Summary
Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven om endotheelcellen te onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor hun mechanische stimulatie. Dit maakt het mogelijk om de ontwikkelingsmechanobiologie van endotheelcellen te bestuderen. Deze aanpak is compatibel met stroomafwaartse assays van levende cellen die na mechanische stimulatie uit de kweekchip zijn verzameld.
Abstract
Het hart is het eerste orgaan dat tijdens de ontwikkeling functioneel tot stand komt, waardoor de bloedcirculatie al heel vroeg in de zwangerschap op gang komt. Naast het transporteren van zuurstof en voedingsstoffen om de groei van de foetus te garanderen, regelt de foetale circulatie veel cruciale ontwikkelingsgebeurtenissen die plaatsvinden in de endotheellaag door middel van mechanische signalen. Biomechanische signalen induceren structurele veranderingen in bloedvaten, stellen arterioveneuze specificatie vast en regelen de ontwikkeling van hematopoëtische stamcellen. De ontoegankelijkheid van de zich ontwikkelende weefsels beperkt het begrip van de rol van de bloedsomloop in de vroege menselijke ontwikkeling; Daarom zijn in-vitromodellen cruciale hulpmiddelen voor de studie van vaatmechanobiologie. Dit artikel beschrijft een protocol om endotheelcellen te onderscheiden van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun daaropvolgende zaaien in een fluïdisch apparaat om hun reactie op mechanische signalen te bestuderen. Deze aanpak maakt het mogelijk om endotheelcellen op lange termijn te kweken onder mechanische stimulatie, gevolgd door het ophalen van de endotheelcellen voor fenotypische en functionele karakterisering. Het hier vastgestelde in-vitromodel zal een belangrijke rol spelen bij het ophelderen van de intracellulaire moleculaire mechanismen die de signalering transduceren die wordt gemedieerd door mechanische signalen, die uiteindelijk de ontwikkeling van bloedvaten tijdens het leven van de menselijke foetus orkestreren.
Introduction
Tijdens de embryonale ontwikkeling is het hart het eerste orgaan dat functionaliteit1 tot stand brengt, met detecteerbare samentrekkingen vanaf het vroegste stadium van de vorming van endocardiale buizen2. De bloedsomloop, samen met de mechanische signalen die worden gemedieerd door de bloedstroom in het vat, regelt veel cruciale aspecten van de vroege ontwikkeling. Voorafgaand aan de vestiging van de foetale circulatie is het vaatstelsel georganiseerd in een primaire capillaire plexus; Bij het functioneren van het hart reorganiseert deze plexus zich in veneuze en arteriële vasculatuur3. De rol van mechanische signalen in arterioveneuze specificatie wordt weerspiegeld door de pan-endotheliale expressie van arteriële en veneuze markers voordat de bloedstroom op gang komt4.
Hemodynamische krachten regelen niet alleen de ontwikkeling van het vaatstelsel zelf, maar spelen ook een fundamentele rol bij de controle van de vorming van bloedcellen. Hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) komen voort uit gespecialiseerde endotheelcellen, hemogeen endotheel 5,6,7,8 genaamd, die uitsluitend in het vroege ontwikkelingsstadium in verschillende anatomische regio's van de embryo's aanwezig zijn. Hartdeficiënte modellen, samen met in vitro modellen, hebben aangetoond dat mechanische signalen de HSPC-productie van het hemogene endotheel 9,10,11,12,13,14 instrueren en verhogen.
Van verschillende soorten stromingsdynamica is aangetoond dat ze de celcyclus differentieel regelen 15, waarvan bekend is dat ze belangrijk zijn in zowel hemogeen endotheel16,17 als arteriële celspecificatie18. Al met al zijn mechanische signalen cruciale determinanten van celidentiteit en -functie tijdens de ontwikkeling. Nieuwe in vitro fluïdische apparaten stellen ons in staat om de beperkingen te overwinnen die gepaard gaan met het bestuderen van ontwikkelingsmechanobiologie tijdens de ontwikkeling van menselijk bloed in vivo.
Het algemene doel van het protocol in dit manuscript is om stap voor stap de experimentele pijplijn te beschrijven om het effect van schuifspanning op menselijke endotheelcellen te bestuderen die in vitro zijn afgeleid van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). Dit protocol bevat gedetailleerde instructies over de differentiatie van hiPSC's in endotheelcellen en hun daaropvolgende zaaien in fluïdische chips voor het stimulatieprotocol. Hiermee kunnen verschillende in vitro afgeleide endotheelcellen worden getest op hun vermogen om de schuifspanning te detecteren door hun oriëntatie als reactie op de stroom te analyseren. Dit zal andere laboratoria in staat stellen om vragen te beantwoorden over de reactie op schuifspanning en de functionele gevolgen ervan voor verschillende endotheelcelidentiteiten.
Protocol
OPMERKING: Alle celkweektechnieken moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroomkap en cellen moeten worden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 . Instructies voor alle cytokinepreparaten voor zowel onderhoud (rhbFGF) als voor het differentiatieprotocol (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) staan in aanvullende tabel S1.
1. Kweken van hiPSC's - ontdooien, onderhouden en invriezen van cellen
- Bereiding van onderhoudsmedium, groeifactoren en andere reagentia
- Bereid het kweekmedium voor door het hele hESC's serumvrije mediumsupplement, 36 ml van 25% runderserumalbumine (BSA) en 1 ml van 55 mM β-mercaptoethanol toe te voegen aan Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) basaal medium (zie materiaaltabel).
- Resuspendeer 1 mg Rho Kinase-remmer (iRock) in 1 ml DMSO, maak aliquots van 50 μL en bewaar deze bij -20 °C.
OPMERKING: Deze aliquots kunnen gedurende 1 jaar bij -20 °C worden bewaard. Eenmaal ontdooid zijn ze 1 week houdbaar bij 4 °C. - Ontdooi de vitronectine (VTN-N)-oplossing op ijs en aliquot 60 μL per injectieflacon voordat u het bij -80 °C bewaart. Verdun vlak voor het coaten van de platen de 60 μL bouillon in 6 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS); de eindconcentratie van 5 μg/ml.
- hiPSC-cellijn ontdooien
OPMERKING: De menselijke pluripotente stamcellijn SFCi55 werd eerder in eigen huis afgeleid en op grote schaal gebruikt voor differentiatie in verschillende celtypen en verschillende embryonale lijnen 19,20,21,22.- Smeer een putje van een plaat met 6 putjes in met 1 ml VTN-N-oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Na incubatie kunnen gecoate platen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard. - Zuig de VTN-N-oplossing op met een aspiratiepipet en voeg 1 ml voorverwarmd kweekmedium toe, aangevuld met 20 ng/ml rhbFGF (aanvullende tabel S1).
- Ontdooi de injectieflacon met de hiPSC's snel in een waterbad en breng de cel over in 5 ml voorverwarmd kweekmedium.
- Draai de cellen 3 minuten op 300 × g bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de celpellet in 0,5 ml kweekmedium aangevuld met 20 ng/ml rhbFGF.
- Breng de cellen over naar een gecoat putje dat al 1 ml medium bevat.
- Voeg 5 μL iRock toe aan de putjes met de cellen in een totaal van 1,5 ml medium.
- Kweek de cellen in de couveuse, vervang het medium dagelijks gedurende de week en voer de cellen dubbel, waarbij u twee keer het normale volume medium aan de cellen toevoegt om ervoor te zorgen dat u in het weekend wordt gevoed.
OPMERKING: Cellen worden slechts 24 uur in aanwezigheid van iRock gekweekt.
- Smeer een putje van een plaat met 6 putjes in met 1 ml VTN-N-oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Onderhoud en doorgifte van hiPSC's
- Vervang het medium dagelijks met vers voorverwarmd kweekmedium aangevuld met 20 ng/ml rhbFGF.
- Passeer de cellen wanneer ze ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, meestal twee keer per week.
- Om de cellen te passeren, bedek je een plaat met VTN-N zoals eerder beschreven in de stappen 1.2.1 en 1.2.2.
- Zuig het medium uit de putjes op met cellen en was ze met DPBS.
- Zuig het DPBS op en voeg 1 ml dissociatiereagens toe (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 minuut.
- Zuig het dissociatiereagens op en incubeer nog eens 3 minuten. Tik 10 keer stevig op de plaat aan elke kant.
OPMERKING: Voor de dissociatiestap moet mogelijk celtypespecifieke optimalisatie nodig zijn in de incubatietijd en de tapprocedure. - Voeg 1 ml kweekmedium toe aan de cellen en was met een pasteurpipet eenmaal met het medium om ervoor te zorgen dat de meeste kolonies worden opgevangen.
- Voeg 150 μL van de celsuspensie toe aan elk putje om een doorgangsverhouding van 1 putje op 6 te verkrijgen.
OPMERKING: Onmiddellijk na het ontdooien van een nieuwe injectieflacon is het beter om de cellen in een lagere verhouding te passeren, zoals 1:1 of 1:2 voor een of twee passages, zodat ze een gestage groeifase kunnen bereiken voordat ze passeren in een verhouding van 1:6. - Kweek de cellen in de couveuse, vervang het medium dagelijks gedurende de week en voer de cellen één keer dubbel in het weekend.
- hiPSC's cellijn bevriezen
OPMERKING: Vries de cellen in de eerste twee passages na het ontdooien in om ervoor te zorgen dat er een constante lage doorgangsbatch van bevroren injectieflacons blijft om de kweek te starten. Bevries de cellen wanneer ze een samenvloeiing van ongeveer 80% bereiken.- Vervang het medium door vers voorverwarmd kweekmedium aangevuld met 20 ng/ml rhbFGF en 5 μL iRock en incubeer gedurende ten minste 1 uur.
- Maak de cellen los zoals beschreven in de stappen 1.3.2.2-1.3.2.5.
- Verzamel de losgemaakte cellen in een centrifugebuisje van 15 ml met 5 ml kweekmedium.
- Centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 × g bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatans op en voeg 1 ml cryopreservatieoplossing toe (zie Materiaaltabel).
- Gebruik een pasteurpipet om de cellen voorzichtig op en neer te pipetten om ze in de cryopreservatie-oplossing te mengen.
OPMERKING: Vermijd overmatig pipetteren, dit kan leiden tot dissociatie van de celclusters. - Verdeel de celsuspensie in twee cryopreservatieflacons van elk 0,5 ml.
- Breng de cryopreservatieflacons over in een cryopreservatiecontainer die is voorgekoeld bij 4 °C.
- Breng de container met de cellen gedurende 24 uur over naar een vriezer van -80 °C voordat u de injectieflacons overbrengt naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
2. Differentiatie van hiPSC's in endotheelcellen
- Bereiding van differentiatiemedium, cytokines en groeifactoren
- Bereid serumvrij differentiatiemedium (SFD) volgens tabel 1. Gebruik dit medium van dag 0 tot dag 5 van differentiatie.
- Bereid serumvrij medium voor CD34+ -cellen (SFM-34) door 34 voedingssupplementen en 5 ml L-glutaminesupplement toe te voegen aan het 34 SFM Basal Medium (zie materiaaltabel). Gebruik dit medium vanaf dag 6 van differentiatie.
- Resuspendeer 1 mg CHIR99021 in 716 μL DMSO om een oplossing van 3 mM te verkrijgen. Incubeer bij kamertemperatuur tot het volledig geresuspendeerd is; indien nodig snel opwarmen bij 37 °C. Maak aliquots van 20 μl en bewaar ze maximaal 6 maanden bij -20 °C. Direct na ontdooien gebruiken en niet opnieuw invriezen of bewaren.
- Resuspendeer de cytokines volgens de instructies in aanvullende tabel S1. Bewaar de aliquots van alle cytokines bij -80 °C.
- Differentiatie van endotheelcellen
OPMERKING: Bereid voor elke dag van de differentiatie 18 ml (3 ml medium/well) voorverwarmd SFD-medium, volgens de cytokinemengsels beschreven in Tabel 2.- Dag 0 - vorming van embryoïde lichamen (EB's)
- Bereid 18 ml SFD-medium met Mix 1 cytokine volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje).
- Voeg 2 ml voorverwarmd SFD-medium met Mix 1 cytokine toe in elk putje van een celafstotende plaat met 6 putjes (zie Materiaaltabel).
- Om EB's te vormen, volgt u de stappen die worden beschreven in de stappen 1.3.2.2-1.3.2.4.
NOTITIE: Zorg ervoor dat hiPSC's voor 70-80% samenvloeiend zijn om de differentiatie te starten. - Voeg 1 ml voorverwarmd SFD-medium met Mix 1 cytokines toe aan elk putje van losgemaakte celclusters.
- Gebruik een pasteurpipet om de celclusters voorzichtig over te brengen in een enkel putje met celafstotend putje voor EB-vorming in een verhouding van 1:1.
- Nadat u de plaat in de couveuse hebt geplaatst, beweegt u deze naar voren en naar achteren, naar rechts en naar links, om de EB's gelijkmatig in de put te verdelen.
- Dag 1 - gemiddelde verandering in de EB's
OPMERKING: Deze stap is alleen nodig als er op dag 1 van de differentiatie veel afzonderlijke cellen in suspensie zijn naast de EB's.- Bereid 18 ml SFD-medium met Mix 1 cytokine volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje).
- Draai de plaat met de EB's om ze naar het midden te verplaatsen en vang ze op met een pasteurpipet in een centrifugebuis van 15 ml.
OPMERKING: Als de EB's er samengeklonterd uitzien zoals in strings, scheid ze dan door ze op en neer te pipetteren met een P1000 voordat u ze opvangt in de centrifugebuis van 15 ml. - Wacht 5-10 minuten totdat de EB's zich op de bodem van de buis hebben genesteld.
OPMERKING: Als de EB's te klein zijn, centrifugeer ze dan 5 minuten op 100 × g om ze te helpen bezinken. - Was de celafstotende platen met steriel water of DPBS om losse cellen of vuil te verwijderen.
- Zuig het supernatans voorzichtig en langzaam op uit de EB's zonder ze los te maken.
- Voeg 2 ml SFD met Mix 1 cytokines toe aan elk putje van de celafstotende platen.
- Resuspendeer de EB's met 1 ml SFD-medium met Mix 1 cytokines voor elk startputje - voeg voor een plaat met 6 putjes 6 ml medium toe.
- Breng de EB's over naar de celafstotende platen in 1 ml volume per putje, dat al 2 ml SFD-medium bevat.
- Nadat u de plaat in de couveuse hebt geplaatst, beweegt u deze naar voren en naar achteren, naar rechts en naar links, om de EB's gelijkmatig in de put te verdelen.
- Dag 2 - toevoeging van CHIR99021
- Draai de EB's in het midden van de plaat en voeg CHIR99021 volgens tabel 2 toe aan de zijkant van het putje om direct contact met de cellen te voorkomen.
OPMERKING: Als het medium op dag 1 niet is gewijzigd, vervang dan het hele medium in plaats van alleen CHIR toe te voegen. Bereid 18 ml SFD-medium met Mix 2 volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje). - Nadat u de plaat in de couveuse hebt geplaatst, beweegt u deze naar voren en naar achteren, naar rechts en naar links, om de EB's gelijkmatig in de put te verdelen.
- Draai de EB's in het midden van de plaat en voeg CHIR99021 volgens tabel 2 toe aan de zijkant van het putje om direct contact met de cellen te voorkomen.
- Dag 3 - gemiddelde verandering in de EB's en toevoeging van Mix 3-cytokines
- Bereid 18 ml SFD-medium met Meng 3 cytokines volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje).
- Verzamel de EB's zoals beschreven in de stappen 2.2.2.2-2.2.2.4.
- Voeg voorverwarmde 2 ml SFD-medium met Mix 3 cytokines toe aan de celafstotende platen.
- Zuig het supernatans voorzichtig op uit de EB's. Voeg 1 ml/putje SFD toe met Meng 3 cytokines.
- Verdeel de EB's over de putten zoals beschreven in de stappen 2.2.2.8-2.2.2.9.
- Dag 6 - gemiddelde verandering voor SFM-34 en toevoeging van Mix 4-cytokines
- Bereid 18 ml SFD-medium met Meng 4 cytokines volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje).
- Verzamel de EB's zoals beschreven in de stappen 2.2.2.2-2.2.2.4.
- Voeg 2 ml voorverwarmd SFM-34 medium met Mix 4 cytokines toe aan de celafstotende platen.
- Zuig het supernatans voorzichtig op uit de EB's. Voeg 1 ml/putje SFM-34 toe met Mix 4 cytokines.
- Verdeel de EB's over de putten zoals beschreven in de stappen 2.2.2.8-2.2.2.9.
- Dag 0 - vorming van embryoïde lichamen (EB's)
3. CD34+ cellen isolatie en seeding in de chip
OPMERKING: CD34+ -cellen worden geïsoleerd via een positieve isolatiebenadering met een CD34-microbeadkit (zie Materiaaltabel), die CD34-microbeads bevat die zijn geconjugeerd aan monoklonale muisantilichamen, anti-menselijke CD34-antilichamen en FcR-blokkerend reagens (Human IgG). Het is belangrijk om de efficiëntie van de kolomisolatie te valideren door cellen voor en na de isolatie te kleuren voor flowcytometrie-analyse, Hieronder wordt aangegeven wanneer cellen moeten worden genomen voor deze analyse.
- Bereid materialen en reagentia voor.
- Bereid de wasbuffer voor door 5 ml 5% BSA-oplossing en 200 μl EDTA 0,5 M toe te voegen aan 45 ml DPBS om PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA te verkrijgen. Bereid vers voor elke isolatie, filter en steriliseer en bewaar gekoeld tot gebruik.
- Smeer de fluïdische spaanders in met een laminineoplossing die is bereid door rhLaminin 521 1:50 te verdunnen in DPBS Ca 2+ Mg2+. Smeer elke chip in met het juiste volume voor de gebruikte chip en incubeer 2 uur voor het zaaien in de incubator.
OPMERKING: Andere matrices kunnen worden gebruikt voor de coating en moeten worden getest voor het specifieke celtype/experiment. - Bereid Mix 4 SFM-34 medium voor door 18 ml SFM-34 medium aan te vullen met Mix 4 cytokines volgens tabel 2 en plaats het mengsel in een buis van 50 ml in de incubator met het deksel iets losgeschroefd om de gasuitwisseling te vergemakkelijken.
- Plaats de geselecteerde perfusiesets en eventuele andere te gebruiken slangen in de incubator om te ontgassen.
- Dag 8 - dissociatie van EB's en CD34+ isolatie
- Verzamel de EB's zoals beschreven in de stappen 2.2.2.2-2.2.2.5.
- Voeg 1 ml celdissociatiereagens toe per startputje van verzamelde EB's (als er 6 putjes zijn verzameld, voeg dan 6 ml toe).
- Breng 1 ml van de EB-suspensie in het celdissociatiereagens terug naar elk putje van de celafstotende plaat.
- Incubeer gedurende 10 minuten in de couveuse.
- Pipeteer de EB's voorzichtig op en neer tegen de put met een P1000, niet meer dan 10 keer.
- Herhaal stap 3.2.4-3.2.5.voor een totaal van 3x.
LET OP: Als de EB's moeilijk te scheiden zijn, herhaal dan de bovenstaande stappen in totaal 4x. - Voeg 5 ml wasbuffer toe voor elk putje gedissocieerde EB's.
- Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 50 ml door ze door een zeef van 40 μm te halen. Neem 10 μL van de celsuspensie om de cellen te tellen.
OPMERKING: Om de efficiëntie van de isolatie te testen, brengt u 10 cellen/buis van5 over in twee verschillende buizen (ongekleurde controle- en voorgesorteerd testmonster) die later zullen worden gebruikt voor flowcytometrie (zoals beschreven in stappen 4.3.9-4.3.13). Voor een plaat met 6 putjes moeten ~106 cellen worden verzameld na filtratie. - Draai de cellen gedurende 10 minuten rond op 300 × g.
- Resuspendeer de cellen in 300 μL wasbuffer en pipetter een paar keer voorzichtig om er zeker van te zijn dat er geen klonten aanwezig zijn. Blijf het protocol van de fabrikant volgen (zie Materiaaltabel).
- CD34+ cel seeding in fluïdische chips
OPMERKING: De fluïdische chip die in het protocol wordt gebruikt, heeft een kanaalhoogte van 0,6 mm en een lengte van 50 mm, voor een totaal groeioppervlak van 2,5cm2 (aanvullende afbeelding S1). Dit type chip wordt gezaaid met een totaal volume celsuspensie van 150 μL. Er kunnen verschillende chips worden gebruikt en het volume van het zaaien en de celdichtheid moeten worden aangepast aan het groeigebied. Aanvullende optimalisatie kan nodig zijn, afhankelijk van de gebruikte cellijn en de groei ervan.- Resuspendeer de geïsoleerde CD34+ -cellen in 300 μL voorverwarmd SFM-34-medium met Mix 4-cytokines.
- Neem 10 μL van de celsuspensie en tel de cellen.
- Resuspendeer 2,5 × 105 cellen in een eindvolume van 150 μL aangevuld SFM-34; voeg 0,5 μL iRock toe.
OPMERKING: Om de efficiëntie van de isolatie te testen, brengt u 105 cellen/buis over in een buis (nagesorteerd testmonster) die later zal worden gebruikt voor flowcytometrie (zoals beschreven in de stappen 4.3.9-4.3.13). - Zuig het laminine langzaam op uit fluïdische chips door de punt van een P200 in het reservoir aan de rand van het kanaal te plaatsen.
NOTITIE: Als de vloeistof moeilijk te verzamelen is, til dan langzaam een kant van de chip op om de vloeistof naar het tegenoverliggende reservoir te laten gaan. - Voeg de celsuspensie gestaag toe aan het kanaal om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen ontstaan.
OPMERKING: Voer de stappen 3.3.4-3.3.5 snel maar voorzichtig uit om uitdroging van het laminaat en de vorming van luchtbellen in de kanalen van de chip te voorkomen. Als er luchtbellen worden gevormd, tilt u een kant van de chip op en tikt u zachtjes op de schuif om de bellen te mobiliseren; Wanneer ze het reservoir bereiken, stijgen ze naar de luchtinterface en zouden ze het kanaal niet moeten kunnen huren. - Breng de chip over naar de incubator en laat ze een nacht staan, zodat de cellen volledig aan het kanaal vastzitten en er langwerpig uitzien.
- Wanneer de cellen volledig zijn gehecht, zuigt u het medium op zoals in stap 3.3.4 en vervangt u het door 200 μl cytokine-aangevuld SFM-34.
- Vervang vanaf nu dagelijks het medium totdat de cellen 90%-100% samenvloeiing hebben bereikt.
4. Toepassing van continue stroom op endotheelcellen - Aorta-op-een-chip
- Bereid materialen en reagentia voor.
- Bereid Mix 4 SFM-34 medium voor door 18 ml SFM-34 medium aan te vullen met Mix 4 cytokines volgens tabel 2 en plaats het in een buis van 50 ml in de incubator met het deksel iets losgeschroefd om de gasuitwisseling te vergemakkelijken.
- Plaats de geselecteerde perfusiesets en eventuele slangen die moeten worden gebruikt voor de fluïdische opstelling in de incubator om te ontgassen.
- Fluidic systeem assemblage
- Installeer de perfusieset in het apparaat volgens het protocol van de fabrikant.
NOTITIE: Vergeet niet om klemmen in het systeem te gebruiken. Als voor deze stap schuifklemmen worden gebruikt, moeten deze op de slang worden geschoven voordat ze op de chip worden aangesloten. - Bevestig een nieuwe fluïdische chip en voeg het cytokine-gesupplementeerde SFM-34-medium toe, waarbij u ervoor zorgt dat beide reservoirs onder steriele omstandigheden in de kap worden gevuld.
- Voer het programma voor het verwijderen van luchtbellen en de kalibratiestap uit.
- Verwijder de vloeistofunit met de aangesloten set uit de couveuse en breng deze over in de kap; Neem ook de chips met de cellen uit de incubator.
- Klem de slang aan beide zijden van de testchip.
- Verwijder de slang van de testchip.
NOTITIE: Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn in de Luer-connector aan het uiteinde van de slang. Als er luchtbellen zichtbaar zijn, zuig ze dan voorzichtig op met een P200-pipet en voeg indien nodig meer medium toe om ervoor te zorgen dat de connector gevuld is met medium. - Verbind de chip met de cellen met de slang.
- Verwijder of open de clamps.
- Breng het systeem over naar de incubator en sluit de luchtpomp aan op de vloeistofunit.
- Start het voorgeselecteerde programma met behulp van de pompspecifieke software (aanvullende afbeelding S2) met de geleidelijke toename van de schuifspanning zoals beschreven in tabel 3.
OPMERKING: Afhankelijk van het specifieke experiment dat nodig is, moet het stimulatieprogramma mogelijk worden geoptimaliseerd. Hier wordt een geleidelijke toename van de schuifspanning beschreven die leidt tot de uiteindelijke waarde van 5 dyn/cm2, die de schuifspanning nabootst die wordt berekend om te worden ervaren door de wand van de dorsale aorta bij het begin van de foetale circulatie 9. Onafhankelijk van de uiteindelijke schuifspanning die zal worden gebruikt, is het noodzakelijk om in de loop van de tijd geleidelijk toe te nemen om de cellen in staat te stellen zich aan de kracht aan te passen zonder dat de cellen loskomen van de chip. Als het geselecteerde stimulatieprotocol langer dan 3 dagen duurt, moeten cytokinen in het systeem worden aangevuld door 1 ml SFM-34 toe te voegen met de Mix 4-cytokines die normaal gesproken aan 18 ml zouden worden toegevoegd. Om dit te doen, wordt het pompprogramma snel gepauzeerd en wordt 500 μL bijgevuld medium toegevoegd aan elk van de twee spuiten in de fluidic set.
- Installeer de perfusieset in het apparaat volgens het protocol van de fabrikant.
- Celverzameling voor analyse
- Verwarm de dissociatiebuffer voor in een waterbad.
- Haal de vloeistofunit uit de couveuse en plaats deze in de kap.
- Klem de slang aan beide zijden naast de chip vast en verwijder de slang van de reservoirs op de chip.
- Verwijder voorzichtig het medium van de chip en vervang het door DPBS Ca 2+ Mg2+ om de cellen te wassen.
NOTITIE: Deze stap van het wassen met PBS kan worden overgeslagen als de cellen beginnen los te laten. - Voeg voorzichtig 150 μL dissociatiebuffer toe en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C.
NOTITIE: Controleer onder de microscoop of de cellen enkelvoudig en losstaand zijn; anders nog 2 minuten incuberen. Het is van essentieel belang dat de cellen volledig van het kanaal worden losgemaakt voordat het medium wordt opgezogen, omdat de chip niet kan helpen bij het losmaken van de cellen door pipetteren. Andere oplossingen kunnen worden gebruikt om de cellen los te maken, zoals trypsine of op EDTA gebaseerde buffers. - Verzamel de dissociatiebuffer met de cellen uit één reservoir en breng over naar een centrifugebuis van 15 ml en was het kanaal eenmaal met DPBS om alle losgemaakte cellen te verzamelen.
- Voeg 1 ml wasbuffer toe aan de 15 ml buis met de cellen en neem 10 μl om de cellen te tellen.
- Verdeel de celsuspensie in flowcytometriebuisjes om 105 cellen per reageerbuis te hebben.
- Draai de buisjes 5 minuten rond op 300 × g.
- Bereid de kleuroplossing voor op 50 μl voor elke reageerbuis om te kleuren. Voeg de CD34 PerCP-efluor710 of CD34-PE toe in een verdunning van respectievelijk 1:100 en 1:200.
- Resuspendeer de cellen in 50 μl kleuroplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Was de cellen door 2 ml wasbuffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g.
- Resuspendeer de pellets in 100 μL kleuroplossing en verkrijg de gegevens met behulp van een flowcytometer.
OPMERKING: De cellen kunnen ook rechtstreeks in de chip worden gelyseerd voor RNA-extractie met behulp van 150 μL RNA-lysisbuffer of worden gefixeerd voor beeldvorming met behulp van 4% paraformaldehyde in DPBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Analyse van de celoriëntatie
- Analyseer de beelden om veranderingen in celoriëntatie te kwantificeren met behulp van FIJI23 (aanvullende afbeelding S3).
- Open de manager Interessegebied (ROI) vanuit de knop Analyseren | Gereedschap | Menu ROI-manager .
- Teken de celcontouren handmatig met behulp van het gereedschap voor het selecteren van polygonen en voeg ze toe aan de ROI-manager door op Toevoegen te klikken of de sneltoets CTRL+T te gebruiken.
- Meet de oriëntatie van elke ROI door de ellips Fit te kiezen in de Analyseren | Menu Afmetingen instellen .
- Pas de meting toe op alle ROI's via de Meer... Opdracht voor meerdere metingen in de ROI-manager.
OPMERKING: Met deze stap past een ellips op elke ROI en wordt een tabel gegenereerd met de lengte van de hoofd- en secundaire ellipsassen, evenals de hoek. - Exporteer de tabel naar een CSV-bestand om in andere software te worden geïmporteerd om te plotten.
OPMERKING: Het script dat voor de plots wordt gebruikt, is beschikbaar op https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf885
0ddc.
- Analyseer de beelden om veranderingen in celoriëntatie te kwantificeren met behulp van FIJI23 (aanvullende afbeelding S3).
Representative Results
We beschrijven hier een protocol voor de differentiatie en mechano-stimulatie van endotheelcellen afgeleid van hiPSC's dat de studie van hun reactie op mechanische signalen mogelijk maakt (Figuur 1). Dit protocol resulteert in de productie van functioneel mechanosensitieve endotheelcellen. We geven hier representatieve resultaten en beschrijven het verwachte fenotype om te beoordelen hoe de cellen reageren op de cytokinestimulatie tijdens de differentiatie.
Figuur 1: Schema van het differentiatie- en mechanische stimulatieprotocol. Schema van het differentiatieprotocol met de timing van de verschillende mengsels van cytokines, de CD34+- celisolatie, het zaaien van fluïdische chips en de uiteindelijke analyse van de mechanisch gestimuleerde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Cultuur van hiPSC's
Het is belangrijk om het protocol te starten vanaf hiPSC's die correct groeien in zelfvernieuwende omstandigheden. Een goede indicatie van de kwaliteit van de cultuur is de snelheid van hun groei. Na het ontdooien hebben de cellen mogelijk 2-3 weken nodig om de juiste groeifase te bereiken die zorgt voor een goede differentiatie. Wanneer de cellen twee keer per week kunnen worden gepasseerd in een verhouding van 1:6 en bijna volledige samenvloeiing bereiken, is dit het moment dat ze klaar zijn om te worden gedifferentieerd op dezelfde dag dat ze moeten worden gepasseerd.
Differentiatie van hiPSC's in endotheelcellen
De eerste stap van de differentiatie, bestaande uit de vorming van embryoïde lichamen (EB's), is afhankelijk van de cellijn en moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor de specifieke cellijn die wordt gebruikt. De in protocolstappen 1.3.2.2-1.3.2.4 beschreven dissociatie kan worden gewijzigd door de incubatie met het dissociatiereagens te verminderen of te verlengen en de daaropvolgende dissociatie met de pasteurpipet. Bovendien kunnen voor deze stap andere dissociatiereagentia worden gebruikt, naast de fysieke dissociatie van de kolonies met een snijgereedschap of een P100-pipetpunt. EB's van goede kwaliteit vertonen een gedefinieerde rand op dag 2 van de differentiatie en zien er helder en helder uit wanneer ze met een microscoop worden waargenomen; donkere gebieden kunnen duiden op celdood binnen de EB's (Figuur 2).
Figuur 2: Morfologie van embryoïde lichamen. (A) Dag 2 embryoïde lichamen met goed gedefinieerde buitenranden en consistente grootte. (B) Dag 2: embryoïde lichamen van slechte kwaliteit die uitgebreide celdood vertonen, wat leidt tot desaggregatie van de structuur. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Op dag 2 remt de toevoeging van CHIR99021 aan de EB's het GSK-3-eiwit, wat resulteert in de activering van de Wnt-route. Verschillende cellijnen reageren verschillend op CHIR-behandeling, en dit moet worden getest door het aantal CD34+- cellen dat op dag 8 is verkregen te kwantificeren met behulp van verschillende concentraties (Figuur 3).
Figuur 3: Endotheelceldifferentiatie met verschillende CHIR-behandelingen. Betrokkenheid van endotheelcellen gekwantificeerd door flowcytometrie op dag 8 van differentiatie door CD34-membraanexpressie, na CHIR-behandeling op dag 2 bij (A) 3 μM, (B) 5 μM en (C) 7 μM. Flowcytometriegegevens werden verkregen met behulp van vijflasercytometers en speciale software (zie Materiaaltabel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
CD34+ cel isolatie
Het is belangrijk om te valideren dat de CD34+ verrijking met behulp van de magnetische kralen ten minste 80% CD34+ levert na elutie van de kolom. Om voldoende zuiverheid te garanderen, kan een aliquot van cellen verkregen uit de magnetische isolatie worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie, waarbij ervoor wordt gezorgd dat een andere antilichaamkloon wordt gebruikt dan degene die wordt gebruikt voor de magnetische verrijking. Hier werd de 4H11-kloon gebruikt en werd ~85% zuiverheid bereikt na verrijking (Figuur 4).
Figuur 4: Membraanexpressie van CD34 voor en na verrijking door magnetische sortering. Dag 8 gedissocieerde embryoïde lichamen (grijs) en cellen na magnetische verrijking (groen) werden gekleurd voor CD34-expressie en geanalyseerd door middel van flowcytometrie, wat een succesvolle verrijking na sortering aantoonde. Flowcytometriegegevens werden verkregen met behulp van vijflasercytometers en speciale software (zie Tabel met materialen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Cellen zaaien in het fluïdische kanaal
Bij het zaaien van de cellen in het fluïdische kanaal is het cruciaal om de adhesie en proliferatie van de endotheelcellen te volgen. Na het zaaien hebben de cellen ~5 uur nodig om zich volledig aan het kanaal te hechten (Figuur 5A). In dit stadium kan ook een alternatieve coatingoplossing worden getest om de hechting te verbeteren. Om te bevestigen dat de geteste cellen mechanosensitief zijn en dus in staat zijn om te reageren op mechanische stimulatie, kan de celoriëntatie in de loop van de tijd worden getest. Cellen vóór de stimulatie vertonen een willekeurige oriëntatie (Figuur 5A en Figuur 5C) en heroriënteren zich evenwijdig aan de stroomrichting (Figuur 5B,C). Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om de cellen uit het kanaal te verzamelen om stroomafwaartse analyses uit te voeren, bijvoorbeeld flowcytometrie, voor de studie van hun membraanimmunofenotype, waarbij de endotheelidentiteit van de gestimuleerde cellen wordt verkregen (Figuur 5D,E).
Figuur 5: Mechanoresponsiviteit van van hiPSC's afgeleide endotheelcellen . (A) Confluente laag van geïsoleerde CD34+ -cellen 48 uur na het zaaien. (B) Geheroriënteerde laag endotheelcellen 3 dagen onder dynamische kweek. (C) Oriëntatieanalyse van de endotheelcellen na 5 dagen dynamische kweek. (D) CD34-expressieprofiel van cellen die gedurende 5 dagen onder stroom zijn gekweekt. (E) Percentage CD34+- cellen van de celpopulatie dat uit het fluïdische kanaal is gehaald. De beelden werden gemaakt met behulp van een omgekeerde in-incubator microscoop; flowcytometriegegevens werden verkregen met behulp van vijflasercytometers en speciale software (zie Materiaaltabel). Schaalbalken = 100 μm (A,B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagentia | Concentratie van de voorraad | Volume toegevoegd | Definitieve concentratie |
| Iscove's gemodificeerde Dulbecco's Medium (IMDM) | - | 333 ml | - |
| Ham's F-12 Voedingsmengsel (F-12) | - | 167 ml | - |
| N-2 supplement (100x) | 100 x | 5 ml | 1x |
| B-27 supplement (50x) | 50 x | 10 ml | 1x |
| Ascorbinezuur | 10 mg/ml | 1,25 ml | 25 μg/ml |
| α-monothioglycerol (MTG) | 11,5 m boven NN | 19,5 μL | 448,5 μM |
| Humaan serumalbumine | 100 mg/ml | 2,5 ml | 0,5 mg/ml |
| Holo-Transferrin | 100 mg/ml | 0,75 ml | 150 μg/ml |
Tabel 1: Samenstelling en recept voor 500 ml serumvrij differentiatiemedium (SFD).
| Dagen van differentiatie | Cytokine Mix | Cytokine | Definitieve concentratie |
| Dag 0 - 2 | Mengen 1 | BMP4 | 20 ng/ml |
| Dag 2 | Mengen 2 | CHIR99021 | 7 μM |
| Vanaf dag 3 | Mix 3 en 4 | VEGF | 15 ng/ml |
| bFGF | 5 ng/ml | ||
| Vanaf dag 6 | Mengen 4 | IL6 | 10 ng/ml |
| FLT3L | 10 ng/ml | ||
| IGF1 | 25 ng/ml | ||
| IL11 | 5 ng/ml | ||
| SCF | 50 ng/ml | ||
| EOB | 3 E/ml | ||
| TPO | 30 ng/ml | ||
| IL3 | 30 ng/ml |
Tabel 2: Mengsels van cytokinen die worden gebruikt voor endotheelceldifferentiatie, dagen waarop ze aan het SFD-medium worden toegevoegd en uiteindelijke concentratie.
| Schuifspanning (dyn/cm2) | Tijd (h) |
| 0.5 | 1 |
| 1 | 1 |
| 1.5 | 1 |
| 2 | 1 |
| 2.5 | 1 |
| 3 | 1 |
| 3.5 | 1 |
| 4 | 1 |
| 4.5 | 1 |
| 5 | Tot het einde van het experiment |
Tabel 3: Schuifspanningswaarden voor de dynamische cultuur en de duur van hun toepassing.
Aanvullende afbeelding S1: Geometrie en afmetingen van de chip en de slang die voor dit protocol worden gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding S2: Stap-voor-stap handleiding voor de software die de luchtpomp aanstuurt met een beschrijving van elke stap. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Leidraad voor de oriëntatieanalyse met behulp van FIJI met de tekening van de celvorm, de elliptische aanpassing en de eindmeting. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Eenheidsgrootte, resuspensievolume en voorraadconcentraties voor cytokines die in het differentiatieprotocol worden gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het protocol dat we hier beschrijven, maakt het mogelijk om mechanosensitieve endotheelcellen te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen en hun reactie op mechanische stimulatie te bestuderen die wordt gemedieerd door gecontroleerde schuifspanning. Dit protocol is volledig gebaseerd op cytokines en volledig compatibel met GMP-reagentia voor mogelijke vertaling in de productie van cellen voor celtherapie.
De afleiding van hiPSC's biedt wetenschappers een instrumenteel model voor de vroege stadia van embryonale ontwikkeling dat de studie van processen mogelijk maakt die anders moeilijk in vivo te bestuderen zijn. In feite worden menselijke embryonale weefsels die beschikbaar zijn voor onderzoek verzameld uit embryo's die niet circuleren, en dit kan een aanzienlijke invloed hebben op de moleculaire handtekening die wordt gecontroleerd door mechanische signalen. De hier beschreven aanpak maakt live-imaging en real-time studie van de celrespons op schuifspanning mogelijk. De combinatie van hiPSC's met fluïdica biedt een studiemodel dat de beperkte beschikbaarheid en de ontoegankelijkheid van de zich ontwikkelende foetale weefsels overwint wanneer de start van de bloedsomloop de oprichting van het cardiovasculaire en bloedsysteem remodelleert en regelt 3,9,10,25.
Een beperking van het protocol is dat de endotheelcellen die van dit protocol zijn afgeleid, mogelijk niet de verschillende identiteiten weerspiegelen van verschillende endotheelcellen die aanwezig zijn in de zich ontwikkelende weefsels. Om deze beperking te overwinnen, kan een specifieke combinatie van cytokinen nodig zijn tijdens het differentiatieproces voorafgaand aan de fluïdische stimulatie om de gewenste identiteit of weefselspecifiek fenotype26 te verkrijgen. De isolatie van endotheliale subsets kan worden verkregen met behulp van een meer verfijnd immunofenotype tijdens de isolatiestap. Dit protocol isoleert endotheelcellen alleen op basis van de expressie van CD34, waardoor kolomisolatie mogelijk is in plaats van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS); Dit vermindert celdood en het risico op besmetting. Bovendien is dit protocol specifiek ontworpen om de rol van schuifspanning gemedieerd door laminaire stroming te bestuderen. Alternatieve fluïdische benaderingen zullen moeten worden gebruikt om het effect van andere mechanische signalen, zoals uitrekken of compressie, of andere soorten stroming zoals verstoorde of verstoorde stroming te bestuderen.
We hebben eerder aangetoond dat iPSC-afgeleide endotheelcellen de heterogene arterioveneuze cellulaire identiteiten nabootsen27, vergelijkbaar met die waargenomen in de foetale dorsale aorta28,29,30. Dit is met name van belang in de context van de ontwikkeling van bloedvaten en cellulaire specificatie, waarvan bekend is dat deze wordt gecontroleerd door de bloedcirculatie. Studies in verschillende modellen toonden aan dat een gebrek aan circulatie resulteert in een veranderde arterioveneuze specificatie11,14,31. De mechanismen die mechanische signalen verbinden met celspecificatie zijn nog onbekend en de hier beschreven pijplijn maakt verfijnde functionele studies mogelijk die niet in vivo konden worden getest.
Deze pijplijn beschrijft de productie en de stimulatie van endotheelcellen die zijn afgeleid van hiPSC's met behulp van in de handel verkrijgbare fluïdische kanalen, waardoor het niet nodig is om de apparaten te gieten zoals bij de veelgebruikte polydimethylsiloxaan (PDMS)-apparaten 12. Bovendien maakt het gebruik van PDMS-chips het verzamelen van de gestimuleerde cellen bijzonder uitdagend, terwijl met dit protocol de cellen gemakkelijk uit het kanaal kunnen worden gehaald. Dit verbetert de analytische kracht aanzienlijk, waardoor latere analyses mogelijk zijn, zoals proteomische en transcriptomische analyses, flowcytometrie en functionele assays, waarvoor mogelijk verdere kweek of in vivo assays nodig zijn.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Research Advanced Grant 2021 van de European Hematology Association, de Global Research Award 2021 van de American Society of Hematology en het Internal Strategy Support Fund ISSF3, gefinancierd door de Welcome Trust en de Universiteit van Edinburgh. We danken Fiona Rossi van de Flow Cytometry Facility voor haar ondersteuning bij de flowcytometrie-analyse. Ten behoeve van open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY)-licentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortkomt uit deze inzending.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
| 25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
| 6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
| Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
| Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
| BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
| BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
| bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
| CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
| CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
| CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
| Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
| CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
| Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
| DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
| EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
| EDTA | Life technologies | 15575020 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
| Fiji | Version 1.53c | ||
| Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
| Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
| Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
| Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
| Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
| Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
| IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
| Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
| Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
| MTG | Merck | M6145-25ML | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
| Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
| Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
| Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
| Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
| Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
| Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
| ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
| rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
| rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
| rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
| rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
| rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
| rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
| rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
| rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
| rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
| RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
| StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
| StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
| StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
| StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
| Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Copp, A. J. Death before birth: clues from gene knockouts and mutations. Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).
- Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. Hemodynamic control of endothelial cell fates in development. Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).
- Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis. Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).
- Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny. Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).
- Zovein, A. C., et al. Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
- Adamo, L., et al. Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis. Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).
- Diaz, M. F., et al. Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis. Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Lundin, V., et al. YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow. Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).
- Li, J., et al. Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development. Cell Reports. 40 (11), 111339 (2022).
- Azzoni, E., et al. The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition. Cell Reports. 37 (11), 110103 (2021).
- Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Batsivari, A., et al. Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture. Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).
- Canu, G., et al. Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation. Genome Biology. 21 (1), 157 (2020).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).
- Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219 (2018).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).
- Fidanza, A., et al. Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs. Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs. Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).
- Petazzi, P., et al. Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2. bioRxiv. , (2022).
- Crosse, E. I., et al. Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 27 (5), 822 (2020).
- Calvanese, V., et al. Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth. Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).
- Zeng, Y., et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).
- Hwa, J. J., et al. Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow. Scientific Reports. 7 (1), 11965 (2017).
