्लेटों में स्थानांतरित करें, जिसमें पहले से ही एसएफडी माध्यम के 2 एमएल शामिल हैं।
      9. इनक्यूबेटर में थाली रखने के बाद, यह आगे और पीछे, सही और बाएं, अच्छी तरह से ईबीएस समान रूप से फैलाने के लिए ले जाएँ.
    3. दिन 2 - CHIR99021 का जोड़
      1. ईबीएस को प्लेट के केंद्र में घुमाएं और कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए अच्छी तरह से तालिका 2 के अनुसार CHIR99021 जोड़ें।
        नोट: यदि माध्यम दिन 1 पर नहीं बदला गया था, तो अकेले CHIR जोड़ने के बजाय पूरे माध्यम को बदलें। तालिका 2 के अनुसार मिश्रण 2 के साथ एसएफडी माध्यम के 18 एमएल तैयार करें, प्रत्येक 6-अच्छी तरह से प्लेट (3 एमएल / अच्छी तरह से) के लिए।
      2. इनक्यूबेटर में थाली रखने के बाद, यह आगे और पीछे, सही और बाएं, अच्छी तरह से ईबीएस समान रूप से फैलाने के लिए ले जाएँ.
    4. दिन 3 - ईबीएस में मध्यम परिवर्तन और मिक्स 3 साइटोकिन्स के अलावा
      1. तालिका 2 के अनुसार मिश्रण 3 साइटोकिन्स के साथ एसएफडी माध्यम के 18 एमएल तैयार करें, प्रत्येक 6-अच्छी प्लेट (3 एमएल / अच्छी तरह से) के लिए।
      2. ईबीएस ले लीजिए जैसा कि चरण 2.2.2.2-2.2.2.4 में वर्णित है।
      3. सेल से बचाने से बचाने वाली क्रीम प्लेटों के लिए मिक्स 3 साइटोकिन्स के साथ SFD माध्यम के prewarmed 2 एमएल जोड़ें.
      4. ध्यान से ईबी से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण. मिक्स 3 साइटोकिन्स के साथ एसएफडी के 1 एमएल /
      5. कुओं के बीच EBs वितरित के रूप में कदम 2.2.2.8-2.2.2.9 में वर्णित है.
    5. दिन 6 - SFM-34 के लिए मध्यम परिवर्तन और मिक्स 4 साइटोकिन्स के अलावा
      1. तालिका 2 के अनुसार मिश्रण 4 साइटोकिन्स के साथ एसएफडी माध्यम के 18 एमएल तैयार करें, प्रत्येक 6-अच्छी प्लेट (3 एमएल / अच्छी तरह से) के लिए।
      2. ईबीएस ले लीजिए जैसा कि चरण 2.2.2.2-2.2.2.4 में वर्णित है।
      3. सेल से बचाने वाली क्रीम प्लेटों के लिए मिक्स 4 साइटोकिन्स के साथ prewarmed SFM-34 मध्यम के 2 एमएल जोड़ें.
      4. ध्यान से ईबी से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण. मिक्स 4 साइटोकिन्स के साथ SFM-34 के 1 एमएल/अच्छी तरह से जोड़ें।
      5. कुओं के बीच EBs वितरित के रूप में कदम 2.2.2.8-2.2.2.9 में वर्णित है.

3. सीडी 34 + कोशिकाओं अलगाव और चिप में सीडिंग

नोट: CD34+ कोशिकाओं को CD34 माइक्रोबीड किट ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक सकारात्मक अलगाव दृष्टिकोण के माध्यम से अलग किया जाता है, जिसमें CD34 माइक्रोबीड्स होते हैं जो मोनोक्लोनल माउस एंटीबॉडी, एंटी-ह्यूमन CD34 एंटीबॉडी और FcR ब्लॉकिंग अभिकर्मक (मानव IgG) से संयुग्मित होते हैं। यह पहले और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए अलगाव के बाद कोशिकाओं धुंधला द्वारा स्तंभ अलगाव की दक्षता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है, नीचे यह संकेत दिया है जब कोशिकाओं इस विश्लेषण के लिए लिया जा करने की जरूरत है.

  1. सामग्री और अभिकर्मकों तैयार करें।
    1. पीबीएस + 0.5% बीएसए + 2 एमएम ईडीटीए प्राप्त करने के लिए 5% बीएसए समाधान के 5 एमएल और ईडीटीए 0.5 एम से 45 एमएल डीपीबीएस के 45 एमएल जोड़कर वाशिंग बफर तैयार करें। प्रत्येक अलगाव के लिए ताजा तैयार करें, फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें, और उपयोग होने तक प्रशीतित रखें।
    2. DPBS Ca 521+ Mg2+ में rhLaminin 521 1:50 को पतला करके तैयार किए गए लेमिनिन समाधान के साथ फ्लुइडिक चिप्स को कोट करें। उपयोग में चिप के लिए उपयुक्त मात्रा के साथ प्रत्येक चिप को कोट करें और सीडिंग से पहले 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
      नोट: अन्य मैट्रिक्स कोटिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है और विशिष्ट सेल प्रकार / प्रयोग के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए।
    3. तालिका 2 के अनुसार मिक्स 4 साइटोकिन्स के साथ एसएफएम -34 माध्यम के 18 एमएल को पूरक करके मिक्स 4 एसएफएम -34 मध्यम तैयार करें और इनक्यूबेटर में 50 एमएल ट्यूब में मिश्रण को ढक्कन के साथ गैस विनिमय की सुविधा के लिए थोड़ा अनस्क्रू करें।
    4. चयनित छिड़काव सेट और किसी भी अन्य टयूबिंग degas करने के लिए इनक्यूबेटर में इस्तेमाल किया जा करने के लिए रखें.
  2. दिन 8 - EBs और CD34+ अलगाव का पृथक्करण
    1. ईबीएस के रूप में कदम 2.2.2.2-2.2.2.5 में वर्णित लीजिए.
    2. एकत्र किए गए ईबीएस के अच्छी तरह से शुरू करने के प्रति सेल पृथक्करण अभिकर्मक के 1 एमएल जोड़ें (यदि 6 कुओं एकत्र किए गए थे, तो 6 एमएल जोड़ें)।
    3. सेल पृथक्करण अभिकर्मक में ईबी निलंबन के 1 एमएल को सेल-विकर्षक प्लेट के प्रत्येक कुएं में वापस स्थानांतरित करें।
    4. इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए सेते हैं.
    5. धीरे एक P1000 के साथ अच्छी तरह से खिलाफ ईबीएस ऊपर और नीचे विंदुक, 10 से अधिक बार नहीं.
    6. चरण 3.2.4-3.2.5 को दोहराएं।
      नोट: यदि ईबीएस को अलग करना मुश्किल है, तो उपरोक्त चरणों को कुल मिलाकर 4x दोहराएं।
    7. अलग ईबी के प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए धोने बफर के 5 एमएल जोड़ें.
    8. कोशिकाओं को 40 माइक्रोन झरनी के माध्यम से पारित करके 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा करें। कोशिकाओं की गिनती करने के लिए सेल निलंबन के 10 माइक्रोन ले लो.
      नोट: अलगाव की दक्षता के लिए परीक्षण करने के लिए, 105 कोशिकाओं/ट्यूब को दो अलग-अलग ट्यूबों (बेदाग नियंत्रण और सहारा परीक्षण नमूना) में स्थानांतरित करें जिनका उपयोग बाद में प्रवाह साइटोमेट्री के लिए किया जाएगा (जैसा कि चरण 4.3.9-4.3.13 में वर्णित है)। एक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए, ~ 106 कोशिकाओं निस्पंदन के बाद एकत्र किया जाना चाहिए.
    9. 300 × जी पर 10 मिनट के लिए नीचे कोशिकाओं स्पिन.
    10. धोने के बफर के 300 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे से कुछ बार पाइप करें कि कोई गुच्छे मौजूद नहीं हैं। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करना जारी रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. CD34+ फ्लूइडिक चिप्स में सेल सीडिंग
    नोट: प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली फ्लुइडिक चिप में 2.5 सेमी2 (पूरक चित्रा एस 1) के कुल विकास क्षेत्र के लिए 0.6 मिमी की चैनल ऊंचाई और 50 मिमी की लंबाई है। इस प्रकार की चिप को 150 μL के सेल निलंबन की कुल मात्रा के साथ वरीयता दी जाती है। विभिन्न चिप्स का उपयोग किया जा सकता है, और सीडिंग की मात्रा और सेल घनत्व को विकास क्षेत्र के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। उपयोग की जाने वाली सेल लाइन और इसकी वृद्धि के आधार पर अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
    1. मिक्स 34 साइटोकिन्स के साथ प्रीवार्म्ड SFM-34 माध्यम के 300 माइक्रोन में पृथक CD4+ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    2. सेल निलंबन के 10 माइक्रोन लें और कोशिकाओं की गिनती करें।
    3. 150 माइक्रोन पूरक एसएफएम -34 की अंतिम मात्रा में 2.5 ×10 5 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें; iRock के 0.5 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: अलगाव की दक्षता के लिए परीक्षण करने के लिए, 105 कोशिकाओं/ट्यूब को एक ट्यूब (पोस्ट-सॉर्टेड टेस्ट नमूना) में स्थानांतरित करें जिसका उपयोग बाद में फ्लो साइटोमेट्री के लिए किया जाएगा (जैसा कि चरण 4.3.9-4.3.13 में वर्णित है)।
    4. धीरे-धीरे चैनल के किनारे पर जलाशय के अंदर एक P200 की नोक डालकर द्रव चिप्स से लेमिनिन महाप्राण करें।
      नोट: यदि तरल को इकट्ठा करना मुश्किल है, तो तरल को विपरीत जलाशय में ले जाने में मदद करने के लिए धीरे-धीरे चिप के एक तरफ उठाएं।
    5. सेल निलंबन चैनल में तेजी से जोड़ें सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले का गठन कर रहे हैं बनाने के लिए.
      नोट: चरण 3.3.4-3.3.5 जल्दी लेकिन धीरे से लेमिनिन सूखने और चिप के चैनलों में बुलबुले के गठन से बचने के लिए। यदि बुलबुले बनते हैं, तो चिप के एक तरफ उठाएं और बुलबुले को जुटाने के लिए स्लाइड को धीरे से टैप करें; जब वे जलाशय तक पहुँचते हैं, तो वे वायु इंटरफ़ेस तक बढ़ जाएंगे और चैनल को किराए पर देने में सक्षम नहीं होना चाहिए।
    6. चिप को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और उन्हें रात भर छोड़ दें ताकि कोशिकाएं पूरी तरह से चैनल से जुड़ी हों और लम्बी दिखें।
    7. जब कोशिकाएं पूरी तरह से संलग्न होती हैं, तो चरण 3.3.4 के रूप में माध्यम को महाप्राण करें और इसे साइटोकाइन-पूरक एसएफएम -34 के 200 माइक्रोन के साथ बदलें।
    8. अब से, दैनिक माध्यम की जगह जब तक कोशिकाओं 90% -100% संगम तक पहुँच गया है.

4. एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए निरंतर प्रवाह का अनुप्रयोग - महाधमनी-ऑन-ए-चिप

  1. सामग्री और अभिकर्मकों तैयार करें।
    1. तालिका 2 के अनुसार मिक्स 4 साइटोकिन्स के साथ एसएफएम -34 माध्यम के 18 एमएल को पूरक करके मिक्स 4 एसएफएम -34 मध्यम तैयार करें और इसे इनक्यूबेटर में 50 एमएल ट्यूब में ढक्कन के साथ गैस विनिमय की सुविधा के लिए थोड़ा अनस्क्रू करें।
    2. चयनित छिड़काव सेट और किसी भी टयूबिंग degas करने के लिए इनक्यूबेटर में तरल पदार्थ सेटअप के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए रखें.
  2. फ्लुइडिक सिस्टम असेंबली
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इकाई में छिड़काव सेट स्थापित करें।
      नोट: क्लू का उपयोग करना याद रखेंampसिस्टम में । यदि स्लाइडिंग क्लैंप का उपयोग इस चरण के लिए किया जाता है, तो चिप से कनेक्ट करने से पहले उन्हें टयूबिंग पर स्लाइड करने की आवश्यकता होती है।
    2. एक नया फ्लुइडिक चिप संलग्न करें और साइटोकाइन-पूरक एसएफएम -34 माध्यम जोड़ें, हुड में बाँझ परिस्थितियों में दोनों जलाशयों को भरना सुनिश्चित करें।
    3. बुलबुला हटाने कार्यक्रम और अंशांकन कदम प्रदर्शन करें।
    4. इनक्यूबेटर से जुड़े सेट के साथ द्रव इकाई निकालें और इसे हुड में स्थानांतरित करें; इनक्यूबेटर से कोशिकाओं वाले चिप्स भी लें।
    5. परीक्षण चिप के दोनों किनारों पर टयूबिंग दबाना.
    6. परीक्षण चिप से टयूबिंग निकालें.
      नोट: जांचें कि कोई बुलबुले ट्यूबिंग के अंत में Luer कनेक्टर में मौजूद नहीं हैं। यदि बुलबुले दिखाई दे रहे हैं, ध्यान से एक P200 विंदुक का उपयोग कर उन्हें महाप्राण और यदि आवश्यक हो, कनेक्टर माध्यम से भर जाता है कि सुनिश्चित करने के लिए और अधिक माध्यम जोड़ें.
    7. टयूबिंग के साथ कोशिकाओं युक्त चिप कनेक्ट.
    8. क्लू निकालें या खोलेंamps।
    9. सिस्टम को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और वायु पंप को द्रव इकाई से कनेक्ट करें।
    10. तालिका 3 में वर्णित कतरनी तनाव की क्रमिक वृद्धि के साथ पंप-समर्पित सॉफ्टवेयर (पूरक चित्रा एस 2) का उपयोग करके पूर्व-चयनित कार्यक्रम शुरू करें।
      नोट: विशिष्ट प्रयोग है कि जरूरत है पर निर्भर करता है, उत्तेजना कार्यक्रम अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. यहाँ वर्णित एक क्रमिक कतरनी तनाव वृद्धि है जो भ्रूण परिसंचरण 9 की शुरुआत में पृष्ठीय महाधमनी की दीवार द्वारा अनुभव किए जाने की गणना की जाने वाली कतरनी तनाव की नकल करता है। नियोजित किए जाने वाले अंतिम कतरनी तनाव से स्वतंत्र रूप से, कोशिकाओं को चिप से अलग किए बिना कोशिकाओं को बल के अनुकूल होने की अनुमति देने के लिए समय के साथ धीरे-धीरे बढ़ाना आवश्यक है। यदि चयनित उत्तेजना प्रोटोकॉल 3 दिनों से अधिक लंबा है, तो साइटोकिन्स को एसएफएम-34 के 1 एमएल जोड़कर सिस्टम में सबसे ऊपर रखा जाना चाहिए जिसमें मिक्स 4 साइटोकिन्स होते हैं जिन्हें सामान्य रूप से 18 एमएल में जोड़ा जाएगा। ऐसा करने के लिए, पंप प्रोग्राम जल्दी से रोक दिया जाता है और तरल पदार्थ सेट में दो सीरिंज में से प्रत्येक में पूरक माध्यम के 500 माइक्रोन को जोड़ा जाता है।
  3. विश्लेषण के लिए सेल संग्रह
    1. पानी के स्नान में पृथक्करण बफर को पहले से गरम करें।
    2. इनक्यूबेटर से द्रव इकाई निकालें और हुड में ले जाएँ.
    3. दोनों तरफ चिप flanking टयूबिंग दबाना और चिप पर जलाशयों से टयूबिंग हटा दें.
    4. धीरे चिप से माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को धोने के लिए इसे DPBS Ca 2+ Mg2+ से बदलें।
      नोट: पीबीएस के साथ धोने के इस कदम को छोड़ दिया जा सकता है अगर कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू.
    5. धीरे से पृथक्करण बफर के 150 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: माइक्रोस्कोप के नीचे जांचें कि क्या कोशिकाएं एकल और अलग हैं; अन्यथा, एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए सेते हैं. यह आवश्यक है कि माध्यम की महाप्राण करने से पहले कोशिकाओं को चैनल से पूरी तरह से अलग कर दिया जाए, क्योंकि चिप पाइपिंग द्वारा सेल डिटेचमेंट की सहायता करने की अनुमति नहीं देती है। कोशिकाओं को अलग करने के लिए अन्य समाधानों को नियोजित किया जा सकता है, जैसे ट्रिप्सिन या ईडीटीए-आधारित बफर।
    6. एक जलाशय से कोशिकाओं युक्त पृथक्करण बफर लीजिए और एक 15mL अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए हस्तांतरण और सभी अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए DPBS के साथ एक बार चैनल धो लें.
    7. कोशिकाओं के साथ 15 एमएल ट्यूब में वाशिंग बफर के 1 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं की गिनती के लिए 10 माइक्रोन लें।
    8. सेल निलंबन को फ्लो साइटोमेट्री ट्यूबों में विभाजित करें ताकि प्रति टेस्ट ट्यूब 105 कोशिकाएं हों।
    9. 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों स्पिन.
    10. दाग करने के लिए प्रत्येक टेस्ट ट्यूब के लिए 50 माइक्रोन के लिए धुंधला समाधान तैयार करें। CD34 PerCP-efluor710 वा CD34-PE लाई क्रमशः 1:100 र 1:200 कमजोर पड़ने मा थप्नुहोस्।
    11. धुंधला समाधान के 50 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. धोने बफर के 2 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धो लें और 300 × ग्राम पर 5 मिन के लिए स्पिन करें।
    13. धुंधला समाधान के 100 माइक्रोन में छर्रों को फिर से निलंबित करें और प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके डेटा प्राप्त करें।
      नोट: कोशिकाओं को आरएनए लाइसिस बफर के 150 माइक्रोन का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण के लिए चिप में सीधे लाइड किया जा सकता है या कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए डीपीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करके इमेजिंग के लिए तय किया जा सकता है।
  4. सेल अभिविन्यास विश्लेषण
    1. फिजी23 (पूरक चित्रा एस 3) का उपयोग करके सेल अभिविन्यास में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए छवियों का विश्लेषण करें।
      1. Analysis से रीजन ऑफ़ इंटरेस्ट (ROI) प्रबंधक खोलें | उपकरण | ROI प्रबंधक मेनू।
      2. बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके मैन्युअल रूप से कक्ष आकृति आरेखित करें और जोड़ें पर क्लिक करके या CTRL+T शॉर्टकट का उपयोग करके उन्हें ROI प्रबंधक में जोड़ें.
      3. विश्लेषण में फ़िट दीर्घवृत्त माप चुनकर प्रत्येक ROI के अभिविन्यास को मापें | माप मेनू सेट करें ।
      4. के माध्यम से सभी आरओआई पर माप लागू करें अधिक... आरओआई प्रबंधक में बहु माप आदेश।
        नोट: यह चरण प्रत्येक आरओआई के लिए एक दीर्घवृत्त फिट होगा और एक तालिका उत्पन्न करेगा जिसमें प्रमुख और मामूली दीर्घवृत्त अक्षों की लंबाई, साथ ही कोण भी होगा।
      5. प्लॉट करने के लिए अन्य सॉफ़्टवेयर में आयात करने के लिए तालिका को CSV फ़ाइल में निर्यात करें।
        नोट: प्लॉट के लिए उपयोग की जाने वाली स्क्रिप्ट https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf885 पर उपलब्ध है
        0डीडीसी।

Representative Results

हम यहां एचआईपीएससी से प्राप्त एंडोथेलियल कोशिकाओं के भेदभाव और मेकोनो-उत्तेजना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो यांत्रिक संकेतों (चित्रा 1) के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के अध्ययन की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप कार्यात्मक रूप से मेकेनोसेंसिटिव एंडोथेलियल कोशिकाओं का उत्पादन होता है। हम यहां प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं और यह आकलन करने के लिए अपेक्षित फेनोटाइप का वर्णन करते हैं कि कोशिकाएं भेदभाव के दौरान साइटोकिन उत्तेजना का जवाब कैसे देती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: भेदभाव और यांत्रिक उत्तेजना प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध। साइटोकिन्स के विभिन्न मिश्रणों के समय को दिखाते हुए भेदभाव प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध, सीडी 34 + सेल अलगाव, द्रव चिप सीडिंग, और यंत्रवत् उत्तेजित कोशिकाओं का अंतिम विश्लेषण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

hiPSCs की संस्कृति
यह hiPSCs है कि आत्म नवीकरण की स्थिति में सही ढंग से बढ़ रहे हैं से प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है. संस्कृति की गुणवत्ता का एक अच्छा संकेत उनके विकास की गति है। विगलन के बाद, कोशिकाओं को विकास के सही चरण तक पहुंचने के लिए 2-3 सप्ताह की आवश्यकता हो सकती है जो अच्छा भेदभाव सुनिश्चित करेगी। जब कोशिकाओं को सप्ताह में दो बार 1: 6 के अनुपात में लगभग पूर्ण संगम तक पहुंचने के लिए पारित किया जा सकता है, तो यह वह समय है जब वे उसी दिन विभेदित होने के लिए तैयार होते हैं जिस दिन उन्हें पारित करने की आवश्यकता होती है।

एंडोथेलियल कोशिकाओं में hiPSCs का भेदभाव
भेदभाव का पहला चरण, जिसमें भ्रूण निकायों (ईबी) के गठन से मिलकर, सेल लाइन-निर्भर है और उपयोग में विशिष्ट सेल लाइन के लिए कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। प्रोटोकॉल चरणों 1.3.2.2-1.3.2.4 में वर्णित पृथक्करण को या तो कम करके या तो पृथक्करण अभिकर्मक के साथ इनक्यूबेशन का विस्तार करके और पाश्चर पिपेट के साथ बाद में पृथक्करण द्वारा संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, अन्य पृथक्करण अभिकर्मकों एक काटने के उपकरण या एक P100 विंदुक टिप के साथ कालोनियों के भौतिक पृथक्करण के अलावा इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अच्छी गुणवत्ता के ईबीएस भेदभाव के दिन 2 तक एक परिभाषित बढ़त दिखाते हैं और माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखे जाने पर स्पष्ट और उज्ज्वल दिखाई देते हैं; गहरे क्षेत्रों ईबी (चित्रा 2) के भीतर कोशिका मृत्यु का संकेत हो सकता है.

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण निकायों आकृति विज्ञान. (ए) दिन 2 भ्रूण निकायों अच्छी तरह से परिभाषित बाहरी किनारों और सुसंगत आकार दिखा रहा है। (बी) खराब गुणवत्ता के दिन 2 भ्रूण निकायों संरचना के विघटन के लिए अग्रणी व्यापक कोशिका मृत्यु दिखा रहा है. स्केल बार = 500 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2 दिन में, ईबीएस में CHIR99021 के अलावा जीएसके -3 प्रोटीन को रोकता है जिसके परिणामस्वरूप डब्ल्यूएनटी मार्ग की सक्रियता होती है। विभिन्न सेल लाइनों CHIR उपचार के लिए अलग प्रतिक्रियाओं है, और यह सीडी 34 + विभिन्न सांद्रता (चित्रा 3) का उपयोग करके दिन 8 में प्राप्त कोशिकाओं की संख्या यों द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए.

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न सीएचआईआर उपचारों के साथ एंडोथेलियल सेल भेदभाव। एंडोथेलियल सेल प्रतिबद्धता सीडी 34 झिल्ली अभिव्यक्ति द्वारा भेदभाव के दिन 8 पर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मात्रा निर्धारित की जाती है, (ए) 3 माइक्रोन, (बी) 5 माइक्रोन, और (सी) 7 माइक्रोन पर दिन 2 पर सीएचआईआर उपचार के बाद। फ्लो साइटोमेट्री डेटा पांच-लेजर साइटोमीटर और समर्पित सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

CD34+ सेल अलगाव
यह मान्य करना महत्वपूर्ण है कि चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके CD34+ संवर्धन स्तंभ के क्षालन के बाद कम से कम 80% CD34+ प्रदान करता है। पर्याप्त शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए, चुंबकीय अलगाव से प्राप्त कोशिकाओं के एक विभाज्य का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जा सकता है जो चुंबकीय संवर्धन के लिए उपयोग किए जाने वाले एक से अलग एंटीबॉडी क्लोन का उपयोग करना सुनिश्चित करता है। यहां, 4 एच 11 क्लोन का उपयोग किया गया था और ~ 85% शुद्धता संवर्धन के बाद हासिल की गई थी (चित्र 4)।

Figure 4
चित्रा 4: चुंबकीय छँटाई द्वारा संवर्धन से पहले और बाद में सीडी 34 की झिल्ली अभिव्यक्ति। दिन 8 विघटित भ्रूण निकायों (ग्रे) और चुंबकीय संवर्धन (हरा) के बाद कोशिकाओं को सीडी 34 अभिव्यक्ति के लिए दाग दिया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था, जो सफल संवर्धन पोस्ट सॉर्टिंग दिखा रहा था। फ्लो साइटोमेट्री डेटा पांच-लेजर साइटोमीटर और समर्पित सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

द्रव चैनल में कोशिकाओं को सीडिंग करना
द्रव चैनल में कोशिकाओं को बोते समय, एंडोथेलियल कोशिकाओं के आसंजन और प्रसार को ट्रैक करना महत्वपूर्ण है। बीजारोपण के बाद, कोशिकाओं ~ 5 घंटे पूरी तरह से चैनल (चित्रा 5 ए) का पालन करने के लिए. इस स्तर पर आसंजन में सुधार के लिए एक वैकल्पिक कोटिंग समाधान का भी परीक्षण किया जा सकता है। यह पुष्टि करने के लिए कि परीक्षण की गई कोशिकाएं मेकेनोसेंसिटिव हैं और इस प्रकार, यांत्रिक उत्तेजना का जवाब देने में सक्षम हैं, सेल अभिविन्यास का समय के साथ परीक्षण किया जा सकता है। उत्तेजना से पहले कोशिकाएं यादृच्छिक अभिविन्यास (चित्रा 5 ए और चित्रा 5 सी) दिखाती हैं और वे प्रवाह की दिशा (चित्रा 5बी, सी) के समानांतर पुन: पेश करती हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल चैनल से कोशिकाओं के संग्रह के लिए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री, उनके झिल्ली इम्यूनोफेनोटाइप के अध्ययन के लिए, उत्तेजित कोशिकाओं(चित्रा 5डी,ई)की एंडोथेलियल पहचान प्रदान करता है।

Figure 5
चित्रा 5: एचआईपीएससी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं की मेकेनोरिस्पॉन्सिबिलिटी । (ए) पृथक सीडी 34 + कोशिकाओं की संगम परत 48 घंटे पोस्ट सीडिंग। (बी) गतिशील संस्कृति के तहत एंडोथेलियल कोशिकाओं की 3 दिनों की पुनर्निर्देशित परत। (सी)गतिशील संस्कृति के 5 दिनों के बाद एंडोथेलियल कोशिकाओं का अभिविन्यास विश्लेषण। (डी) 5 दिनों के लिए प्रवाह के तहत सुसंस्कृत कोशिकाओं की सीडी 34 अभिव्यक्ति प्रोफाइल। (ई) द्रव चैनल से प्राप्त सेल आबादी की सीडी 34+ कोशिकाओं का प्रतिशत। छवियों को एक उल्टे इन-इनक्यूबेटर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया गया था; प्रवाह साइटोमेट्री डेटा पांच-लेजर साइटोमीटर और समर्पित सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन (ए, बी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मकों स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम जोड़ा गया अंतिम एकाग्रता
इस्कोव का संशोधित Dulbecco का माध्यम (IMDM) - 333 एमएल -
हैम का एफ -12 पोषक तत्व मिश्रण (एफ -12) - 167 एमएल -
एन -2 पूरक (100x) 100 एक्स 5 एमएल 1x
बी -27 पूरक (50x) 50 एक्स 10 एमएल 1x
एस्कॉर्बिक एसिड 10 मिलीग्राम/एमएल 1.25 एमएल 25 μg/mL
α-मोनोथियोग्लिसरॉल (MTG) 11.5 एम 19.5 माइक्रोन 448.5 माइक्रोन
मानव सीरम एल्ब्यूमिन 100 मिलीग्राम/एमएल 2.5 एमएल 0.5 मिलीग्राम/एमएल
होलो-ट्रांसफ़रिन 100 मिलीग्राम/एमएल 0.75 एमएल 150 μg/mL

तालिका 1: सीरम मुक्त भेदभाव (एसएफडी) माध्यम के 500 एमएल के लिए संरचना और नुस्खा।

भेदभाव के दिन साइटोकिन मिक्स साइटोकाइन अंतिम एकाग्रता
दिन 0 - 2 मिक्स 1 बीएमपी4 20 एनजी/एमएल
दिन 2 मिक्स 2 CHIR99021 7 माइक्रोन
तीसरे दिन से मिक्स 3 और 4 वीईजीएफ 15 एनजी/एमएल
बीएफजीएफ 5 एनजी/एमएल
दिन 6 से आगे मिक्स 4 आईएल6 10 एनजी/एमएल
एफएलटी3एल 10 एनजी/एमएल
आईजीएफ1 25 एनजी/एमएल
आईएल11 5 एनजी/एमएल
एससीएफ 50 एनजी/एमएल
ईपीओ 3 यू/एमएल
टीपीओ 30 एनजी/एमएल
आईएल3 30 एनजी/एमएल

तालिका 2: एंडोथेलियल सेल भेदभाव के लिए उपयोग किए जाने वाले साइटोकिन्स के मिश्रण, जिन दिनों में उन्हें एसएफडी माध्यम में जोड़ा जाता है, और अंतिम एकाग्रता।

अपरूपण तनाव (dyn/cm2) समय (ज)
0.5 1
1 1
1.5 1
2 1
2.5 1
3 1
3.5 1
4 1
4.5 1
5 प्रयोग के अंत तक

तालिका 3: गतिशील संस्कृति और उनके आवेदन की लंबाई के लिए कतरनी तनाव मूल्य।

अनुपूरक चित्रा S1: इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली चिप और टयूबिंग की ज्यामिति और आयाम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र S2: प्रत्येक चरण के विवरण के साथ वायु पंप को नियंत्रित करने वाले सॉफ़्टवेयर के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा एस 3: सेल आकार, अण्डाकार फिटिंग और अंतिम माप के ड्राइंग को दिखाते हुए फिजी का उपयोग करके अभिविन्यास विश्लेषण के लिए गाइड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: यूनिट आकार, resuspension मात्रा, और भेदभाव प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले साइटोकिन्स के लिए स्टॉक सांद्रता। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रोटोकॉल है कि हम यहाँ वर्णन मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से mechanosensitive endothelial कोशिकाओं की पीढ़ी और नियंत्रित कतरनी तनाव द्वारा मध्यस्थता यांत्रिक उत्तेजना के लिए उनकी प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. यह प्रोटोकॉल पूरी तरह से साइटोकाइन आधारित है और सेल थेरेपी के लिए कोशिकाओं के उत्पादन में संभावित अनुवाद के लिए जीएमपी अभिकर्मकों के साथ पूरी तरह से संगत है।

HIPSCs की व्युत्पत्ति भ्रूण के विकास के शुरुआती चरणों के लिए एक वाद्य मॉडल के साथ वैज्ञानिकों को प्रदान करती है जो प्रक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम बनाती है जो अन्यथा विवो24 में अध्ययन करना मुश्किल है। वास्तव में, अनुसंधान के लिए उपलब्ध मानव भ्रूण के ऊतकों को संचलन की कमी वाले भ्रूण से एकत्र किया जाता है, और इसका यांत्रिक संकेतों द्वारा नियंत्रित आणविक हस्ताक्षर पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। यहां वर्णित दृष्टिकोण कतरनी तनाव के लिए सेल प्रतिक्रिया के लाइव-इमेजिंग और वास्तविक समय के अध्ययन को सक्षम बनाता है। तरल पदार्थ के साथ hiPSCs के संयोजन सीमित उपलब्धता और विकासशील भ्रूण के ऊतकों की दुर्गमता पर काबू पाने कि अध्ययन का एक मॉडल प्रदान करता है जब परिसंचरण remodels की दीक्षा remodels और हृदय और रक्त प्रणाली 3,9,10,25 की स्थापना को नियंत्रित करता है.

प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि इस प्रोटोकॉल से प्राप्त एंडोथेलियल कोशिकाएं विकासशील ऊतकों में मौजूद विभिन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं की विभिन्न पहचानों को प्रतिबिंबित नहीं कर सकती हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, वांछित पहचान या ऊतक-विशिष्ट फेनोटाइप26 प्राप्त करने के लिए द्रव उत्तेजना से पहले भेदभाव प्रक्रिया के दौरान साइटोकिन्स के एक विशिष्ट संयोजन की आवश्यकता हो सकती है। अलगाव चरण के दौरान एंडोथेलियल सबसेट का अलगाव अधिक परिष्कृत इम्यूनोफेनोटाइप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल केवल सीडी 34 की अभिव्यक्ति के आधार पर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करता है, जिससे प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के बजाय कॉलम अलगाव की अनुमति मिलती है; यह कोशिका मृत्यु और संदूषण के जोखिम को कम करता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से लामिना का प्रवाह द्वारा मध्यस्थता कतरनी तनाव की भूमिका का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है. वैकल्पिक द्रव दृष्टिकोण को अन्य यांत्रिक संकेतों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए नियोजित करना होगा, जैसे कि खिंचाव या संपीड़न, या अन्य प्रकार के प्रवाह जैसे कि परेशान या परेशान प्रवाह।

हम पहले से पता चला है कि IPSC व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं विषम धमनीशिरापरक सेलुलर पहचान की नकल27 भ्रूण पृष्ठीय महाधमनी 28,29,30 में मनाया है कि इसी तरह. यह पोत विकास और सेलुलर विनिर्देश के संदर्भ में विशेष महत्व का है, जिसे रक्त परिसंचरण द्वारा नियंत्रित किया जाना जाता है। विभिन्न मॉडलों में अध्ययन से पता चला है कि परिसंचरण की कमी के परिणामस्वरूप धमनीशिरापरक विनिर्देश 11,14,31में परिवर्तन होता है। सेल विनिर्देश के साथ यांत्रिक संकेतों को जोड़ने वाले तंत्र अभी भी अज्ञात हैं और यहां वर्णित पाइपलाइन परिष्कृत कार्यात्मक अध्ययनों की अनुमति देती है जिन्हें विवो में परीक्षण नहीं किया जा सकता है।

इस पाइपलाइन उत्पादन और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरल पदार्थ चैनलों का उपयोग hiPSCs से व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं की उत्तेजना का वर्णन करता है, व्यापक रूप से इस्तेमाल polydimethylsiloxane (PDMS) उपकरणों12 के लिए के रूप में उपकरणों कास्टिंग के लिए की आवश्यकता से परहेज. इसके अलावा, पीडीएमएस चिप्स का उपयोग उत्तेजित कोशिकाओं के संग्रह को विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनाता है, जबकि इस प्रोटोकॉल के साथ, कोशिकाओं को आसानी से चैनल से पुनः प्राप्त किया जा सकता है। यह विश्लेषणात्मक शक्ति में काफी सुधार करता है जो बाद के विश्लेषण जैसे प्रोटिओमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री और कार्यात्मक परख के लिए अनुमति देता है, जिसे आगे संस्कृति या विवो परख की आवश्यकता हो सकती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपियन हेमेटोलॉजी एसोसिएशन से रिसर्च एडवांस्ड ग्रांट 2021, अमेरिकन सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी से ग्लोबल रिसर्च अवार्ड 2021 और वेलकम ट्रस्ट और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित आंतरिक रणनीति सहायता कोष ISSF3 द्वारा समर्थित किया गया था। हम फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण में समर्थन के लिए फ्लो साइटोमेट्री सुविधा से फियोना रॉसी को धन्यवाद देते हैं। खुली पहुंच के उद्देश्य के लिए, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (सीसी बाय) लाइसेंस लागू किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 Luer uncoated slide ibidi IB-80186
25% BSA Life Technologies A10008-01
6-well plates Greiner Bio-one 657160
Accutase Life Technologies A1110501 Cited as Dissociation reagent
Ascorbic acid Merck A4544-100G
Aspiration pipette Sardtedt 86.1252.011
B27 supplement Life Technologies 17504044 Cited as Neuronal cell culture supplement (50x)
BD FACS DIVA BD Biosciences Version 8.0.1 Cited as flow cytometry software
BD LSR Fortessa 5 Laser BD Biosciences
bFGF Life Technologies PHG0021
CD34 Microbead kit Miltenyil Biotec 30-046-702
CD34 PE clone 4H11 Invitrogen 12-0349-42
CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 Invitrogen 44-0349-42
Cellstar cell-repellent surface 6-well plates Greiner Bio-one 657970 Cited as cell-repellent plate
CHIR99021 Cayman Chemicals  13122-1mg-CAY
Cryostor CS10  cell cryopreservation Merck C2874-100ML Cited as Cryopreservation solution
Dimethyl Sulfoxide VWR 200-664-3 Cited as DMSO
DMEM/F-12 Life Technologies 10565-018
DPB Ca2+ Mg2+ Life Technologies 14080055
DPBS Life Technologies 14200075
EASY Strainer 40 μm Greiner Bio-one 542040
EDTA Life technologies 15575020
FcR Blocking Reagent Miltenyil Biotec 130-059-901
Fiji Version 1.53c
Flow Jo Version 10.7.1 Cited as flow cytometry sanalysis oftware
FLT3L Peprotech 300-19-10uG
Fluidic unit ibidi 10903
GlutaMax Life Technologies 35050038 Cited as L-glutamine supplement
Ham F-12  Life Technologies 11765054
Holo-transferrin Merk T0665-500MG
Human Serum Albumin Fujifilm UK LTD 9988
Ibidi Pump system ibidi 10902 Cited as Pump system
IMDM Life Technologies 12440053
Inverted microscope ioLight/Thisle Scientific IOL-IO-INVERT Cited as inverted in-incubator microscope
Lyophilised BSA  Merck A2153-100G
MiniMACS Separator Miltenyil Biotec 130-042-102 Cited as Magnetic separator
MS Columns Miltenyil Biotec 130-042-201 Cited as Magnetic column
MTG Merck M6145-25ML
N2 supplement Life Technologies 17502048
Notebook for pump system ibidi 10908
Paraformaldehyde 37-41% Fisher Chemicals F/1501/PB15
Pastette Greiner Bio-one 612398
Pen/Strep Gibco 15070063
Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs Ibidi IB-10964 Cited as Perfusion set
Polystyrene Round Bottom Tubes Falcon 352008 Cited as Flow cytometry tubes
Prism 9 Verison 9.4.0
Pump control software ibidi version 1.6.1 Cited as Pump software
ReLeSR Stem cell tecchonologies 5872 Cited as Detaching solution
rhBMP4 R&D 314-BP-010
rhEPO R&D 287-TC-500
rhIGF1 Peprotech 100-11-100uG
rhIL11 Peprotech 200-11-10uG
rhIL3 Peprotech 200-03-10uG
rhIL6 R&D 206-IL-010
rhLaminin-521 Life technologies A29248 Cited as Laminin
rhSCF Life Technologies PHC2111
rhTPO R&D 288-TPN-025
rhVEGF R&D 293-VE-010
RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile ibidi IB-10830
StemPro-CD34 SFM media Life Technologies 10639011 Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34)
StemPro-CD34 Nutrient Supplement  Life Technologies 10641-025 Cited as 34 nutrient supplement
StemPro hESC SFM Life Technologies A1000701 Cited as Culture media 
StemPro supplement Life Technologies A10006-01
Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated Invitrogen A31804
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 Cited as iRock
β-Mercaptoethanol Gibco 21985023

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References

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