Summary
Här beskrivs ett enkelt arbetsflöde för att skilja endotelceller från humana pluripotenta stamceller följt av ett detaljerat protokoll för deras mekaniska stimulering. Detta gör det möjligt att studera endotelcellernas utvecklingsmekanobiologi. Detta tillvägagångssätt är kompatibelt med nedströmsanalyser av levande celler som samlats in från odlingschipet efter mekanisk stimulering.
Abstract
Hjärtat är det första organet som etableras funktionellt under utvecklingen, vilket sätter igång blodcirkulationen mycket tidigt i dräktigheten. Förutom att transportera syre och näringsämnen för att säkerställa fostrets tillväxt, kontrollerar fostrets cirkulation många avgörande utvecklingshändelser som äger rum i endotelskiktet genom mekaniska signaler. Biomekaniska signaler inducerar strukturella förändringar i blodkärlen, etablerar arteriovenös specifikation och styr utvecklingen av hematopoetiska stamceller. Otillgängligheten av de framväxande vävnaderna begränsar förståelsen av cirkulationens roll i människans tidiga utveckling; Därför är in vitro-modeller centrala verktyg för studier av kärlmekanobiologi. Denna artikel beskriver ett protokoll för att differentiera endotelceller från humant inducerade pluripotenta stamceller och deras efterföljande sådd i en fluidisk enhet för att studera deras svar på mekaniska signaler. Detta tillvägagångssätt möjliggör långsiktig odling av endotelceller under mekanisk stimulering följt av hämtning av endotelcellerna för fenotypisk och funktionell karakterisering. In vitro-modellen som etablerats här kommer att vara avgörande för att belysa de intracellulära molekylära mekanismer som transducerar signaleringen medierad av mekaniska signaler, som i slutändan orkestrerar kärlutveckling under människans fosterliv.
Introduction
Under embryonal utveckling är hjärtat det första organet som etablerar funktionalitet1, med detekterbara sammandragningar från det tidigaste stadiet av endokardiell rörbildning2. Cirkulationen, tillsammans med de mekaniska signaler som förmedlas av blodflödet i kärlet, styr många viktiga aspekter av den tidiga utvecklingen. Före etablering av fostrets cirkulation är kärlen organiserad i en primär kapillär plexus; Vid hjärtfunktion omorganiseras denna plexus till venös och arteriell vaskulatur3. De mekaniska signalernas roll i arteriovenös specifikation återspeglas av pan-endoteluttrycket av arteriella och venösa markörer innan blodflödet initieras4.
Hemodynamiska krafter styr inte bara utvecklingen av själva kärlet utan spelar också en grundläggande roll i kontrollen av blodkroppsbildningen. Hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) uppstår från specialiserade endotelceller som kallas hemogent endotel 5,6,7,8, som finns i olika anatomiska regioner av embryona uteslutande i det tidiga utvecklingsstadiet. Modeller med hjärtbrist, tillsammans med in vitro-modeller, har visat att mekaniska signaler instruerar och ökar HSPC-produktionen från det hemogena endotelet 9,10,11,12,13,14.
Olika typer av flödesdynamik har visat sig differentiera cellcykeln15, som är kända för att vara viktiga i både hemogent endotel 16,17 och arteriell cellspecifikation18. Sammantaget är mekaniska signaler avgörande faktorer för cellens identitet och funktion under utvecklingen. Nya in vitro-vätskekomponenter gör det möjligt för oss att övervinna de begränsningar som är förknippade med att studera utvecklingsmekanobiologi under mänsklig blodutveckling in vivo.
Det övergripande målet med protokollet i detta manuskript är att beskriva, steg för steg, den experimentella pipelinen för att studera effekten av skjuvstress på humana endotelceller som härrör in vitro från humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs). Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner om differentiering av hiPSCs till endotelceller och deras efterföljande sådd till fluidiska chips för stimuleringsprotokollet. Med hjälp av detta kan olika in vitro-härledda endotelceller testas för sin förmåga att känna av skjuvspänningen genom att analysera deras orientering som svar på flödet. Detta kommer att göra det möjligt för andra laboratorier att ta itu med frågor om responsen på skjuvspänning och dess funktionella konsekvenser på olika endotelcellsidentiteter.
Protocol
OBS: Alla cellodlingstekniker måste utföras under sterila förhållanden i en huva med laminärt flöde och cellerna måste inkuberas vid 37 °C i en humifierad atmosfär med 5 % CO2 . Instruktioner för all cytokinberedning för både underhållsbehandling (rhbFGF) och för differentieringsprotokollet (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) finns i tilläggstabell S1.
1. Odling av hiPSCs - upptining, underhåll och frysning av celler
- Beredning av underhållsmedium, tillväxtfaktorer och andra reagenser
- Bered odlingsmediet genom att tillsätta hela hESC-serumfria mediumtillskottet, 36 ml 25 % bovint serumalbumin (BSA) och 1 ml 55 mM β-merkaptoetanol till Dulbeccos Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) basala medium (se materialtabell).
- Återsuspendera 1 mg rhokinashämmare (iRock) i 1 ml DMSO, späd alikvoter på 50 μl och förvara dem vid -20 °C.
OBS: Dessa alikvoter kan förvaras vid -20 °C i 1 år. När de har tinats kan de förvaras vid 4 °C i 1 vecka. - Tina vitronektinlösningen (VTN-N) på is och alikvot 60 μl per injektionsflaska före förvaring vid -80 °C. Strax före beläggningen av plattorna, späd 60 μL-stammen i 6 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS); koncentrationen på 5 μg/ml.
- hiPSC-cellinje tinar
OBS: Den humana pluripotenta stamcellslinjen SFCi55 har tidigare tagits fram internt och använts i stor utsträckning för differentiering till olika celltyper och olika embryonala linjer 19,20,21,22.- Täck en brunn på en 6-hålsplatta med 1 ml VTN-N-lösning i 1 timme vid 37 °C.
OBS: Efter inkubation kan belagda plattor förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka. - Aspirera VTN-N-lösningen med en aspirationspipett och tillsätt 1 ml förvärmt odlingsmedium kompletterat med 20 ng/ml rhbFGF (tilläggstabell S1).
- Tina snabbt injektionsflaskan med hiPSC i ett vattenbad och överför cellen till 5 ml förvärmt odlingsmedium.
- Snurra cellerna i 3 minuter vid 300 × g vid rumstemperatur.
- Återsuspendera cellpelleten i 0,5 ml odlingsmedium kompletterat med 20 ng/ml rhbFGF.
- Överför cellerna till en belagd brunn som redan innehåller 1 ml medium.
- Tillsätt 5 μL iRock i brunnarna som innehåller cellerna i totalt 1,5 ml medium.
- Odla cellerna i inkubatorn, byt medium dagligen under veckan och dubbelmata cellerna, tillsätt dubbelt så mycket medium som normalt medium till cellerna för att säkerställa utfodring under helgen.
OBS: Celler odlas endast i närvaro av iRock i 24 timmar.
- Täck en brunn på en 6-hålsplatta med 1 ml VTN-N-lösning i 1 timme vid 37 °C.
- Underhåll och passering av hiPSC:er
- Byt medium dagligen mot färskt förvärmt odlingsmedium kompletterat med 20 ng/ml rhbFGF.
- Passera cellerna när de når cirka 80 % sammanflöde, vanligtvis två gånger i veckan.
- För att passera cellerna, belägg en platta med VTN-N enligt beskrivningen tidigare i steg 1.2.1 och 1.2.2.
- Aspirera mediet från brunnarna med celler och tvätta dem med DPBS.
- Aspirera DPBS och tillsätt 1 ml dissociationsreagens (se materialtabell) och inkubera i 1 min.
- Aspirera dissociationsreagenset och inkubera i ytterligare 3 minuter. Knacka ordentligt på plattan 10 gånger på varje sida.
OBS: Dissociationssteget kan behöva celltypsspecifik optimering i inkubationstiden och tappningsproceduren. - Tillsätt 1 ml odlingsmedium till cellerna och tvätta med en Pasteurpipett en gång med mediet för att säkerställa att de flesta av kolonierna samlas upp.
- Tillsätt 150 μl cellsuspension till varje brunn för att få ett passageförhållande på 1 brunn till 6.
OBS: Omedelbart efter upptining av en ny injektionsflaska är det bättre att passera cellerna i ett lägre förhållande som 1:1 eller 1:2 för en eller två passager så att de kan nå en stadig tillväxtfas innan de passerar i förhållandet 1:6. - Odla cellerna i inkubatorn, byt medium dagligen under veckan och dubbelmata cellerna en gång under helgen.
- hiPSCs cellinjefrysning
OBS: Frys cellerna i deras två första passager efter upptining för att säkerställa att bibehålla en konstant låg passage av frysta ampuller för att starta odlingen. Frys cellerna när de når ett sammanflöde på cirka 80 %.- Byt ut mediet till färskt förvärmt odlingsmedium kompletterat med 20 ng/ml rhbFGF och 5 μL iRock och inkubera i minst 1 timme.
- Lossa cellerna enligt beskrivningen i steg 1.3.2.2-1.3.2.5.
- Samla upp de lossnade cellerna i ett 15 ml centrifugrör som innehåller 5 ml odlingsmedium.
- Centrifugera i 3 minuter vid 300 × g vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 1 ml kryokonserveringslösning (se Materialförteckning).
- Använd en Pasteur-pipett och pipettera försiktigt cellerna upp och ner för att blanda dem i kryokonserveringslösningen.
OBS: Undvik överdriven pipettering, vilket kan leda till att cellklustren dissocieras. - Dela cellsuspensionen i två injektionsflaskor med kryokonservering på 0,5 ml vardera.
- Överför injektionsflaskorna för kryokonservering till en kryokonserveringsbehållare som förkyls vid 4 °C.
- Överför behållaren med cellerna till en frys på -80 °C i 24 timmar innan injektionsflaskorna överförs till flytande kväve för långtidsförvaring.
2. Differentiering av hiPSCs till endotelceller
- Beredning av differentieringsmedium, cytokiner och tillväxtfaktorer
- Bered serumfritt differentieringsmedium (SFD) enligt tabell 1. Använd detta medium från dag 0 till dag 5 av differentiering.
- Förbered serumfritt medium för CD34+ -celler (SFM-34) genom att tillsätta 34 näringstillskott och 5 ml L-glutamintillskott till 34 SFM Basal Medium (se materialförteckning). Använd detta medium från dag 6 av differentiering och framåt.
- Återsuspendera 1 mg CHIR99021 i 716 μl DMSO för att erhålla en lösning på 3 mM. Inkubera i rumstemperatur tills den är helt återupplivad. vid behov, värm upp snabbt vid 37 °C. Gör 20 μL alikvoter och förvara dem vid -20 °C i upp till 6 månader. Använd omedelbart efter upptining och frys inte igen eller förvara.
- Återsuspendera cytokinerna enligt instruktionerna i tilläggstabell S1. Förvara alla cytokiners alikvoter vid -80 °C.
- Differentiering av endotelceller
OBS: För varje dag av differentiering, förbered 18 ml (3 ml medium/brunn) förvärmt SFD-medium, enligt cytokinernas blandningar som beskrivs i Tabell 2.- Dag 0 - bildning av embryoidkroppar (EB)
- Bered 18 ml SFD-medium med blandning 1 cytokin enligt tabell 2, för varje 6-hålsplatta (3 ml/brunn).
- Tillsätt 2 ml förvärmt SFD-medium med Mix 1-cytokin i varje brunn på en cellavvisande 6-hålsplatta (se materialtabell).
- För att bilda EB, följ stegen som beskrivs i steg 1.3.2.2-1.3.2.4.
OBS: Se till att hiPSCs är 70-80 % sammanflytande för att starta differentieringen. - Tillsätt 1 ml förvärmt SFD-medium med Mix 1-cytokiner till varje brunn med fristående cellkluster.
- Använd en Pasteur-pipett för att försiktigt överföra cellklustren till en enda brunn med cellavvisande brunn för EB-bildning i förhållandet 1:1.
- Efter att ha placerat plattan i inkubatorn, flytta den framåt och bakåt, höger och vänster, för att fördela EB:erna jämnt i brunnen.
- Dag 1 - medelstor förändring av EB
OBS: Detta steg är endast nödvändigt om det vid dag 1 av differentieringen finns många enstaka celler i suspension tillsammans med EB.- Bered 18 ml SFD-medium med blandning 1 cytokin enligt tabell 2, för varje 6-hålsplatta (3 ml/brunn).
- Snurra plattan med EB:erna för att flytta dem in i mitten och samla upp dem med hjälp av en Pasteur-pipett i ett 15 ml centrifugrör.
OBS: Om EB:erna ser klumpade ihop som i strängar, separera dem genom att pipettera dem upp och ner med en P1000 innan du samlar upp dem i 15 ml centrifugröret. - Vänta 5-10 minuter tills EB har lagt sig i botten av röret.
OBS: Om EB är för små, centrifugera dem i 5 minuter vid 100 × g för att hjälpa dem att sätta sig. - Tvätta de cellavvisande plattorna med sterilt vatten eller DPBS för att ta bort enstaka celler eller skräp.
- Aspirera försiktigt och långsamt supernatanten från EB utan att rubba dem.
- Tillsätt 2 ml SFD med Mix 1-cytokiner till varje brunn på de cellavvisande plattorna.
- Återsuspendera EB med 1 ml SFD-medium med Mix 1-cytokiner för varje startbrunn - för en 6-hålsplatta, tillsätt 6 ml medium.
- Överför EB till de cellavvisande plattorna i 1 ml volym per brunn, som redan innehåller 2 ml SFD-medium.
- Efter att ha placerat plattan i inkubatorn, flytta den framåt och bakåt, höger och vänster, för att fördela EB:erna jämnt i brunnen.
- Dag 2 - tillägg av CHIR99021
- Virvla EB:erna in i mitten av plattan och tillsätt CHIR99021 enligt tabell 2 på sidan av brunnen för att undvika direktkontakt med cellerna.
OBS: Om mediet inte byttes ut dag 1, byt ut hela mediet istället för att tillsätta enbart CHIR . Bered 18 ml SFD-medium med blandning 2 enligt tabell 2, för varje 6-hålsplatta (3 ml/brunn). - Efter att ha placerat plattan i inkubatorn, flytta den framåt och bakåt, höger och vänster, för att fördela EB:erna jämnt i brunnen.
- Virvla EB:erna in i mitten av plattan och tillsätt CHIR99021 enligt tabell 2 på sidan av brunnen för att undvika direktkontakt med cellerna.
- Dag 3 - medelstor förändring av EB och tillägg av Mix 3-cytokiner
- Bered 18 ml SFD-medium med Mix 3 cytokiner enligt tabell 2, för varje 6-hålsplatta (3 ml/brunn).
- Samla in EB:erna enligt beskrivningen i steg 2.2.2.2-2.2.2.4.
- Tillsätt förvärmt 2 ml SFD-medium med Mix 3-cytokiner till de cellavvisande plattorna.
- Aspirera försiktigt supernatanten från EB. Tillsätt 1 ml/brunn SFD med Mix 3 cytokiner.
- Fördela EB mellan brunnarna enligt beskrivningen i punkterna 2.2.2.8–2.2.2.9.
- Dag 6 - medelstor förändring för SFM-34 och tillägg av Mix 4-cytokiner
- Bered 18 ml SFD-medium med Mix 4 cytokiner enligt tabell 2, för varje 6-hålsplatta (3 ml/brunn).
- Samla in EB:erna enligt beskrivningen i steg 2.2.2.2-2.2.2.4.
- Tillsätt 2 ml förvärmt SFM-34-medium med Mix 4-cytokiner till de cellavvisande plattorna.
- Aspirera försiktigt supernatanten från EB. Tillsätt 1 ml/brunn SFM-34 med Mix 4 cytokiner.
- Fördela EB mellan brunnarna enligt beskrivningen i punkterna 2.2.2.8–2.2.2.9.
- Dag 0 - bildning av embryoidkroppar (EB)
3. CD34+ -cellisolering och sådd i chipet
OBS: CD34+ -celler isoleras via en positiv isoleringsmetod med ett CD34-mikropärlkit (se materialförteckning), som innehåller CD34-mikropärlor konjugerade till monoklonala musantikroppar mot humana CD34-antikroppar och FcR-blockerande reagens (humant IgG). Det är viktigt att validera effektiviteten av kolonnisoleringen genom att färga celler före och efter isoleringen för flödescytometrianalys, Nedan anges när celler behöver tas för denna analys.
- Förbered material och reagenser.
- Förbered tvättbufferten genom att tillsätta 5 ml 5 % BSA-lösning och 200 μL EDTA 0,5 M till 45 ml DPBS för att erhålla PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA. Förbered färskt för varje isolering, filtersterilisera och förvara i kylskåp tills det används.
- Bestryk flytande spån med lamininlösning beredd genom spädning av rhLaminin 521 1:50 i DPBS Ca 2+ Mg2+. Täck varje flis med lämplig volym för den flis som används och inkubera i inkubatorn i 2 timmar före sådd.
OBS: Andra matriser kan användas för beläggningen och bör testas för den specifika celltypen/experimentet. - Förbered blandning 4 SFM-34-medium genom att komplettera 18 ml SFM-34-medium med Mix 4-cytokiner enligt tabell 2 och placera blandningen i ett 50 ml rör i inkubatorn med locket lätt avskruvat för att underlätta gasutbytet.
- Placera de valda perfusionsseten och alla andra slangar som ska användas i inkubatorn för att avgasa.
- Dag 8 - dissociation av EB och CD34+ isolering
- Samla in EB:erna enligt beskrivningen i steg 2.2.2.2-2.2.2.5.
- Tillsätt 1 ml celldissociationsreagens per startbrunn av EB som samlats in (om 6 brunnar samlades upp, tillsätt 6 ml).
- Överför 1 ml av EB-suspensionen i celldissociationsreagenset till varje brunn på den cellavvisande plattan.
- Inkubera i 10 min i inkubatorn.
- Pipettera försiktigt EB:erna upp och ner mot brunnen med en P1000, inte mer än 10 gånger.
- Upprepa steg 3.2.4-3.2.5.för totalt 3x.
OBS: Om EB är svåra att dissociera, upprepa ovanstående steg 4x totalt. - Tillsätt 5 ml tvättbuffert för varje brunn med dissocierade EB.
- Samla cellerna i ett 50 ml centrifugrör genom att föra dem genom en 40 μm sil. Ta 10 μl av cellsuspensionen för att räkna cellerna.
OBS: För att testa isoleringens effektivitet, överför 105 celler/rör till två olika rör (ofärgad kontroll och försorterat testample) som kommer att användas senare för flödescytometri (enligt beskrivningen i steg 4.3.9-4.3.13). För en 6-hålsplatta bör ~106 celler samlas in efter filtrering. - Snurra ner cellerna i 10 minuter vid 300 × g.
- Återsuspendera cellerna i 300 μL tvättbuffert och pipettera försiktigt några gånger för att säkerställa att det inte finns några klumpar. Fortsätt att följa tillverkarens protokoll (se materialförteckning).
- CD34+ cellsådd i fluidiska chips
OBS: Fluidikchipet som används i protokollet har en kanalhöjd på 0.6 mm och en längd på 50 mm, för en total tillväxtyta på 2.5 cm2 (tilläggsfigur S1). Denna typ av chip sås med en total volym cellsuspension på 150 μL. Olika chips kan användas, och såddvolymen och celldensiteten bör anpassas efter tillväxtområdet. Ytterligare optimering kan behövas beroende på vilken cellinje som används och dess tillväxt.- Återsuspendera de isolerade CD34+ -cellerna i 300 μl förvärmt SFM-34-medium med Mix 4-cytokiner.
- Ta 10 μl av cellsuspensionen och räkna cellerna.
- Återsuspendera 2,5 × 105 celler i en slutlig volym på 150 μL kompletterad SFM-34. tillsätt 0,5 μL iRock.
OBS: För att testa isoleringens effektivitet, överför 105 celler/rör till ett rör (eftersorterat testamp) som kommer att användas senare för flödescytometri (enligt beskrivningen i steg 4.3.9-4.3.13). - Aspirera långsamt laminin från fluidiska chips genom att sätta spetsen på en P200 inuti behållaren på kanten av kanalen.
OBS: Om vätskan är svår att samla upp, lyft långsamt ena sidan av chipet för att hjälpa vätskan att röra sig till den motsatta behållaren. - Tillsätt cellsuspensionen stadigt i kanalen för att se till att inga bubblor bildas.
OBS: Utför steg 3.3.4-3.3.5 snabbt men försiktigt för att undvika att laminin torkar ut och att det bildas bubblor i spånets kanaler. Om bubblor bildas, lyft ena sidan av chipet och knacka försiktigt på sliden för att mobilisera bubblorna; När de når reservoaren kommer de att stiga till luftgränssnittet och bör inte kunna hyra kanalen. - Överför chipet till inkubatorn och låt dem stå över natten så att cellerna är helt fästa vid kanalen och ser långsträckta ut.
- När cellerna är helt fästa, aspirera mediet som i steg 3.3.4 och ersätt det med 200 μL cytokinkompletterat SFM-34.
- Från och med nu, byt ut mediet dagligen tills cellerna har nått 90%-100% sammanflöde.
4. Applicering av kontinuerligt flöde på endotelceller - Aorta-on-a-chip
- Förbered material och reagenser.
- Bered Mix 4 SFM-34-medium genom att komplettera 18 ml SFM-34-medium med Mix 4-cytokiner enligt tabell 2 och placera det i ett 50 ml rör i inkubatorn med locket lätt avskruvat för att underlätta gasutbytet.
- Placera de valda perfusionssatserna och eventuella slangar som ska användas för vätskeinstallationen i inkubatorn för att avgasa.
- Montering av fluidiksystem
- Installera perfusionssetet i enheten enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Kom ihåg att använda clamps i systemet. Om glidklämmor används för detta steg måste de skjutas på slangen innan de ansluts till chipet. - Fäst ett nytt vätskechip och tillsätt det cytokinkompletterade SFM-34-mediet, se till att fylla båda reservoarerna under sterila förhållanden i huven.
- Utför programmet för borttagning av bubblor och kalibreringssteget.
- Ta bort vätskeenheten med den anslutna uppsättningen från inkubatorn och överför den till huven; Ta också chipsen som innehåller cellerna från inkubatorn.
- Clamp slangen på båda sidor av testchipet.
- Ta bort slangen från testchipet.
OBS: Kontrollera att det inte finns några bubblor i Luer-anslutningen i änden av slangen. Om bubblor är synliga, aspirera dem försiktigt med en P200-pipett och tillsätt vid behov mer medium för att säkerställa att kontakten är fylld med medium. - Anslut chipet som innehåller cellerna med slangen.
- Ta bort eller öppna clamps.
- Överför systemet till inkubatorn och anslut luftpumpen till fluidenheten.
- Starta det förvalda programmet med hjälp av den pumpdedikerade programvaran (tilläggsfigur S2) med den gradvisa ökningen av skjuvspänningen som beskrivs i tabell 3.
OBS: Beroende på vilket specifikt experiment som behövs kan stimuleringsprogrammet behöva optimeras. Här beskrivs en gradvis ökning av skjuvspänningen som leder till det slutliga värdet på 5 dyn/cm2, vilket efterliknar den skjuvspänning som beräknas upplevas av väggen i den dorsala aortan vid början av fostrets cirkulation 9. Oberoende av den slutliga skjuvspänningen som kommer att användas är det nödvändigt att gradvis öka med tiden för att cellerna ska kunna anpassa sig till kraften utan att cellerna lossnar från chipet. Om det valda stimuleringsprotokollet är längre än 3 dagar, bör cytokiner fyllas på i systemet genom att tillsätta 1 ml SFM-34 innehållande Mix 4-cytokiner som normalt skulle tillsättas i 18 ml. För att göra detta pausas pumpprogrammet snabbt och 500 μL tillsatt medium tillsätts till var och en av de två sprutorna i vätskesetet.
- Installera perfusionssetet i enheten enligt tillverkarens protokoll.
- Cellsamling för analys
- Förvärm dissociationsbufferten i ett vattenbad.
- Ta bort vätskeenheten från inkubatorn och flytta den till huven.
- Kläm fast slangen som flankerar spånet på båda sidor och ta bort slangen från behållarna på chipet.
- Ta försiktigt bort mediet från chipet och ersätt det med DPBS Ca2 + Mg2+ för att tvätta cellerna.
OBS: Detta steg för tvätt med PBS kan hoppas över om cellerna börjar lossna. - Tillsätt försiktigt 150 μl dissociationsbuffert och inkubera i 3 minuter vid 37 °C.
OBS: Kontrollera under mikroskopet om cellerna är enkla och fristående; I annat fall inkuberas i ytterligare 2 minuter. Det är viktigt att cellerna är helt avskilda från kanalen innan mediet aspireras, eftersom chipet inte tillåter att cellerna lossnar genom pipettering. Andra lösningar kan användas för att lossa cellerna, såsom trypsin eller EDTA-baserade buffertar. - Samla upp dissociationsbufferten som innehåller cellerna från en behållare och överför till ett 15 ml centrifugrör och tvätta kanalen en gång med DPBS för att samla upp alla lossnade celler.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert till 15 ml röret med cellerna och ta 10 μL för att räkna cellerna.
- Dela upp cellsuspensionen i flödescytometrirör så att det finns 105 celler per provrör.
- Snurra tuberna i 5 minuter med 300 × g.
- Förbered färgningslösningen så att den har 50 μL för varje provrör att färga. Tillsätt CD34 PerCP-efluor710 eller CD34-PE vid spädning 1:100 respektive 1:200.
- Blanda cellerna på nytt i 50 μl färgningslösning och inkubera i 30 minuter vid 4 °C.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 2 ml tvättbuffert och centrifugera i 5 minuter vid 300 × g.
- Återsuspendera pelletsen i 100 μL färgningslösning och samla in data med hjälp av en flödescytometer.
OBS: Cellerna kan också lyseras direkt i chipet för RNA-extraktion med 150 μL RNA-lysbuffert eller fixeras för avbildning med 4% paraformaldehyd i DPBS i 10 min vid rumstemperatur.
- Analys av cellorientering
- Analysera bilderna för att kvantifiera förändringar i cellorientering med hjälp av FIJI23 (tilläggsfigur S3).
- Öppna ROI-hanteraren (Region of Interest) från Analysera | Verktyg | Meny för ROI-hanterare .
- Rita cellkonturerna manuellt med hjälp av polygonmarkeringsverktyget och lägg till dem i ROI-hanteraren genom att klicka på Lägg till eller använda genvägen CTRL+T .
- Mät orienteringen för varje ROI genom att välja måttet Anpassa ellips i menyn Analysera | Ställ in menyn Mått .
- Tillämpa mätningen på alla ROI:er genom Mer... Flermåttskommando i ROI-hanteraren.
OBS: Det här steget anpassar en ellips till varje ROI och genererar en tabell som innehåller längden på de större och mindre ellipsaxlarna, samt vinkeln. - Exportera tabellen till en CSV-fil som ska importeras till annan programvara för att plotta.
OBS: Skriptet som används för diagrammen finns på https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf885
0ddc.
- Analysera bilderna för att kvantifiera förändringar i cellorientering med hjälp av FIJI23 (tilläggsfigur S3).
Representative Results
Vi beskriver här ett protokoll för differentiering och mekanostimulering av endotelceller härledda från hiPSCs som gör det möjligt att studera deras svar på mekaniska signaler (Figur 1). Detta protokoll resulterar i produktion av funktionellt mekanokänsliga endotelceller. Vi ger här representativa resultat och beskriver den förväntade fenotypen för att bedöma hur cellerna svarar på cytokinstimuleringen under differentieringen.
Figur 1: Schematisk bild av protokollet för differentiering och mekanisk stimulering. Schematisk bild av differentieringsprotokollet som visar tidpunkten för de olika blandningarna av cytokiner, CD34+ -cellisolering, sådd av fluidiska chip och slutlig analys av de mekaniskt stimulerade cellerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kultur av hiPSCs
Det är viktigt att starta protokollet från hiPSC:er som växer korrekt under självförnyelseförhållanden. En bra indikation på kulturens kvalitet är hur snabbt de växer. Efter upptining kan cellerna behöva 2-3 veckor för att nå rätt tillväxtfas som säkerställer god differentiering. När cellerna kan passera två gånger i veckan i förhållandet 1:6 och nå nästan fullt sammanflöde, är det den tid då de är redo att differentieras samma dag som de behöver passeras.
Differentiering av hiPSCs till endotelceller
Det första steget i differentieringen, som består av bildandet av embryoidkroppar (EB), är cellinjeberoende och kan behöva viss optimering för den specifika cellinje som används. Dissociationen som beskrivs i protokollstegen 1.3.2.2–1.3.2.4 kan modifieras genom att antingen minska eller förlänga inkubationen med dissociationsreagenset och den efterföljande dissociationen med Pasteurpipetten. Dessutom kan andra dissociationsreagenser användas för detta steg utöver den fysiska dissociationen av kolonierna med ett skärverktyg eller en P100-pipettspets. EB av god kvalitet visar en definierad kant på dag 2 av differentieringen och verkar klara och ljusa när de observeras med hjälp av ett mikroskop; mörkare områden kan tyda på celldöd inom EB (figur 2).
Figur 2: Embryoidkropparnas morfologi. (A) Embryoidkroppar dag 2 med väldefinierade ytterkanter och jämn storlek. (B) Dag 2 embryoidkroppar av dålig kvalitet som uppvisar omfattande celldöd som leder till sönderdelning av strukturen. Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
På dag 2 hämmar tillsatsen av CHIR99021 till EB GSK-3-proteinet, vilket resulterar i aktivering av Wnt-vägen. Olika cellinjer svarar olika på HIR-behandling, och detta bör testas genom att kvantifiera antalet CD34+ -celler som erhålls vid dag 8 med hjälp av olika koncentrationer (figur 3).
Figur 3: Endotelcellsdifferentiering med olika HIR-behandlingar. Endotelcellsåtagande kvantifierat genom flödescytometri vid dag 8 av differentiering med CD34-membranuttryck, efter HIR-behandling vid dag 2 vid (A) 3 μM, (B) 5 μM och (C) 7 μM. Flödescytometridata erhölls med hjälp av fem lasercytometrar och dedikerad programvara (se materialtabell). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Isolering av CD34+ -celler
Det är viktigt att validera att CD34+-anrikningen med hjälp av de magnetiska pärlorna ger minst 80 % CD34+ efter eluering av kolonnen. För att säkerställa tillräcklig renhet kan en alikvot av celler som erhålls från den magnetiska isoleringen analyseras genom flödescytometri och se till att använda en annan antikroppsklon än den som används för den magnetiska anrikningen. Här användes 4H11-klonen och ~85 % renhet uppnåddes efter anrikning (figur 4).
Figur 4: Membranuttryck av CD34 före och efter anrikning genom magnetisk sortering. Dag 8 färgades dissocierade embryoidkroppar (grå) och celler efter magnetisk anrikning (grön) för CD34-uttryck och analyserades med flödescytometri, vilket visade framgångsrik anrikning efter sortering. Flödescytometridata erhölls med hjälp av fem lasercytometrar och dedikerad programvara (se materialförteckning). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Sådd av celler i fluidkanalen
När du planterar cellerna i vätskekanalen är det avgörande att spåra vidhäftningen och spridningen av endotelcellerna. Efter sådd tar det ~5 timmar för cellerna att fästa helt vid kanalen (Figur 5A). En alternativ beläggningslösning kan också testas för att förbättra vidhäftningen i detta skede. För att bekräfta att de testade cellerna är mekanokänsliga och därmed kan svara på mekanisk stimulering kan cellorienteringen testas över tid. Cellerna före stimuleringen visar slumpmässig orientering (Figur 5A och Figur 5C) och de omorienteras parallellt med flödesriktningen (Figur 5B,C). Det protokoll som beskrivs här gör det möjligt att samla in cellerna från kanalen för att utföra nedströmsanalys, t.ex. flödescytometri, för att studera deras membranimmunfenotyp, vilket ger endotelidentiteten hos de stimulerade cellerna (figur 5D,E).
Figur 5: Mekanoresponsivitet hos hiPSCs-härledda endotelceller . (A) Konfluentskikt av isolerade CD34+ -celler 48 timmar efter sådd. (B) Omorienterat skikt av endotelceller 3 dagar under dynamisk odling. C) Orienteringsanalys av endotelcellerna efter 5 dagars dynamisk odling. D) CD34-uttrycksprofil för celler odlade under flöde i 5 dagar. (E) Procentandel CD34+ -celler i cellpopulationen som hämtats från fluidkanalen. Bilderna togs med hjälp av ett uppochnedvänt inkubatormikroskop; flödescytometridata erhölls med hjälp av fem lasercytometrar och dedikerad programvara (se materialförteckning). Skalstaplar = 100 μm (A,B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagenser | Beståndets koncentration | Volym tillagd | Slutlig koncentration |
| Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) | - | 333 ml | - |
| Skinkans F-12 näringsblandning (F-12) | - | 167 ml | - |
| N-2 tillägg (100x) | 100 x | 5 ml | 1x |
| B-27 tillägg (50x) | 50 x | 10 ml | 1x |
| Askorbinsyra | 10 mg/ml | 1,25 ml | 25 μg/ml |
| α-monotioglycerol (MTG) | 11,5 m | 19,5 μL | 448,5 μM |
| Humant serumalbumin | 100 mg/ml | 2,5 ml | 0,5 mg/ml |
| Holo-transferrin | 100 mg/ml | 0,75 ml | 150 μg/ml |
Tabell 1: Sammansättning och recept för 500 ml serumfritt differentieringsmedium (SFD).
| Dagar av differentiering | Cytokinblandning | Cytokin | Slutlig koncentration |
| Dag 0 - 2 | Blandning 1 | BMP4 | 20 ng/ml |
| Dag 2 | Blandning 2 | CHIR99021 | 7 μM |
| Från dag 3 och framåt | Blanda 3 och 4 | VEGF | 15 ng/ml |
| bFGF | 5 ng/ml | ||
| Från dag 6 och framåt | Blandning 4 | IL6 | 10 ng/ml |
| FLT3L | 10 ng/ml | ||
| IGF1 | 25 ng/ml | ||
| IL11 | 5 ng/ml | ||
| SCF | 50 ng/ml | ||
| EPO | 3 U/ml | ||
| TPO | 30 ng/ml | ||
| IL3 | 30 ng/ml |
Tabell 2: Blandningar av cytokiner som används för endotelcellsdifferentiering, dagar då de tillsätts till SFD-mediet och slutlig koncentration.
| Skjuvspänning (dyn/cm2) | Tid (h) |
| 0.5 | 1 |
| 1 | 1 |
| 1.5 | 1 |
| 2 | 1 |
| 2.5 | 1 |
| 3 | 1 |
| 3.5 | 1 |
| 4 | 1 |
| 4.5 | 1 |
| 5 | Fram till slutet av försöket |
Tabell 3: Skjuvspänningsvärden för den dynamiska kulturen och längden på deras applicering.
Kompletterande figur S1: Geometri och mått på spån och slangar som används för detta protokoll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Steg-för-steg-guide för programvaran som styr luftpumpen med en beskrivning av varje steg. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Guide för orienteringsanalys med hjälp av FIJI som visar ritningen av cellformen, elliptisk anpassning och slutlig mätning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S1: Enhetsstorlek, resuspensionsvolym och stamkoncentrationer för cytokiner som används i differentieringsprotokollet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Protokollet som vi beskriver här möjliggör generering av mekanokänsliga endotelceller från humana pluripotenta stamceller och studier av deras svar på mekanisk stimulering medierad av kontrollerad skjuvspänning. Detta protokoll är helt cytokinbaserat och helt kompatibelt med GMP-reagenser för potentiell översättning till produktion av celler för cellterapi.
Härledningen av hiPSCs ger forskarna en instrumentell modell för de tidiga stadierna av embryonal utveckling som möjliggör studier av processer som annars är svåra att studera in vivo24. Faktum är att mänskliga embryonala vävnader som är tillgängliga för forskning samlas in från embryon som saknar cirkulation, och detta kan ha en betydande inverkan på den molekylära signaturen som styrs av mekaniska signaler. Tillvägagångssättet som beskrivs här möjliggör live-avbildning och realtidsstudier av cellens respons på skjuvspänning. Kombinationen av hiPSCs med fluidik ger en studiemodell som övervinner den begränsade tillgängligheten och otillgängligheten av fostrets vävnader under utveckling när initieringen av cirkulationen omformar och kontrollerar etableringen av det kardiovaskulära systemet och blodsystemet 3,9,10,25.
En begränsning med protokollet är att endotelcellerna som härrör från detta protokoll kanske inte återspeglar de olika identiteterna hos olika endotelceller som finns i de utvecklande vävnaderna. För att övervinna denna begränsning kan en specifik kombination av cytokiner behövas under differentieringsprocessen som föregår den fluidiska stimuleringen för att erhålla den önskade identiteten eller vävnadsspecifik fenotyp26. Isoleringen av endotelundergrupper kan erhållas med hjälp av en mer förfinad immunfenotyp under isoleringssteget. Detta protokoll isolerar endotelceller endast baserat på uttrycket av CD34, vilket möjliggör kolonnisolering i stället för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Detta minskar celldöd och risken för kontaminering. Dessutom är detta protokoll speciellt utformat för att studera skjuvspänningens roll medierad av laminär strömning. Alternativa fluidiska metoder kommer att behöva användas för att studera effekten av andra mekaniska signaler, såsom sträckning eller kompression, eller andra typer av flöde såsom störd eller störd strömning.
Vi har tidigare visat att iPSC-härledda endotelceller efterliknar de heterogena arteriovenösa cellulära identiteterna27 liknande de som observerats i fostrets dorsala aorta28,29,30. Detta är särskilt viktigt i samband med kärlutveckling och cellulär specifikation, som är känd för att styras av blodcirkulationen. Studier i olika modeller visade att brist på cirkulation resulterar i förändrad arteriovenös specifikation11,14,31. Mekanismerna som kopplar samman mekaniska signaler med cellspecifikation är fortfarande okända och pipelinen som beskrivs här möjliggör förfinade funktionella studier som inte kunde testas in vivo.
Denna pipeline beskriver produktion och stimulering av endotelceller som härrör från hiPSCs med hjälp av kommersiellt tillgängliga fluidiska kanaler, vilket undviker behovet av att gjuta enheterna som för de allmänt använda polydimetylsiloxanenheterna (PDMS)12. Dessutom gör användningen av PDMS-chips insamlingen av de stimulerade cellerna särskilt utmanande, medan cellerna med detta protokoll enkelt kan hämtas från kanalen. Detta förbättrar analyskraften avsevärt och möjliggör efterföljande analyser såsom proteomik- och transkriptomiska analyser, flödescytometri och funktionella analyser, som kan behöva ytterligare odling eller in vivo-analyser .
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Research Advanced Grant 2021 från European Hematology Association, Global Research Award 2021 från American Society of Hematology och Internal Strategy Support Fund ISSF3 finansierad av Welcome Trust och University of Edinburgh. Vi tackar Fiona Rossi från Flow Cytometry Facility för stöd i flödescytometrianalysen. För open access-ändamål har författaren tillämpat en Creative Commons Attribution (CC BY)-licens på alla manuskriptversioner som accepterats av författaren och som härrör från detta bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
| 25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
| 6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
| Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
| Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
| BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
| BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
| bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
| CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
| CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
| CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
| Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
| CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
| Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
| DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
| EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
| EDTA | Life technologies | 15575020 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
| Fiji | Version 1.53c | ||
| Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
| Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
| Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
| Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
| Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
| Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
| IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
| Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
| Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
| MTG | Merck | M6145-25ML | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
| Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
| Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
| Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
| Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
| Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
| Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
| ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
| rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
| rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
| rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
| rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
| rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
| rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
| rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
| rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
| rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
| RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
| Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
| StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
| StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
| StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
| StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
| Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Copp, A. J. Death before birth: clues from gene knockouts and mutations. Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).
- Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. Hemodynamic control of endothelial cell fates in development. Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).
- Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis. Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).
- Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny. Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).
- Zovein, A. C., et al. Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
- Adamo, L., et al. Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis. Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).
- Diaz, M. F., et al. Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis. Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Lundin, V., et al. YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow. Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).
- Li, J., et al. Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development. Cell Reports. 40 (11), 111339 (2022).
- Azzoni, E., et al. The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition. Cell Reports. 37 (11), 110103 (2021).
- Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).
- Batsivari, A., et al. Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture. Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).
- Canu, G., et al. Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation. Genome Biology. 21 (1), 157 (2020).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).
- Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219 (2018).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).
- Fidanza, A., et al. Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs. Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
- Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs. Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).
- Petazzi, P., et al. Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2. bioRxiv. , (2022).
- Crosse, E. I., et al. Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 27 (5), 822 (2020).
- Calvanese, V., et al. Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth. Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).
- Zeng, Y., et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).
- Hwa, J. J., et al. Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow. Scientific Reports. 7 (1), 11965 (2017).
