Summary
מתואר כאן תהליך עבודה פשוט להבדיל בין תאי אנדותל לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ואחריו פרוטוקול מפורט לגירוי המכני שלהם. זה מאפשר לחקור את המכנוביולוגיה ההתפתחותית של תאי אנדותל. גישה זו תואמת לבדיקות במורד הזרם של תאים חיים שנאספו משבב התרבית לאחר גירוי מכני.
Abstract
הלב הוא האיבר הראשון שהוקם תפקודית במהלך ההתפתחות, ובכך מתחיל את זרימת הדם בשלב מוקדם מאוד בהריון. מלבד הובלת חמצן וחומרים מזינים כדי להבטיח את גדילת העובר, זרימת הדם העוברית שולטת באירועים התפתחותיים חיוניים רבים המתרחשים בתוך שכבת האנדותל באמצעות רמזים מכניים. אותות ביומכניים גורמים לשינויים מבניים בכלי הדם, קובעים מפרט עורקי ושולטים בהתפתחות תאי גזע המטופויטיים. חוסר הנגישות של הרקמות המתפתחות מגביל את הבנת תפקיד המחזור בהתפתחות האנושית המוקדמת; לכן, מודלים במבחנה הם כלים מרכזיים לחקר מכנוביולוגיה של כלי שיט. מאמר זה מתאר פרוטוקול להבדיל תאי אנדותל מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם וזריעתם לאחר מכן לתוך מכשיר נוזלי כדי לחקור את תגובתם לרמזים מכניים. גישה זו מאפשרת תרבית ארוכת טווח של תאי אנדותל תחת גירוי מכני ולאחר מכן שליפה של תאי האנדותל לצורך אפיון פנוטיפי ופונקציונלי. מודל ה- in vitro שהוקם כאן יהיה חיוני להבהרת המנגנונים המולקולריים התוך-תאיים המתמרים את האיתות בתיווך רמזים מכניים, אשר בסופו של דבר מתזמרים את התפתחות כלי הדם במהלך חיי העובר האנושי.
Introduction
במהלך ההתפתחות העוברית, הלב הוא האיבר הראשון שביסס פונקציונליות1, עם התכווצויות ניתנות לזיהוי מהשלב המוקדם ביותר של היווצרות צינור הלב2. זרימת הדם, יחד עם הרמזים המכניים המתווכים על ידי זרימת הדם בתוך כלי השיט, שולטת בהיבטים מכריעים רבים של התפתחות מוקדמת. לפני הקמת מחזור הדם העוברי, כלי הדם מאורגנים במקלעת נימים ראשונית; עם תפקוד הלב, מקלעת זו מתארגנת מחדש לכלי דם ורידיים ועורקיים3. תפקידם של רמזים מכניים באפיון העורקים משתקף על ידי ביטוי פאן-אנדותל של סמנים עורקיים וורידיים לפני תחילת זרימת הדם4.
כוחות המודינמיים לא רק שולטים על התפתחות כלי הדם עצמם, אלא גם ממלאים תפקיד בסיסי בשליטה על היווצרות תאי הדם. תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs) יוצאים מתאי אנדותל מיוחדים הנקראים אנדותל המוגן 5,6,7,8, הנמצאים באזורים אנטומיים שונים של העוברים אך ורק בשלב המוקדם של ההתפתחות. מודלים של מחסור בלב, יחד עם מודלים במבחנה, הוכיחו כי רמזים מכניים מורים ומגבירים את ייצור HSPC מהאנדותל ההמוגן 9,10,11,12,13,14.
סוגים שונים של דינמיקת זרימה הוכחו כשולטים באופן דיפרנציאלי במחזור התא15, הידוע כחשוב הן באנדותל המוגן 16,17 והן במפרט תאי עורקים18. בסך הכל, רמזים מכניים הם גורמים קריטיים לזהות התא ולתפקודו במהלך ההתפתחות. התקנים פלואידים חדשניים במבחנה מאפשרים לנו להתגבר על המגבלות הכרוכות בחקר מכנוביולוגיה התפתחותית במהלך התפתחות הדם האנושי in vivo.
המטרה הכוללת של הפרוטוקול בכתב יד זה היא לתאר, שלב אחר שלב, את צינור הניסוי לחקר ההשפעה של לחץ גזירה על תאי אנדותל אנושיים שמקורם במבחנה מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). פרוטוקול זה מכיל הוראות מפורטות על התמיינות של hiPSCs לתאי אנדותל וזריעתם לאחר מכן לתוך שבבים נוזליים עבור פרוטוקול הגירוי. באמצעות שימוש זה, תאי אנדותל שונים במבחנה יכולים להיבדק על יכולתם לחוש את לחץ הגזירה על ידי ניתוח האוריינטציה שלהם בתגובה לזרימה. זה יאפשר למעבדות אחרות לענות על שאלות לגבי התגובה ללחץ גזירה וההשלכות התפקודיות שלה על זהויות שונות של תאי אנדותל.
Protocol
הערה: כל טכניקות תרבית התאים חייבות להתבצע בתנאים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית ותאים חייבים להיות מודגרים ב 37 ° C באטמוספירה לח עם 5% CO2. ההוראות להכנת כל הציטוקינים הן לתחזוקה (rhbFGF) והן לפרוטוקול ההבחנה (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) מופיעות בטבלה משלימה S1.
1. גידול hiPSCs - הפשרה, תחזוקה והקפאה של תאים
- הכנת אמצעי תחזוקה, גורמי גדילה וריאגנטים אחרים
- הכינו את מדיום התרבית על ידי הוספת תוסף בינוני ללא תאי גזע עובריים (גזע עובריים) מלא, 36 מ"ל של 25% אלבומין בסרום בקר (BSA), ו-1 מ"ל של 55 מ"ל של β-מרקפטואתנול למדיום הבסיסי Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) של Dulbecco (ראו טבלת חומרים).
- להשעות 1 מ"ג של מעכב Rho קינאז (iRock) ב 1 מ"ל של DMSO, לעשות aliquots של 50 μL, ולאחסן אותם ב -20 ° C.
הערה: aliquots אלה ניתן לשמור ב -20 ° C במשך שנה אחת. לאחר הפשרתם, הם יכולים להישמר ב 4 °C (75 °F) במשך שבוע אחד. - הפשירו את תמיסת הוויטרונקטין (VTN-N) על קרח ואליקוט 60 מיקרוליטר לבקבוקון לפני האחסון בטמפרטורה של -80°C. ממש לפני ציפוי הצלחות, לדלל את מלאי 60 μL ב 6 מ"ל של מלוחים חוצצי פוספט של Dulbecco (DPBS); הריכוז הסופי של 5 מק"ג/מ"ל.
- הפשרת קו תאי hiPSC
הערה: קו תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים SFCi55 נגזר בעבר בבית ונעשה בו שימוש נרחב להתמיינות לסוגי תאים שונים ושושלות עובריות שונות 19,20,21,22.- צפה באר אחת של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של פתרון VTN-N במשך 1 שעה ב 37 ° C.
הערה: לאחר הדגירה, ניתן לאחסן צלחות מצופות בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע. - שאפו את תמיסת VTN-N עם פיפטה שואפת והוסיפו 1 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש בתוספת 20 ng/mL של rhbFGF (טבלה משלימה S1).
- להפשיר במהירות את הבקבוקון המכיל hiPSCs באמבט מים ולהעביר את התא לתוך 5 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש.
- סובבו את התאים למשך 3 דקות בטמפרטורה של 300 × גרם בטמפרטורת החדר.
- להשהות מחדש את גלולת התא ב 0.5 מ"ל של מדיום תרבית בתוספת 20 ng / mL של rhbFGF.
- מעבירים את התאים לבאר מצופה אחת המכילה כבר 1 מ"ל של מדיום.
- הוסף 5 μL של iRock לתוך הבארות המכילות את התאים בסך הכל 1.5 מ"ל של בינוני.
- תרביתו את התאים באינקובטור, החליפו את התווך מדי יום במהלך השבוע, והזינו את התאים פעמיים, תוך הוספת נפח כפול של תווך לתאים כדי להבטיח הזנה בסוף השבוע.
הערה: התאים גדלים בנוכחות iRock למשך 24 שעות בלבד.
- צפה באר אחת של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של פתרון VTN-N במשך 1 שעה ב 37 ° C.
- תחזוקה ומעבר של hiPSCs
- החליפו את המדיום מדי יום במדיום תרבית טרי שחומם מראש בתוספת 20 נ"ג/מ"ל של rhbFGF.
- עוברים את התאים כשהם מגיעים לכ-80% מפגש, בדרך כלל פעמיים בשבוע.
- כדי לעבור בין התאים, צפו צלחת ב-VTN-N כפי שתואר קודם לכן בשלבים 1.2.1 ו-1.2.2.
- שואפים את המדיום מהבארות עם תאים ושוטפים אותם עם DPBS.
- שאפו את ה-DPBS והוסיפו 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה (ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך דקה אחת.
- לשאוף את מגיב הדיסוציאציה ולדגור במשך 3 דקות נוספות. טפחו בחוזקה על הצלחת 10 פעמים מכל צד.
הערה: שלב הדיסוציאציה עשוי לדרוש מיטוב ספציפי לסוג תא בזמן הדגירה ובהליך ההקשה. - מוסיפים 1 מ"ל מדיום תרבית לתאים ועם פיפטה פסטר, שוטפים פעם אחת עם המדיום כדי להבטיח שרוב המושבות נאספות.
- הוסף 150 μL של תרחיף התא לכל באר כדי לספק יחס מעבר של 1 באר לתוך 6.
הערה: מיד לאחר הפשרת בקבוקון חדש, עדיף להעביר את התאים ביחס נמוך יותר כגון 1:1 או 1:2 עבור מעבר אחד או שניים כדי לאפשר להם להגיע לשלב גידול יציב לפני המעבר ביחס של 1:6. - תרביתו את התאים באינקובטור, החליפו את התווך מדי יום במהלך השבוע, והאכילו את התאים פעמיים פעם אחת במהלך סוף השבוע.
- הקפאת קו תאי hiPSCs
הערה: יש להקפיא תאים בתוך שני המעברים הראשונים שלהם לאחר ההפשרה כדי להבטיח שמירה על קבוצה קבועה במעבר נמוך של בקבוקונים קפואים כדי להתחיל את התרבית. להקפיא את התאים כאשר הם מגיעים למפגש של כ 80%.- שנה את מדיום התרבית המחומם מראש בינוני לטרי בתוספת 20 ng/mL של rhbFGF ו- 5 μL של iRock ודגר במשך שעה אחת לפחות.
- נתק את התאים כמתואר בשלבים 1.3.2.2-1.3.2.5.
- לאסוף את התאים מנותקים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום תרבית.
- צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 300 × גרם בטמפרטורת החדר.
- שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת שימור בהקפאה (ראו טבלת חומרים).
- בעזרת פיפטה של פסטר, מקפיצים בעדינות את התאים למעלה ולמטה כדי לערבב אותם בתמיסת ההקפאה.
הערה: הימנע מפיפטינג מוגזם, שעלול לגרום לניתוק אשכולות התאים. - מחלקים את תרחיף התא לשני בקבוקונים לשימור בהקפאה עם 0.5 מ"ל כל אחד.
- העבירו את בקבוקוני ההקפאה למיכל הקפאה מקורר מראש ב-4°C.
- מעבירים את המיכל עם התאים למקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות לפני העברת הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
2. התמיינות של hiPSCs לתאי אנדותל
- הכנת מדיום התמיינות ציטוקינים וגורמי גדילה
- הכינו מדיום בידול ללא סרום (SFD) לפי טבלה 1. השתמש במדיום זה מיום 0 עד יום 5 של בידול.
- הכן מדיום ללא סרום לתאי CD34+ (SFM-34) על ידי הוספת 34 תוספי תזונה ו -5 מ"ל של תוסף L-גלוטמין למדיום הבסיסי 34 SFM (ראה טבלת חומרים). השתמש במדיום זה מהיום השישי של הבידול ואילך.
- להשהות 1 מ"ג של CHIR99021 ב 716 μL של DMSO כדי לקבל פתרון 3 mM. יש לדגור בטמפרטורת החדר עד להשעיה מלאה; במידת הצורך, התחממו במהירות ב-37°C. הפוך 20 μL aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C עד 6 חודשים. יש להשתמש מיד לאחר ההפשרה ואין להקפיא שוב או לאחסן.
- השהה מחדש את הציטוקינים בהתאם להוראה בטבלה משלימה S1. יש לאחסן את כל האליציטוטים של הציטוקינים בטמפרטורה של -80°C.
- התמיינות תאי אנדותל
הערה: עבור כל יום של ההבחנה, הכינו 18 מ"ל (3 מ"ל בינוני/באר) של תווך SFD שחומם מראש, בהתאם לתערובות הציטוקינים המתוארות ב טבלה 2.- יום 0 - היווצרות גופים עובריים (EBs)
- הכינו 18 מ"ל של מדיום SFD עם ערבוב ציטוקין 1 לפי טבלה 2, עבור כל צלחת של 6 בארות (3 מ"ל/באר).
- הוסיפו 2 מ"ל של מדיום SFD שחומם מראש עם ערבבו ציטוקין 1 בכל באר של צלחת דוחה תאים בעלת 6 בארות (ראו טבלת חומרים).
- כדי ליצור EBs, בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.3.2.2-1.3.2.4.
הערה: ודא כי hiPSCs הם 70-80% confluent כדי להתחיל את הבידול. - הוסף 1 מ"ל של מדיום SFD שחומם מראש עם ערבוב 1 ציטוקינים לכל באר של אשכולות תאים מנותקים.
- השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר בעדינות את אשכולות התאים לתוך באר אחת של באר דוחה תאים עבור היווצרות EB ביחס של 1: 1.
- לאחר הנחת הצלחת באינקובטור, הזיזו אותה קדימה ואחורה, ימינה ושמאלה, כדי לפזר את ה- EBs באופן שווה בבאר.
- יום 1 - שינוי בינוני ל- EBs
הערה: שלב זה נחוץ רק אם, עד היום הראשון של ההתמיינות, ישנם תאים בודדים רבים בתרחיף לצד EBs.- הכינו 18 מ"ל של מדיום SFD עם ערבוב ציטוקין 1 לפי טבלה 2, עבור כל צלחת של 6 בארות (3 מ"ל/באר).
- מערבלים את הצלחת עם EBs כדי להעביר אותם למרכז ולאסוף אותם באמצעות פיפטה פסטר לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
הערה: אם EBs נראים מגובשים יחד כמו בחוטים, להפריד אותם על ידי pipetthem למעלה ולמטה עם P1000 לפני איסוף אותם לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. - המתן 5-10 דקות עד שה- EBs יתיישבו בתחתית הצינור.
הערה: אם ה-EBs קטנים מדי, צנטריפוגו אותם למשך 5 דקות ב-100 × גרם כדי לעזור להם להתיישב. - שטפו את הצלחות דוחות התאים במים סטריליים או DPBS כדי להסיר תאים בודדים או לכלוך.
- שאפו בזהירות ובאיטיות את הסופרנאטנט מה-EBs מבלי לעקור אותם.
- הוסיפו 2 מ"ל של SFD עם ערבבו ציטוקינים 1 לכל באר של הלוחות דוחי התאים.
- השהה מחדש את ה- EBs באמצעות 1 מ"ל של מדיום SFD עם ערבוב 1 ציטוקינים לכל באר התחלה - לקבלת צלחת של 6 בארות, הוסף 6 מ"ל של מדיום.
- העבר את EBs ללוחות דוחי תאים בנפח 1 מ"ל לכל באר, אשר כבר מכיל 2 מ"ל של מדיום SFD.
- לאחר הנחת הצלחת באינקובטור, הזיזו אותה קדימה ואחורה, ימינה ושמאלה, כדי לפזר את ה- EBs באופן שווה בבאר.
- יום 2 - תוספת של CHIR99021
- מערבלים את ה-EBs למרכז הצלחת ומוסיפים CHIR99021 לפי טבלה 2 בצד הבאר כדי למנוע מגע ישיר עם התאים.
הערה: אם המדיום לא השתנה ביום הראשון, החלף את המדיום כולו במקום להוסיף CHIR בלבד. הכינו 18 מ"ל של מדיום SFD עם ערבוב 2 לפי טבלה 2, לכל צלחת של 6 בארות (3 מ"ל/באר). - לאחר הנחת הצלחת באינקובטור, הזיזו אותה קדימה ואחורה, ימינה ושמאלה, כדי לפזר את ה- EBs באופן שווה בבאר.
- מערבלים את ה-EBs למרכז הצלחת ומוסיפים CHIR99021 לפי טבלה 2 בצד הבאר כדי למנוע מגע ישיר עם התאים.
- יום 3 - שינוי בינוני ל-EBs ותוספת של מיקס 3 ציטוקינים
- הכינו 18 מ"ל של מדיום SFD עם ערבבו 3 ציטוקינים לפי טבלה 2, לכל צלחת בת 6 בארות (3 מ"ל/באר).
- אסוף את EBs כמתואר בשלבים 2.2.2.2-2.2.2.4.
- הוסיפו 2 מ"ל של מדיום SFD שחומם מראש עם ערבבו 3 ציטוקינים לצלחות דוחות התאים.
- בזהירות לשאוף את supernatant מן EBs. הוסף 1 מ"ל / באר של SFD עם ערבוב 3 ציטוקינים.
- פיזור EBs בין הבארות כמתואר בשלבים 2.2.2.8-2.2.2.9.
- יום 6 - שינוי בינוני עבור SFM-34 ותוספת של מיקס 4 ציטוקינים
- הכינו 18 מ"ל של מדיום SFD עם ערבבו 4 ציטוקינים לפי טבלה 2, לכל צלחת של 6 בארות (3 מ"ל/באר).
- אסוף את EBs כמתואר בשלבים 2.2.2.2-2.2.2.4.
- הוסיפו 2 מ"ל של מדיום SFM-34 שחומם מראש עם ערבבו 4 ציטוקינים ללוחות דוחי התאים.
- בזהירות לשאוף את supernatant מן EBs. הוסף 1 מ"ל/באר של SFM-34 עם ערבוב 4 ציטוקינים.
- פיזור EBs בין הבארות כמתואר בשלבים 2.2.2.8-2.2.2.9.
- יום 0 - היווצרות גופים עובריים (EBs)
3. בידוד תאי CD34+ וזריעה לתוך השבב
הערה: תאי CD34+ מבודדים באמצעות גישת בידוד חיובי עם ערכת מיקרו-חרוזים CD34 (ראה טבלת חומרים), המכילה מיקרו-כדוריות CD34 מצומדות לנוגדנים חד-שבטיים של עכבר נוגדנים אנטי-אנושיים CD34 מגיב חוסם FcR (IgG אנושי). חשוב לאמת את יעילות בידוד העמודה על ידי צביעת תאים לפני ואחרי הבידוד לניתוח ציטומטריית זרימה, להלן מצוין מתי יש לקחת תאים לניתוח זה.
- הכינו חומרים וריאגנטים.
- הכן את מאגר הכביסה על ידי הוספת 5 מ"ל של תמיסת 5% BSA ו- 200 μL של EDTA 0.5 מ"ל עד 45 מ"ל של DPBS לקבלת PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA. יש להתכונן טרי לכל בידוד, לעקר ולסנן ולשמור בקירור עד לשימוש.
- מצפים שבבים נוזליים עם תמיסת למינין שהוכנה על ידי דילול rhLaminin 521 1:50 ב- DPBS Ca2 + Mg2+. מצפים כל שבב בנפח המתאים לשבב הנמצא בשימוש ודגרים באינקובטור במשך שעתיים לפני הזריעה.
הערה: ניתן להשתמש במטריצות אחרות עבור הציפוי ויש לבדוק אותן עבור סוג התא / הניסוי הספציפי. - הכינו את Mix 4 SFM-34 medium על ידי תוספת של 18 מ"ל של מדיום SFM-34 עם Mix 4 ציטוקינים לפי טבלה 2 והניחו את התערובת בצינור של 50 מ"ל באינקובטור כשהמכסה מעט לא מוברג כדי להקל על החלפת הגזים.
- מניחים את ערכות הזילוח שנבחרו וכל צינורות אחרים שישמשו באינקובטור לדגה.
- יום 8 - דיסוציאציה של EBs ובידוד CD34+
- אסוף את EBs כמתואר בשלבים 2.2.2.2-2.2.2.5.
- הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים לכל באר התחלה של EBs שנאספו (אם נאספו 6 בארות, הוסף 6 מ"ל).
- העבר בחזרה 1 מ"ל של מתלה EB בריאגנט דיסוציאציה התא לכל באר של צלחת דוחה תאים.
- דגירה של 10 דקות באינקובטור.
- החזירו בעדינות את ה-EBs מעלה ומטה כנגד הבאר עם P1000, לא יותר מ-10 פעמים.
- חזור על שלבים 3.2.4-3.2.5.עבור סך של 3x.
הערה: אם קשה לנתק את EBs, חזור על השלבים לעיל 4x בסך הכל. - הוסף 5 מ"ל של חיץ כביסה עבור כל באר של EBs מנותקים.
- אספו את התאים לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל על ידי העברתם דרך מסננת של 40 מיקרומטר. קח 10 μL של תרחיף התא כדי לספור את התאים.
הערה: כדי לבדוק את יעילות הבידוד, העבר 105 תאים/צינור לשני צינורות שונים (בקרה לא מוכתמת ודגימת בדיקה מדוברת) שישמשו מאוחר יותר לציטומטריית זרימה (כמתואר בשלבים 4.3.9-4.3.13). עבור צלחת 6 בארות, ~ 106 תאים יש לאסוף לאחר סינון. - סובבו את התאים כלפי מטה במשך 10 דקות במהירות של 300 × גרם.
- השהה מחדש את התאים ב 300 μL של חיץ כביסה, בעדינות pipeting כמה פעמים כדי לוודא כי אין גושים. המשך לעקוב אחר פרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
- CD34+ זריעת תאים לתוך שבבים נוזליים
הערה: לשבב הנוזלי המשמש בפרוטוקול יש גובה תעלה של 0.6 מ"מ ואורך של 50 מ"מ, עבור שטח גידול כולל של 2.5 ס"מ2 (איור משלים S1). סוג זה של שבב הוא זרע עם נפח כולל של השעיית התא של 150 μL. שבבים שונים ניתן להשתמש, ואת נפח הזריעה ואת צפיפות התא צריך להיות מותאם על פי אזור הגידול. ייתכן שיהיה צורך במיטוב נוסף בהתאם לקו התאים שבו נעשה שימוש ולצמיחתו.- השהה מחדש את תאי CD34+ המבודדים ב- 300 μL של מדיום SFM-34 שחומם מראש עם ערבוב 4 ציטוקינים.
- קח 10 μL של תרחיף התא ולספור את התאים.
- Resuspend 2.5 × 105 תאים בנפח סופי של 150 μL בתוספת SFM-34; הוסף 0.5 μL של iRock.
הערה: כדי לבדוק את יעילות הבידוד, העבר 105 תאים/צינורית לתוך צינור (מדגם בדיקה לאחר מיון) שישמש מאוחר יותר עבור ציטומטריית זרימה (כמתואר בשלבים 4.3.9-4.3.13). - שאפו לאט את הלמינין משבבי נוזלים על ידי הצבת קצה P200 בתוך המאגר בקצה התעלה.
הערה: אם קשה לאסוף את הנוזל, הרימו באיטיות צד אחד של השבב כדי לעזור לנוזל לעבור למאגר הנגדי. - הוסף את מתלה התא בהתמדה לתוך התעלה כדי לוודא שלא נוצרות בועות.
הערה: בצע את שלבים 3.3.4-3.3.5 במהירות אך בעדינות כדי למנוע התייבשות הלמינין והיווצרות בועות בתעלות השבב. אם נוצרות בועות, הרימו צד אחד של השבב והקישו בעדינות על המגלשה כדי לגייס את הבועות; כאשר הם יגיעו למאגר, הם יעלו לממשק האוויר ולא יוכלו להיכנס לערוץ. - מעבירים את השבב לאינקובטור ומשאירים אותם למשך הלילה, כך שהתאים מחוברים לחלוטין לתעלה ונראים מוארכים.
- כאשר התאים מחוברים במלואם, שאפו את המדיום כמו בשלב 3.3.4 והחליפו אותו ב-200 מיקרוליטר של SFM-34 בתוספת ציטוקינים.
- מעתה, להחליף את המדיום מדי יום עד שהתאים יגיעו 90%-100% מפגש.
4. יישום זרימה רציפה לתאי אנדותל - אבי העורקים על שבב
- הכינו חומרים וריאגנטים.
- הכינו את Mix 4 SFM-34 medium על ידי תוספת של 18 מ"ל של מדיום SFM-34 עם Mix 4 ציטוקינים לפי טבלה 2 והניחו אותו בצינור של 50 מ"ל באינקובטור כשהמכסה מעט לא מוברג כדי להקל על חילופי גזים.
- הניחו את ערכות הזילוח שנבחרו ואת כל הצינוריות שישמשו להתקנה הנוזלית באינקובטור כדי להוריד גזים.
- הרכבת מערכת פלואידית
- התקן את ערכת הזלוף ביחידה בהתאם לפרוטוקול היצרן.
הערה: זכור להשתמש מלחציים במערכת. אם מלחציים הזזה משמשים לשלב זה, הם צריכים להיות מחליקים על הצינור לפני חיבור השבב. - חברו שבב נוזלי חדש והוסיפו את מדיום SFM-34 בתוספת ציטוקינים, תוך הקפדה למלא את שני המאגרים בתנאים סטריליים במכסה המנוע.
- בצע את תוכנית הסרת הבועות ואת שלב הכיול.
- הסר את היחידה הנוזלית עם הקבוצה המחוברת מהאינקובטור והעבר אותה למכסה המנוע; קח גם את השבבים המכילים את התאים מהאינקובטור.
- הדקו את הצינור משני צידי שבב הבדיקה.
- הסר את הצינורית משבב הבדיקה.
הערה: בדוק שאין בועות במחבר Luer בקצה הצינור. אם הבועות גלויות, שאפו אותן בזהירות באמצעות פיפטה P200 ואם יש צורך, הוסיפו עוד מדיום כדי לוודא שהמחבר מלא במדיום. - חבר את השבב המכיל את התאים עם הצינור.
- הסר או פתח את המלחציים.
- מעבירים את המערכת לאינקובטור ומחברים את משאבת האוויר ליחידה הנוזלית.
- התחילו את התוכנית שנבחרה מראש באמצעות התוכנה ייעודית למשאבה (איור משלים S2) עם העלייה ההדרגתית של לחץ הגזירה המתואר בטבלה 3.
הערה: בהתאם לניסוי הספציפי הדרוש, ייתכן שיהיה צורך למטב את תוכנית הגירוי. מתוארת כאן עלייה הדרגתית בלחץ הגזירה המובילה לערך הסופי של 5 dyn/cm2, המחקה את לחץ הגזירה המחושב על ידי דופן אבי העורקים הגבי בתחילת מחזור הדם העוברי 9. ללא תלות בלחץ הגזירה הסופי שיופעל, יש צורך להגדיל בהדרגה לאורך זמן כדי לאפשר לתאים להסתגל לכוח מבלי לגרום לתאים להתנתק מהשבב. אם פרוטוקול הגירוי שנבחר ארוך מ-3 ימים, יש להוסיף ציטוקינים למערכת על ידי הוספת 1 מ"ל SFM-34 המכיל את Mix 4 ציטוקינים שבדרך כלל יתווספו ל-18 מ"ל. כדי לעשות זאת, תוכנית המשאבה מושהית במהירות ו 500 μL של מדיום בתוספת מתווסף לכל אחד משני מזרקים להגדיר fluidic.
- התקן את ערכת הזלוף ביחידה בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- איסוף תאים לניתוח
- מחממים מראש את חיץ הדיסוציאציה באמבט מים.
- מוציאים את היחידה הנוזלית מהאינקובטור ומעבירים אותה למכסה המנוע.
- הדקו את הצינור הצמוד לשבב משני הצדדים והוציאו את הצינור מהמאגרים שעל השבב.
- הסר בעדינות את המדיום מהשבב והחלף אותו ב- DPBS Ca2 + Mg2+ כדי לשטוף את התאים.
הערה: ניתן לדלג על שלב זה של שטיפה עם PBS אם התאים מתחילים להתנתק. - הוסף בעדינות 150 μL של חיץ דיסוציאציה ודגר במשך 3 דקות ב 37 ° C.
הערה: בדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים בודדים ומנותקים; אחרת, יש לדגור למשך 2 דקות נוספות. זה חיוני כי התאים מנותקים לחלוטין מן התעלה לפני שאיפת המדיום, כמו השבב אינו מאפשר לסייע ניתוק התא על ידי pipetting. ניתן להשתמש בתמיסות אחרות כדי לנתק את התאים, כגון טריפסין או מאגרים מבוססי EDTA. - אספו את מאגר הדיסוציאציה המכיל את התאים ממאגר אחד והעבירו לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל ושטפו את התעלה פעם אחת עם DPBS כדי לאסוף את כל התאים המנותקים.
- הוסף 1 מ"ל של חיץ כביסה לצינור 15 מ"ל עם התאים ולקחת 10 μL לספור את התאים.
- חלק את תרחיף התא בצינורות ציטומטריית זרימה כדי לקבל 105 תאים לכל מבחנה.
- סובבו את הצינורות במשך 5 דקות ב 300 × גרם.
- הכינו את תמיסת הצביעה כך שתהיה 50 μL לכל מבחנה להכתים. הוסף את CD34 PerCP-efluor710 או CD34-PE בדילול של 1:100 ו- 1:200, בהתאמה.
- להשהות מחדש את התאים ב 50 μL של תמיסת צביעה לדגור במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ כביסה ולסובב במשך 5 דקות ב 300 × גרם.
- השהה מחדש את הכדוריות ב -100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה ורכוש את הנתונים באמצעות ציטומטר זרימה.
הערה: ניתן גם ליזה את התאים ישירות בשבב לצורך מיצוי RNA באמצעות 150 μL של מאגר RNA lysis או לקיבוע לצורך הדמיה באמצעות 4% paraformaldehyde ב-DPBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- ניתוח כיוון התא
- נתח את התמונות כדי לכמת שינויים בכיוון התא באמצעות FIJI23 (איור משלים S3).
- פתח את מנהל אזור העניין (ROI) מתוך נתח | כלים | תפריט מנהל ROI .
- צייר את קווי המתאר של התא באופן ידני באמצעות הכלי לבחירת מצולע והוסף אותם למנהל החזר ההשקעה על-ידי לחיצה על הוסף או באמצעות קיצור הדרך CTRL+T .
- מדוד את הכיוון של כל החזר השקעה על-ידי בחירה במדידת האליפסה 'התאם' בניתוח | תפריט 'קבע מדידות '.
- החל את המדידה על כל החזר ההשקעה באמצעות עוד ... הפקודה Multi measure במנהל החזר ההשקעה.
הערה: שלב זה יתאים אליפסה לכל החזר השקעה וייצור טבלה המכילה את אורך צירי האליפסה הראשית והמינורית, כמו גם את הזווית. - יצא את הטבלה לקובץ CSV כדי לייבא אותה לתוכנה אחרת לצורך התוויית.
הערה: הסקריפט המשמש למגרשים זמין בכתובת https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf885
0ddc.
- נתח את התמונות כדי לכמת שינויים בכיוון התא באמצעות FIJI23 (איור משלים S3).
Representative Results
אנו מתארים כאן פרוטוקול להתמיינות ולגירוי מכנו של תאי אנדותל שמקורם בתאי גזע גזעיים גבוהים המאפשר לחקור את התגובה שלהם לרמזים מכניים (איור 1). פרוטוקול זה גורם לייצור תאי אנדותל בעלי רגישות תפקודית. אנו מספקים כאן תוצאות מייצגות ומתארים את הפנוטיפ הצפוי כדי להעריך כיצד התאים מגיבים לגירוי הציטוקינים במהלך ההתמיינות.
איור 1: סכמה של פרוטוקול התמיינות וגירוי מכני. סכמה של פרוטוקול התמיינות המראה את העיתוי של תערובות שונות של ציטוקינים, בידוד תאים CD34+ , זריעת שבב נוזלי, וניתוח סופי של תאים מעוררים מכנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרבות של hiPSCs
חשוב להתחיל את הפרוטוקול מ-hiPSCs שגדלים נכון בתנאי התחדשות עצמית. אינדיקציה טובה לאיכות התרבות היא מהירות צמיחתם. לאחר ההפשרה, התאים עשויים להזדקק 2-3 שבועות כדי להגיע לשלב הנכון של הצמיחה שיבטיח התמיינות טובה. כאשר ניתן להעביר את התאים פעמיים בשבוע ביחס של 1:6 ולהגיע למפגש כמעט מלא, זה הזמן שבו הם מוכנים להתמיין באותו יום שבו הם צריכים לעבור.
התמיינות של hiPSCs לתאי אנדותל
השלב הראשון של ההתמיינות, המורכב מהיווצרות גופים עובריים (EBs), תלוי בקו התא ועשוי להזדקק לאופטימיזציה מסוימת עבור קו התאים הספציפי שבשימוש. הדיסוציאציה המתוארת בשלבי פרוטוקול 1.3.2.2-1.3.2.4 ניתנת לשינוי על ידי צמצום או הרחבה של הדגירה עם מגיב הדיסוציאציה והדיסוציאציה שלאחר מכן עם פיפטת פסטר. יתר על כן, ריאגנטים דיסוציאציה אחרים יכולים לשמש לשלב זה בנוסף לדיסוציאציה פיזית של המושבות עם כלי חיתוך או קצה פיפטה P100. EBs באיכות טובה מראים קצה מוגדר ביום השני של ההתמיינות ונראים ברורים ובהירים כאשר הם נצפים באמצעות מיקרוסקופ; אזורים כהים יותר עשויים להצביע על מוות תאי בתוך EBs (איור 2).
איור 2: מורפולוגיה של גופים עובריים. (A) גופים עובריים ביום 2 המראים קצוות חיצוניים מוגדרים היטב וגודל עקבי. (B) יום 2 גופים עובריים באיכות ירודה המראים מוות תאי נרחב המוביל לפירוק המבנה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ביום השני, הוספת CHIR99021 ל-EBs מעכבת את החלבון GSK-3 וכתוצאה מכך מופעלת מסלול Wnt. לקווי תאים שונים יש תגובות שונות לטיפול ב-CHR, ויש לבדוק זאת על-ידי כימות מספר תאי CD34+ המתקבלים ביום 8 באמצעות ריכוזים שונים (איור 3).
איור 3: התמיינות תאי אנדותל עם טיפולי CHIR שונים. מחויבות תאי אנדותל כומתה על ידי ציטומטריית זרימה ביום 8 להתמיינות על ידי ביטוי קרום CD34, לאחר טיפול CHIR ביום 2 ב (A) 3 μM, (B) 5 μM, ו (C) 7 μM. נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו באמצעות ציטומטרים של חמישה לייזרים ותוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בידוד תאים CD34+
חשוב לוודא כי העשרת CD34+ באמצעות החרוזים המגנטיים מספקת לפחות 80% CD34+ לאחר ביטול העמודה. כדי להבטיח טוהר מספיק, ניתן לנתח אליציטוט של תאים המתקבלים מהבידוד המגנטי על ידי ציטומטריית זרימה תוך הקפדה על שימוש בשיבוט נוגדנים שונה מזה המשמש להעשרה המגנטית. כאן, נעשה שימוש בשיבוט 4H11 ו~85% טוהר הושג לאחר העשרה (איור 4).
איור 4: ביטוי ממברנה של CD34 לפני ואחרי העשרה באמצעות מיון מגנטי. יום 8 גופים עובריים מנותקים (אפור) ותאים לאחר העשרה מגנטית (ירוק) הוכתמו לביטוי CD34 ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה, מה שהדגים מיון מוצלח לאחר העשרה. נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו באמצעות ציטומטרים של חמישה לייזרים ותוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
זריעת תאים לתעלה הנוזלית
בעת זריעת התאים בתעלה הפלואידית, חיוני לעקוב אחר ההידבקות וההתרבות של תאי האנדותל. לאחר הזריעה, לוקח לתאים ~5 שעות להיצמד באופן מלא לתעלה (איור 5A). ניתן לבדוק גם פתרון ציפוי חלופי לשיפור ההדבקה בשלב זה. כדי לוודא שהתאים שנבדקו רגישים למכנו ולכן מסוגלים להגיב לגירוי מכני, ניתן לבדוק את כיוון התא לאורך זמן. תאים לפני הגירוי מראים אוריינטציה אקראית (איור 5A ואיור 5C) והם מכוונים מחדש במקביל לכיוון הזרימה (איור 5B,C). הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לאסוף את התאים מהתעלה כדי לבצע אנליזה במורד הזרם, לדוגמה, ציטומטריית זרימה, לחקר האימונופנוטיפ של הממברנה שלהם, ומספק את הזהות האנדותלית של התאים המגוריים (איור 5D,E).
איור 5: Mechanoresponsiveness של תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSCs . (A) שכבה משולבת של תאי CD34+ מבודדים 48 שעות לאחר הזריעה. (B) שכבה מכוונת מחדש של תאי אנדותל 3 ימים תחת תרבית דינמית. (C) ניתוח אוריינטציה של תאי אנדותל לאחר 5 ימים של תרבית דינמית. (D) פרופיל ביטוי CD34 של תאים בתרבית תחת זרימה במשך 5 ימים. (E) אחוז תאי CD34+ של אוכלוסיית תאים שנלקחו מהתעלה הנוזלית. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אינקובטור הפוך; נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו באמצעות ציטומטרים של חמישה לייזרים ותוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A,B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| ריאגנטים | ריכוז מלאי | נפח נוסף | ריכוז סופי |
| המדיום של Dulbecco של Iscove (IMDM) | - | 333 מ"ל | - |
| תערובת F-12 של Ham's Nutrient (F-12) | - | 167 מ"ל | - |
| תוסף N-2 (100x) | פי 100 | 5 מ"ל | 1x |
| תוסף B-27 (50x) | פי 50 | 10 מ"ל | 1x |
| חומצה אסקורבית | 10 מ"ג/מ"ל | 1.25 מ"ל | 25 מיקרוגרם/מ"ל |
| α-מונותיוגליצרול (MTG) | 11.5 מ' | 19.5 מיקרוליטר | 448.5 מיקרומטר |
| אלבומין בסרום אנושי | 100 מ"ג/מ"ל | 2.5 מ"ל | 0.5 מ"ג/מ"ל |
| הולו-טרנספרין | 100 מ"ג/מ"ל | 0.75 מ"ל | 150 מיקרוגרם/מ"ל |
טבלה 1: הרכב ומתכון עבור 500 מ"ל של מדיום בידול ללא סרום (SFD).
| ימים של בידול | תערובת ציטוקינים | ציטוקין | ריכוז סופי |
| יום 0 - 2 | ערבוב 1 | BMP4 | 20 נ"ג/מ"ל |
| יום 2 | מיקס 2 | CHIR99021 | 7 מיקרומטר |
| מהיום השלישי ואילך | מערבבים 3 ו-4 | VEGF | 15 נ"ג/מ"ל |
| bFGF | 5 נ"ג/מ"ל | ||
| מהיום השישי ואילך | ערבוב 4 | IL6 | 10 נ"ג/מ"ל |
| FLT3L | 10 נ"ג/מ"ל | ||
| IGF1 | 25 נ"ג/מ"ל | ||
| IL11 | 5 נ"ג/מ"ל | ||
| SCF | 50 נ"ג/מ"ל | ||
| EPO | 3 U/מ"ל | ||
| TPO | 30 נ"ג/מ"ל | ||
| IL3 | 30 נ"ג/מ"ל |
טבלה 2: תערובות של ציטוקינים המשמשים להתמיינות תאי אנדותל, ימים שבהם הם מתווספים למדיום SFD וריכוז סופי.
| לחץ גזירה (dyn/cm2) | זמן (ח) |
| 0.5 | 1 |
| 1 | 1 |
| 1.5 | 1 |
| 2 | 1 |
| 2.5 | 1 |
| 3 | 1 |
| 3.5 | 1 |
| 4 | 1 |
| 4.5 | 1 |
| 5 | עד סוף הניסוי |
טבלה 3: ערכי לחץ גזירה עבור התרבות הדינמית ואורך היישום שלהם.
איור משלים S1: גיאומטריה ומידות השבב והצנרת המשמשים לפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: מדריך שלב אחר שלב עבור התוכנה השולטת במשאבת האוויר עם תיאור של כל שלב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S3: מדריך לניתוח כיוון באמצעות FIJI המציג את ציור צורת התא, התאמה אליפטית ומדידה סופית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S1: גודל יחידה, נפח תרחיף וריכוזי מלאי עבור ציטוקינים המשמשים בפרוטוקול התמיינות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
הפרוטוקול שאנו מתארים כאן מאפשר יצירה של תאי אנדותל רגישים למכנו מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים וחקר תגובתם לגירוי מכני המתווך על ידי לחץ גזירה מבוקר. פרוטוקול זה מבוסס כולו על ציטוקינים ותואם באופן מלא לריאגנטים GMP לתרגום פוטנציאלי לייצור תאים לטיפול תאי.
הנגזרת של hiPSCs מספקת למדענים מודל אינסטרומנטלי לשלבים המוקדמים של התפתחות עוברית, המאפשר לחקור תהליכים שאחרת קשה לחקור in vivo24. למעשה, רקמות עובריות אנושיות הזמינות למחקר נאספות מעוברים חסרי מחזור דם, ועשויה להיות לכך השפעה משמעותית על החתימה המולקולרית הנשלטת על ידי רמזים מכניים. הגישה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה חיה ומחקר בזמן אמת של תגובת התא ללחץ גזירה. השילוב של hiPSCs עם פלואידיקה מספק מודל של מחקר המתגבר על הזמינות המוגבלת וחוסר הנגישות של רקמות העובר המתפתחות כאשר התחלת מחזור הדם מחדש ושולטת על הקמת מערכת הלב וכלי הדם 3,9,10,25.
מגבלה של הפרוטוקול היא שתאי האנדותל הנגזרים מפרוטוקול זה עשויים שלא לשקף את הזהויות השונות של תאי אנדותל שונים הקיימים ברקמות המתפתחות. כדי להתגבר על מגבלה זו, ייתכן שיהיה צורך בשילוב ספציפי של ציטוקינים במהלך תהליך ההתמיינות שקדם לגירוי הנוזלי כדי להשיג את הזהות הרצויה או פנוטיפ ספציפי לרקמה26. ניתן לקבל בידוד של תת-קבוצות אנדותל באמצעות אימונופנוטיפ מעודן יותר במהלך שלב הבידוד. פרוטוקול זה מבודד תאי אנדותל רק על סמך ביטוי CD34, ובכך מאפשר בידוד עמודות במקום מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS); זה מפחית מוות תאי ואת הסיכון של זיהום. יתר על כן, פרוטוקול זה תוכנן במיוחד כדי לחקור את התפקיד של מתח גזירה מתווך על ידי זרימה למינרית. יהיה צורך להשתמש בגישות פלואידיות חלופיות כדי לחקור את ההשפעה של רמזים מכניים אחרים, כגון מתיחה או דחיסה, או סוגים אחרים של זרימה כגון זרימה מופרעת או מופרעת.
הראינו בעבר כי תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC מחקים את הזהויות התאיות העורקיות ההטרוגניות27 בדומה לזה שנצפה באבי העורקים הגבי העוברי28,29,30. יש לכך חשיבות מיוחדת בהקשר של התפתחות כלי הדם והאפיון התאי, הידוע כנשלט על ידי מחזור הדם. מחקרים במודלים שונים הראו כי חוסר זרימת דם גורם לשינוי מפרט עורקי11,14,31. המנגנונים המחברים רמזים מכניים עם מפרט התא עדיין אינם ידועים, והצנרת המתוארת כאן מאפשרת מחקרים פונקציונליים מעודנים שלא ניתן היה לבדוק in vivo.
צינור זה מתאר את הייצור והגירוי של תאי אנדותל שמקורם בתאי גזע גזעיים גבוהים באמצעות תעלות פלואידיות זמינות מסחרית, תוך הימנעות מהצורך ביציקת המכשירים כמו בהתקני פולידימתילסילוקסאן (PDMS) הנמצאים בשימוש נרחב12. יתר על כן, השימוש בשבבי PDMS הופך את איסוף התאים המגורה למאתגר במיוחד, בעוד שעם פרוטוקול זה, ניתן לשלוף את התאים בקלות מהערוץ. זה משפר באופן משמעותי את הכוח האנליטי המאפשר ניתוח עוקב כגון ניתוחים פרוטאומיים ו transcriptomic, ציטומטריה זרימה, ובדיקות פונקציונליות, אשר עשוי להזדקק תרבית נוספת או בדיקות in vivo .
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר המתקדם 2021 מהאגודה ההמטולוגית האירופית, פרס המחקר העולמי 2021 מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, וקרן התמיכה באסטרטגיה פנימית ISSF3 במימון קרן ברוכים הבאים ואוניברסיטת אדינבורו. אנו מודים לפיונה רוסי ממתקן ציטומטריית הזרימה על התמיכה בניתוח ציטומטריית זרימה. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
| 25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
| 6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
| Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
| Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
| BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
| BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
| bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
| CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
| CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
| CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
| Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
| CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
| Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
| DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
| EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
| EDTA | Life technologies | 15575020 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
| Fiji | Version 1.53c | ||
| Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
| Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
| Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
| Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
| Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
| Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
| IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
| Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
| Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
| MTG | Merck | M6145-25ML | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
| Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
| Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
| Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
| Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
| Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
| Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
| ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
| rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
| rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
| rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
| rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
| rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
| rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
| rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
| rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
| rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
| RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
| StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
| StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
| StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
| StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
| Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Copp, A. J. Death before birth: clues from gene knockouts and mutations. Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).
- Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. Hemodynamic control of endothelial cell fates in development. Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).
- Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis. Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).
- Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny. Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).
- Zovein, A. C., et al. Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
- Adamo, L., et al. Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis. Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).
- Diaz, M. F., et al. Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis. Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Lundin, V., et al. YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow. Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).
- Li, J., et al. Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development. Cell Reports. 40 (11), 111339 (2022).
- Azzoni, E., et al. The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition. Cell Reports. 37 (11), 110103 (2021).
- Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Batsivari, A., et al. Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture. Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).
- Canu, G., et al. Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation. Genome Biology. 21 (1), 157 (2020).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).
- Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219 (2018).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).
- Fidanza, A., et al. Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs. Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs. Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).
- Petazzi, P., et al. Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2. bioRxiv. , (2022).
- Crosse, E. I., et al. Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 27 (5), 822 (2020).
- Calvanese, V., et al. Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth. Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).
- Zeng, Y., et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).
- Hwa, J. J., et al. Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow. Scientific Reports. 7 (1), 11965 (2017).
