Summary
يوفر هذا التقرير بروتوكولات للتجميع وزراعة الخلايا والمقايسات على منصة μSiM لبناء نماذج الحاجز الدموي الدماغي.
Abstract
microSiM (μSiM) عبارة عن منصة ثقافة قائمة على الغشاء لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي (BBB). على عكس المنصات التقليدية القائمة على الأغشية ، يوفر μSiM للتجريبيين قدرات جديدة ، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية ، وإشارات paracrine دون عوائق بين غرف "الدم" و "الدماغ" ، والقدرة على تصوير التألق المناعي مباشرة دون الحاجة إلى استخراج / إعادة تركيب الأغشية. نوضح هنا الاستخدام الأساسي للمنصة لإنشاء نماذج الزراعة الأحادية (الخلايا البطانية) والثقافة المشتركة (الخلايا البطانية والخلايا المحيطة) ل BBB باستخدام أغشية نيتريد السيليكون النانوية المسامية للغاية. نثبت التوافق مع كل من مزارع الخلايا الأولية ومزارع الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC). نحن نقدم طرقا للتحليل النوعي لنماذج BBB عبر تلطيخ التألق المناعي ونوضح استخدام μSiM للتقييم الكمي لوظيفة الحاجز في مقايسة نفاذية جزيء صغير. يجب أن تمكن الطرق المقدمة المستخدمين من إنشاء نماذج الحواجز الخاصة بهم على المنصة ، مما يعزز استخدام تقنية رقائق الأنسجة لدراسة الأنسجة البشرية.
Introduction
يتم تقسيم الأنسجة الحية بواسطة خلايا متخصصة تخلق الحواجز وتحافظ عليها وتنظم الخلايا والجزيئات التي يتم نقلها من حجرة إلى أخرى. يمكن أن يكون التنظيم غير السليم لوظائف الحاجز مصدرا لكل من الأمراض الحادة والأمراض المزمنة. الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو حاجز الأنسجة الأكثر تقييدا في جسم الإنسان1. يكمن خلل BBB وراء مجموعة واسعة من أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، بما في ذلك مرض الزهايمر2 ومرض باركنسون3,4 والتصلب المتعدد 5,6. ترتبط إصابة BBB أيضا بضعف إدراكي طويل الأمد نتيجة للاضطرابات الحادة ، مثل الإنتان7 و COVID-198 والهذيان بعد العمليةالجراحية 9. كان تطوير الأدوية التي لديها القدرة على علاج اضطرابات الدماغ صعبا بشكل محبط بسبب التحدي المتمثل في اختراق BBB عمدا لتوصيل الجزيئات النشطة بيولوجيا إلى أهداف في الدماغ10. لهذه الأسباب ، فإن طرق دراسة وظيفة BBB في المختبر لها أهمية قصوى لفهم وعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي.
تتضمن الطرق الأساسية لقياس وظيفة الحاجز في المختبر إنشاء طبقة أحادية أو ثقافة مشتركة على غشاء شبه منفذ وقياس المقاومة التي تنقلها الخلايا إما إلى انتشار الجزيئات الصغيرة أو التيارات الكهربائية الصغيرة11،12،13،14. في حين أن ظهور الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة (MPS) قد أنتج وفرة من الخيارات لنمذجة BBB في 3D15,16 ، فإن تنوع هندسة النظام يجعل من الصعب مقارنة قياسات النفاذية بين MPS أو قيم الأدبيات الثابتة. يعد إنشاء قيم أساسية موثوقة أمرا مهما بشكل خاص في أبحاث BBB حيث ، بسبب التنظيم الواسع للحاجز بواسطة الخلايا البطانية الوعائية في الدماغ ، يتم فحص قيم النفاذية في المختبر بشدة12،17،18. لهذه الأسباب ، ستظل قياسات النفاذية عبر الطبقات الأحادية التي تم إنشاؤها على أغشية 2D عنصرا أساسيا في دراسات BBB لسنوات قادمة. وينطبق هذا على حواجز الأنسجة الأخرى ، بما في ذلك الحواجز الظهارية ، حيث يتم استخدام القيم المطلقة لنفاذية خط الأساس للتحقق من صحة ومقارنة النماذج في المختبر 19،20،21.
بهدف إنشاء أداة جديدة قيمة لمجتمع أبحاث BBB ، قدمنا22 و 23،24،25،26 الجهاز الصغيرالذي يتميز بمنصة Silicon membrane (μSiM) للاستخدام في نمذجة الأنسجة الحاجزة على مدى السنوات ال 5 الماضية. الميزة التمكينية للمنصة هي غشاء فائق النحافة (بسمك <100 نانومتر) مع مئات الملايين من المسام النانوية 27,28 أو مزيج من المسام النانوية والمسام الدقيقة29. يتم إنتاج رقائق الغشاء القائمة بذاتها على "شريحة" سيليكون 300 ميكرومتر تعمل على استقرار الهياكل فائقة النحافة30 وتسمح بالتعامل معها بواسطة ملاقط لتجميع الجهاز. نظرا لطبيعتها فائقة النحافة ، تتمتع الأغشية بنفاذية أعلى بأمرين من الأغشية التقليدية المحفورة بالمسار المستخدمة في أجهزة زراعة الأغشية التجارية31,32. في الممارسة العملية ، هذا يعني أن عائق الغشاء أمام انتشار جزيئات أصغر من المسام النانوية (<60 نانومتر) لا يكاد يذكر33. وبالتالي ، بالنسبة للحواجز الخلوية ، فإن الخلايا والمصفوفات التي ترسبها فقط هي التي ستحدد معدل نقل الجزيئات الصغيرة من المقصورات القمية إلى القاعدية التي يفصلها الغشاء34. يوفر تصميم الجهاز والطبيعة الرقيقة جدا للأغشية أيضا العديد من المزايا للفحص المجهري الضوئي. وتشمل هذه 1) القدرة على متابعة الثقافات الحية باستخدام تباين الطور أو التصوير الميداني الساطع ، 2) القدرة على تلطيخ الفلورسنت والصورة في الموقع دون الحاجة إلى استخراج الغشاء ونقله إلى غطاء زجاجي ، و 3) حقيقة أن الأغشية أرق من "الشرائح" متحدة البؤر بحيث يكون للثقافات المشتركة المباشرة تباعد طبيعي بين أنواع الخلايا أكثر مما يمكن تحقيقه باستخدام أغشية محفورة بسمك 6-10 ميكرومتر.
في الآونة الأخيرة ، قمنا بتطوير النظام الأساسي إلى تنسيق معياري لتسهيل التجميع السريع34 والتخصيص35,36. لقد استفدنا من التنسيق المعياري لتوزيع مكونات الجهاز بين مختبرات الهندسة الحيوية ومختبرات حاجز الدماغ المتعاونة. ثم قمنا بتطوير بروتوكولات لتجميع الأجهزة ، والزراعة الأحادية والزراعة المشتركة ، والتلوين المناعي ، ونفاذية الجزيئات الصغيرة وأظهرنا أن هذه الطرق قابلة للتكرار بين المختبرات. باستخدام هذه البروتوكولات ، أظهرنا أيضا أن النظام الأساسي المعياري يدعم BBB تم التحقق من صحته تم تطويره باستخدام طريقة الثقافة البطانية الممتدة (EECM) لإنشاء خلايا بطانية تشبه الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ (BMEC) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) 37. الغرض من التقرير الحالي هو مراجعة هذه الأساليب بمزيد من التفصيل ، وبمساعدة الفيديو المصاحب ، تسهيل اعتماد النظام الأساسي على نطاق أوسع في مجتمع BBB.
Protocol
1. تجميع جهاز μSiM
ملاحظة: تصف هذه الطريقة تجميع الأجهزة. تحتوي رقاقة الغشاء على جانب خندق وجانب مسطح ، يمكن تجميعه لأعلى أو خندق لأسفل. تستخدم أجهزة الخنادق بشكل شائع لزراعة الخلايا.
- في بيئة معقمة (أي غطاء للسلامة البيولوجية) ، قم بإعداد جميع المواد للتجميع ، بما في ذلك تركيبات التجميع والمكونات ورقائق الغشاء والملاقط.
- ضع رقاقة الغشاء في وسط التركيب A1 باستخدام ملاقط الرقائق. السطح المسطح للرقاقة متجها لأسفل ومنطقة الخندق متجهة لأعلى لأجهزة الخندق لأسفل ، والعكس صحيح لأجهزة الخندق لأعلى.
ملاحظة: يتم توضيح خطوات التجميع التالية باستخدام جهاز الخندق لأسفل كمثال ، مما يسمح بمنطقة نمو مسطحة في الغرفة العلوية. - مكون السندات 1 إلى الشريحة. أولا ، انزع الطبقات الواقية الزرقاء على جانبي المكون 1 باستخدام ملاقط مستقيمة وضعها في التركيب A1 ، الحجرة العلوية لأسفل. اضغط برفق على المكون 1 لأسفل حتى يلامس اللاصق الحساس للضغط (PSA) الشريحة.
- ضع التركيبات A2 على التركيبات A1 واضغط بقوة في زوايا مختلفة لضمان ملاءمة ضيقة للرقاقة والمكون.
ملاحظة: تأكد من عدم إزالة طبقة PSA. إنها طبقة شفافة وأكثر صلابة مقارنة بالطبقات الواقية الزرقاء. - ربط المكون 2 بالمكون 1 بالشريحة. أولا ، قم بإعداد المكون 2 عن طريق الإمساك بزاوية واحدة من المكون 2 بملاقط مستقيمة وتقشيرها من الورقة. بعد ذلك ، أمسك بمنطقة "المثلث" غير PSA للمكون 2 وقم معا بإزالة الطبقة الواقية السميكة والشفافة والطبقة الزرقاء للمكون 2 ، مما يعرض سطح PSA. ضع المكون 2 في التركيب B1 ، جانب PSA لأعلى.
- ضع المكون 1 مع رقاقة الغشاء في التركيب B1 ، الغرفة العلوية متجهة لأعلى.
- ضع التركيبات B2 على المكون 1 واضغط بقوة في زوايا مختلفة من التركيب B2.
- أخرج الجهاز المجمع من التركيبات واستخدم ملاقط مستقيمة للضغط على أي فقاعات هواء على الجانب السفلي من الجهاز وأغلق حواف القناة ، وتجنب ملامسة منطقة الغشاء. قبل الاستخدام لزراعة الخلايا ، تقوم الأشعة فوق البنفسجية (UV) بتعقيم الأجهزة المجمعة حديثا لمدة 20 دقيقة.
2. ثقافة الخلية
ملاحظة: تصف هذه الطريقة بروتوكولات الثقافات الأساسية والمشتقة من hiPSC على النظام الأساسي. تصف الطرق الزراعة الأحادية للخلايا البطانية في الغرفة العلوية للجهاز وزراعة الخلايا المحيطة بالخلية والخلايا البطانية مع الخلايا المحيطة في الغرفة السفلية والخلايا البطانية في الغرفة العلوية للأجهزة المجمعة في الخنادق. لمعرفة أبعاد الغرفة وأحجامها ، انظر الجدول 1. هذه هي التنسيقات الأكثر شيوعا. ومع ذلك ، يمكن استخدام تخطيطات زراعة الخلايا الأخرى حسب احتياجات المستخدم.
- إعداد غرفة زراعة الخلايا
- قم بتجميع الأجهزة وفقا للبروتوكول المفصل في القسم 1.
- ضع الأجهزة في مشابك خرطوم معقمة. قبل زراعة الخلايا ، قم بتعقيم المشابك عن طريق نقعها في الإيثانول لمدة ≥20 دقيقة. تعقيم بعد كل تجربة لإعادة استخدامها.
- ثقافة الأجهزة في طبق بتري كبير معقمة. لمزيد من الرطوبة ، أضف طبق بتري صغير أو غطاء أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء بالماء المعقم.
- اغسل الغرفة العلوية للأجهزة مرتين ب 100 ميكرولتر من الماء المعقم. لثقافة خلايا الغرفة السفلية ، اغسل الغرفة السفلية ب 20 ميكرولتر من الماء المعقم.
- hCMEC / D3 خط الخلية (BBB) أحادي الزراعة
- تحضير غرفة زراعة الخلايا وفقا للقسم 2.1.
- قم بتغطية الغرف العلوية ب 25 ميكروغرام / سم 2 من الكولاجين I و 5 ميكروغرام / سم2 من الفبرونيكتين البشري الممزوج بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). اتركه لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة محلول الطلاء وإضافة 100 ميكرولتر من الوسط البطاني المستنفد لعامل النمو المسخن مسبقا (وسيط الفحص) إلى الغرفة العلوية و 20 ميكرولتر إلى الغرفة السفلية. لتحضير وسط الفحص ، امزج 100 مل من الوسط القاعدي البطاني + 400 ميكرولتر من عامل النمو الليفي البشري + 40 ميكرولتر من الهيدروكورتيزون + 100 ميكرولتر من كبريتات الجنتاميسين + 2 مل من مصل الجنين البقري.
- مرور خلايا hCMEC / D3 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ؛ التربسين الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق ثم وقف التربسين عن طريق إضافة وسط بطاني مسخن مسبقا. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسائط الفحص وزرع الخلايا في الغرف العلوية بكثافة 40,000-60,000 خلية / سم2. احتضان الأجهزة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO 2) لمدة2-4 ساعات لتسهيل التصاق الخلايا. على سبيل المثال ، لتحقيق 40000 خلية / سم 2 على شريحة 0.37 سم2 ، أضف 100 ميكرولتر من محلول خلوي بتركيز 150000 خلية / مل إلى الغرفة العلوية.
ملاحظة: نقوم بزراعة وتمرير hCMEC / D3 وفقا ل Hudecz et al.38 ، باستخدام تركيبة معدلة من وسائط النمو البطانية -2 (EGM-2) لصيانة الخلايا و "وسط فحص" منخفض عامل النمو بعد الثقافة الفرعية للمقايسات. يجب أن تكون تركيبات الوسائط الأخرى متوافقة مع الأجهزة ، على الرغم من أننا نوصي بتركيبات الوسائط من Hudecz et al.38 إذا واجه المستخدمون مشكلات في بقاء hCMEC / D3. - بعد 2-4 ساعات للتصاق الخلايا ، تبادل مع وسيط فحص جديد في كلا الغرفتين لإزالة الخلايا الميتة أو غير الملتصقة.
- الحفاظ على الأجهزة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ، وتبادل وسيط الفحص في كلا المجلسين كل2-3 أيام حتى التجربة. عادة ما يتم إجراء المقايسات بعد 2 أسابيع من الثقافة.
- الزراعة الأحادية للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المشتقة من hiPSC
- تحضير غرفة زراعة الخلايا وفقا للقسم 2.1.
- تحضير الكولاجين الوريدي من محلول المشيمة البشرية عن طريق إضافة 5 مل من 0.5 ملغ / مل من حمض الخليك إلى 5 ملغ من الكولاجين الوريدي لإنشاء محلول 1 ملغ / مل. دع المحلول يجلس لمدة ≥4 ساعات عند 4 درجات مئوية لإعادة تكوينه بالكامل. الحل مستقر عند 4 °C لمدة 2 أسابيع.
- قم بتغطية الغرف العلوية ب 100 ميكرولتر من نسبة 4: 1: 5 من الكولاجين الوريدي والفبرونيكتين البقري والماء المعقم. معطف في 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعات.
- قم بإزالة محلول الطلاء وإضافة 100 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة hECSR إلى الغرفة العلوية و 20 ميكرولتر إلى الغرفة السفلية.
- مرور الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC وفقا ل Nishihara et al.37 ؛ أضف خليط إنزيم انفصال الخلايا إلى الخلايا وانقله إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5-8 دقائق. ماصة محلول الخلية لتفرد وإضافة إلى 4x حجم الوسط البطاني في أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ؛ إعادة تعليق الخلايا في hECSR والبذور في الغرف العلوية بكثافة 40000 خلية / سم2. احتضان الأجهزة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة2-4 ساعات لتسهيل التصاق الخلايا. على سبيل المثال ، لتحقيق 40000 خلية / سم2 ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الخلية عند 150000 خلية / مل.
- بعد 2-4 ساعات للتصاق الخلايا ، استبدل مع hECSR الطازج في كلا الغرفتين لإزالة الخلايا الميتة أو غير الملتصقة.
- الحفاظ على الأجهزة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ، وتبادل hECSR في كلا المجلسين كل1-2 أيام حتى التجربة. يتم إجراء المقايسات عادة في اليوم 6 من الثقافة.
- hCMEC / D3 وثقافة الأوعية الدموية الأولية للدماغ البشري (HBVP)
- قبل تجميع الجهاز ، قم بتغطية رقائق الغشاء ب 2 ميكروغرام / سم2 من بولي-L-lysine (PLL) مختلطة في PBS. ضع 50-80 ميكرولتر PLL في قطرة فقط على الجانب الذي سيكون متجها لأسفل في مجموعة الجهاز النهائية. أكمل عملية الطلاء إما في 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة محلول الطلاء. اغسل رقائق الغشاء بالماء المعقم عالي النقاء واتركها حتى تجف.
- قم بتجميع الأجهزة وفقا للبروتوكول المفصل في القسم 1 أعلاه ، مع توجيه الجانب المطلي ب PLL لأسفل ، وقم بإعداد غرفة زراعة الخلايا وفقا للقسم 2.1.
- قم بتغطية الغرف العلوية وفقا للقسم 2.2.2.
- أضف 50 ميكرولتر من وسط pericyte المسخن مسبقا إلى الغرف العلوية وأضف 20 ميكرولتر إلى القنوات السفلية.
- مرور HBVPs وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ؛ التربسين الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق ، ثم توقف عن التربسين عن طريق إضافة وسط pericyte مسخن مسبقا. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط pericyte وزرع الخلايا في الغرف السفلية بكثافة 14000-25000 خلية / سم2. اقلب الأجهزة مع الحفاظ على واجهة هوائية مع الغرف العلوية لتسهيل تبادل الغازات.
ملاحظة: يمكن تحقيق واجهة الهواء المطلوبة أثناء الانقلاب عن طريق قلب الأجهزة بعد وضعها داخل مشابك الخراطيم والضغط لأسفل على جميع الزوايا قبل التقليب ، أو عن طريق وضع الأجهزة رأسا على عقب على شرائط متوازية من الأكريليك أو السيليكون متباعدة بما يكفي للحفاظ على الغرف العلوية دون عوائق. قد تحتاج كثافة البذر إلى التحسين لكل مستخدم. لتحقيق 14000 خلية / سم2 ، أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية عند ~ 590000 خلية / مل. لاحظ أنه يتم سحب 20 ميكرولتر في الغرفة السفلية لتجنب الفقاعات ، ولكن يتم حساب الكثافة باستخدام حجم الغرفة السفلية البالغ 10 ميكرولتر. - احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة2-4 ساعات في الوضع المقلوب لتسهيل التصاق الخلايا.
- بعد 2-4 ساعات للتصاق الخلايا ، اقلب الأجهزة في وضع مستقيم واستبدلها بوسط pericyte جديد في كلا الغرفتين لإزالة الخلايا الميتة أو غير الملتصقة.
- بعد بذر pericyte ، البذور hCMEC / D3s في الغرفة العلوية ، باتباع الخطوات 2.2.4-2.2.5. قم بتبديل كلا الغرفتين إلى وسيط الفحص.
- الحفاظ على الأجهزة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ، وتبادل وسيط الفحص في كلا المجلسين كل1-2 أيام حتى التجربة. عادة ما يتم الحفاظ على الثقافة المشتركة للخلايا الأولية لمدة 6-8 أيام قبل المقايسات.
ملاحظة: إذا تمت مقارنة الزراعات الأحادية HBVP بالزراعات الأحادية hCMEC / D3 أو الثقافات المشتركة hCMEC / D3 و HBVP ، فقم بتبادل وسط pericyte مع وسيط الفحص بعد 2-3 أيام من بذر HBVPs.
- الخلايا الشبيهة بالخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المشتقة من hiPSC والخلايا الشبيهة بالخلايا المحيطة بالدماغ (BPLC)
- قم بإعداد غرفة زراعة الخلايا وفقا للقسم 2.1 وقم بتغطية الغرف العلوية وفقا للخطوات 2.3.2-2.3.3.
- قم بإزالة محلول الطلاء وإضافة 50 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة Essential 6 Medium + 10٪ مصل بقري جنيني (E6 + 10٪ FBS) إلى الغرفة العلوية.
- تمرير BPLCs وفقا ل Gastfriend et al.39 ؛ أضف خليط إنزيم انفصال الخلية إلى الخلايا وانقله إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة ، حتى يتم تقريب ~ 90٪ من الخلايا. ماصة محلول الخلية لتفرد وإضافة 4 أضعاف حجم DMEM / F12 في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر لتصفية الخلايا وتفردها بالكامل. نقل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل ، وأجهزة الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإعادة تعليق بيليه الخلية في E6 + 10٪ FBS ، وزرع الخلايا في الغرف السفلية بكثافة 14000-25000 خلية / سم2. اقلب الأجهزة مع الحفاظ على واجهة هوائية مع الغرفة العلوية لتسهيل تبادل الغازات.
ملاحظة: يمكن تحقيق واجهة الهواء المطلوبة أثناء الانقلاب عن طريق قلب الأجهزة بعد وضعها داخل مشابك الخرطوم والضغط لأسفل على جميع الزوايا قبل التقليب ، أو عن طريق وضع الأجهزة رأسا على عقب على شرائط متوازية من الأكريليك أو السيليكون متباعدة بما يكفي للحفاظ على الغرف العلوية دون عائق. قد تحتاج كثافة البذر إلى التحسين لكل مستخدم. لتحقيق 14000 خلية / سم2 ، أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية عند ~ 590000 خلية / مل. لاحظ أنه يتم سحب 20 ميكرولتر في الغرفة السفلية لتجنب الفقاعات ، ولكن يتم حساب الكثافة باستخدام حجم الغرفة السفلية البالغ 10 ميكرولتر. - احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة2-4 ساعات في الوضع المقلوب لتسهيل التصاق الخلايا.
- بعد 2-4 ساعات للتصاق الخلايا ، اقلب الأجهزة في وضع مستقيم واستبدلها ب E6 + 10٪ FBS جديد في كلتا الغرفتين لإزالة الخلايا الميتة أو غير المرفقة.
- بعد يوم واحد من بذر pericyte ، قم بزرع خلايا تشبه EECM-BMEC في الغرفة العلوية ، باتباع الخطوات 2.3.5-2.3.6. قم بتبديل كلا المجلسين إلى hECSR.
- الحفاظ على الأجهزة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ، وتبادل وسيط الفحص في كلا المجلسين كل1-2 أيام حتى التجربة. عادة ما يتم الاحتفاظ بالاستزراع المشترك المشتق من hiPSC لمدة 7 أيام ل BPLCs و 6 أيام للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC قبل المقايسات.
ملاحظة: إذا تمت مقارنة الزراعات الأحادية BPLC بالزراعات الأحادية EECM-BMEC أو الثقافات المشتركة EECM-BMEC و BPLC ، فقم بتبادل E6 + 10٪ FBS مع hECSR بعد يوم واحد من بذر BPLCs.
3. الكيمياء المناعية
ملاحظة: تصف هذه الطريقة بروتوكولا للتلطيخ الكيميائي المناعي وتصوير الخلايا المزروعة في الجانب العلوي و / أو السفلي من الغشاء. الهدف من هذه التجربة هو تحديد وجود وموقع البروتينات الرئيسية التي يجب العثور عليها في BBB مثل الالتصاق وبروتينات الوصلات الضيقة وبروتينات هوية الخلية. طرق التلوين البديلة والحية متوافقة أيضا مع النظام الأساسي.
- التثبيت والتلوين على الأجهزة
- ضع الأجسام المضادة الأولية على الثلج لتذوب.
- قم بإعداد محلول بارافورمالدهايد 4٪ (PFA) في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال ، قم بتخفيف 16٪ PFA في 3 أضعاف حجمه من PBS) أو قم بتبريد الميثانول بنسبة 100٪ عند -20 درجة مئوية.
- قم بإنشاء حل حظر مناسب وفقا للجدول 2. تخزينها على الجليد.
ملاحظة: قد يكون من الضروري حل دوامة الحل لحل Triton X-100 بالكامل. - ثبت الخلايا عن طريق سحب 20 ميكرولتر من المثبت (على سبيل المثال ، PFA أو الميثانول) في الغرفة السفلية و 50 ميكرولتر في الغرفة العلوية. احتضان الأجهزة لمدة 10 دقائق (PFA) أو 2 دقيقة (الميثانول) في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل لمدة 3 × 5 دقائق عن طريق سحب 20 ميكرولتر من PBS عبر الحجرة السفلية و 100 ميكرولتر في الغرفة العلوية.
- قم بالحظر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من محلول الحجب إلى الحجرة السفلية و 50 ميكرولتر من محلول الحجب إلى الغرفة العلوية. تحقق من وجود فقاعات في الغرفة السفلية.
- تحضير محلول الأجسام المضادة الأولي عن طريق تخفيف الجسم المضاد (الأجسام المضادة) في محلول الحجب وفقا للجدول 2. تخزينها على الجليد.
- تلطيخ بالأجسام المضادة الأولية عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى الحجرة السفلية واستبدال حجم الغرفة العلوية ب 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي. تحقق من وجود فقاعات في الغرفة السفلية. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- اغسل لمدة 3 × 5 دقائق عن طريق سحب 20 ميكرولتر من PBS عبر الحجرة السفلية و 100 ميكرولتر في الغرفة العلوية.
- قم بإعداد محلول الجسم المضاد الثانوي عن طريق تخفيف الجسم (الأجسام) المضادة في محلول الحجب وفقا للجدول 2. تخزينها على الجليد محمية من الضوء.
- تلطيخ بالأجسام المضادة الثانوية عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي إلى الغرفة السفلية واستبدال حجم الغرفة العلوية ب 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية. تحقق من وجود فقاعات في الغرفة السفلية. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
- اغسل لمدة 3 × 5 دقائق عن طريق سحب 20 ميكرولتر من PBS عبر الحجرة السفلية و 100 ميكرولتر في الغرفة العلوية.
- اصنع محلول بقع نووي. تمييع Hoechst 1: 10,000 في برنامج تلفزيوني. أضف 20 ميكرولتر من محلول البقع النووية إلى الحجرة السفلية واستبدل حجم الغرفة العلوية ب 50 ميكرولتر من محلول البقع النووية. تحقق من وجود فقاعات في الغرفة السفلية. احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
- قم بإزالة البقعة بإضافة 20 ميكرولتر من PBS إلى الغرفة السفلية واستبدال حجم الغرفة العلوية ب 100 ميكرولتر من PBS. تخيل الأجهزة على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية مع لف طبق بتري في بارافيلم وحمايته من الضوء حتى يصبح جاهزا للتصوير.
- التصوير البؤري
ملاحظة: يصف هذا القسم تصوير الأجهزة باستخدام مجهر متحد البؤر لقرص دوار مقلوب مع هدف مسافة عمل طويلة (LWD) 40x (الماء ، WD 590-610 ، الفتحة العددية 1.15) كمثال. لمعرفة مسافات العمل وتوافق العدسات، يرجى الرجوع إلى المواد التكميلية في McCloskey et al.34. يتم أيضا التقاط صور لمنطقة الغشاء بأكملها باستخدام هدف 10x للتأكد من أن الصور 40x تمثل المجال بأكمله. وعادة ما تؤخذ هذه في مجال واسع.- قم بتشغيل المجهر وافتح برنامج التصوير.
- اضبط القنوات وفقا لخصائص الجسم المضاد الثانوي والبقعة النووية ، باستخدام وضع التصوير البؤري. قم بتحسين طاقة الليزر ووقت التعرض للتأكد من أن الإشارة فوق الخلفية وتقلل من آثار التصوير.
- بالنسبة للتلطيخ النووي Hoechst ، استخدم الإثارة 405 ، والانبعاث 450/50 Bandpass (BP) ، ووقت التعرض 500 مللي ثانية ، وطاقة الليزر 50٪. بالنسبة للملصقات التي تستخدم جسما مضادا ثانويا مقترنا ب Alexa Fluor (AF) 488 ، استخدم الإثارة 488 ، والانبعاث 525/50BP ، ووقت التعرض 500 مللي ثانية ، وطاقة الليزر 50٪. بالنسبة للملصقات التي تستخدم جسما مضادا ثانويا مترافقا مع AF568 ، استخدم الإثارة 561 ، والانبعاث 600/50BP ، ووقت التعرض 500 مللي ثانية ، وطاقة الليزر بنسبة 100٪.
- ضع الجهاز في حامل جهاز الانزلاق المجهري ، بحيث تكون الحجرة العلوية متجهة لأعلى واضبطها في المجهر باستخدام حامل منزلق مجهر. قم بتشغيل Live وحدد القناة الخاصة بالبقعة النووية. أوجد الغشاء باستخدام هدف منخفض، وتأكد من تمركز منطقة غشاء نيتريد السيليكون الشفاف؛ لأن الضوء لن ينتقل عبر منطقة السيليكون الزرقاء الصلبة. بمجرد توسيط الجهاز بشكل صحيح والعثور على طبقة الخلية ، قم بالتبديل إلى الهدف 40x ، وبلل الهدف ، وركز على منطقة الغشاء باستخدام البقعة النووية كدليل.
- قم بتشغيل تصوير z-stack واضبط وضع المسح الضوئي على بدء / إنهاء. تعيين حجم الخطوة أو العدد. باستخدام مقبض الضبط الخشن على المجهر ، اضبط بداية المسح على الجزء العلوي من طبقة الخلية البطانية ، باستخدام البقعة النووية كدليل ، ونهاية المسح في الجزء السفلي من طبقة pericyte ، باستخدام البقعة النووية كدليل. تحقق من جميع القنوات للتأكد من أنه سيتم التقاط كل شيء في مجال التصوير.
ملاحظة: عادة ما نستخدم الخطوة التلقائية ، وهي شرائح ~ 0.2 ميكرومتر. - قم بتعيين اسم الصورة واضغط على Acquisition لبدء التصوير. كرر على مناطق مختلفة حسب الحاجة.
- معالجة الصور متحدة البؤر باستخدام ImageJ40 أو Imaris.
- للمعالجة في Imaris ، اسحب ملف الصورة إلى البرنامج لفتحه. حدد القسم في شريط القائمة العلوي لمشاهدة صورة 2D لمستوى x-y مع طرق العرض المقابلة لطائرات x-z و y-z. حدد 3D View في شريط القائمة العلوي لرؤية صورة ثلاثية الأبعاد. انقر على الصورة واسحبها للتدوير. حدد لقطة في شريط القائمة العلوي لالتقاط صورة.
4. فحص أخذ العينات لنفاذية الجزيئات الصغيرة
ملاحظة: يصف هذا القسم منهجية للقياسات الكمية لخصائص الحاجز الواقي لمزارع الخلايا. الهدف من هذه التجربة هو الكشف عن تركيز جزيء صغير فلوري يمر عبر طبقات الخلية ويدخل الغرفة السفلية للمنصة. ثم تستخدم هذه البيانات لحساب النفاذية الخلوية.
- تقنية أخذ العينات
- قم بتجميع الأجهزة وفقا للبروتوكول المفصل في القسم 1 واستزراع خطوط الخلايا المطلوبة كما هو موضح في القسم 2. قم بتضمين جهاز إضافي ليكون بمثابة جهاز تحكم مطلي خال من الخلايا لقياس نفاذية النظام.
ملاحظة: يوصى بثلاثة تكرارات تقنية على الأقل لكل حالة ؛ ومع ذلك ، مطلوب نسخة واحدة فقط من التحكم المطلي. - قبل البدء في فحص أخذ العينات ، استبدل الوسط الموجود في الغرفة السفلية بوسط جديد. تحقق من التقاء الطبقة الأحادية البطانية في كل جهاز تحت المجهر. لاحظ أي فجوات في الطبقة الأحادية للخلية ، لأن هذا سيؤثر على انتشار الصبغة في الحجرة السفلية.
ملاحظة: يجب أن تكون الثقافة البطانية الصحية متقاربة بنسبة 100٪. - تحضير محلول الجزيء الصغير الفلوري (على سبيل المثال ، 150 ميكروغرام / مل لوسيفر الأصفر ، 457 دا) في وسط زراعة الخلايا. تحضير الحجم الزائد من محلول الجزيء الصغير الفلوري لاستخدامه في تحضير المحاليل القياسية التي تعمل كمراجع لحساب تركيز الجزيء الصغير الفلوري المأخوذ من القناة السفلية.
ملاحظة: نوصي بإعداد 400 ميكرولتر من المحلول الزائد لاستخدامه كمحلول قياسي بأعلى تركيز لجزيء الفلورسنت الصغير. - استبدل الوسط في البئر العلوي ب 100 ميكرولتر من محلول الجزيء الصغير الفلوري.
ملاحظة: نوصي باستخدام قلم كاره للماء لرسم دوائر حول منافذ أخذ العينات والانتظار حتى يجف الحبر الكارهة للماء تماما قبل إضافة محلول صبغة الفلورسنت. هذا يمنع انتشار الوسيط من القناة السفلية حول منفذ أخذ العينات في الخطوة 4.1.7. نوصي بإضافة محلول الجزيء الصغير الفلوري إلى الجزء العلوي جيدا انتظر 2 دقيقة قبل إضافة محلول الفلورسنت إلى الجهاز التالي ، أو العمل في مجموعات من 3 (أضف المحلول إلى ثلاثة أجهزة في نفس الوقت وانتظر 5 دقائق لإضافة الأجهزة الثلاثة التالية). - احتضان الأجهزة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
- أثناء الحضانة بطول ساعة واحدة في الخطوة السابقة ، قم بإعداد الحلول القياسية عن طريق إجراء تخفيفات تسلسلية 2 أضعاف من محلول الجزيء الصغير الفلوري المحضر في الخطوة 4.1.3. ماصة 50 ميكرولتر من كل محلول في لوحة 96 بئر سوداء مسطحة القاع في ثلاث نسخ. استخدم وسيط زراعة الخلايا الفارغة كحل قياسي أساسي.
ملاحظة: لإعداد الحلول القياسية ، نوصي ب 11 تخفيفا تسلسليا بحجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر واستخدام وسط زراعة الخلايا فارغا لقياس شدة الفلورسنت الأساسية.- انقل 200 ميكرولتر من 400 ميكرولتر من محلول الجزيء الصغير الفلوري الزائد المحضر في الخطوة 4.1.3 إلى أنبوب يحتوي على 200 ميكرولتر من الوسط ، واخلطه جيدا ، وانقل 200 ميكرولتر من هذا المحلول إلى الأنبوب التالي الذي يحتوي على 200 ميكرولتر من الوسط. كرر التخفيفات 1: 2 حتى يكون هناك ما مجموعه 10 أنابيب. ماصة 50 ميكرولتر من المحلول القياسي الأكثر تركيزا في العمود 1 في ثلاث نسخ في لوحة 96 بئرا (B1 ، C1 ، D1) ، المحلولالثاني الأكثر تركيزا في العمود 2 (B2 ، C2 ، D2) ، وهكذا. بالنسبةللعمود الثاني عشر في اللوحة ، ماصة 50 ميكرولتر من الوسائط الفارغة في ثلاث نسخ (B12 ، C12 ، D12).
- نفذ الخطوات التالية لأخذ عينة من محلول الجزيء الصغير الفلوري من القناة السفلية.
- قم بإزالة محلول الجزيء الصغير الفلوري من البئر لإيقاف عملية الانتشار.
- ضع طرفا يحتوي على 50 ميكرولتر من الوسط في المنفذ العلوي ليكون بمثابة خزان عن طريق إدخال الطرف ب 50 ميكرولتر في المنفذ ، ورفع الجهاز ، وإخراج الطرف برفق أثناء التمسك بالأعلى لتحقيق الاستقرار. قم بضبط الجهاز. تأكد من عدم وجود فقاعات في طرف الماصة أو هواء عند طرف الماصة لتجنب إضافة فقاعات إلى الحجرة السفلية أثناء أخذ العينات.
- أضف 50 ميكرولتر من الوسط إلى البئر العلوي لمنع تعطل الطبقة الأحادية للخلية أثناء أخذ العينات.
- لأخذ عينات من المحلول من القناة السفلية ، ادفع ماصة بطرف ماصة فارغ إلى مقاومته الأولى ، وأدخل الطرف في منفذ أخذ العينات ، وقم بسحب 50 ميكرولتر من المحلول من القناة السفلية. انقله مباشرة إلى اللوحة السوداء ذات القاع المسطح ذات 96 بئرا التي تحتوي على الحلول القياسية.
ملاحظة: نوصي بفحص الطبقة الأحادية للخلية تحت المجهر مباشرة بعد أخذ العينات. يمكن أن يؤدي سحب الوسائط من القناة السفلية أحيانا إلى تعطيل طبقة الخلية في البئر العلوي ، مما قد يتسبب في قياسات نفاذية غير متسقة. سيساعد العمل بسرعة خلال الخطوات في 4.1.7 في منع ذلك.
- قم بقياس شدة التألق في قارئ الصفيحة الدقيقة باستخدام معلمات الطول الموجي للإثارة والانبعاث المناسبة للجزيء الصغير الفلوري المستخدم. بالنسبة إلى Lucifer Yellow ، استخدم إثارة 428 نانومتر وانبعاث 536 نانومتر ، مع الكسب الأمثل. يتم قياس مضان من أعلى اللوحة. أضف اللوحة إلى قارئ اللوحة ، وقم بتمييز الآبار بالعينة (بما في ذلك المنحنى القياسي) وحدد ابدأ لقراءة اللوحة.
- قم بتجميع الأجهزة وفقا للبروتوكول المفصل في القسم 1 واستزراع خطوط الخلايا المطلوبة كما هو موضح في القسم 2. قم بتضمين جهاز إضافي ليكون بمثابة جهاز تحكم مطلي خال من الخلايا لقياس نفاذية النظام.
- حساب قيمة النفاذية (انظر الملف التكميلي 1 للقالب)
- اطرح متوسط قيمة شدة التألق للوسط الفارغ من جميع قيم شدة التألق المقاسة.
- استخدم المعادلة (1) لحساب نفاذية النظام Ps:
(1)
حيث [A] A هو تركيز الجزيء الصغير الفلوري الذي تم جمعه من القناة السفلية ، V هو الحجم الذي تم أخذ عينات منه وإضافته إلى اللوحة (0.050 مل) ، [A] L هو تركيز الجزيء الصغير الفلوري المضاف إلى البئر العلوي (على سبيل المثال 0.15 مجم / مل) ، t هو وقت الحضانة (في s أو min حسب الوحدات المطلوبة) ، و S هي مساحة سطح الغشاء (0.014 سم2).- احسب [A] A باستخدام المعادلة التي تم الحصول عليها عن طريق رسم منحنى قياسي من مخرجات شدة التألق والتركيزات المعروفة للحلول القياسية. احسب التركيزات (x) للعينات التجريبية عن طريق إدخال قيم شدة التألق (y) في المعادلة.
ملاحظة: استخدم جزء المنحنى القياسي الخطي. نوصي بقياس مساحة سطح الغشاء من صورة للغشاء مأخوذة تحت المجهر حيث يمكن أن تختلف مساحة الغشاء اعتمادا على رقم اللوت وقد تؤثر بشكل كبير على قيم النفاذية المحسوبة إذا كانت تختلف عن التحكم المطلي.
- احسب [A] A باستخدام المعادلة التي تم الحصول عليها عن طريق رسم منحنى قياسي من مخرجات شدة التألق والتركيزات المعروفة للحلول القياسية. احسب التركيزات (x) للعينات التجريبية عن طريق إدخال قيم شدة التألق (y) في المعادلة.
- استخدم المعادلة (2) لحساب نفاذية الخلية أحادية الطبقة Pe:
(2)
حيث PS هي نفاذية النظام كما تم حسابها في الخطوة 4.2.2 و PC هي قيمة نفاذية النظام لجهاز التحكم المطلي الخالي من الخلايا.
(1)
(2)Representative Results
يظهر تجميع جهاز الخندق لأسفل في الشكل 1. توجه التركيبات تجميع المكونات ورقاقة الغشاء. المكون 1 هو في المقام الأول من الأكريليك مع سطح PSA للربط بالشريحة وفتحة إلى الغرفة السفلية ومنافذ للوصول إلى الماصة إلى الغرفة السفلية. المكون 2 هو طبقة القناة ويحتوي على "مثلث" غير لاصق وخالي من PSA في أعلى اليمين للإمساك به. توفر أجهزة الخندق لأسفل منطقة نمو خلية مسطحة في الغرفة العلوية ، بينما تحتوي أجهزة الخنادق العلوية على سطح مستو لزراعة الخلايا في الغرفة السفلية.
أجرينا عمليات زراعة أحادية ومزارع مشتركة ل hCMEC / D3 و HBVPs والخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المشتقة من hiPSC IMR90-4 و BPLCs واكتسبنا صورا طورية باستخدام مجهر تباين الطور Nikon Eclipse Ts2 وهدف 10x (الشكل 2). يتم عرض كثافات البذر المثلى لزراعة الخلايا الأولية (الصور المأخوذة بعد يوم واحد من البذر) ، وكذلك HBVPs تحت البذور (الشكل 2 أ). قد يكون من الصعب التمييز بين صور مرحلة الزراعة المشتركة والزراعة الأحادية النهائية (6 أيام من زراعة الخلايا البطانية) (الشكل 2C) ، وقد يتطلب تأكيد نجاح الثقافة المشتركة للخلايا الأولية تلطيخا مناعيا (انظر قسم البروتوكول 3). كما يتم توضيح كثافات البذر BPLC المنخفضة والعالية والمثلى المشتقة من hiPSC (الشكل 2B). الثقافة المشتركة المشتقة من hiPSC أكثر وضوحا للتمييز في تصوير تباين الطور مقارنة بالثقافات المشتركة الأولية (الشكل 2D). يؤدي انخفاض البذر BPLC إلى ضعف تغطية pericyte وتكتل pericyte ، في حين أن الإفراط في البذر يؤدي إلى تقشير طبقة pericyte من الغشاء. علاوة على ذلك ، قد يؤدي تبادل الوسط في الغرفة السفلية بسرعة كبيرة إلى فقدان pericyte ، لأن هذه الخلايا حساسة جدا للقص. التغطية المثلى بواسطة pericytes هي ~ 90٪ لنموذج BBB ، مع عدم وجود فجوات في الطبقة البطانية.
يتم توضيح الصور التمثيلية للثقافة المشتركة المشتقة من hiPSC الملطخة بالمناعة في الشكل 3 (6 أيام من زراعة الخلايا البطانية). تم تلطيخ BPLCs المشتقة من IMR90-4 لعلامة pericyte PDGFRβ ، وتم تلطيخ الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المشتقة من IMR90-4 لعلامة تقاطع الالتصاق VE-cadherin. تم استخدام Hoechst لتلطيخ النوى. تم الحصول على الصور على مجهر متحد البؤر القرص الدوار باستخدام هدف LWD 40x مع شرائح 0.2 ميكرومتر ومعالجتها باستخدام Imaris. يمكن تصور كلتا طبقتي الخلية على الرغم من عدم رؤية الغشاء النانوي الرقيق.
أجرينا مقايسة نفاذية الجزيئات الصغيرة القائمة على أخذ العينات باستخدام نفس الظروف التجريبية في مختبرين بعيدين ماديا في جامعة برن ، سويسرا ، وجامعة روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية لإثبات قابلية استنساخ النتائج بين المختبرات (الشكل 4)34. تم استزراع الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المشتقة من hiPSC IMR90-4 في جهاز μSiM لمدة 2 أو 4 أو 6 أيام وعلى مرشحات الإرسال لمدة 6 أيام. تم إجراء الفحص باستخدام 150 ميكروغرام / مل لوسيفر الأصفر (457 دا) في كلا المختبرين. يشير التباين العالي في نفاذية الخلايا البطانية المزروعة لمدة يومين في الجهاز إلى أن يومين من الثقافة لم يكونا كافيين لنضوج الحاجز. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في النفاذية بين المختبرات عند نضج الحاجز - من 4 أيام فصاعدا. أظهرنا أيضا أن نفاذية الخلايا البطانية المزروعة في μSiM ومرشحات transwell لمدة 6 أيام تتطابق مع تلك المنشورةسابقا 40.
الشكل 1: خطوات تجميع μSiM . (أ) قم بإعداد الشريحة بوضعها على التركيب A1. ضع خندق الرقاقة لأعلى للحصول على جهاز خندق نهائي. ضع خندق الرقاقة لأسفل للحصول على جهاز خندق نهائي. (ب) اربط المكون 1 بالشريحة عن طريق إزالة الأقنعة الواقية من المكون 1 ووضعها ووجهها لأسفل في FA1. السندات عن طريق الضغط مع لاعبا اساسيا A2. (ج) ربط المكون 2 والمكون 1 عن طريق إزالة المكون 2 من الصفيحة وتقشير الطبقات الواقية العلوية. ضع القناة لأعلى في التركيب B1 وضع المكون 1 أعلى المكون 2 لأعلى. السندات عن طريق الضغط مع لاعبا اساسيا B2. الاختصارات: FAn = لاعبا اساسيا An; FBn = لاعبا اساسيا Bn. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي للاستزراع المشترك وصور تباين الطور التمثيلي لزراعة الخلايا في الأجهزة. أ: موقع بذر الخلايا المحيطة والبطانية. (ب) منظر تخطيطي جانبي لمواقع الخلايا عبر خندق رقاقة الغشاء. (ج) صور تمثيلية لكثافات البذر المنخفضة والمثلى لخط الخلايا البطانية الأولية للدماغ HBVP و hCMEC / D3. تم الحصول على الصور بعد يوم واحد من البذر (HBVP) و 2 ساعة بعد البذر (hCMEC / D3). د: صور تمثيلية لكثافات البذر المنخفضة والعالية والمثلى للخلايا الشبيهة بالخلايا المحيطة بالدماغ المشتقة من hiPSC. تم الحصول على الصور 1 يوم بعد البذر. (ه) صور تمثيلية للثقافة المشتركة النهائية HBVP و hCMEC / D3 والزراعة الأحادية hCMEC / D3. تم الحصول على الصور بعد 8 أيام من بذر HBVP و 7 أيام بعد بذر hCMEC / D3. (و) صور تمثيلية للثقافة المشتركة الشبيهة ب BPLC و EECM-BMEC الفاشلة والناجحة وزراعة الخلايا الأحادية الشبيهة ب EECM-BMEC. تم الحصول على الصور بعد 7 أيام من بذر BPLC و 6 أيام بعد بذر EECM-BMEC. تفشل ثقافات BPLC غير المصنفة في الحصول على تغطية كافية ، في حين أن الإفراط في زراعة ثقافات BPLC سينمو بشكل مفرط ويبدأ في التكتل / الانحسار. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (C-F). الاختصارات: HBVPs = pericytes الأوعية الدموية في الدماغ البشري. hiPSC = الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ؛ BPLCs = خلايا تشبه الخلايا المحيطة بالدماغ المشتقة من hiPSC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية للثقافة المشتركة للخلايا المشتقة من hiPSC الملطخة بالمناعة في الأجهزة. تم تلطيخ الخلايا لعلامة الخلايا البطانية VE-cadherin (أخضر) ، وعلامة pericyte PDGFRβ (حمراء) ، وبقعة نووية (زرقاء). يمكن رؤية طبقتين من الخلايا على مقربة ، مفصولة فقط بغشاء نانوي رقيق من نيتريد السيليكون (يشير السهم الأبيض إلى موقع الغشاء على الصورة اليسرى). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: hiPSC = الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. PDGFRβ = مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية بيتا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مقايسة نفاذية الجزيئات الصغيرة القائمة على أخذ العينات. (أ) رسم تخطيطي لسير العمل التجريبي. (ب) عرض لقابلية التكاثر بين المختبرات بين مختبرين بعيدين ماديا في جامعة برن (UniBe) ، سويسرا ، وجامعة روتشستر (UR) ، NY ، الولايات المتحدة الأمريكية: تم زرع الخلايا البطانية المشتقة من hiPSC في جهاز μSiM لمدة 2 أو 4 أو 6 أيام وفي مرشحات transwell لمدة 6 أيام. تم إجراء مقايسة النفاذية باستخدام 150 ميكروغرام / مل لوسيفر الأصفر (457 دا). يشير الشريط الأحمر إلى بيانات نفاذية فلوريسئين الصوديوم (376 Da) المنشورة مسبقا لنفس الخلايا البطانية المشتقة من hiPSC المزروعة لمدة 6 أيام في مرشحات transwell40. N = 4-16 لكل مجموعة. تم استخدام ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق ، وتم عرض المقارنات فقط ل p < 0.05 ذات الصلة. (ج) إظهار استجابة السيتوكين باستخدام الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المشتقة من hiPSC المزروعة في μSiM لمدة 2 أيام ؛ تمت إضافة 0.1 نانوغرام / مل TNFα + 2 وحدة دولية / مل IFNγ) أو التحكم في الوسائط (غير محفز ، NS) إلى الغرفة العلوية لمدة 20 ساعة قبل مقايسة النفاذية باستخدام 150 ميكروغرام / مل لوسيفر أصفر. N = 3 لكل مجموعة. اختبار t للطالب ، ص < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مساحة سطح البذر في الغرفة العلوية | أعلى حجم البئر | الغرفة السفلية البذر مساحة السطح | حجم القناة السفلي |
| ~ 37 مم2 | 100 ميكرولتر (يمكن أن تستوعب ≥115 ميكرولتر) | ~ 42 مم2 | 10 ميكرولتر (ماصة 20 ميكرولتر لتجنب الفقاعات) |
الجدول 1: مساحة سطح μSiM الحرجة وأحجامها.
| هدف | مثبت | حل الحظر | التخفيف |
| VE-cadherin | 4٪ PFA أو 100٪ MeOH | 5٪ GS + 0.4٪ Tx-100 أو 10٪ GS + 0.3٪ Triton X-100 | 1:50 |
| سي دي 31 | 4٪ PFA أو 100٪ MeOH | 5٪ GS + 0.3-0.4٪ تريتون X-100 | 1:100 |
| كلاودين-5 | 100٪ MeOH | 5-10٪ GS + 0.3٪ تريتون X-100 | 1:200 |
| زو-1 | 100٪ MeOH | 5-10٪ GS + 0.3٪ تريتون X-100 | 1:200 |
| أوكلودين | 100٪ MeOH | 5-10٪ GS + 0.3٪ تريتون X-100 | 1:50 |
| PDGFRβ | 4٪ PFA | 5٪ GS + 0.4٪ Triton X-100 | 1:100 |
| إن جي 2 | 4٪ PFA | 5٪ GS + 0.4٪ Triton X-100 | 1:100 |
| ماعز α ماوس IgG أليكسا فلور 488 | 1:200 | ||
| ماعز α ماوس IgG أليكسا فلور 568 | 1:200 |
الجدول 2: الأجسام المضادة وطرق التلوين التي تم التحقق من صحتها للكيمياء المناعية للثقافة المشتركة في أجهزة μSiM. الاختصارات: PFA = بارافورمالدهيد. MeOH = الميثانول. GS = مصل الماعز.
الملف التكميلي 1: نموذج لحساب قيمة النفاذية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
بينما تم تصميم رقائق الغشاء لتحقيق الاستقرار ، يمكن أن تتشقق أو تنكسر إذا تم التعامل معها بشكل غير صحيح أثناء التجميع. وبالتالي ، من الأهمية بمكان الإمساك بالشريحة في شقوق ملاقط الرقاقة ووضعها برفق في التركيبات. عند التعامل مع الأجهزة بشكل عام ، يجب اتخاذ احتياطات إضافية لعدم ارتطام الأجهزة أو إسقاطها. أثناء ربط رقاقة الغشاء بالتركيبات A1 ، يجب وضع الشريحة بشكل مسطح وتوسيطها على عمود التركيب A1 لتجنب تكسير الغشاء أثناء الترابط بالمكون 1. علاوة على ذلك ، يجب تجنب أي اتصال بطبقات PSA المكشوفة بعد إزالة الأقنعة الواقية. عند التعامل مع المكون 2 بعد إزالة الأقنعة الواقية ، ينصح بتثبيته على طول حافة المكون واستخدام الملقط للاستيلاء على زاوية المثلث الخالية من PSA.
بينما تم وصف بروتوكولات زراعة الخلايا لنماذج BBB المحتملة ، فإن نموذج الثقافة المشتركة BMEC / pericyte ل BBB الموصوف هنا قد يكون كافيا أو غير كاف اعتمادا على السياق الفسيولوجي والأسئلة ذات الاهتمام. على سبيل المثال ، يحدث الاتجار بالخلايا المناعية إلى حد كبير في الأوردة التالية للشعيرات الدموية في الدماغ41,42. في هذه المناطق ، يفصل الفضاء حول الأوعية حاجز BMEC / pericyte عن الحدود الدبقية التي أنشأتها الخلايا النجمية. وهكذا ، في الأوردة بعد الشعيرات الدموية ، تتكون الوحدة الوعائية العصبية (NVU) من حاجزين منفصلين جسديا في سلسلة ، ولا تتصل القدمان النجمية مباشرة بحاجز الدم BMEC / pericyte ، والذي يمثله النموذج الحالي بشكل جيد. إذا كان الهدف هو نموذج NVU الذي يفسر تأثير العوامل التي تفرزها الخلايا النجمية على حاجز الدم ، فيمكن إضافة حجرة الخلايا النجمية إلى الجهاز الذي يسمح بتبادل العوامل القابلة للذوبان عبر الفضاء حول الأوعية. تم توضيح هذا المثال سابقا34 ويمكن توسيعه ليشمل خلايا أخرى مثل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في حجرة "الدماغ" ثلاثية الأبعاد. تتيح البنية المعيارية للمنصة استخدام استراتيجيات التجميع البسيطة لتحقيق عمليات إعادة التشكيل هذه بحيث تكون المنصة بسيطة أو معقدة حسب الحاجة لمعالجة الفرضيات المطروحة. كل إعداد ثقافة الخلية. ومع ذلك ، يجب تحسينها لخطوط الخلايا الجديدة والثقافات المتعددة. على سبيل المثال ، نظرا لخصائص أغشية نيتريد السيليكون ، قد تحتاج محاليل الطلاء إلى التعديل مقارنة بألواح زراعة الأنسجة. يساعد إدراج الفبرونيكتين عادة في ارتباط الخلية وبقائها على قيد الحياة. علاوة على ذلك ، يمكن للمستخدمين زراعة الخلايا البطانية والخلايا المحيطة في اتجاهين متعاكسين. في هذه الحالة ، قد يكون من الضروري تعديل ، على سبيل المثال ، طريقة إجراء قياسات النفاذية وتفسيرها. ومع ذلك ، فإن توفير خطوات لهذا النوع من الثقافة يتجاوز نطاق هذه الورقة.
التحدي الآخر الذي قد يواجهه المرء أثناء زراعة الخلايا هو التبخر السريع للوسائط لأن الأجهزة يمكن أن تكون أكثر حساسية للتغيرات في البيئة مقارنة بألواح وقاروير زراعة الأنسجة القياسية. إذا شوهد التبخر الزائد أو تباطأ نمو الخلايا ، فيجب قياس جميع معلمات الحاضنة الحرجة لضمان الإعدادات الدقيقة. يمكن إضافة المزيد من الماء إلى غطاء الأنسجة أو طبق بتري الصغير الموجود داخل غرفة زراعة الخلايا ، أو يجب تبادل الوسائط بشكل متكرر. علاوة على ذلك ، يمكن أن تدخل الفقاعات القناة السفلية وتتعثر في الخندق لأجهزة الخندق. بينما يمكن إزالتها ، فمن الأسهل تجنب إضافة فقاعات في المقام الأول. للقيام بذلك ، من المهم التحقق من عدم وجود فقاعات في طرف الماصة أو الهواء في نهاية طرف الماصة قبل سحب الوسائط إلى الغرفة السفلية. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تبخر الوسائط في القناة إلى وجود فجوة بين سطح الوسائط وأعلى المنفذ. يمكن سحب حجم صغير من الوسائط في منفذ واحد حتى تصل الوسائط إلى سطح المنفذ المقابل ، وبعد ذلك يمكن تبادل الوسائط في هذا المنفذ المقابل. بينما لا ينبغي تسخين وسائط hECSR و E6 + 10٪ FBS في حمام مائي ، يمكن تسخين الوسائط الأخرى لتقليل تكوين الفقاعة. إذا دخلت فقاعة إلى الغرفة السفلية ، فيمكن إزالتها عن طريق سحب 100 ميكرولتر بسرعة عبر القناة. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي هذه الطريقة إلى التلوث بين الغرف أو الوسائط المنسكبة عبر سطح الجهاز. قد يعطل أيضا طبقات الخلايا. بدلا من ذلك ، يمكن إزالة الوسائط من القناة أولا ثم إعادة تقديمها بحجم 50 ميكرولتر. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي إزالة الوسائط أولا إلى تكوين المزيد من الفقاعات في القناة. إذا لم تكن الفقاعة تحت منطقة الغشاء مباشرة ، فيمكن تركها في القناة دون أي تأثيرات على زراعة الخلايا.
يمكن أن يكون ارتباط الخلايا المحيطة بالخلية ونموها، كما هو موضح في الشكل 2، أمرا صعبا. يعد استخدام كثافة البذر المحسنة أمرا ضروريا لتشكيل طبقة ذات نسبة خلية محيطية إلى بطانة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الخلايا المحيطة حساسة للقص ، يجب أن تتم جميع عمليات تبادل الوسائط في القناة ببطء شديد لحماية الخلايا. بالنسبة لثقافة BPLC ، يمكن تحقيق ارتباط محسن عن طريق طلاء الغرفة السفلية ب 800 ميكروغرام / مل من الكولاجين من النوع الرابع أو 100 ميكروغرام / مل من الفبرونيكتين.
تتيح الكيمياء المناعية في الأجهزة الموصوفة هنا التحليل النوعي لصحة الخلية ووظيفتها. يجب أن تكون طرق التلوين في ألواح زراعة الأنسجة أو المنصات الأخرى قابلة للترجمة مباشرة إلى المنصة. لزراعة الخلايا في الغرفة العلوية فقط ، بعد التثبيت ، يمكن إضافة PBS إلى الغرفة السفلية وتركها للخطوات المتبقية ، مع إجراء الحجب والتلوين في الغرفة العلوية فقط. هذا يقلل من مخاطر كسر الأغشية أو الحصول على فقاعات في الغرفة السفلية. لتلطيخ الثقافة المشتركة ، نوصي باستخدام كلا الغرفتين في جميع الخطوات. من المهم ملاحظة أن لزوجة المثبت و PBS تختلف عن لزوجة الوسائط. وبالتالي ، قد يكون من الأسهل إضافة فقاعات إلى الحجرة السفلية ، ويجب توخي الحذر الشديد لفحص أطراف الماصة بحثا عن الهواء في نهاية الطرف قبل السحب في الغرفة السفلية.
يسمح البروتوكول الموصوف لمقايسة نفاذية الجزيء الصغير بالتقييم الوظيفي والكمي لوظيفة الحاجز للخلايا البطانية المزروعة في جهاز μSiM. إحدى المشكلات التي قد تتم مواجهتها أثناء هذا الفحص هي سحب فقاعات الهواء إلى الماصة أثناء جمع العينات من القناة السفلية في خطوة البروتوكول 4.1.7.4. لتجنب هذه المشكلة ، من المهم التأكد من إغلاق الطرف في المنفذ قبل البدء في جمع العينات ويجب عدم سحب العينة بسرعة كبيرة. إذا لم يؤد ذلك إلى حل المشكلة ، فقد يكون حجم الأطراف المستخدمة صغيرا جدا أو كبيرا جدا بحيث لا يتناسب مع المنافذ ؛ استخدم النصائح المدرجة في جدول المواد. إذا تم قياس قيم نفاذية عالية بشكل غير متوقع على الرغم من وجود طبقة أحادية متقاربة ذات مظهر صحي ، فيجب التحقق من سلامة الطبقة الأحادية بحثا عن الاضطراب أثناء جمع العينة. نوصي دائما بفحص الطبقة الأحادية تحت المجهر مباشرة بعد جمع العينات. إذا كانت الطبقة الأحادية لا تزال تبدو سليمة وصحية ، فيمكن تثبيت العينة ويمكن تقييم العلامات البيولوجية لوظيفة الحاجز ، على سبيل المثال ، عن طريق التلوين المناعي للبروتينات الموصلية. على العكس من ذلك ، إذا تم قياس قيم نفاذية منخفضة بشكل غير متوقع ، فمن المهم التأكد من أخذ عينات من 50 ميكرولتر من الوسائط من القناة السفلية دون أي فقاعات هواء. إذا خرج الوسط من منفذ أخذ العينات بمجرد وضع طرف الخزان ، فيجب جمع هذه الوسائط قبل تركيب الماصة في منفذ أخذ العينات لأن معظم جزيء الفلورسنت الصغير سيكون موجودا في الحجم الأولي 10 ميكرولتر الذي تم أخذ عينات منه من القناة السفلية. إن رسم دوائر حول المنافذ باستخدام قلم كاره للماء أو وضع شريط كاره للماء به فتحة حول المنفذ يمنع أي وسائط يتم ضخها بشكل سلبي من الانتشار. إذا تم سحب الفقاعات أثناء أخذ العينات أو لم تتم إزالة عينة 50 ميكرولتر الكاملة ، فيجب عدم استخدام العينة. بدلا من ذلك ، يمكن تحديد الحجم الدقيق واستخدامه في حساب النفاذية ؛ ومع ذلك ، يجب أن يتم ذلك فقط إذا كان الحجم الذي تمت إزالته هو ≥40 ميكرولتر ، وهو ما يتوافق مع ~ 98-99٪ استعادة الصبغة34.
Disclosures
J.L.M. هو أحد مؤسسي SiMPore ويمتلك حصة في الشركة. تقوم SiMPore بتسويق التقنيات القائمة على السيليكون فائقة النحافة بما في ذلك الأغشية المستخدمة في هذه الدراسة.
Acknowledgments
تم تمويل J.L.M. ، B.E. ، T.R.G. ، M.C.M. ، P.K. ، M.T. ، K.C. ، و L.W. من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R33 HL154249. تم تمويل J.L.M. من قبل R44 GM137651. تم تمويل M.M. من قبل جائزة برنامج شميدت معهد ديل مونتي لعلم الأعصاب ، جامعة روتشستر. تم تمويل M.T. من قبل RF1 AG079138. تم تمويل KC من قبل المؤسسة الدولية للبحوث الأخلاقية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
| Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
| Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
| VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
| ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| 100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
| DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
| hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
| PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
| Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
| Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
| Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
| Experimental models: Cell lines | |||
| Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
| Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
| iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
| Glassware and Plasticware | |||
| 150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
| Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
| Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
| Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
| Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
| P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
| Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
| Instruments | |||
| 10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
| 10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
| 40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
| Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
| Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
| TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
| Other | |||
| Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
| Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
| Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 - Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
| Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
| Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
| Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
| Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
| Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
| SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
| Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
| Software | |||
| Fiji | ImageJ | For image processing | |
| Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
| i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
| Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |
References
- Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405 (2019).
- Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
- Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson's disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813 (2011).
- Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451 (2022).
- Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
- Ortiz, G. G., et al.
- Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
- Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222 (2022).
- Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
- Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
- Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
- Abbott, N. J., et al.
- Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
- Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671 (2016).
- van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770 (2023).
- Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685 (2021).
- Lea, T., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).
- Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
- Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880 (2021).
- Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
- Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
- Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
- DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
- Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750 (2020).
- Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111 (2019).
- Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
- Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
- Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
- Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
- McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802 (2022).
- Su, S. -H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030 (2023).
- Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
- Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
- Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21 (2021).
- Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H.
