Summary
Beskrevet her er en enkel arbeidsflyt for å skille endotelceller fra humane pluripotente stamceller etterfulgt av en detaljert protokoll for mekanisk stimulering. Dette muliggjør studier av endotelcellers utviklingsmekanobiologi. Denne tilnærmingen er kompatibel med nedstrømsanalyser av levende celler samlet fra kulturbrikken etter mekanisk stimulering.
Abstract
Hjertet er det første organet som er funksjonelt etablert under utviklingen, og dermed starter blodsirkulasjonen svært tidlig i svangerskapet. I tillegg til å transportere oksygen og næringsstoffer for å sikre fostervekst, styrer fosterets sirkulasjon mange viktige utviklingshendelser som foregår i endotellaget gjennom mekaniske signaler. Biomekaniske signaler induserer strukturelle endringer i blodkar, etablerer arteriovenøs spesifikasjon og kontrollerer utviklingen av hematopoietiske stamceller. Utilgjengeligheten av utviklingsvevet begrenser forståelsen av sirkulasjonens rolle i tidlig menneskelig utvikling; Derfor er in vitro-modeller sentrale verktøy for studier av fartøymekanobiologi. Dette papiret beskriver en protokoll for å skille endotelceller fra humane induserte pluripotente stamceller og deres etterfølgende såing i en fluidisk enhet for å studere deres respons på mekaniske signaler. Denne tilnærmingen muliggjør langsiktig kultur av endotelceller under mekanisk stimulering etterfulgt av gjenfinning av endotelceller for fenotypisk og funksjonell karakterisering. In vitro-modellen etablert her vil være medvirkende til å belyse de intracellulære molekylære mekanismene som transducerer signaleringen mediert av mekaniske signaler, som til slutt orkestrerer fartøyets utvikling under menneskelig fosterliv.
Introduction
Under embryonal utvikling er hjertet det første organet som etablerer funksjonalitet1, med påviselige sammentrekninger fra det tidligste stadiet av endokardial rørdannelse2. Sirkulasjon, sammen med de mekaniske signalene mediert av blodstrømmen i karet, styrer mange viktige aspekter ved tidlig utvikling. Før fosterets sirkulasjon etableres, er vaskulaturen organisert i en primær kapillær plexus; Ved hjertefunksjon omorganiseres denne plexus til venøs og arteriell vaskulatur3. Rollen til mekaniske signaler i arteriovenøs spesifikasjon reflekteres av det panendoteliale uttrykket av arterielle og venøse markører før blodstrømsinitiering4.
Hemodynamiske krefter styrer ikke bare utviklingen av selve vaskulaturen, men spiller også en grunnleggende rolle i kontrollen av blodcelledannelse. Hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCer) kommer fra spesialiserte endotelceller kalt hemogent endotel 5,6,7,8, tilstede i forskjellige anatomiske regioner av embryoene utelukkende i det tidlige utviklingsstadiet. Hjertefattige modeller, sammen med in vitro-modeller, har vist at mekaniske signaler instruerer og øker HSPC-produksjonen fra det hemogene endotelet 9,10,11,12,13,14.
Ulike typer strømningsdynamikk har vist seg å differensielt kontrollere cellesyklusen15, kjent for å være viktig i både hemogent endotel 16,17 og arteriell cellespesifikasjon18. Alt i alt er mekaniske signaler kritiske determinanter for celleidentitet og funksjon under utvikling. Nye in vitro fluidiske enheter tillater oss å overvinne begrensningene som er involvert i å studere utviklingsmekanobiologi under menneskelig blodutvikling in vivo.
Det overordnede målet med protokollen i dette manuskriptet er å beskrive, trinn for trinn, den eksperimentelle rørledningen for å studere effekten av skjærspenning på humane endotelceller avledet in vitro fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs). Denne protokollen inneholder detaljerte instruksjoner om differensiering av hiPSCs i endotelceller og deres påfølgende såing i fluidiske chips for stimuleringsprotokollen. Ved hjelp av dette kan forskjellige in vitro-avledede endotelceller testes for deres evne til å føle skjærspenningen ved å analysere deres orientering som svar på strømmen. Dette vil tillate andre laboratorier å ta opp spørsmål om responsen på skjærspenning og dens funksjonelle konsekvenser på forskjellige endotelcelleidentiteter.
Protocol
MERK: Alle cellekulturteknikker må utføres under sterile forhold i en laminær strømningshette, og cellene må inkuberes ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 5 % CO2. Instruksjoner for alt cytokinpreparat for både vedlikehold (rhbFGF) og for differensieringsprotokollen (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) finnes i tilleggstabell S1.
1. Dyrking av hiPSCs - tining, vedlikehold og frysing av celler
- Fremstilling av vedlikeholdsmedium, vekstfaktorer og andre reagenser
- Forbered dyrkningsmediet ved å tilsette hele hESCs serumfrie mediumtilskudd, 36 ml 25 % bovint serumalbumin (BSA) og 1 ml 55 mM β-merkaptoetanol til Dulbeccos modifiserte ørnemedium/F12 (DMEM/F-12) basalmedium (se materialfortegnelse).
- Resuspender 1 mg Rho Kinase-hemmer (iRock) i 1 ml DMSO, lag alikoter på 50 μL og oppbevar dem ved -20 °C.
MERK: Disse alikotene kan oppbevares ved -20 °C i 1 år. Etter opptining kan de oppbevares ved 4 °C i 1 uke. - Tine vitronectin (VTN-N) oppløsningen på is og alikot 60 μL per hetteglass før oppbevaring ved -80 °C. Like før platene belegges, fortynn 60 μL-stambestanden i 6 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS); den endelige konsentrasjonen på 5 μg/ml.
- tining av hiPSC-cellelinje
MERK: Den humane pluripotente stamcellelinjen SFCi55 ble tidligere avledet internt og mye brukt til differensiering i forskjellige celletyper og forskjellige embryonale linjer 19,20,21,22.- Belegg en brønn av en 6-brønns plate med 1 ml VTN-N-løsning i 1 time ved 37 °C.
MERK: Etter inkubering kan belagte plater oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke. - Aspirer VTN-N-løsningen med en aspirasjonspipette og tilsett 1 ml forvarmet kulturmedium tilsatt 20 ng/ml rhbFGF (tilleggstabell S1).
- Tin hetteglasset med hissc raskt i et vannbad og overfør cellen til 5 ml forvarmet dyrkningsmedium.
- Spinn cellene ned i 3 minutter ved 300 × g ved romtemperatur.
- Resuspender cellepelleten i 0,5 ml kulturmedium tilsatt 20 ng/ml rhbFGF.
- Overfør cellene til en belagt brønn som inneholder allerede 1 ml medium.
- Tilsett 5 μL iRock i brønnene som inneholder cellene i totalt 1,5 ml medium.
- Kultur cellene i inkubatoren, bytt medium daglig i løpet av uken, og dobbeltmate cellene, og legg til to ganger det normale volumet av medium til cellene for å sikre fôring i løpet av helgen.
MERK: Celler dyrkes kun i nærvær av iRock i 24 timer.
- Belegg en brønn av en 6-brønns plate med 1 ml VTN-N-løsning i 1 time ved 37 °C.
- Vedlikehold og passering av hiPSCer
- Bytt medium daglig med ferskt forvarmet kulturmedium supplert med 20 ng / ml rhbFGF.
- Pass cellene når de når omtrent 80% samløp, vanligvis to ganger i uken.
- For å passere cellene, belegg en plate med VTN-N som beskrevet tidligere i trinn 1.2.1 og 1.2.2.
- Aspirer mediet fra brønnene med celler og vask dem med DPBS.
- Aspirer DPBS og tilsett 1 ml dissosiasjonsreagens (se materialfortegnelse) og inkuber i 1 min.
- Aspirer dissosiasjonsreagenset og inkuber i ytterligere 3 minutter. Bank platen bestemt 10 ganger på hver side.
MERK: Dissosiasjonstrinnet kan trenge celletypespesifikk optimalisering i inkubasjonstiden og bankeprosedyren. - Tilsett 1 ml kulturmedium til cellene og vask en gang med en Pasteur-pipette med mediet for å sikre at de fleste koloniene samles inn.
- Tilsett 150 μL av cellesuspensjonen til hver brønn for å gi et passasjeforhold på 1 brønn inn i 6.
MERK: Umiddelbart etter tining av et nytt hetteglass, er det bedre å passere cellene i et lavere forhold som 1: 1 eller 1: 2 for en eller to passasjer for å tillate dem å nå en jevn vekstfase før de passerer i forholdet 1: 6. - Dyrk cellene i inkubatoren, bytt medium daglig i løpet av uken, og dobbeltmate cellene en gang i løpet av helgen.
- hiPSCs cellelinje fryser
MERK: Frys celler i løpet av de to første passasjene etter tining for å sikre at du opprettholder en konstant lav passasje med frosne hetteglass for å starte kulturen. Frys cellene når de når en konfluens på ca. 80%.- Bytt medium til friskt forvarmet kulturmedium supplert med 20 ng / ml rhbFGF og 5 μL iRock og inkuber i minst 1 time.
- Koble fra cellene som beskrevet i trinn 1.3.2.2-1.3.2.5.
- Samle de frittliggende cellene i et 15 ml sentrifugerør inneholdende 5 ml kulturmedium.
- Sentrifuge i 3 min ved 300 × g ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og tilsett 1 ml kryopreserveringsoppløsning (se materialfortegnelse).
- Bruk en Pasteur-pipette til å pipette cellene forsiktig opp og ned for å blande dem i kryopreserveringsløsningen.
MERK: Unngå overdreven pipettering, noe som kan føre til at celleklyngene løsnes. - Del cellesuspensjonen i to kryopreserveringshetteglass med 0,5 ml hver.
- Overfør hetteglassene med kryopreservering til en kryopreserveringsbeholder som er forkjølt ved 4 °C.
- Overfør beholderen med cellene til en fryser på -80 °C i 24 timer før hetteglassene overføres til flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.
2. Differensiering av hiPSCs i endotelceller
- Fremstilling av differensieringsmedium, cytokiner og vekstfaktorer
- Klargjør serumfritt differensieringsmedium (SFD) i henhold til tabell 1. Bruk dette mediet fra dag 0 til dag 5 av differensiering.
- Klargjør serumfritt medium for CD34+ -celler (SFM-34) ved å tilsette 34 næringstilskudd og 5 ml L-glutamintilskudd til 34 SFM basalmedium (se materialtabell). Bruk dette mediet fra dag 6 av differensiering og utover.
- Resuspender 1 mg CHIR99021 i 716 mikrol DMSO for å oppnå en 3 ml oppløsning. Inkuber ved romtemperatur til den er helt resuspendert; om nødvendig, varm opp raskt ved 37 °C. Lag 20 μL alikoter og oppbevar dem ved -20 °C i opptil 6 måneder. Brukes umiddelbart etter tining og skal ikke fryses igjen eller oppbevares.
- Resuspender cytokinene i henhold til instruksjonene i tilleggstabell S1. Oppbevar alle cytokiners alikoter ved -80 °C.
- Endotelceller differensiering
MERK: For hver dag av differensieringen, klargjør 18 ml (3 ml medium / brønn) av forvarmet SFD-medium, i henhold til cytokinenes blandinger beskrevet i Tabell 2.- Dag 0 - dannelse av embryoide legemer (EB)
- Klargjør 18 ml SFD-medium med Mix 1 cytokin i henhold til tabell 2, for hver 6-brønnsplate (3 ml/brønn).
- Tilsett 2 ml forvarmet SFD-medium med Mix 1 cytokin i hver brønn av en celleavvisende 6-brønnsplate (se materialtabell).
- For å danne EB-er, følg trinnene beskrevet i trinn 1.3.2.2-1.3.2.4.
MERK: Sørg for at hissc-er er 70-80% sammenflytende for å starte differensieringen. - Tilsett 1 ml forvarmet SFD-medium med Mix 1-cytokiner til hver brønn i frittliggende celleklynger.
- Bruk en Pasteur-pipette til forsiktig overføring av celleklyngene til en enkelt brønn med celleavvisende brønn for EB-dannelse i forholdet 1:1.
- Etter å ha plassert platen i inkubatoren, flytt den frem og tilbake, høyre og venstre, for å spre EB-ene jevnt i brønnen.
- Dag 1 - middels bytte til EBs
MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis det på dag 1 av differensieringen er mange enkeltceller i suspensjonen ved siden av EB-ene.- Klargjør 18 ml SFD-medium med Mix 1 cytokin i henhold til tabell 2, for hver 6-brønnsplate (3 ml/brønn).
- Virvle platen med EB-ene for å flytte dem inn i midten og samle dem ved hjelp av en Pasteur-pipette i et 15 ml sentrifugerør.
MERK: Hvis EB-ene ser klumpet sammen som i strenger, skill dem ved å pipetere dem opp og ned med en P1000 før du samler dem inn i 15 ml sentrifugerøret. - Vent 5-10 min til EB-ene har lagt seg i bunnen av røret.
MERK: Hvis EB-ene er for små, sentrifugerer du dem i 5 minutter ved 100 × g for å hjelpe dem med å sette seg. - Vask de celleavvisende platene med sterilt vann eller DPBS for å fjerne enkeltceller eller rusk.
- Aspirer supernatanten forsiktig og langsomt fra EB-ene uten å løsne dem.
- Tilsett 2 ml SFD med Mix 1 cytokiner til hver brønn på de celleavvisende platene.
- Resuspender EB-ene ved å bruke 1 ml SFD-medium med Bland 1-cytokiner for hver startbrønn - tilsett 6 ml medium for en 6-brønnsplate.
- Overfør EB-ene til de celleavvisende platene i 1 ml volum per brønn, som allerede inneholder 2 ml SFD-medium.
- Etter å ha plassert platen i inkubatoren, flytt den frem og tilbake, høyre og venstre, for å spre EB-ene jevnt i brønnen.
- Dag 2 - tillegg av CHIR99021
- Virvle EB-ene inn i midten av platen og tilsett CHIR99021 i henhold til tabell 2 på siden av brønnen for å unngå direkte kontakt med cellene.
MERK: Hvis mediet ikke ble endret på dag 1, erstatt hele mediet i stedet for å legge til CHIR alene. Klargjør 18 ml SFD-medium med blanding 2 i henhold til tabell 2, for hver 6-brønnsplate (3 ml/brønn). - Etter å ha plassert platen i inkubatoren, flytt den frem og tilbake, høyre og venstre, for å spre EB-ene jevnt i brønnen.
- Virvle EB-ene inn i midten av platen og tilsett CHIR99021 i henhold til tabell 2 på siden av brønnen for å unngå direkte kontakt med cellene.
- Dag 3 - middels endring til EBs og tillegg av Mix 3 cytokiner
- Klargjør 18 ml SFD-medium med Bland 3 cytokiner i henhold til tabell 2, for hver 6-brønnsplate (3 ml/brønn).
- Samle inn EB-ene som beskrevet i trinn 2.2.2.2-2.2.2.4.
- Tilsett forvarmet 2 ml SFD-medium med Mix 3-cytokiner til de celleavvisende platene.
- Aspirer supernatanten forsiktig fra EB-ene. Tilsett 1 ml / brønn SFD med Mix 3 cytokiner.
- Fordele EBene mellom brønnene som beskrevet i trinn 2.2.2.8-2.2.2.9.
- Dag 6 - middels endring for SFM-34 og tilsetning av Mix 4 cytokiner
- Klargjør 18 ml SFD-medium med Mix 4 cytokiner i henhold til tabell 2, for hver 6-brønnsplate (3 ml/brønn).
- Samle inn EB-ene som beskrevet i trinn 2.2.2.2-2.2.2.4.
- Tilsett 2 ml forvarmet SFM-34 medium med Mix 4 cytokiner til de celleavvisende platene.
- Aspirer supernatanten forsiktig fra EB-ene. Tilsett 1 ml / brønn SFM-34 med Mix 4 cytokiner.
- Fordele EBene mellom brønnene som beskrevet i trinn 2.2.2.8-2.2.2.9.
- Dag 0 - dannelse av embryoide legemer (EB)
3. CD34+ -celler isoleres og sås inn i brikken
MERK: CD34+ -celler isoleres via en positiv isolasjonstilnærming med et CD34-mikroperlesett (se materialfortegnelse), som inneholder CD34-mikroperler konjugert til monoklonale museantistoffer, anti-humane CD34-antistoffer og FcR-blokkerende reagens (humant IgG). Det er viktig å validere effektiviteten av kolonneisolasjonen ved å farge celler før og etter isolasjonen for flowcytometrianalyse, Nedenfor er det angitt når celler må tas for denne analysen.
- Forbered materialer og reagenser.
- Forbered vaskebuffer ved å tilsette 5 ml 5% BSA-løsning og 200 μL EDTA 0,5 M til 45 ml DPBS for å oppnå PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA. Forbered deg frisk for hver isolasjon, filtrer-steriliser og oppbevar i kjøleskap til bruk.
- Belegg fluidiske chips med lamininoppløsning fremstilt ved å fortynne rhLaminin 521 1:50 i DPBS Ca 2+ Mg2+. Belegg hver brikke med riktig volum for brikken i bruk og inkuber i inkubatoren i 2 timer før såing.
MERK: Andre matriser kan brukes til belegget og bør testes for den spesifikke celletypen / eksperimentet. - Forbered Bland 4 SFM-34 medium ved å supplere 18 ml SFM-34 medium med Mix 4 cytokiner i henhold til tabell 2 og legg blandingen i et 50 ml rør i inkubatoren med lokket litt skrudd ut for å lette gassutveksling.
- Plasser de valgte perfusjonssettene og eventuelle andre slanger som skal brukes i inkubatoren til degas.
- Dag 8 - dissosiasjon av EBs og CD34+ isolasjon
- Samle EB-ene som beskrevet i trinn 2.2.2.2-2.2.2.5.
- Tilsett 1 ml celledissosiasjonsreagens per startbrønn av EB samlet (hvis 6 brønner ble samlet, tilsett 6 ml).
- Overfør tilbake 1 ml av EB-suspensjonen i celledissosiasjonsreagenset til hver brønn i den celleavvisende platen.
- Inkuber i 10 minutter i inkubatoren.
- Pipetter EB-ene forsiktig opp og ned mot brønnen med en P1000, ikke mer enn 10 ganger.
- Gjenta trinn 3.2.4-3.2.5.for totalt 3x.
MERK: Hvis EB-ene er vanskelige å dissosiere, gjenta trinnene ovenfor 4x totalt. - Tilsett 5 ml vaskebuffer for hver brønn med dissosierte EB-er.
- Samle cellene i et 50 ml sentrifugerør ved å føre dem gjennom en 40 μm sil. Ta 10 μL av cellesuspensjonen for å telle cellene.
MERK: For å teste effektiviteten av isolasjonen, overfør 105 celler/rør til to forskjellige rør (ufarget kontroll og utskiftet testprøve) som vil bli brukt senere for flowcytometri (som beskrevet i trinn 4.3.9-4.3.13). For en 6-brønnsplate skal ~106 celler samles etter filtrering. - Spinn cellene ned i 10 minutter ved 300 × g.
- Resuspender cellene i 300 μL vaskebuffer, pipetter forsiktig noen ganger for å sikre at det ikke er klumper. Fortsett å følge produsentens protokoll (se Materialfortegnelse).
- CD34+ cellesåing i fluidbrikker
MERK: Den fluidiske brikken som brukes i protokollen har en kanalhøyde på 0,6 mm og lengde på 50 mm, for et totalt vekstområde på 2,5 cm2 (tilleggsfigur S1). Denne typen chip er frøet med et totalt volum cellesuspensjon på 150 μL. Ulike sjetonger kan brukes, og volumet av såing og celletettheten skal tilpasses i henhold til vekstområdet. Ytterligere optimalisering kan være nødvendig, avhengig av cellelinjen som brukes og dens vekst.- Resuspender de isolerte CD34+ -cellene i 300 μL forvarmet SFM-34-medium med Mix 4-cytokiner.
- Ta 10 μL av cellesuspensjonen og telle cellene.
- Resuspend 2,5 × 105 celler i et endelig volum på 150 μL supplert SFM-34; tilsett 0,5 μL iRock.
MERK: For å teste effektiviteten av isolasjonen, overfør 105 celler/rør til et rør (ettersortert testprøve) som skal brukes senere for flowcytometri (som beskrevet i trinn 4.3.9-4.3.13). - Aspirer laminin sakte fra fluidiske chips ved å sette spissen av en P200 inne i reservoaret på kanten av kanalen.
MERK: Hvis væsken er vanskelig å samle opp, løft sakte den ene siden av brikken for å hjelpe væsken til å bevege seg til motsatt reservoar. - Legg cellesuspensjonen jevnt inn i kanalen for å sikre at det ikke dannes bobler.
MERK: Utfør trinn 3.3.4-3.3.5 raskt, men forsiktig for å unngå at laminin tørker ut og danner bobler i kanalene til brikken. Hvis det dannes bobler, løfter du den ene siden av brikken og banker forsiktig på lysbildet for å mobilisere boblene; Når de når reservoaret, vil de stige til luftgrensesnittet og bør ikke kunne leie kanalen. - Overfør brikken til inkubatoren og la dem stå over natten slik at cellene er helt festet til kanalen og ser langstrakte ut.
- Når cellene er fullt festet, aspirerer du mediet som i trinn 3.3.4 og erstatter det med 200 μL cytokinsupplert SFM-34.
- Fra nå av, bytt ut mediet daglig til cellene har nådd 90% -100% sammenløp.
4. Påføring av kontinuerlig strømning til endotelceller - Aorta-on-a-chip
- Forbered materialer og reagenser.
- Forbered Mix 4 SFM-34 medium ved å supplere 18 ml SFM-34 medium med Mix 4 cytokiner i henhold til tabell 2 og legg det i et 50 ml rør i inkubatoren med lokket litt skrudd ut for å lette gassutveksling.
- Plasser de valgte perfusjonssettene og eventuelle slanger som skal brukes til fluidoppsettet i inkubatoren til degas.
- Fluidisk systemmontering
- Monter perfusjonssettet i enheten i henhold til produsentens protokoll.
MERK: Husk å bruke klemmer i systemet. Hvis glideklemmer brukes til dette trinnet, må de skyves på slangen før du kobler til brikken. - Fest en ny fluidic chip og legg til cytokin-supplert SFM-34 medium, og sørg for å fylle begge reservoarene under sterile forhold i hetten.
- Utfør boblefjerningsprogrammet og kalibreringstrinnet.
- Fjern den fluidiske enheten med det tilkoblede settet fra inkubatoren og overfør den inn i hetten; Ta også sjetongene som inneholder cellene fra inkubatoren.
- Klem slangen på begge sider av testbrikken.
- Fjern slangen fra testbrikken.
MERK: Kontroller at det ikke er noen bobler i Luer-koblingen på enden av slangen. Hvis bobler er synlige, aspirerer du dem forsiktig med en P200-pipette og tilsett om nødvendig mer medium for å sikre at kontakten er fylt med medium. - Koble brikken som inneholder cellene med slangen.
- Fjern eller åpne klemmene.
- Overfør systemet til inkubatoren og koble luftpumpen til fluidenheten.
- Start det forhåndsvalgte programmet ved hjelp av den pumpededikerte programvaren (tilleggsfigur S2) med den gradvise økningen av skjærspenning beskrevet i tabell 3.
MERK: Avhengig av det spesifikke eksperimentet som trengs, kan stimuleringsprogrammet trenge optimalisering. Beskrevet her er en gradvis økning av skjærspenning som fører til den endelige verdien på 5 dyn/cm2, som etterligner skjærspenningen beregnet for å oppleves av veggen i dorsalaorta ved begynnelsen av fostersirkulasjonen 9. Uavhengig av den endelige skjærspenningen som vil bli anvendt, er det nødvendig å gradvis øke over tid for å tillate cellene å tilpasse seg kraften uten å få cellene til å løsne fra brikken. Hvis den valgte stimuleringsprotokollen er lengre enn 3 dager, bør cytokiner fylles på i systemet ved å tilsette 1 ml SFM-34 inneholdende Mix 4-cytokiner som normalt vil bli tilsatt i 18 ml. For å gjøre dette settes pumpeprogrammet raskt på pause og 500 μL supplert medium tilsettes hver av de to sprøytene i fluidsettet.
- Monter perfusjonssettet i enheten i henhold til produsentens protokoll.
- Cellesamling for analyse
- Forvarm dissosiasjonsbufferen i et vannbad.
- Fjern den fluidiske enheten fra inkubatoren og flytt den inn i hetten.
- Klem slangen som flankerer brikken på begge sider og fjern slangen fra reservoarene på brikken.
- Fjern mediet forsiktig fra brikken og erstatt det med DPBS Ca 2+ Mg2+ for å vaske cellene.
MERK: Dette trinnet med vask med PBS kan hoppes over hvis cellene begynner å løsne. - Tilsett forsiktig 150 μL dissosiasjonsbuffer og inkuber i 3 minutter ved 37 °C.
MERK: Sjekk under mikroskopet om cellene er enkle og frittliggende; Ellers ruge i ytterligere 2 minutter. Det er viktig at cellene er helt løsrevet fra kanalen før aspirering av mediet, da brikken ikke tillater å hjelpe cellefrigjøring ved pipettering. Andre løsninger kan brukes til å løsne cellene, for eksempel trypsin eller EDTA-baserte buffere. - Samle dissosiasjonsbufferen som inneholder cellene fra ett reservoar og overfør til et 15 ml sentrifugerør og vask kanalen en gang med DPBS for å samle alle de frittliggende cellene.
- Tilsett 1 ml vaskebuffer til 15 ml røret med cellene og ta 10 μL for å telle cellene.
- Del cellesuspensjonen i flowcytometrirør for å ha 105 celler per reagensrør.
- Spinn rørene i 5 minutter ved 300 × g.
- Forbered fargeløsningen for å ha 50 μL for hvert reagensrør for å flekke. Tilsett CD34 PerCP-efluor710 eller CD34-PE ved henholdsvis 1:100 og 1:200 fortynning.
- Resuspender cellene i 50 μL fargeoppløsning og inkuber i 30 minutter ved 4 °C.
- Vask cellene ved å tilsette 2 ml vaskebuffer og sentrifugerer i 5 minutter ved 300 × g.
- Resuspender pellets i 100 μL fargeoppløsning og samle inn dataene ved hjelp av et flowcytometer.
MERK: Cellene kan også lyseres direkte i brikken for RNA-ekstraksjon ved bruk av 150 μL RNA-lysisbuffer eller fikseres for avbildning ved bruk av 4% paraformaldehyd i DPBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Analyse av celleorientering
- Analyser bildene for å kvantifisere endringer i celleretning ved hjelp av FIJI23 (tilleggsfigur S3).
- Åpne Region of Interest (ROI) manager fra Analyser | Verktøy | ROI manager-menyen .
- Tegn celleprofilene manuelt ved hjelp av mangekantmerkingsverktøyet , og legg dem til i ROI-behandling ved å klikke Legg til eller bruke CTRL+T-snarveien .
- Mål retningen for hver avkastning ved å velge Tilpass-ellipsemålet i Analyser | Angi Målinger-menyen .
- Bruk målingen på alle avkastninger gjennom Mer... Kommandoen Flere mål i ROI-behandleren.
MERK: Dette trinnet vil tilpasse en ellipse til hver avkastning og generere en tabell som inneholder lengden på de store og mindre ellipseaksene, samt vinkelen. - Eksporter tabellen til en CSV-fil som skal importeres til annen programvare for å plotte.
MERK: Skriptet som brukes til plottene er tilgjengelig på https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf885
0ddc.
- Analyser bildene for å kvantifisere endringer i celleretning ved hjelp av FIJI23 (tilleggsfigur S3).
Representative Results
Vi beskriver her en protokoll for differensiering og mekanostimulering av endotelceller avledet fra hiPSCer som gjør det mulig å studere deres respons på mekaniske signaler (figur 1). Denne protokollen resulterer i produksjon av funksjonelt mekanosensitive endotelceller. Vi gir her representative resultater og beskriver forventet fenotype for å vurdere hvordan cellene reagerer på cytokinstimuleringen under differensieringen.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av differensiering og mekanisk stimuleringsprotokoll. Skjematisk fremstilling av differensieringsprotokollen som viser tidspunktet for de forskjellige blandingene av cytokiner, CD34+ -celleisolasjonen, fluidbrikkesåing og endelig analyse av de mekanisk stimulerte cellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Kultur av hiPSCs
Det er viktig å starte protokollen fra hissc-er som vokser riktig under selvfornyelsesforhold. En god indikasjon på kvaliteten på kulturen er hastigheten på veksten. Etter tining kan cellene trenge 2-3 uker for å nå riktig vekstfase som vil sikre god differensiering. Når cellene kan passeres to ganger i uken i forholdet 1: 6 og når nesten full sammenløp, er dette tiden de er klare til å bli differensiert på samme dag som de må passeres.
Differensiering av hiPSCs i endotelceller
Det første trinnet i differensieringen, som består av dannelsen av embryoidlegemer (EB), er cellelinjeavhengig og kan trenge litt optimalisering for den spesifikke cellelinjen som brukes. Dissosiasjonen beskrevet i protokolltrinn 1.3.2.2-1.3.2.4 kan modifiseres ved enten å redusere eller utvide inkubasjonen med dissosiasjonsreagenset og den påfølgende dissosiasjonen med Pasteur-pipetten. Videre kan andre dissosiasjonsreagenser brukes til dette trinnet i tillegg til den fysiske dissosiasjonen av koloniene med et skjæreverktøy eller en P100 pipettespiss. EB av god kvalitet viser en definert kant ved dag 2 av differensieringen og virker klare og lyse når de observeres ved hjelp av et mikroskop; mørkere områder kan indikere celledød i EB (figur 2).
Figur 2: Morfologi for embryoide legemer. (A) Dag 2 embryoide legemer som viser veldefinerte ytterkanter og konsistent størrelse. (B) Dag 2 embryoide legemer av dårlig kvalitet som viser omfattende celledød som fører til disaggregering av strukturen. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
På dag 2 hemmer tilsetning av CHIR99021 til EBs GSK-3-proteinet, noe som resulterer i aktivering av Wnt-banen. Ulike cellelinjer har ulik respons på CIR-behandling, og dette bør testes ved å kvantifisere antall CD34+ -celler oppnådd ved dag 8 ved bruk av ulike konsentrasjoner (figur 3).
Figur 3 Endotelcelledifferensiering med ulike CIR-behandlinger. Endotelcelleforpliktelse kvantifisert ved flowcytometri ved dag 8 av differensiering ved CD34-membranekspresjon, etter CIR-behandling ved dag 2 ved (A) 3 μM, (B) 5 μM og (C) 7 μM. Flowcytometridata ble innhentet ved hjelp av femlasercytometre og dedikert programvare (se materialfortegnelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
CD34+ celleisolasjon
Det er viktig å validere at CD34+-anrikningen ved hjelp av magnetkulene gir minst 80 % CD34+ etter eluering av kolonnen. For å sikre tilstrekkelig renhet, kan en alikot av celler oppnådd fra magnetisk isolasjon analyseres ved flowcytometri, og sørg for å bruke en annen antistoffklon enn den som brukes til magnetisk anrikning. Her ble 4H11-klonen brukt og ~85% renhet ble oppnådd etter anrikning (figur 4).
Figur 4: Membranuttrykk av CD34 før og etter anrikning ved magnetisk sortering. Dag 8 ble dissosierte embryoidlegemer (grå) og celler etter magnetisk anrikning (grønn) farget for CD34-ekspresjon og analysert ved flowcytometri, og viste vellykket anrikning etter sortering. Flowcytometridata ble innhentet ved hjelp av fem-laser cytometre og dedikert programvare (se Materialfortegnelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Såing celler inn i fluidkanalen
Når du sår cellene i den fluidiske kanalen, er det avgjørende å spore vedheft og spredning av endotelcellene. Etter såing tar cellene ~ 5 timer for å feste seg helt til kanalen (figur 5A). En alternativ overflatebehandlingsløsning kan også testes for å forbedre vedheft på dette stadiet. For å bekrefte at de testede cellene er mekanosensitive og dermed i stand til å reagere på mekanisk stimulering, kan celleorienteringen testes over tid. Celler før stimuleringen viser tilfeldig orientering (figur 5A og figur 5C) og de reorienterer parallelt med strømningsretningen (figur 5B,C). Protokollen beskrevet her tillater innsamling av cellene fra kanalen for å utføre nedstrømsanalyse, for eksempel flowcytometri, for studiet av deres membranimmunofenotype, som gir endotelidentiteten til de stimulerte cellene (figur 5D, E).
Figur 5: Mekanoresponsivitet av hiPSCs-deriverte endotelceller . (A) Konfluent lag av isolerte CD34+ -celler 48 timer etter såing. (B) Reorientert lag av endotelceller 3 dager under dynamisk kultur. (C) Orienteringsanalyse av endotelceller etter 5 dager med dynamisk kultur. (D) CD34-ekspresjonsprofil av celler dyrket under strømning i 5 dager. (E) Prosentandel av CD34+ celler i cellepopulasjonen hentet fra den fluidiske kanalen. Bildene ble tatt ved hjelp av et invertert inkubatormikroskop; flowcytometridata ble innhentet ved hjelp av fem-laser cytometre og dedikert programvare (se Materialfortegnelse). Skalastenger = 100 μm (A,B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagenser | Konsentrasjon av aksjer | Volum lagt til | Endelig konsentrasjon |
| Iscoves modifiserte Dulbecco's Medium (IMDM) | - | 333 ml | - |
| Skinkes F-12 næringsblanding (F-12) | - | 167 ml | - |
| N-2 tillegg (100x) | 100 x | 5 ml | 1x |
| B-27 tillegg (50x) | 50 x | 10 ml | 1x |
| Askorbinsyre | 10 mg/ml | 1,25 ml | 25 μg/ml |
| α-monotioglyserol (MTG) | 11,5 M | 19,5 μL | 448,5 μM |
| Humant serumalbumin | 100 mg/ml | 2,5 ml | 0,5 mg/ml |
| Holo-Transferrin | 100 mg/ml | 0,75 ml | 150 μg/ml |
Tabell 1: Sammensetning og oppskrift på 500 ml serumfritt differensieringsmedium (SFD).
| Dager med differensiering | Cytokin blanding | Cytokin | Endelig konsentrasjon |
| Dag 0 - 2 | Bland 1 | BMP4 | 20 ng/ml |
| Dag 2 | Bland 2 | CHIR99021 | 7 μM |
| Fra dag 3 og fremover | Bland 3 og 4 | VEGF | 15 ng/ml |
| bFGF | 5 ng/ml | ||
| Fra dag 6 og fremover | Bland 4 | IL6 | 10 ng/ml |
| FLT3L | 10 ng/ml | ||
| IGF1 | 25 ng/ml | ||
| IL11 | 5 ng/ml | ||
| SCF | 50 ng/ml | ||
| EPO | 3 E/ml | ||
| TPO | 30 ng/ml | ||
| IL3 | 30 ng/ml |
Tabell 2: Blandinger av cytokiner brukt til endotelcelledifferensiering, dager de tilsettes SFD-mediet og endelig konsentrasjon.
| Skjærspenning (dyn/cm2) | Tid (h) |
| 0.5 | 1 |
| 1 | 1 |
| 1.5 | 1 |
| 2 | 1 |
| 2.5 | 1 |
| 3 | 1 |
| 3.5 | 1 |
| 4 | 1 |
| 4.5 | 1 |
| 5 | Til slutten av eksperimentet |
Tabell 3: Skjærspenningsverdier for den dynamiske kulturen og lengden på søknaden.
Tilleggsfigur S1: Geometri og dimensjoner på brikken og røret som brukes til denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Trinnvis veiledning for programvaren som styrer luftpumpen med en beskrivelse av hvert trinn. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S3: Veiledning for orienteringsanalyse ved hjelp av FIJI som viser tegningen av celleformen, elliptisk tilpasning og endelig måling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Enhetsstørrelse, resuspensjonsvolum og stamkonsentrasjoner for cytokiner brukt i differensieringsprotokoll. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Protokollen som vi beskriver her tillater generering av mekanosensitive endotelceller fra humane pluripotente stamceller og studiet av deres respons på mekanisk stimulering mediert av kontrollert skjærspenning. Denne protokollen er helt cytokinbasert og fullt kompatibel med GMP-reagenser for potensiell oversettelse til produksjon av celler for celleterapi.
Utledningen av hiPSCs gir forskere en instrumentell modell for de tidlige stadiene av embryonal utvikling som muliggjør studier av prosesser som ellers er vanskelige å studere in vivo24. Faktisk samles humane embryonale vev tilgjengelig for forskning fra embryoer som mangler sirkulasjon, og dette kan ha en betydelig innvirkning på molekylærsignaturen kontrollert av mekaniske tegn. Tilnærmingen beskrevet her muliggjør live-imaging og sanntidsstudie av cellerespons på skjærspenning. Kombinasjonen av hissc med fluidikk gir en studiemodell som overvinner den begrensede tilgjengeligheten og utilgjengeligheten av det utviklende fostervevet når initiering av sirkulasjon remodellerer og kontrollerer etableringen av kardiovaskulær og blodsystem 3,9,10,25.
En begrensning av protokollen er at endotelceller avledet fra denne protokollen kanskje ikke gjenspeiler de forskjellige identitetene til forskjellige endotelceller som er tilstede i det utviklende vevet. For å overvinne denne begrensningen kan det være nødvendig med en spesifikk kombinasjon av cytokiner under differensieringsprosessen forut for den fluidiske stimuleringen for å oppnå ønsket identitet eller vevsspesifikk fenotype26. Isoleringen av endotelundergrupper kan oppnås ved bruk av en mer raffinert immunfenotype under isolasjonstrinnet. Denne protokollen isolerer endotelceller basert bare på ekspresjonen av CD34, og tillater dermed kolonneisolering i stedet for fluorescensaktivert cellesortering (FACS); Dette reduserer celledød og risikoen for forurensning. Videre er denne protokollen spesielt utviklet for å studere rollen som skjærspenning mediert av laminær strømning. Alternative fluidiske tilnærminger må brukes til å studere effekten av andre mekaniske signaler, for eksempel strekking eller kompresjon, eller andre typer strømning som forstyrret eller forstyrret strømning.
Vi har tidligere vist at iPSC-deriverte endotelceller etterligner de heterogene arteriovenøse cellulære identitetene27 tilsvarende det som er observert i fosterets dorsale aorta28,29,30. Dette er spesielt viktig i sammenheng med fartøyutvikling og cellulær spesifikasjon, kjent for å bli kontrollert av blodsirkulasjonen. Studier i ulike modeller viste at manglende sirkulasjon resulterer i endret arteriovenøs spesifikasjon11,14,31. Mekanismene som forbinder mekaniske signaler med cellespesifikasjon er fortsatt ukjente, og rørledningen beskrevet her tillater raffinerte funksjonelle studier som ikke kunne testes in vivo.
Denne rørledningen beskriver produksjon og stimulering av endotelceller avledet fra hiPSCer ved bruk av kommersielt tilgjengelige fluidiske kanaler, og unngår behovet for støping av enhetene som for de mye brukte polydimetylsiloksan (PDMS) enhetene12. Videre gjør bruken av PDMS-brikker samlingen av de stimulerte cellene spesielt utfordrende, mens med denne protokollen kan cellene enkelt hentes fra kanalen. Dette forbedrer analysekraften betydelig, noe som muliggjør påfølgende analyser som proteomiske og transkriptomiske analyser, flowcytometri og funksjonelle analyser, som kan trenge ytterligere kultur eller in vivo-analyser .
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Research Advanced Grant 2021 fra European Hematology Association, Global Research Award 2021 fra American Society of Hematology, og Internal Strategy Support Fund ISSF3 finansiert av Welcome Trust og University of Edinburgh. Vi takker Fiona Rossi fra Flow Cytometry Facility for støtte i flowcytometrianalysen. For formålet med åpen tilgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY)-lisens på enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
| 25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
| 6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
| Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
| Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
| BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
| BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
| bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
| CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
| CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
| CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
| Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
| CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
| Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
| DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
| EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
| EDTA | Life technologies | 15575020 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
| Fiji | Version 1.53c | ||
| Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
| Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
| Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
| Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
| Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
| Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
| IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
| Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
| Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
| MTG | Merck | M6145-25ML | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
| Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
| Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
| Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
| Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
| Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
| Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
| ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
| rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
| rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
| rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
| rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
| rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
| rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
| rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
| rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
| rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
| RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
| StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
| StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
| StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
| StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
| Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Copp, A. J. Death before birth: clues from gene knockouts and mutations. Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).
- Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. Hemodynamic control of endothelial cell fates in development. Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).
- Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis. Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).
- Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny. Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).
- Zovein, A. C., et al. Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
- Adamo, L., et al. Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis. Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).
- Diaz, M. F., et al. Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis. Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Lundin, V., et al. YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow. Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).
- Li, J., et al. Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development. Cell Reports. 40 (11), 111339 (2022).
- Azzoni, E., et al. The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition. Cell Reports. 37 (11), 110103 (2021).
- Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Batsivari, A., et al. Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture. Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).
- Canu, G., et al. Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation. Genome Biology. 21 (1), 157 (2020).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).
- Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219 (2018).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).
- Fidanza, A., et al. Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs. Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs. Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).
- Petazzi, P., et al. Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2. bioRxiv. , (2022).
- Crosse, E. I., et al. Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 27 (5), 822 (2020).
- Calvanese, V., et al. Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth. Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).
- Zeng, Y., et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).
- Hwa, J. J., et al. Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow. Scientific Reports. 7 (1), 11965 (2017).
