Summary
Dit rapport biedt protocollen voor assemblage, celkweek en assays op het μSiM-platform voor de constructie van bloed-hersenbarrièremodellen.
Abstract
De microSiM (μSiM) is een op membraan gebaseerd kweekplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière (BBB). In tegenstelling tot conventionele op membranen gebaseerde platforms, biedt de μSiM experimentalisten nieuwe mogelijkheden, waaronder beeldvorming van levende cellen, ongehinderde paracriene signalering tussen 'bloed'- en 'hersen'-kamers, en de mogelijkheid om immunofluorescentie direct in beeld te brengen zonder de noodzaak van extractie/hermontage van membranen. Hier demonstreren we het basisgebruik van het platform om monocultuur (endotheelcellen) en co-cultuur (endotheelcellen en pericyten) modellen van de BBB op te zetten met behulp van ultradunne nanoporeuze siliciumnitridemembranen. We tonen compatibiliteit aan met zowel primaire celculturen als humane geïnduceerde pluripotente stamcelculturen (hiPSC). We bieden methoden voor kwalitatieve analyse van BBB-modellen via immunofluorescentiekleuring en demonstreren het gebruik van de μSiM voor de kwantitatieve beoordeling van de barrièrefunctie in een permeabiliteitstest van kleine moleculen. De aangeboden methoden moeten gebruikers in staat stellen hun barrièremodellen op het platform vast te stellen, waardoor het gebruik van weefselchiptechnologie voor het bestuderen van menselijke weefsels wordt bevorderd.
Introduction
Levende weefsels worden gecompartimenteerd door gespecialiseerde cellen die barrières creëren en in stand houden en reguleren welke cellen en moleculen van het ene compartiment naar het andere worden getransporteerd. De onjuiste regulatie van barrièrefuncties kan de bron zijn van zowel acute ziekten als chronische ziekten. De bloed-hersenbarrière (BBB) is de meest beperkende weefselbarrière in het menselijklichaam1. Disfunctie van de BBB ligt ten grondslag aan een breed scala aan ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS), waaronder de ziekte van Alzheimer2, de ziekte van Parkinson3,4 en multiple sclerose 5,6. Letsel aan de BBB is ook gekoppeld aan langdurige cognitieve stoornissen als gevolg van acute aandoeningen, zoals sepsis7, COVID-198 en postoperatief delirium9. De ontwikkeling van geneesmiddelen met het potentieel om hersenaandoeningen te behandelen is frustrerend moeilijk geweest vanwege de uitdaging om opzettelijk de BBB te doorbreken om bioactieve moleculen af te leveren aan doelen in de hersenen10. Om deze redenen zijn methoden om de BBB-functie in vitro te bestuderen van het grootste belang voor het begrip en de behandeling van ziekten van het CZS.
De basismethoden voor het meten van de barrièrefunctie in vitro omvatten het aanbrengen van een monolaag of cocultuur op een semi-permeabel membraan en het meten van de weerstand die cellen geven aan diffusie van kleine moleculen of kleine elektrische stromen11,12,13,14. Hoewel de opkomst van microfysiologische systemen (MPS) een overvloed aan keuzes heeft opgeleverd voor het modelleren van de BBB in 3D15,16, maakt de diversiteit aan systeemgeometrieën het moeilijk om permeabiliteitsmetingen tussen MPS of gevestigde literatuurwaarden te vergelijken. Het vaststellen van betrouwbare basiswaarden is vooral belangrijk in BBB-onderzoek waar, vanwege de uitgebreide barrièreregulatie door vasculaire endotheelcellen in de hersenen, in vitro permeabiliteitswaarden sterk worden onderzocht12,17,18. Om deze redenen zullen permeabiliteitsmetingen over monolagen op 2D-membranen de komende jaren een hoofdbestanddeel blijven van BBB-studies. Dit geldt voor andere weefselbarrières, waaronder epitheliale barrières, waar absolute waarden van baseline permeabiliteit worden gebruikt om in vitro modellen te valideren en te vergelijken 19,20,21.
Met het doel om een waardevol nieuw hulpmiddel voor de BBB-onderzoeksgemeenschap tot stand te brengen, hebben we de afgelopen 5 jaar 22 en 23,24,25,26 het microapparaatmet een siliconm embrane (μSiM)-platform geïntroduceerd voor gebruik bij het modelleren van barrièreweefsel. Het faciliterende kenmerk van het platform is een ultradun (<100 nm dik) membraan met honderden miljoenen nanoporiën 27,28 of een mix van nanoporiën en microporiën29. De vrijstaande membraanchips worden geproduceerd op een silicium 'chip' van 300 μm die de ultradunne structurenstabiliseert 30 en het mogelijk maakt om ze met een pincet te hanteren voor de assemblage van het apparaat. Vanwege hun ultradunne aard hebben de membranen een permeabiliteit die twee ordes van grootte hoger is dan die van conventionele spoorgeëtste membranen die worden gebruikt in commerciële membraankweekapparaten31,32. In de praktijk betekent dit dat de hinder van het membraan voor de diffusie van moleculen kleiner dan de nanoporiën (<60 nm) verwaarloosbaar is33. Voor cellulaire barrières zullen dus alleen de cellen en de matrices die ze afzetten de snelheid bepalen van het transport van kleine moleculen van de apicale naar basale compartimenten die door het membraan worden gescheiden34. Het ontwerp van het apparaat en de ultradunne aard van de membranen bieden ook veel voordelen voor optische microscopie. Deze omvatten 1) de mogelijkheid om levende culturen te volgen met behulp van fasecontrast of helderveldbeeldvorming, 2) de mogelijkheid om fluorescerend te kleuren en in situ te beelden zonder de noodzaak om het membraan te extraheren en over te brengen naar een dekglas, en 3) het feit dat de membranen dunner zijn dan confocale 'plakjes', zodat directe co-culturen een meer natuurlijke afstand tussen celtypen hebben dan kan worden bereikt met 6-10 μm dikke spoorgeëtste membranen.
Onlangs hebben we het platform doorontwikkeld naar een modulair formaat om snelle montage34 en maatwerk35,36 mogelijk te maken. We hebben het modulaire formaat gebruikt om apparaatcomponenten te distribueren tussen onze bio-engineering en samenwerkende hersenbarrièrelaboratoria. Vervolgens ontwikkelden we gezamenlijk protocollen voor apparaatassemblage, monocultuur en co-cultuur, immunofluorescerende kleuring en permeabiliteit van kleine moleculen en toonden we aan dat deze methoden reproduceerbaar waren tussen laboratoria. Met behulp van deze protocollen toonden we ook aan dat het modulaire platform een gevalideerde BBB ondersteunt die is ontwikkeld met behulp van de uitgebreide endotheelkweekmethode (EECM) voor het creëren van microvasculaire-achtige endotheelcellen (BMEC) in de hersenen uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's)37. Het doel van dit rapport is om deze methoden nader te bekijken en met behulp van de bijbehorende video een bredere acceptatie van het platform in de BBB-community mogelijk te maken.
Protocol
1. Assemblage van μSiM-apparaten
NOTITIE: Deze methode beschrijft de montage van de apparaten. De membraanchip heeft een sleufzijde en een platte zijde, die geul-omhoog of sleuf-omlaag kan worden geassembleerd. Trench-down apparaten worden het meest gebruikt voor celkweek.
- Bereid in een steriele omgeving (d.w.z. een bioveiligheidskap) alle materialen voor op de montage, inclusief de montage-armaturen, componenten, membraanchips en pincetten.
- Plaats de membraanchip met een chippincet op het midden van armatuur A1. Het vlakke oppervlak van de chip is naar beneden gericht en het sleufgebied is naar boven gericht voor sleufapparaten en vice versa voor sleufapparaten.
NOTITIE: De volgende montagestappen worden geïllustreerd aan de hand van de sleuf als voorbeeld, die een vlak groeigebied in de bovenste kamer mogelijk maakt. - Bind component 1 aan de chip. Trek eerst de blauwe beschermlagen aan beide zijden van component 1 af met een recht pincet en plaats deze in armatuur A1, bovenste kamer naar beneden. Druk component 1 voorzichtig naar beneden totdat de drukgevoelige lijm (PSA) de chip raakt.
- Plaats armatuur A2 op armatuur A1 en oefen stevige druk uit op verschillende hoeken om een strakke pasvorm van de chip en het onderdeel te garanderen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u de PSA-laag niet verwijdert. Het is een transparante en stijvere laag in vergelijking met de blauwe beschermlagen. - Verbind component 2 met component 1 met de chip. Bereid eerst component 2 voor door met een recht pincet een hoek van component 2 vast te pakken en van het vel af te pellen. Pak vervolgens het niet-PSA "driehoekige" gebied van component 2 en verwijder samen de dikke, transparante beschermlaag en blauwe laag van component 2, waardoor het PSA-oppervlak bloot komt te liggen. Plaats component 2 in armatuur B1, met de PSA-kant naar boven.
- Plaats component 1 met de membraanchip in armatuur B1, bovenste kamer naar boven gericht.
- Plaats armatuur B2 op component 1 en oefen stevige druk uit op verschillende hoeken van armatuur B2.
- Haal het gemonteerde apparaat uit het armatuur en gebruik een recht pincet om eventuele luchtbellen aan de onderkant van het apparaat eruit te drukken en de randen van de channelx af te dichten, waarbij contact met het membraangebied wordt vermeden. Voorafgaand aan gebruik voor celkweek, steriliseer nieuw geassembleerde apparaten gedurende 20 minuten met ultraviolet (UV).
2. Celkweek
OPMERKING: Deze methode beschrijft protocollen voor primaire en hiPSC-afgeleide culturen op het platform. De methoden beschrijven de monocultuur van endotheelcellen in de bovenste kamer van het apparaat en de co-cultuur van pericyten en endotheelcellen met pericyten in de onderste kamer en endotheelcellen in de bovenste kamer van gegreppelde geassembleerde apparaten. Voor de afmetingen en volumes van de kamers, zie tabel 1. Dit zijn de meest voorkomende formaten; Er kunnen echter andere celkweeklay-outs worden gebruikt, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker.
- Voorbereiding van de celkweekkamer
- Monteer de apparaten volgens het protocol dat in sectie 1 wordt beschreven.
- Plaats de apparaten in steriele slangklemmen. Steriliseer de klemmen voorafgaand aan de celkweek door ze ≥20 minuten in ethanol te laten weken. Steriliseer na elk experiment opnieuw voor hergebruik.
- Kweek de apparaten in een grote steriele petrischaal. Voeg voor extra vochtigheid een kleine petrischaal of een conisch buisdeksel van 50 ml gevuld met steriel water toe.
- Was de bovenste kamer van de apparaten twee keer met 100 μL steriel water. Voor celkweek in de onderste kamer wast u de onderste kamer met 20 μL steriel water.
- hCMEC/D3 cellijn (BBB) monocultuur
- Bereid de celkweekkamer voor volgens punt 2.1.
- Smeer de bovenste kamers in met 25 μg/cm2 collageen I en 5 μg/cm2 humaan fibronectine gemengd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Laat het 1-2 uur staan op 37 °C of een nacht op 4 °C.
- Verwijder de coatingoplossing en voeg 100 μl voorverwarmd groeifactor-verarmd endotheelmedium (assaymedium) toe aan de bovenste kamer en 20 μl aan de onderste kamer. Om het analysemedium te bereiden, mengt u 100 ml endotheliaal basaal medium + 400 μl humane fibroblastische groeifactor + 40 μl hydrocortison + 100 μl gentamicinesulfaat + 2 ml foetaal runderserum.
- Passage hCMEC/D3-cellen volgens het protocol van de fabrikant; trypsiniseer de cellen in een incubator van 37 °C gedurende 3-5 minuten en stop vervolgens de trypsinisatie door toevoeging van voorverwarmd endotheelmedium. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis en centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de celpellet in testmedia en zaai de cellen in de bovenste kamers met een dichtheid van 40.000-60.000 cellen/cm2. Incubeer de apparaten bij 37 °C met 5% kooldioxide (CO 2) gedurende2-4 uur om de celhechting te vergemakkelijken. Om bijvoorbeeld 40.000 cellen/cm2 op de 0,37cm2-chip te bereiken, voegt u 100 μL van een celoplossing met een concentratie van 150.000 cellen/ml toe aan de bovenste kamer.
OPMERKING: We kweken en passeren hCMEC/D3 volgens Hudecz et al.38, met behulp van een gemodificeerde formulering van endotheliale groeimedia-2 (EGM-2) voor celonderhoud en een groeifactor-gereduceerd "assay medium" na subcultuur voor assays. Andere mediaformuleringen moeten compatibel zijn met de apparaten, hoewel we de mediaformuleringen van Hudecz et al.38 aanbevelen als gebruikers problemen ondervinden met de overleving van hCMEC/D3. - Na 2-4 uur voor celadhesie, verwisselen met vers testmedium in beide kamers om dode of niet-aangehechte cellen te verwijderen.
- Houd de apparaten op 37 °C met 5% CO 2 en vervang het testmedium in beide kamers om de2-3 dagen tot het experiment. Assays worden meestal uitgevoerd na 2 weken kweek.
- hiPSC-afgeleide EECM-BMEC-achtige celmonocultuur
- Bereid de celkweekkamer voor volgens punt 2.1.
- Bereid collageen IV uit menselijke placenta-oplossing door 5 ml 0,5 mg/ml azijnzuur toe te voegen aan 5 mg collageen IV om een oplossing van 1 mg/ml te creëren. Laat de oplossing ≥4 uur bij 4 °C staan om volledig te reconstitueren. De oplossing is gedurende 2 weken stabiel bij 4 °C.
- Smeer de bovenste kamers in met 100 μL in een verhouding van 4:1:5 collageen IV, runderfibronectine en steriel water. Coaten bij 37 °C gedurende 2-4 uur.
- Verwijder de coatingoplossing en voeg 100 μL hECSR op kamertemperatuur toe aan de bovenste kamer en 20 μl aan de onderste kamer.
- Passage EECM-BMEC-achtige cellen volgens Nishihara et al.37; voeg een enzymmengsel voor celafgifte toe aan de cellen en breng het gedurende 5-8 minuten over naar een incubator van 37 °C. Pipetter de celoplossing om te verenkelen en toe te voegen aan 4x het volume van het endotheelmedium in een centrifugebuis. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur; resuspendeer de cellen in hECSR en zaad in de bovenste kamers met een dichtheid van 40.000 cellen/cm2. Incubeer de apparaten bij 37 °C met 5% CO 2 gedurende2-4 uur om de celhechting te vergemakkelijken. Om bijvoorbeeld 40.000 cellen/cm2 te bereiken, voegt u 100 μl van een celoplossing toe met 150.000 cellen/ml.
- Na 2-4 uur voor celadhesie, vervang met verse hECSR in beide kamers om dode of niet-gehechte cellen te verwijderen.
- Houd de apparaten op 37 °C met 5% CO 2 en wissel elke1-2 dagen hECSR uit in beide kamers tot het experiment. Assays worden meestal uitgevoerd op dag 6 van de kweek.
- hCMEC/D3 en primaire co-cultuur van vasculaire pericyten (HBVP) in de menselijke hersenen
- Smeer de membraanchips vóór de montage van het apparaat in met 2 μg/cm2 poly-L-lysine (PLL) gemengd in PBS. Breng 50-80 μL PLL in een druppel alleen aan op de kant die naar beneden wijst in de uiteindelijke apparaatassemblage. Voltooi het coatingproces in 1-2 uur bij 37 °C of een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de coatingoplossing. Was de membraanchips met steriel ultrapuur water en laat ze drogen.
- Monteer de apparaten volgens het protocol dat is beschreven in sectie 1 hierboven, met de PLL-gecoate kant naar beneden, en bereid de celkweekkamer voor volgens paragraaf 2.1.
- Smeer de bovenste kamers in volgens punt 2.2.2.
- Voeg 50 μL voorverwarmd pericytmedium toe aan de bovenste kamers en voeg 20 μL toe aan de onderste kanalen.
- Passage HBVP's volgens het protocol van de fabrikant; trypsiniseer de cellen in een incubator van 37 °C gedurende 3-5 minuten en stop vervolgens de trypsinisatie door toevoeging van voorverwarmd pericytmedium. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis en centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de celpellet in pericytmedium en zaai de cellen in de onderste kamers met een dichtheid van 14.000-25.000 cellen/cm2. Keer de apparaten om, maar behoud een luchtinterface met de bovenste kamers om gasuitwisseling te vergemakkelijken.
NOTITIE: De luchtinterface die nodig is tijdens inversie kan worden bereikt door de apparaten om te draaien nadat ze in slangklemmen zijn geplaatst en door alle hoeken naar beneden te duwen voordat ze worden omgedraaid, of door de apparaten ondersteboven te plaatsen op parallelle stroken acryl of siliconen die ver genoeg uit elkaar staan om de bovenste kamers vrij te houden. De zaaidichtheid moet mogelijk voor elke gebruiker worden geoptimaliseerd. Om 14.000 cellen/cm2 te bereiken, voegt u 20 μL van een celsuspensie toe met ~590.000 cellen/ml. Merk op dat 20 μL in de onderste kamer wordt gepipetteerd om luchtbellen te voorkomen, maar de dichtheid wordt berekend met behulp van het volume van de onderste kamer van 10 μL. - Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO 2 gedurende2-4 uur in omgekeerde positie om de celhechting te vergemakkelijken.
- Na 2-4 uur voor celadhesie, zet u de apparaten rechtop en vervangt u ze door vers pericytmedium in beide kamers om dode of losstaande cellen te verwijderen.
- Na het zaaien van pericyten hCMEC/D3's in de bovenste kamer zaaien volgens de stappen 2.2.4-2.2.5. Schakel beide kamers over naar het testmedium.
- Houd de apparaten op 37 °C met 5% CO 2 en wissel tot het experimenteren elke1-2 dagen testmedium uit in beide kamers. Co-kweek van primaire cellen wordt gewoonlijk gedurende 6-8 dagen voorafgaand aan de tests gehandhaafd.
OPMERKING: Als de HBVP-monoculturen worden vergeleken met hCMEC/D3-monoculturen of hCMEC/D3- en HBVP-coculturen, vervang dan 2-3 dagen na het zaaien van de HBVP's pericytmedium door testmedium.
- hiPSC-afgeleide EECM-BMEC-achtige cel en hersenpericyt-achtige cel (BPLC) co-cultuur
- Bereid de celkweekkamer voor volgens punt 2.1 en bedek de bovenste kamers volgens de stappen 2.3.2-2.3.3.
- Verwijder de coatingoplossing en voeg 50 μL kamertemperatuur Essential 6 Medium + 10% Fetal Bovine Serum (E6 + 10% FBS) toe aan de bovenste kamer.
- Passage van de BPLC's volgens Gastfriend et al.39; voeg een enzymmengsel voor celafgifte toe aan de cellen en breng over naar een incubator van 37 °C gedurende 5-15 minuten, totdat ~90% van de cellen afgerond is. Pipetter de celoplossing om te verenkelen en voeg 4x het volume DMEM/F12 toe in een centrifugebuis van 50 ml, met behulp van een celzeef van 40 μm om de cellen te filteren en volledig te verenkelen. Breng over naar een centrifugebuis van 15 ml, centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, resuspendeer de celpellet in E6 + 10% FBS en zaai de cellen in de onderste kamers met een dichtheid van 14.000-25.000 cellen/cm2. Keer de apparaten om, maar behoud een luchtinterface met de bovenste kamer om de gasuitwisseling te vergemakkelijken.
NOTITIE: De luchtinterface die nodig is tijdens de inversie kan worden bereikt door de apparaten om te draaien nadat ze in de slangklemmen zijn geplaatst en door alle hoeken naar beneden te duwen voordat ze worden omgedraaid, of door de apparaten ondersteboven te plaatsen op parallelle stroken acryl of siliconen die ver genoeg uit elkaar staan om de bovenste kamers vrij te houden. De zaaidichtheid moet mogelijk voor elke gebruiker worden geoptimaliseerd. Om 14.000 cellen/cm2 te bereiken, voegt u 20 μL van een celsuspensie toe met ~590.000 cellen/ml. Merk op dat 20 μL in de onderste kamer wordt gepipetteerd om luchtbellen te voorkomen, maar de dichtheid wordt berekend met behulp van het volume van de onderste kamer van 10 μL. - Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO 2 gedurende2-4 uur in omgekeerde positie om de celhechting te vergemakkelijken.
- Na 2-4 uur voor celhechting, zet u de apparaten rechtop en vervangt u ze door verse E6 + 10% FBS in beide kamers om dode of losse cellen te verwijderen.
- Een dag na het zaaien van pericyten EECM-BMEC-achtige cellen in de bovenste kamer zaaien, volgens de stappen 2.3.5-2.3.6. Zet beide kamers op hECSR.
- Houd de apparaten op 37 °C met 5% CO 2 en vervang het testmedium in beide kamers om de1-2 dagen tot het experiment. hiPSC-afgeleide co-cultuur wordt gewoonlijk gedurende 7 dagen gehandhaafd voor BPLC's en 6 dagen voor EECM-BMEC-achtige cellen voorafgaand aan tests.
OPMERKING: Als de BPLC-monoculturen worden vergeleken met EECM-BMEC-monoculturen of EECM-BMEC- en BPLC-coculturen, vervang dan E6 + 10% FBS met hECSR 1 dag na het zaaien van de BPLC's.
3. Immunocytochemie
OPMERKING: Deze methode beschrijft een protocol voor immunocytochemische kleuring en beeldvorming van cellen die aan de boven- en/of onderkant van het membraan zijn gekweekt. Het doel van dit experiment is het bepalen van de aanwezigheid en locatie van belangrijke eiwitten die in de BBB moeten worden gevonden, zoals adherens en tight junction-eiwitten en celidentiteitseiwitten. Alternatieve en live kleuringsmethoden zijn ook compatibel met het platform.
- Fixatie en kleuring op de apparaten
- Plaats de primaire antilichamen op ijs om te ontdooien.
- Bereid een 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing bij kamertemperatuur (bijv. verdun 16% PFA in 3x het volume PBS) of koel 100% methanol bij -20 °C.
- Creëer een geschikte blokkeringsoplossing volgens tabel 2. Bewaren op ijs.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om de oplossing te vortexen om Triton X-100 volledig op te lossen. - Fixeer de cellen door 20 μL fixeermiddel (bijv. PFA of methanol) in de onderste kamer te pipetteren en 50 μL in de bovenste kamer. Incubeer de apparaten gedurende 10 minuten (PFA) of 2 minuten (methanol) bij kamertemperatuur.
- Was gedurende 3 x 5 minuten door 20 μL PBS door de onderste kamer en 100 μL in de bovenste kamer te pipetteren.
- Blokkeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur door 20 μL van de blokkeeroplossing toe te voegen aan de onderste kamer en 50 μL blokkeeroplossing aan de bovenste kamer. Controleer op luchtbellen in de onderste kamer.
- Bereid de primaire antilichaamoplossing door de antilichaam(en) in de blokkerende oplossing te verdunnen volgens tabel 2. Bewaren op ijs.
- Kleurs met de primaire antilichamen door 20 μL van de primaire antilichaamoplossing toe te voegen aan de onderste kamer en het volume van de bovenste kamer te vervangen door 50 μL van de primaire antilichaamoplossing. Controleer op luchtbellen in de onderste kamer. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C.
- Was gedurende 3 x 5 minuten door 20 μL PBS door de onderste kamer en 100 μL in de bovenste kamer te pipetteren.
- Bereid de secundaire antilichaamoplossing door de antilichaam(en) in de blokkerende oplossing te verdunnen volgens tabel 2. Bewaren op ijs beschermd tegen licht.
- Kleuring met secundaire antilichamen door 20 μL secundaire antilichaamoplossing toe te voegen aan de onderste kamer en het volume van de bovenste kamer te vervangen door 50 μL van de secundaire antilichaamoplossing. Controleer op luchtbellen in de onderste kamer. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Was gedurende 3 x 5 minuten door 20 μL PBS door de onderste kamer en 100 μL in de bovenste kamer te pipetteren.
- Maak een nucleaire vlekoplossing. Verdun Hoechst 1:10.000 in PBS. Voeg 20 μL van de nucleaire kleurstofoplossing toe aan de onderste kamer en vervang het volume van de bovenste kamer door 50 μL van de nucleaire kleuringsoplossing. Controleer op luchtbellen in de onderste kamer. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Verwijder de vlek door 20 μL PBS toe te voegen aan de onderste kamer en het volume van de bovenste kamer te vervangen door 100 μL PBS. Breng de apparaten onmiddellijk in beeld of bewaar ze bij 4 °C met de petrischaal gewikkeld in parafilm en beschermd tegen licht totdat ze klaar zijn voor beeldvorming.
- Confocale beeldvorming
NOTITIE: In dit gedeelte worden de apparaten bijvoorbeeld afgebeeld met behulp van een confocale microscoop met een omgekeerde draaiende schijf met een lange werkafstand (LWD) 40x objectief (water, WD 590-610, numerieke apertuur 1.15). Voor werkafstanden en lenscompatibiliteit, zie aanvullend materiaal in McCloskey et al.34. Beelden van het gehele membraangebied worden ook gemaakt met behulp van een 10x objectief om ervoor te zorgen dat de 40x beelden representatief zijn voor het hele veld. Deze worden meestal in widefield genomen.- Zet de microscoop aan en open de beeldvormingssoftware.
- Stel de kanalen in op basis van de eigenschappen van het secundaire antilichaam en de nucleaire kleuring, met behulp van de confocale beeldvormingsmodus. Optimaliseer het laservermogen en de belichtingstijd om ervoor te zorgen dat het signaal zich boven de achtergrond bevindt en beeldartefacten vermindert.
- Gebruik voor de nucleaire kleuring van Hoechst excitatie 405, emissie 450/50 Bandpass (BP), 500 ms belichtingstijd, 50% laservermogen. Gebruik voor labels met een secundair antilichaam dat is geconjugeerd aan Alexa Fluor (AF) 488 excitatie 488, emissie 525/50BP, 500 ms belichtingstijd en 50% laservermogen. Gebruik voor labels met een secundair antilichaam dat is geconjugeerd met AF568 excitatie 561, emissie 600/50BP, 500 ms belichtingstijd en 100% laservermogen.
- Plaats het apparaat in de houder van het microscoopglaasje, met de bovenste kamer naar boven gericht en plaats het in de microscoop met behulp van een objectglaasjeshouder. Schakel Live in en selecteer het kanaal voor de nucleaire vlek. Zoek het membraan met een laag objectief en zorg ervoor dat het transparante siliciumnitridemembraangebied gecentreerd is, aangezien licht niet door het blauwe, vaste siliconengebied wordt doorgelaten. Zodra het apparaat goed gecentreerd is en de cellaag is gevonden, schakelt u over naar het 40x-objectief, maakt u het objectief nat en concentreert u zich op het membraangebied met behulp van de nucleaire vlek als richtlijn.
- Schakel z-stack imaging in en stel de scanmodus in op Start/End. Stel de grootte of het aantal stappen in. Gebruik de grove instelknop op de microscoop om het scanbegin in te stellen op de bovenkant van de endotheelcellaag, met de nucleaire kleuring als richtlijn, en de scan eindigt aan de onderkant van de pericytlaag, met de nucleaire kleuring als richtlijn. Controleer alle kanalen om er zeker van te zijn dat alles wordt vastgelegd in het beeldveld.
OPMERKING: We gebruiken meestal automatische stap, dat zijn plakjes van ~0.2 μm. - Stel de afbeeldingsnaam in en druk op Verwerven om de beeldvorming te starten. Herhaal dit indien nodig op verschillende regio's.
- Verwerk de confocale beelden met ImageJ40 of Imaris.
- Om in Imaris te verwerken, sleept u het afbeeldingsbestand naar het programma om te openen. Selecteer Sectie in de bovenste menubalk om een 2D-afbeelding van het x-y-vlak te zien met bijbehorende weergaven van de x-z- en y-z-vlakken. Selecteer 3D-weergave in de bovenste menubalk om een 3D-afbeelding te zien. Klik op de afbeelding en sleep deze om te draaien. Selecteer Snapshot in de bovenste menubalk om een foto te maken.
4. Bemonsteringsbepaling van de permeabiliteit van kleine moleculen
OPMERKING: In deze sectie wordt een methodologie beschreven voor kwantitatieve metingen van barrière-eigenschappen van de celculturen. Het doel van dit experiment is om de concentratie te detecteren van een fluorescerend klein molecuul dat door de cellagen gaat en de onderste kamer van het platform binnendringt. Deze gegevens worden vervolgens gebruikt om de cellulaire permeabiliteit te berekenen.
- Bemonsteringstechniek
- Monteer de apparaten volgens het protocol dat in sectie 1 wordt beschreven en kweek de gewenste cellijnen zoals beschreven in sectie 2. Voeg een extra apparaat toe om te dienen als een celvrij, gecoat regelapparaat om de permeabiliteit van het systeem te meten.
OPMERKING: Minimaal drie technische replica's per voorwaarde worden aanbevolen; Er is echter slechts één replica van de gecoate besturing vereist. - Voordat u met de bemonsteringstest begint, vervangt u het medium in de onderste kamer door vers medium. Controleer de samenvloeiing van de endotheliale monolaag in elk apparaat onder de microscoop. Let op eventuele openingen in de monolagen van de cel, omdat dit de diffusie van kleurstof in de onderste kamer zal beïnvloeden.
OPMERKING: Een gezonde endotheelcultuur moet 100% confluent zijn. - Bereid de fluorescerende oplossing met kleine moleculen (bijv. 150 μg/ml Lucifer Yellow, 457 Da) in een celkweekmedium. Bereid een overtollig volume van de fluorescerende oplossing met kleine moleculen voor die wordt gebruikt voor de bereiding van de standaardoplossingen die als referentie dienen voor de berekening van de concentratie van het fluorescerende kleine molecuul dat uit het onderste kanaal wordt bemonsterd.
OPMERKING: We raden aan om de bereiding van 400 μL overtollige oplossing te gebruiken als de standaardoplossing met de hoogste concentratie van het fluorescerende kleine molecuul. - Vervang het medium in het bovenste putje door 100 μL van de fluorescerende oplossing met kleine moleculen.
OPMERKING: We raden aan om een hydrofobe pen te gebruiken om cirkels rond de bemonsteringspoorten te tekenen en te wachten tot de hydrofobe inkt volledig is opgedroogd voordat u fluorescerende kleurstofoplossing toevoegt. Dit voorkomt dat het medium zich verspreidt vanuit het onderste kanaal rond de bemonsteringspoort bij stap 4.1.7. We raden aan om de toevoeging van de fluorescerende oplossing met kleine moleculen in de bovenste put te spreiden en 2 minuten te wachten voordat u de fluorescerende oplossing aan het volgende apparaat toevoegt, of in groepen van 3 te werken (voeg de oplossing toe aan drie apparaten tegelijk en wacht 5 minuten om de volgende drie apparaten toe te voegen). - Incubeer de apparaten bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur.
- Bereid tijdens de incubatietijd van 1 uur in de vorige stap standaardoplossingen door 2-voudige seriële verdunningen uit te voeren van de fluorescerende oplossing met kleine moleculen, bereid in stap 4.1.3. Pipetteer 50 μl van elke oplossing in drievoud in de zwarte plaat met 96 putjes met platte bodem. Gebruik blanco celkweekmedium als de basisstandaardoplossing.
OPMERKING: Om standaardoplossingen te bereiden, raden we 11 seriële verdunningen aan bij een eindvolume van 200 μL en het gebruik van celkweekmedium als blanco om de basisfluorescerende intensiteit te meten.- Breng 200 μl van 400 μl van de overtollige fluorescerende oplossing met kleine moleculen, bereid in stap 4.1.3, over in een buis met 200 μl medium, meng goed en breng 200 μl van deze oplossing over in de volgende buis met 200 μl medium. Herhaal 1:2 verdunningen totdat er in totaal 10 buisjes zijn. Pipetteer 50 μl van de meest geconcentreerde standaardoplossing in kolom 1 in drievoud in de plaat met 96 putjes (B1, C1, D1), de 2emeest geconcentreerde oplossing in kolom 2 (B2, C2, D2), enzovoort. Pipetteer voor de 12ekolom van de plaat 50 μl blanco media in drievoud (B12, C12, D12).
- Voer de volgende stappen uit om de fluorescerende oplossing met kleine moleculen uit het onderste kanaal te bemonsteren.
- Verwijder de fluorescerende oplossing met kleine moleculen uit de put om het diffusieproces te stoppen.
- Plaats een punt met 50 μL medium in de bovenste poort om als reservoir te dienen door de punt met 50 μL in de poort te steken, het apparaat op te tillen en de punt voorzichtig uit te werpen terwijl u de bovenkant vasthoudt voor stabilisatie. Zet het apparaat neer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de pipetpunt of lucht aan de punt van de pipet zitten om te voorkomen dat er tijdens de bemonstering luchtbellen in de onderste kamer worden toegevoegd.
- Voeg 50 μL medium toe aan het bovenste putje om te voorkomen dat de monolaag van de cel tijdens de bemonstering wordt verstoord.
- Om de oplossing uit het onderste kanaal te bemonsteren, duwt u een pipet met een lege pipetpunt naar de eerste weerstand, steekt u de punt in de bemonsteringspoort en spuit u 50 μl van de oplossing uit het onderste kanaal omgekeerd. Breng direct over in de zwarte plaat met 96 putjes met platte bodem die de standaardoplossingen bevat.
OPMERKING: We raden aan om de monolaag van de cel onmiddellijk na de bemonstering onder de microscoop te controleren. Het trekken van media uit het onderste kanaal kan af en toe leiden tot verstoring van de cellaag in de bovenste put, wat kan leiden tot inconsistente permeabiliteitsmetingen. Door snel te werken tijdens de stappen in 4.1.7 kunt u dit voorkomen.
- Meet de fluorescentie-intensiteit in een microplaatlezer met behulp van de juiste excitatie- en emissiegolflengteparameters voor het gebruikte fluorescerende kleine molecuul. Gebruik voor Lucifer Yellow 428 nm excitatie en 536 nm emissie, met optimale versterking. Fluorescentie wordt gemeten vanaf de bovenkant van de plaat. Voeg de plaat toe aan de plaatlezer, markeer de putjes met monster (inclusief de standaardcurve) en selecteer Start om de plaat te lezen.
- Monteer de apparaten volgens het protocol dat in sectie 1 wordt beschreven en kweek de gewenste cellijnen zoals beschreven in sectie 2. Voeg een extra apparaat toe om te dienen als een celvrij, gecoat regelapparaat om de permeabiliteit van het systeem te meten.
- Berekening van de permeabiliteitswaarde (zie aanvullend bestand 1 voor sjabloon)
- Trek de gemiddelde fluorescentie-intensiteitswaarde van het blancomedium af van alle gemeten fluorescentie-intensiteitswaarden.
- Gebruik vergelijking (1) om de systeempermeabiliteit Ps te berekenen:
(1)
waarbij [A]A de concentratie van het fluorescerende kleine molecuul is die uit het onderste kanaal wordt opgevangen, V het volume is dat is bemonsterd en aan de plaat is toegevoegd (0,050 ml), [A]L de concentratie van het fluorescerende kleine molecuul dat in het bovenste putje is toegevoegd (bv. 0,15 mg/ml); t de incubatietijd is (in s of min, afhankelijk van de gewenste eenheden); en S is het membraanoppervlak (0,014cm2).- Bereken [A]A met behulp van de vergelijking die wordt verkregen door een standaardcurve uit te zetten op basis van de fluorescentie-intensiteitsuitgangen en de bekende concentraties van de standaardoplossingen. Bereken de concentraties (x) van de experimentele monsters door hun fluorescentie-intensiteitswaarden (y) in de vergelijking in te voegen.
OPMERKING: Gebruik het gedeelte van de standaardcurve dat lineair is. We raden aan om het membraanoppervlak te meten aan de hand van een beeld van het membraan dat onder de microscoop is genomen, aangezien het membraanoppervlak kan variëren afhankelijk van het lotnummer en de berekende permeabiliteitswaarden aanzienlijk kan beïnvloeden als deze afwijken van de gecoate controle.
- Bereken [A]A met behulp van de vergelijking die wordt verkregen door een standaardcurve uit te zetten op basis van de fluorescentie-intensiteitsuitgangen en de bekende concentraties van de standaardoplossingen. Bereken de concentraties (x) van de experimentele monsters door hun fluorescentie-intensiteitswaarden (y) in de vergelijking in te voegen.
- Gebruik vergelijking (2) om de permeabiliteit van de celmonolaag Pe te berekenen:
(2)
PS is de systeempermeabiliteit zoals berekend in stap 4.2.2 en PC is de systeempermeabiliteitswaarde van de celvrije, gecoate regelinrichting.
(1)
(2)Representative Results
De montage van een sleuf is weergegeven in figuur 1. De armaturen begeleiden de assemblage van de componenten en de membraanchip. Component 1 is voornamelijk acryl met een PSA-oppervlak voor hechting aan de chip en een opening naar de onderste kamer en poorten voor pipettoegang tot de onderste kamer. Component 2 is de kanaallaag en bevat rechtsboven een niet-klevende, PSA-vrije "driehoek" om vast te pakken. Trench-down-apparaten bieden een vlak celkweekgebied in de bovenste kamer, terwijl trench-up-apparaten een plat oppervlak hebben voor celkweek in de onderste kamer.
We voerden endotheliale monoculturen en co-culturen uit van hCMEC/D3 en HBVP's en van hiPSC IMR90-4-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen en BPLC's en verkregen fasebeelden met behulp van een Nikon Eclipse Ts2 fasecontrastmicroscoop en 10x objectief (Figuur 2). Optimale zaaidichtheden voor primaire celkweek worden getoond (foto's genomen 1 dag na het zaaien), evenals ondergezaaide HBVP's (Figuur 2A). Definitieve beelden van de cocultuur- en monocultuurfase (6 dagen endotheelcelkweek) kunnen moeilijk te onderscheiden zijn (Figuur 2C), en bevestiging van succesvolle co-cultuur van primaire cellen kan immunofluorescentiekleuring vereisen (zie protocolsectie 3). Lage, hoge en optimale hiPSC-afgeleide BPLC-zaaidichtheden worden ook geïllustreerd (Figuur 2B). hiPSC-afgeleide co-cultuur is duidelijker te onderscheiden in fasecontrastbeeldvorming in vergelijking met primaire co-culturen (Figuur 2D). Lage BPLC-seeding resulteert in een slechte pericytendekking en perocytenklontering, terwijl doorzaaien resulteert in het afbladderen van de pericytlaag van het membraan. Verder kan het te snel verwisselen van het medium in de onderste kamer leiden tot pericytenverlies, omdat deze cellen erg gevoelig zijn voor afschuiving. Optimale dekking door pericyten is ~90% voor een BBB-model, zonder openingen in de endotheellaag.
Representatieve beelden van immunogekleurde hiPSC-afgeleide cocultuur worden geïllustreerd in figuur 3 (6 dagen endotheelcelkweek). IMR90-4-afgeleide BPLC's werden gekleurd voor de pericytmarker PDGFRβ, en IMR90-4-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen werden gekleurd voor de adherens-junctiemarker VE-cadherine. Hoechst werd gebruikt om de kernen te kleuren. De beelden werden verkregen op een confocale microscoop van een draaiende schijf met behulp van een 40x LWD-objectief met plakjes van 0,2 μm en verwerkt met Imaris. Beide cellagen kunnen worden gevisualiseerd, ook al is het dunne nanomembraan niet te zien.
We voerden de op bemonstering gebaseerde permeabiliteitstest van kleine moleculen uit onder dezelfde experimentele omstandigheden in twee fysiek van elkaar verwijderde laboratoria aan de Universiteit van Bern, Zwitserland, en de Universiteit van Rochester, NY, VS om de reproduceerbaarheid van resultaten tussen laboratoria aan te tonen (Figuur 4)34. hiPSC IMR90-4-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen werden gedurende 2, 4 of 6 dagen in het μSiM-apparaat gekweekt en gedurende 6 dagen op transwellfilters. De test werd uitgevoerd met 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da) in beide laboratoria. Hoge variabiliteit in de permeabiliteit van de endotheelcellen die gedurende 2 dagen in het apparaat zijn gekweekt, geeft aan dat 2 dagen kweek onvoldoende was voor barrièrerijping. Er waren geen significante verschillen in permeabiliteit tussen de laboratoria bij barrièrerijping - vanaf 4 dagen. We toonden ook aan dat de permeabiliteit van de endotheelcellen die gedurende 6 dagen in μSiM- en transwellfilters werden gekweekt, overeenkwam met de eerder gepubliceerde40.
Figuur 1: Stappen van μSiM-assemblage . (A) Bereid de chip voor door deze op armatuur A1 te plaatsen. Plaats de spaansleuf omhoog voor een laatste sleuf-neerwaarts apparaat. Plaats de spaansleuf naar beneden voor een laatste sleufinrichting. (B) Bind component 1 aan de chip door de beschermende maskers van component 1 te verwijderen en deze met de voorkant naar beneden in FA1 te plaatsen. Verlijm door druk uit te oefenen met armatuur A2. (C) Bind component 2 en component 1 door component 2 van de plaat te verwijderen en de bovenste beschermlagen af te pellen. Plaats het kanaal omhoog in armatuur B1 en plaats component 1 met de voorkant naar boven op component 2. Lijm door druk uit te oefenen met armatuur B2. Afkortingen: FAn = armatuur An; FBn = armatuur Bn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van cocultuur en representatieve fasecontrastbeelden van celkweek in apparaten. (A) Locatie van pericyten en endotheelcellen. (B) Zijaanzichtschema van cellocaties over de sleuf van de membraanchip. (C) Representatieve beelden van lage en optimale zaaidichtheden voor primaire HBVP- en hCMEC/D3-endotheelcellijn in de hersenen. Beelden werden verkregen 1 dag na het zaaien (HBVP) en 2 uur na het zaaien (hCMEC/D3). (D) Representatieve beelden van lage, hoge en optimale zaaidichtheden voor hiPSC-afgeleide pericytachtige cellen in de hersenen. De beelden zijn 1 dag na het zaaien verkregen. (E) Representatieve beelden van de uiteindelijke HBVP- en hCMEC/D3-cocultuur en hCMEC/D3-monocultuur. De beelden werden verkregen 8 dagen na het zaaien van HBVP en 7 dagen na het zaaien van hCMEC/D3. (F) Representatieve beelden van mislukte en succesvolle BPLC- en EECM-BMEC-achtige celcocultuur en EECM-BMEC-achtige celmonocultuur. De beelden werden verkregen 7 dagen na het zaaien van BPLC en 6 dagen na het zaaien van EECM-BMEC. Ondergezaaide BPLC-culturen hebben onvoldoende dekking, terwijl doorzaaiende BPLC-culturen overvloeiend zullen worden en zullen gaan klonteren/terugtrekken. Schaalbalken = 100 μm (CF). Afkortingen: HBVP's = human brain vascular pericytes; hiPSC = humaan geïnduceerde pluripotente stamcel; BPLC's = hiPSC-afgeleide pericytachtige cellen in de hersenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden van immuno-gekleurde hiPSC-afgeleide celcocultuur in apparaten. Cellen werden gekleurd voor endotheelcelmarker VE-cadherine (groen), pericytmarker PDGFRβ (rood) en nucleaire kleuring (blauw). Twee lagen cellen zijn dicht bij elkaar te zien, alleen gescheiden door een dun siliciumnitride nanomembraan (witte pijl markeert de locatie van het membraan op de linkerafbeelding). Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: hiPSC = humaan geïnduceerde pluripotente stamcel; PDGFRβ = van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor bèta. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Op bemonstering gebaseerde permeabiliteitstest van kleine moleculen . (A) Schema van de experimentele workflow. (B) Demonstratie van de reproduceerbaarheid tussen twee fysiek van elkaar verwijderde laboratoria aan de Universiteit van Bern (UniBe), Zwitserland, en de Universiteit van Rochester (UR), NY, VS: van hiPSC afgeleide endotheelcellen werden gedurende 2, 4 of 6 dagen gekweekt in het μSiM-apparaat en gedurende 6 dagen in transwellfilters. De permeabiliteitstest werd uitgevoerd met behulp van 150 μg/ml Lucifergeel (457 Da). De rode balk geeft de eerder gepubliceerde permeabiliteitsgegevens van natriumfluoresceïne (376 Da) aan van dezelfde hiPSC-afgeleide endotheelcellen die gedurende 6 dagen in transwellfilters zijn gekweekt40. N = 4-16 per groep. Er werd gebruik gemaakt van tweerichtings-ANOVA met Tukey's post-hoctest en vergelijkingen werden alleen weergegeven voor relevante p < 0,05. (C) Demonstratie van cytokinerespons met behulp van hiPSC-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen die gedurende 2 dagen in de μSiM zijn gekweekt; 0,1 ng/ml TNFα + 2 IE/ml IFNγ) of mediacontrole (niet-gestimuleerd, NS) werd gedurende 20 uur aan de bovenste kamer toegevoegd voorafgaand aan de permeabiliteitstest met behulp van 150 μg/ml Lucifer Yellow. N = 3 per groep. T-toets van de student, p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Bovenste kamer zaaioppervlak | Top Well Volume | Bodemkamer Zaaioppervlak | Volume onderste kanaal |
| ~37 mm2 | 100 μL (kan ≥115 μL bevatten) | ~42 mm2 | 10 μL (pipette 20 μL om luchtbellen te voorkomen) |
Tabel 1: Kritische μSiM-oppervlakte en -volumes.
| Doel | Fixative | Blokkerende oplossing | Verdunning |
| VE-cadherine | 4% PFA of 100% MeOH | 5% GS + 0,4% Tx-100 of 10% GS + 0,3% Triton X-100 | 1:50 |
| CD31 | 4% PFA of 100% MeOH | 5% GS + 0,3-0,4% Triton X-100 | 1:100 |
| Claudin-5 | 100% MeOH | 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 | 1:200 |
| ZO-1 | 100% MeOH | 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 | 1:200 |
| Occludine | 100% MeOH | 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 | 1:50 |
| PDGFRβ | 4% PFA | 5% GS + 0.4% Triton X-100 | 1:100 |
| NG2 | 4% PFA | 5% GS + 0.4% Triton X-100 | 1:100 |
| Geit α-muis IgG Alexa Fluor 488 | 1:200 | ||
| Geit α-muis IgG Alexa Fluor 568 | 1:200 |
Tabel 2: Antilichamen en kleuringsmethoden gevalideerd voor co-cultuur immunocytochemie in μSiM-apparaten. Afkortingen: PFA = paraformaldehyde; MeOH = methanol; GS = geiten serum.
Aanvullend bestand 1: Sjabloon voor de berekening van de permeabiliteitswaarde. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Hoewel membraanchips zijn ontworpen voor stabiliteit, kunnen ze barsten of breken als ze tijdens de montage verkeerd worden behandeld. Het is dus van cruciaal belang om de chip in de inkepingen van het chippincet vast te pakken en voorzichtig in de armatuur te plaatsen. Bij het hanteren van de apparaten in het algemeen moet extra voorzorgsmaatregelen worden genomen om de apparaten niet te stoten of te laten vallen. Tijdens het verlijmen van de membraanchip op armatuur A1 moet de chip plat en gecentreerd op de pilaar van armatuur A1 worden gelegd om te voorkomen dat het membraan scheurt tijdens de verlijming aan component 1. Verder moet elk contact met de blootgestelde PSA-lagen worden vermeden na het verwijderen van beschermende maskers. Bij het hanteren van component 2 na het verwijderen van de beschermende maskers, is het raadzaam om het langs de rand van het onderdeel te houden en een pincet te gebruiken om de driehoekige hoek vast te pakken die PSA-vrij is.
Hoewel celkweekprotocollen werden beschreven voor mogelijke BBB-modellen, kan het BMEC/pericyte co-cultuurmodel van de BBB dat hier wordt beschreven voldoende of onvoldoende zijn, afhankelijk van de fysiologische context en interessante vragen. Het transport van immuuncellen vindt bijvoorbeeld grotendeels plaats in de postcapillaire venulen van de hersenen41,42. In deze regio's scheidt een perivasculaire ruimte de BMEC/perocytenbarrière van de gliale limieten die door astrocyten zijn vastgesteld. In postcapillaire venulen bestaat de neurovasculaire eenheid (NVU) dus uit twee fysiek gescheiden barrières in serie, en astrocytaire eindvoeten maken geen rechtstreeks contact met de BMEC/pericyte bloedbarrière, die goed wordt weergegeven door het huidige model. Als het doel een NVU-model is dat rekening houdt met de impact van door astrocyten uitgescheiden factoren op de bloedbarrière, kan een astrocytencompartiment aan het apparaat worden toegevoegd dat oplosbare factoruitwisseling door de perivasculaire ruimte mogelijk maakt. Dit voorbeeld werd eerder geïllustreerd34 en zou kunnen worden uitgebreid met andere cellen zoals microglia en neuronen in een 3D 'hersen'-compartiment. De modulaire architectuur van het platform maakt het mogelijk om eenvoudige assemblagestrategieën te gebruiken om deze herconfiguraties te realiseren, zodat het platform zo eenvoudig of complex is als nodig is om de hypothesen aan te pakken. Elke opstelling van de celkweek; moet echter worden geoptimaliseerd voor nieuwe cellijnen en multiculturen. Vanwege de eigenschappen van de siliciumnitridemembranen kan het bijvoorbeeld nodig zijn om coatingoplossingen aan te passen in vergelijking met weefselkweekplaten. De opname van fibronectine helpt meestal bij celhechting en overleving. Verder zouden gebruikers endotheelcellen en pericyten in tegengestelde richtingen kunnen kweken. In dit geval kan het nodig zijn om bijvoorbeeld de manier waarop de permeabiliteitsmetingen worden uitgevoerd en geïnterpreteerd aan te passen. Het geven van stappen voor dit soort cultuur valt echter buiten het bestek van dit document.
Een andere uitdaging die men kan tegenkomen tijdens celkweek is de snelle verdamping van media, aangezien de apparaten gevoeliger kunnen zijn voor veranderingen in de omgeving in vergelijking met standaard weefselkweekplaten en kolven. Als er overmatige verdamping wordt waargenomen of de celgroei wordt vertraagd, moeten alle kritische incubatorparameters worden gemeten om nauwkeurige instellingen te garanderen. Er kan meer water worden toegevoegd aan de weefseldop of het kleine petrischaaltje dat in de celkweekkamer is geplaatst, of media moeten vaker worden verwisseld. Verder kunnen luchtbellen het onderste kanaal binnendringen en vast komen te zitten in de greppel voor greppel-neerwaartse apparaten. Hoewel ze kunnen worden verwijderd, is het het gemakkelijkst om in de eerste plaats geen bubbels toe te voegen. Om dit te doen, is het belangrijk om te controleren of er geen luchtbellen in de pipetpunt of lucht aan het uiteinde van de pipetpunt zitten voordat u het pipetteermedium in de onderste kamer brengt. Verder kan mediaverdamping in het kanaal leiden tot een opening tussen het mediaoppervlak en de bovenkant van de poort. Een kleine hoeveelheid media kan in de ene poort worden gepipetteerd totdat de media het oppervlak van de tegenoverliggende poort bereikt, waarna de media in die tegenoverliggende poort kunnen worden uitgewisseld. Hoewel hECSR- en E6 + 10% FBS-media niet in het waterbad mogen worden opgewarmd, kunnen andere media worden voorverwarmd om de vorming van luchtbellen te verminderen. Als er toch een luchtbel in de onderste kamer komt, kan deze worden verwijderd door snel 100 μL door het kanaal te pipetteren. Deze methode kan echter leiden tot verontreiniging tussen kamers of media die over het oppervlak van het apparaat worden gemorst. Het kan ook de cellagen verstoren. Als alternatief kunnen de media eerst uit het kanaal worden verwijderd en vervolgens opnieuw worden geïntroduceerd met een volume van 50 μL. Als u echter eerst de media verwijdert, kan dit leiden tot meer luchtbelvorming in het kanaal. Als een luchtbel zich niet direct onder het membraangebied bevindt, kan deze in het kanaal worden achtergelaten zonder effecten op de celkweek.
Aanhechting en groei van pericyten, zoals aangetoond in figuur 2, kan een uitdaging zijn. Het gebruik van een geoptimaliseerde zaaidichtheid is essentieel voor de vorming van een laag met een fysiologisch relevante pericyt-endotheelcelverhouding. Verder, omdat de pericyten gevoelig zijn voor afschuiving, moeten alle media-uitwisselingen in het kanaal zeer langzaam worden gedaan om de cellen te beschermen. Voor BPLC-kweek kan een verbeterde hechting worden bereikt door de onderste kamer te coaten met 800 μg/ml collageen type IV of 100 μg/ml fibronectine.
Immunocytochemie in apparaten die hier worden beschreven, maakt kwalitatieve analyse van de gezondheid en functie van cellen mogelijk. Methoden voor kleuring in weefselkweekplaten of andere platforms moeten direct naar het platform kunnen worden vertaald. Voor celkweek in alleen de bovenste kamer kan PBS na fixatie in de onderste kamer worden toegevoegd en voor de resterende stappen worden gelaten, waarbij blokkering en kleuring alleen in de bovenste kamer worden gedaan. Dit minimaliseert de risico's op het breken van de vliezen of het krijgen van luchtbellen in de onderste kamer. Voor co-cultuur kleuring raden we aan om beide kamers in alle stappen te gebruiken. Het is belangrijk op te merken dat de viscositeit van het fixeermiddel en PBS verschilt van die van media. Het kan dus gemakkelijker zijn om luchtbellen in de onderste kamer toe te voegen en er moet extra aandacht aan worden besteed om pipetpunten aan het uiteinde van de tip op lucht te controleren voordat u in de onderste kamer pipettert.
Het protocol dat is beschreven voor de permeabiliteitstest van kleine moleculen maakt een functionele en kwantitatieve beoordeling mogelijk van de barrièrefunctie van de endotheelcellen die in het μSiM-apparaat zijn gekweekt. Een probleem dat zich tijdens deze test kan voordoen, is het aanzuigen van luchtbellen in de pipet tijdens het nemen van monsters uit het onderste kanaal bij protocolstap 4.1.7.4. Om dit probleem te voorkomen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de punt in de poort is verzegeld voordat u begint met het verzamelen van monsters en dat het monster niet te snel mag worden afgenomen. Als dat het probleem niet oplost, kan de grootte van de gebruikte tips te klein of te groot zijn om in de poorten te passen; gebruik de tips in de materiaaltabel. Als er onverwacht hoge permeabiliteitswaarden worden gemeten ondanks een gezond ogende confluente monolaag, moet de integriteit van de monolaag tijdens de monsterafname worden gecontroleerd op verstoring. We raden aan om de monolaag altijd direct na het afnemen van het monster onder de microscoop te controleren. Als de monolaag nog intact en gezond lijkt, kan het monster worden gefixeerd en kunnen biologische markers van barrièrefunctie worden beoordeeld, bijvoorbeeld via immunokleuring van de junctie-eiwitten. Omgekeerd is het belangrijk om ervoor te zorgen dat 50 μL media uit het onderste kanaal wordt bemonsterd zonder luchtbellen als er onverwacht lage permeabiliteitswaarden worden gemeten. Als er medium uit de bemonsteringspoort komt zodra de punt van het reservoir is geplaatst, moet dat medium worden opgevangen voordat de pipet in de bemonsteringspoort wordt geplaatst, aangezien het grootste deel van het fluorescerende kleine molecuul aanwezig zal zijn in het initiële volume van 10 μl dat uit het onderste kanaal wordt bemonsterd. Door cirkels rond de poorten te tekenen met een hydrofobe pen of een hydrofobe tape met een gat rond de poort te plaatsen, wordt voorkomen dat passief verpompte media zich verspreiden. Als er tijdens de bemonstering belletjes worden opgezogen of als het volledige monster van 50 μl niet wordt verwijderd, mag het monster niet worden gebruikt. Als alternatief kan het exacte volume worden bepaald en gebruikt in de permeabiliteitsberekening; dit mag echter alleen worden gedaan als het verwijderde volume ≥40 μL is, wat overeenkomt met ~98-99% kleurstofterugwinning34.
Disclosures
J.L.M. is mede-oprichter van SiMPore en heeft een aandelenbelang in het bedrijf. SiMPore commercialiseert ultradunne technologieën op basis van silicium, waaronder de membranen die in deze studie worden gebruikt.
Acknowledgments
J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. en L.W. werden gefinancierd door NIH-subsidie R33 HL154249. J.L.M. werd gefinancierd door R44 GM137651. M.M. werd gefinancierd door de Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. MT werd gefinancierd door RF1 AG079138. K.C. werd gefinancierd door de International Foundation for Ethical Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
| Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
| Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
| VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
| ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| 100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
| DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
| hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
| PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
| Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
| Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
| Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
| Experimental models: Cell lines | |||
| Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
| Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
| iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
| Glassware and Plasticware | |||
| 150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
| Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
| Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
| Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
| Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
| P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
| Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
| Instruments | |||
| 10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
| 10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
| 40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
| Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
| Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
| TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
| Other | |||
| Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
| Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
| Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 - Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
| Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
| Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
| Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
| Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
| Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
| SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
| Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
| Software | |||
| Fiji | ImageJ | For image processing | |
| Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
| i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
| Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |
References
- Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405 (2019).
- Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
- Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson's disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813 (2011).
- Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451 (2022).
- Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
- Ortiz, G. G., et al.
- Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
- Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222 (2022).
- Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
- Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
- Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
- Abbott, N. J., et al.
- Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
- Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671 (2016).
- van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770 (2023).
- Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685 (2021).
- Lea, T., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).
- Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
- Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880 (2021).
- Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
- Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
- Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
- DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
- Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750 (2020).
- Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111 (2019).
- Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
- Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
- Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
- Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
- McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802 (2022).
- Su, S. -H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030 (2023).
- Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
- Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
- Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21 (2021).
- Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H.
