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Bioengineering

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65258
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 3, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Dieser Bericht enthält Protokolle für den Aufbau, die Zellkultur und die Assays auf der μSiM-Plattform für den Aufbau von Blut-Hirn-Schrankenmodellen.

Abstract

Das microSiM (μSiM) ist eine membranbasierte Kulturplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Im Gegensatz zu herkömmlichen membranbasierten Plattformen bietet das μSiM Experimentatoren neue Möglichkeiten, darunter die Bildgebung lebender Zellen, die ungehinderte parakrine Signalübertragung zwischen "Blut"- und "Gehirn"-Kammern und die Möglichkeit, Immunfluoreszenz direkt abzubilden, ohne dass Membranen extrahiert/wieder montiert werden müssen. Hier demonstrieren wir die grundlegende Verwendung der Plattform zur Etablierung von Monokultur- (Endothelzellen) und Kokulturmodellen (Endothelzellen und Perizyten) der BHS unter Verwendung ultradünner nanoporöser Siliziumnitrid-Membranen. Wir zeigen die Kompatibilität sowohl mit primären Zellkulturen als auch mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellkulturen (hiPSC). Wir stellen Methoden zur qualitativen Analyse von BHS-Modellen mittels Immunfluoreszenzfärbung zur Verfügung und demonstrieren die Verwendung des μSiM zur quantitativen Bewertung der Barrierefunktion in einem niedermolekularen Permeabilitätstest. Die bereitgestellten Methoden sollen es den Nutzern ermöglichen, ihre Barrieremodelle auf der Plattform zu etablieren und so den Einsatz der Gewebechip-Technologie zur Untersuchung von menschlichem Gewebe voranzutreiben.

Introduction

Lebende Gewebe werden von spezialisierten Zellen abgeschottet, die Barrieren bilden und aufrechterhalten und regulieren, welche Zellen und Moleküle von einem Kompartiment zum anderen transportiert werden. Die Fehlregulation von Barrierefunktionen kann sowohl die Ursache für akute als auch für chronische Erkrankungen sein. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist die restriktivste Gewebeschranke im menschlichen Körper1. Eine Funktionsstörung der BHS liegt einer Vielzahl von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) zugrunde, darunter Alzheimer2, Parkinson3,4 und Multiple Sklerose 5,6. Eine Verletzung der BHS ist auch mit einer langfristigen kognitiven Beeinträchtigung als Folge akuter Erkrankungen wie Sepsis7, COVID-198 und postoperativem Delir9 verbunden. Die Entwicklung von Medikamenten mit dem Potenzial zur Behandlung von Hirnerkrankungen war frustrierend schwierig, da es schwierig war, die BHS absichtlich zu durchbrechen, um bioaktive Moleküle an Ziele im Gehirn zu liefern10. Aus diesen Gründen sind Methoden zur Untersuchung der BHS-Funktion in vitro von größter Bedeutung für das Verständnis und die Behandlung von Erkrankungen des ZNS.

Die grundlegenden Methoden zur Messung der Barrierefunktion in vitro umfassen die Etablierung einer Monoschicht oder Co-Kultur auf einer semipermeablen Membran und die Messung des Widerstands, den Zellen entweder der Diffusion kleiner Moleküle oder kleinen elektrischen Strömen verleihen11,12,13,14. Während das Aufkommen mikrophysiologischer Systeme (MPS) eine Fülle von Möglichkeiten für die Modellierung der BHS in 3D15,16 hervorgebracht hat, macht es die Vielfalt der Systemgeometrien schwierig, Permeabilitätsmessungen zwischen MPS oder mit etablierten Literaturwerten zu vergleichen. Die Etablierung vertrauenswürdiger Ausgangswerte ist besonders wichtig in der BHS-Forschung, wo aufgrund der umfangreichen Barriereregulation durch vaskuläre Endothelzellen des Gehirns die Permeabilitätswerte in vitro genau unter die Lupe genommen werden12,17,18. Aus diesen Gründen werden Permeabilitätsmessungen über Monolagen, die auf 2D-Membranen etabliert wurden, auch in den kommenden Jahren ein fester Bestandteil von BHS-Studien bleiben. Dies gilt auch für andere Gewebebarrieren, einschließlich epithelialer Barrieren, bei denen absolute Werte der Baseline-Permeabilität zur Validierung und zum Vergleich von In-vitro-Modellen verwendet werden 19,20,21.

Mit dem Ziel, ein wertvolles neues Werkzeug für die BBB-Forschungsgemeinschaft zu etablieren, haben wir in den letzten 5 Jahren 22 vorgestellt und23,24,25,26 das Mikrogerätmit einer Sizilon membrane (μSiM)-Plattform für den Einsatz in der Barrieregewebemodellierung weiterentwickelt. Das grundlegende Merkmal der Plattform ist eine ultradünne (<100 nm dicke) Membran mit Hunderten von Millionen Nanoporen 27,28 oder einer Mischung aus Nanoporen und Mikroporen29. Die freistehenden Membranchips werden auf einem 300 μm Silizium-"Chip" hergestellt, der die ultradünnen Strukturen30 stabilisiert und es ermöglicht, sie mit einer Pinzette für die Vorrichtungsmontage zu handhaben. Aufgrund ihrer ultradünnen Beschaffenheit weisen die Membranen eine Permeabilität auf, die um zwei Größenordnungen höher ist als die herkömmlicher spurgeätzter Membranen, die in kommerziellen Membrankulturvorrichtungen verwendet werden31,32. In der Praxis bedeutet dies, dass die Behinderung der Membran für die Diffusion von Molekülen, die kleiner als die Nanoporen sind (<60 nm), vernachlässigbar ist33. Daher bestimmen für zelluläre Barrieren nur die Zellen und die von ihnen abgeschiedenen Matrizen die Geschwindigkeit des Transports kleiner Moleküle von den apikalen zu basalen Kompartimenten, die durch die Membran34 getrennt sind. Das Gerätedesign und die ultradünne Beschaffenheit der Membranen bieten auch für die optische Mikroskopie viele Vorteile. Dazu gehören 1) die Fähigkeit, lebende Kulturen mit Phasenkontrast oder Hellfeld-Bildgebung zu verfolgen, 2) die Fähigkeit, in situ fluoreszierend zu färben und abzubilden, ohne dass die Membran extrahiert und auf ein Deckglas übertragen werden muss, und 3) die Tatsache, dass die Membranen dünner sind als konfokale "Schichten", so dass direkte Co-Kulturen einen natürlicheren Abstand zwischen den Zelltypen haben, als dies mit 6-10 μm dicken spurgeätzten Membranen erreicht werden kann.

Zuletzt haben wir die Plattform zu einem modularen Format weiterentwickelt, um eine schnelle Montage34 und Anpassung35,36 zu ermöglichen. Wir nutzten das modulare Format, um Gerätekomponenten zwischen unseren biotechnischen und kooperierenden Laboren für die Hirnschranke zu verteilen. Anschließend entwickelten wir gemeinsam Protokolle für die Geräteassemblierung, Monokultur und Co-Kultur, Immunfluoreszenzfärbung und Permeabilität kleiner Moleküle und zeigten, dass diese Methoden zwischen Laboren reproduzierbar sind. Unter Verwendung dieser Protokolle haben wir auch gezeigt, dass die modulare Plattform eine validierte BHS unterstützt, die mit der erweiterten Endothelkulturmethode (EECM) entwickelt wurde, um mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu erzeugen37. Ziel des vorliegenden Berichts ist es, diese Methoden genauer zu beleuchten und mit Hilfe des begleitenden Videos eine breitere Akzeptanz der Plattform in der BBB-Community zu ermöglichen.

Protocol

1. μSiM-Baugruppe

HINWEIS: Diese Methode beschreibt den Zusammenbau der Geräte. Der Membranchip hat eine Grabenseite und eine Flachseite, die Trench-up oder Trench-down montiert werden können. Trench-Down-Geräte werden am häufigsten für die Zellkultur verwendet.

  1. Bereiten Sie in einer sterilen Umgebung (z. B. in einer Biosicherheitshaube) alle Materialien für die Montage vor, einschließlich der Montagevorrichtungen, Komponenten, Membranchips und Pinzetten.
  2. Platzieren Sie den Membranchip mit einer Chippinzette in der Mitte der Vorrichtung A1. Die flache Oberfläche des Chips zeigt nach unten und der Grabenbereich zeigt bei Trench-Down-Geräten nach oben und umgekehrt bei Trench-Up-Geräten.
    HINWEIS: Die folgenden Montageschritte werden am Beispiel der Trench-Down-Vorrichtung veranschaulicht, die eine flache Wachstumsfläche in der oberen Kammer ermöglicht.
  3. Verbinden Sie Bauteil 1 mit dem Chip. Ziehen Sie zunächst die blauen Schutzschichten auf beiden Seiten von Bauteil 1 mit einer geraden Pinzette ab und legen Sie es mit der oberen Kammer nach unten in die Vorrichtung A1. Drücken Sie Bauteil 1 vorsichtig nach unten, bis der Haftkleber (PSA) den Chip berührt.
  4. Setzen Sie die Vorrichtung A2 auf die Vorrichtung A1 und üben Sie an verschiedenen Ecken festen Druck aus, um einen festen Sitz des Chips und des Bauteils zu gewährleisten.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die PSA-Schicht nicht zu entfernen. Es handelt sich um eine transparente und steifere Schicht im Vergleich zu den blauen Schutzschichten.
  5. Verbinden Sie Bauteil 2 mit Bauteil 1 mit dem Chip. Bereiten Sie zunächst Bauteil 2 vor, indem Sie eine Ecke von Bauteil 2 mit einer geraden Pinzette anfassen und vom Blatt abziehen. Greifen Sie dann den Nicht-PSA-"Dreiecks"-Bereich von Komponente 2 und entfernen Sie gemeinsam die dicke, transparente Schutzschicht und die blaue Schicht von Komponente 2, wodurch die PSA-Oberfläche freigelegt wird. Bauteil 2 mit der PSA-Seite nach oben in die Vorrichtung B1 einlegen.
  6. Bauteil 1 mit dem Membranchip in die Halterung B1 mit der oberen Kammer nach oben legen.
  7. Setzen Sie die Vorrichtung B2 auf Bauteil 1 und üben Sie an verschiedenen Ecken der Vorrichtung B2 festen Druck aus.
  8. Nehmen Sie das zusammengebaute Gerät aus der Halterung und drücken Sie mit einer geraden Pinzette alle Luftblasen an der Unterseite des Geräts heraus und versiegeln Sie die Ränder des Kanals, wobei Sie den Kontakt mit dem Membranbereich vermeiden. Vor der Verwendung für die Zellkultur werden neu montierte Geräte 20 Minuten lang mit UV-Sterilisation sterilisiert.

2. Zellkultur

HINWEIS: Diese Methode beschreibt Protokolle für primäre und hiPSC-abgeleitete Kulturen auf der Plattform. Die Methoden beschreiben die Monokultur von Endothelzellen in der oberen Kammer des Geräts und die Kokultur von Perizyten und Endothelzellen mit Perizyten in der unteren Kammer und Endothelzellen in der oberen Kammer von Trench-Down-montierten Geräten. Zu den Abmessungen und Volumina der Kammer siehe Tabelle 1. Dies sind die gebräuchlichsten Formate; Je nach Benutzerbedarf können jedoch auch andere Zellkulturlayouts verwendet werden.

  1. Vorbereitung der Zellkulturkammer
    1. Montieren Sie die Geräte gemäß dem in Abschnitt 1 beschriebenen Protokoll.
    2. Legen Sie die Geräte in sterile Schlauchschellen. Sterilisieren Sie die Klammern vor der Zellkultur, indem Sie sie ≥20 Minuten lang in Ethanol einweichen. Nach jedem Experiment zur Wiederverwendung resterilisieren.
    3. Kultivieren Sie die Geräte in einer großen, sterilen Petrischale. Für zusätzliche Feuchtigkeit fügen Sie eine kleine Petrischale oder einen konischen 50-ml-Röhrchendeckel hinzu, der mit sterilem Wasser gefüllt ist.
    4. Waschen Sie die obere Kammer der Geräte zweimal mit 100 μl sterilem Wasser. Für die Zellkultur in der unteren Kammer wird die untere Kammer mit 20 μl sterilem Wasser gewaschen.
  2. hCMEC/D3-Zelllinie (BHS) Monokultur
    1. Bereiten Sie die Zellkulturkammer gemäß Abschnitt 2.1 vor.
    2. Die oberen Kammern werden mit 25 μg/cm2 Kollagen I und 5 μg/cm2 humanem Fibronektin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bestrichen. 1-2 h bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C stehen lassen.
    3. Entfernen Sie die Beschichtungslösung und geben Sie 100 μl vorgewärmtes Wachstumsfaktor-abgereichertes Endothelmedium (Assay-Medium) in die obere Kammer und 20 μl in die untere Kammer. Zur Herstellung des Assaymediums werden 100 ml endotheliales Basalmedium + 400 μl humaner fibroblastischer Wachstumsfaktor + 40 μl Hydrocortison + 100 μl Gentamicinsulfat + 2 ml fötales Kälberserum gemischt.
    4. Passage hCMEC/D3-Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers; Die Zellen werden in einem 37 °C warmen Inkubator für 3-5 min trypsinisiert und dann die Trypsinisierung durch Zugabe von vorgewärmtem Endothelmedium gestoppt. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Assay-Medien und säen Sie die Zellen in den oberen Kammern mit einer Dichte von 40.000-60.000 Zellen/cm2 aus. Inkubieren Sie die Geräte bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid (CO2) für 2-4 Stunden, um die Zelladhäsion zu erleichtern. Um beispielsweise 40.000 Zellen/cm2 auf dem 0,37cm2-Chip zu erreichen, geben Sie 100 μl einer Zelllösung mit einer Konzentration von 150.000 Zellen/ml in die obere Kammer.
      ANMERKUNG: Wir kultivieren und passagen hCMEC/D3 gemäß Hudecz et al.38 unter Verwendung einer modifizierten Formulierung von endothelialem Wachstumsmedium-2 (EGM-2) für die Zellerhaltung und einem wachstumsfaktorreduzierten "Assay-Medium" nach der Subkultur für Assays. Andere Medienformulierungen sollten mit den Geräten kompatibel sein, obwohl wir die Medienformulierungen von Hudecz et al.38 empfehlen, wenn Benutzer Probleme mit dem Überleben von hCMEC/D3 haben.
    5. Nach 2-4 h für die Zelladhäsion in beiden Kammern mit frischem Assay-Medium austauschen, um abgestorbene oder nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
    6. Halten Sie die Geräte bei 37 °C mit 5 % CO 2 und tauschen Sie das Assay-Medium in beiden Kammern alle2-3 Tage aus, bis Sie experimentieren. Die Assays werden in der Regel nach 2 Wochen Kultur durchgeführt.
  3. hiPSC-abgeleitete EECM-BMEC-ähnliche Zellmonokultur
    1. Bereiten Sie die Zellkulturkammer gemäß Abschnitt 2.1 vor.
    2. Bereiten Sie Kollagen IV aus menschlicher Plazentalösung vor, indem Sie 5 ml 0,5 mg/ml Essigsäure zu 5 mg Kollagen IV hinzufügen, um eine 1 mg/ml-Lösung zu erhalten. Lassen Sie die Lösung ≥4 Stunden bei 4 °C ruhen, um sie vollständig zu rekonstituieren. Die Lösung ist bei 4 °C für 2 Wochen stabil.
    3. Beschichten Sie die oberen Kammern mit 100 μl Kollagen IV im Verhältnis 4:1:5, Rinderfibronektin und sterilem Wasser. Bei 37 °C 2-4 h ummanteln.
    4. Entfernen Sie die Beschichtungslösung und geben Sie 100 μl hECSR bei Raumtemperatur in die obere Kammer und 20 μl in die untere Kammer.
    5. Passage von EECM-BMEC-ähnlichen Zellen nach Nishihara et al.37; Eine Enzymmischung zur Zellablösung in die Zellen geben und für 5-8 min in einen 37 °C warmen Inkubator überführen. Pipetieren Sie die Zelllösung, um sie zu vereinzeln, und fügen Sie sie dem 4-fachen Volumen des Endothelmediums in einem Zentrifugenröhrchen hinzu. Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur; Resuspendieren Sie die Zellen in hECSR und säen Sie in den oberen Kammern mit einer Dichte von 40.000 Zellen/cm2. Inkubieren Sie die Geräte bei 37 °C mit 5 %CO2 für 2-4 h, um die Zelladhäsion zu erleichtern. Um beispielsweise 40.000 Zellen/cm2 zu erreichen, fügen Sie 100 μl einer Zelllösung mit 150.000 Zellen/ml hinzu.
    6. Nach 2-4 h für die Zelladhäsion Austausch mit frischem hECSR in beiden Kammern, um abgestorbene oder nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
    7. Halten Sie die Geräte bei 37 °C mit 5 % CO 2 und tauschen Sie hECSR in beiden Kammern alle1-2 Tage aus, bis Sie experimentieren. Die Assays werden in der Regel am 6. Tag der Kultur durchgeführt.
  4. hCMEC/D3 und primäre humane vaskuläre Perizyten (HBVP)
    1. Beschichten Sie die Membranchips vor der Gerätemontage mit 2 μg/cm2 Poly-L-Lysin (PLL), das in PBS gemischt ist. Tragen Sie 50-80 μl PLL in einem Tröpfchen nur auf die Seite auf, die in der endgültigen Gerätebaugruppe nach unten zeigt. Beenden Sie den Beschichtungsprozess entweder in 1-2 h bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie die Beschichtungslösung. Waschen Sie die Membranchips mit sterilem Reinstwasser und lassen Sie sie trocknen.
    3. Montieren Sie die Geräte gemäß dem in Abschnitt 1 beschriebenen Protokoll mit der PLL-beschichteten Seite nach unten und bereiten Sie die Zellkulturkammer gemäß Abschnitt 2.1 vor.
    4. Die oberen Kammern sind gemäß Abschnitt 2.2.2 zu beschichten.
    5. Geben Sie 50 μl vorgewärmtes Perizytenmedium in die oberen Kammern und 20 μl in die unteren Kanäle.
    6. Passage HBVPs gemäß dem Protokoll des Herstellers; Trypsinisieren Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Inkubator für 3-5 Minuten und beenden Sie dann die Trypsinisierung durch Zugabe von vorgewärmtem Perizytenmedium. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Perizytenmedium und säen Sie die Zellen in den unteren Kammern mit einer Dichte von 14.000-25.000 Zellen/cm2 aus. Drehen Sie die Geräte um, aber behalten Sie eine Luftschnittstelle mit den oberen Kammern bei, um den Gasaustausch zu erleichtern.
      HINWEIS: Die während der Inversion erforderliche Luftschnittstelle kann erreicht werden, indem die Geräte nach dem Einsetzen in Schlauchschellen umgedreht und vor dem Wenden an allen Ecken nach unten gedrückt werden, oder indem die Geräte kopfüber auf parallele Streifen aus Acryl oder Silikon gelegt werden, die weit genug voneinander entfernt sind, um die oberen Kammern frei zu halten. Die Aussaatdichte muss möglicherweise für jeden Benutzer optimiert werden. Um 14.000 Zellen/cm2 zu erreichen, fügen Sie 20 μl einer Zellsuspension mit ~590.000 Zellen/ml hinzu. Beachten Sie, dass 20 μl in die untere Kammer pipettiert werden, um Blasen zu vermeiden, aber die Dichte wird mit dem Volumen der unteren Kammer von 10 μl berechnet.
    7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 %CO2 für 2-4 h in umgekehrter Position, um die Zelladhäsion zu erleichtern.
    8. Nach 2-4 h für die Zelladhäsion drehen Sie die Geräte aufrecht und tauschen sie in beiden Kammern gegen frisches Perizytenmedium aus, um abgestorbene oder nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
    9. Nach der Perizytenaussaat wird hCMEC/D3s in die obere Kammer gesät, wobei die Schritte 2.2.4-2.2.5 befolgt werden. Schalten Sie beide Kammern auf das Assay-Medium um.
    10. Halten Sie die Geräte bei 37 °C mit 5 % CO 2 und tauschen Sie das Assay-Medium in beiden Kammern alle1-2 Tage aus, bis Sie experimentieren. Die primäre Zell-Co-Kultur wird in der Regel 6-8 Tage vor den Assays aufrechterhalten.
      HINWEIS: Wenn die HBVP-Monokulturen mit hCMEC/D3-Monokulturen oder hCMEC/D3- und HBVP-Kokulturen verglichen werden, tauschen Sie 2-3 Tage nach der Aussaat der HBVPs das Perizytenmedium mit dem Assay-Medium aus.
  5. hiPSC-abgeleitete EECM-BMEC-ähnliche Zellen und Gehirnperizyten-ähnliche Zellen (BPLC) Kokultur
    1. Bereiten Sie die Zellkulturkammer gemäß Abschnitt 2.1 vor und beschichten Sie die oberen Kammern gemäß den Schritten 2.3.2-2.3.3.
    2. Entfernen Sie die Beschichtungslösung und geben Sie 50 μl Essential 6 Medium + 10 % fötales Kälberserum (E6 + 10 % FBS) bei Raumtemperatur in die obere Kammer.
    3. Passage der BPLCs nach Gastfriend et al.39; Geben Sie eine Enzymmischung zur Zellablösung in die Zellen und geben Sie sie für 5-15 Minuten in einen 37 °C warmen Inkubator, bis ~90% der Zellen gerundet sind. Pipetieren Sie die Zelllösung, um sie zu vereinzeln, und fügen Sie das 4-fache des Volumens von DMEM/F12 in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu, wobei Sie ein 40-μm-Zellsieb verwenden, um die Zellen zu filtern und vollständig zu singularisieren. In ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen, bei 200 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, das Zellpellet in E6 + 10% FBS resuspendieren und die Zellen in den unteren Kammern mit einer Dichte von 14.000-25.000 Zellen/cm2 aussäen. Drehen Sie die Geräte um, aber behalten Sie eine Luftschnittstelle mit der oberen Kammer bei, um den Gasaustausch zu erleichtern.
      HINWEIS: Die während der Inversion erforderliche Luftschnittstelle kann erreicht werden, indem die Geräte nach dem Einsetzen in die Schlauchschellen umgedreht und vor dem Umdrehen an allen Ecken nach unten gedrückt werden, oder indem die Geräte kopfüber auf parallele Streifen aus Acryl oder Silikon gelegt werden, die weit genug voneinander entfernt sind, um die oberen Kammern frei zu halten. Die Aussaatdichte muss möglicherweise für jeden Benutzer optimiert werden. Um 14.000 Zellen/cm2 zu erreichen, fügen Sie 20 μl einer Zellsuspension mit ~590.000 Zellen/ml hinzu. Beachten Sie, dass 20 μl in die untere Kammer pipettiert werden, um Blasen zu vermeiden, aber die Dichte wird mit dem Volumen der unteren Kammer von 10 μl berechnet.
    4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 %CO2 für 2-4 h in umgekehrter Position, um die Zelladhäsion zu erleichtern.
    5. Nach 2-4 h für die Zelladhäsion die Geräte aufrichten und in beiden Kammern mit frischem E6 + 10% FBS austauschen, um abgestorbene oder nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
    6. Einen Tag nach der Perizytenaussaat werden EECM-BMEC-ähnliche Zellen in der oberen Kammer ausgesät, indem Sie die Schritte 2.3.5-2.3.6 befolgen. Schalten Sie beide Kammern auf hECSR.
    7. Halten Sie die Geräte bei 37 °C mit 5 % CO 2 und tauschen Sie das Assay-Medium in beiden Kammern alle1-2 Tage aus, bis Sie experimentieren. Die aus hiPSC gewonnene Co-Kultur wird in der Regel für 7 Tage für BPLCs und 6 Tage für EECM-BMEC-ähnliche Zellen vor dem Assay aufrechterhalten.
      HINWEIS: Wenn die BPLC-Monokulturen mit EECM-BMEC-Monokulturen oder EECM-BMEC- und BPLC-Co-Kulturen verglichen werden, tauschen Sie E6 + 10% FBS 1 Tag nach der Aussaat der BPLCs gegen hECSR aus.

3. Immunzytochemie

HINWEIS: Diese Methode beschreibt ein Protokoll für die immunzytochemische Färbung und Bildgebung von Zellen, die auf der Ober- und/oder Unterseite der Membran kultiviert wurden. Das Ziel dieses Experiments ist es, das Vorhandensein und die Lage von Schlüsselproteinen zu bestimmen, die in der BHS gefunden werden sollten, wie z. B. Adhärenzen und Tight-Junction-Proteine sowie Zellidentitätsproteine. Alternative und Live-Färbemethoden sind ebenfalls mit der Plattform kompatibel.

  1. Fixierung und Färbung auf den Geräten
    1. Legen Sie die Primärantikörper zum Auftauen auf Eis.
    2. Bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung bei Raumtemperatur vor (z. B. verdünnen Sie 16% PFA in dem 3-fachen seines PBS-Volumens) oder kühlen Sie 100%iges Methanol bei -20 °C.
    3. Erstellen Sie eine geeignete Blockierungslösung gemäß Tabelle 2. Auf Eis lagern.
      HINWEIS: Das Vortexen der Lösung kann erforderlich sein, um Triton X-100 vollständig aufzulösen.
    4. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 20 μl Fixiermittel (z. B. PFA oder Methanol) in die untere Kammer und 50 μl in die obere Kammer pipettieren. Inkubieren Sie die Geräte für 10 min (PFA) oder 2 min (Methanol) bei Raumtemperatur.
    5. 3 x 5 Minuten lang waschen, indem 20 μl PBS durch die untere Kammer und 100 μl in die obere Kammer pipettiert werden.
    6. Blockieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur, indem Sie 20 μl der Blockierungslösung in die untere Kammer und 50 μl Blockierungslösung in die obere Kammer geben. Prüfen Sie, ob sich in der unteren Kammer Blasen befinden.
    7. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den/die Antikörper in der blockierenden Lösung gemäß Tabelle 2 verdünnen. Auf Eis lagern.
    8. Färben Sie mit den Primärantikörpern, indem Sie 20 μl der primären Antikörperlösung in die untere Kammer geben und das Volumen der oberen Kammer durch 50 μl der primären Antikörperlösung ersetzen. Prüfen Sie, ob sich in der unteren Kammer Blasen befinden. 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    9. 3 x 5 Minuten lang waschen, indem 20 μl PBS durch die untere Kammer und 100 μl in die obere Kammer pipettiert werden.
    10. Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie den/die Antikörper in der blockierenden Lösung gemäß Tabelle 2 verdünnen. Auf Eis vor Licht geschützt lagern.
    11. Färben Sie mit sekundären Antikörpern, indem Sie 20 μl sekundäre Antikörperlösung in die untere Kammer geben und das Volumen der oberen Kammer durch 50 μl der sekundären Antikörperlösung ersetzen. Prüfen Sie, ob sich in der unteren Kammer Blasen befinden. 1 Stunde bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren.
    12. 3 x 5 Minuten lang waschen, indem 20 μl PBS durch die untere Kammer und 100 μl in die obere Kammer pipettiert werden.
    13. Stelle eine nukleare Fleckenlösung her. Hoechst 1:10.000 in PBS verdünnen. Geben Sie 20 μl der nuklearen Färbelösung in die untere Kammer und ersetzen Sie das Volumen der oberen Kammer durch 50 μl der nuklearen Färbelösung. Prüfen Sie, ob sich in der unteren Kammer Blasen befinden. 3 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren.
    14. Entfernen Sie den Fleck, indem Sie 20 μl PBS in die untere Kammer geben und das Volumen der oberen Kammer durch 100 μl PBS ersetzen. Fotografieren Sie die Geräte sofort oder lagern Sie sie bei 4 °C, wobei die Petrischale in Parafilm eingewickelt und vor Licht geschützt ist, bis sie für die Bildgebung bereit ist.
  2. Konfokale Bildgebung
    HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Bildgebung der Geräte mit einem konfokalen Mikroskop mit inverser rotierender Scheibe und einem 40-fach-Objektiv mit langem Arbeitsabstand (LWD) (Wasser, WD 590-610, numerische Apertur 1,15) als Beispiel beschrieben. Informationen zu Arbeitsabständen und Objektivkompatibilität finden Sie in den ergänzenden Materialien von McCloskey et al.34. Die Bilder des gesamten Membranbereichs werden ebenfalls mit einem 10-fach-Objektiv aufgenommen, um sicherzustellen, dass die 40-fachen Bilder repräsentativ für das gesamte Feld sind. Diese werden in der Regel im Weitfeld aufgenommen.
    1. Schalten Sie das Mikroskop ein und öffnen Sie die Bildgebungssoftware.
    2. Stellen Sie die Kanäle entsprechend den Eigenschaften des Sekundärantikörpers und der Kernfärbung mit dem konfokalen Bildgebungsmodus ein. Optimieren Sie die Laserleistung und die Belichtungszeit, um sicherzustellen, dass sich das Signal über dem Hintergrund befindet und Bildartefakte reduziert werden.
      1. Für die Kernfärbung von Hoechst verwenden Sie die Anregung 405, die Emission 450/50 Bandpass (BP), 500 ms Belichtungszeit, 50 % Laserleistung. Für Etiketten mit einem sekundären Antikörper, der mit Alexa Fluor (AF) 488 konjugiert ist, verwenden Sie die Anregung 488, die Emission 525/50BP, eine Belichtungszeit von 500 ms und eine Laserleistung von 50 %. Für Markierungen mit einem sekundären Antikörper, der mit AF568 konjugiert ist, verwenden Sie die Anregung 561, die Emission 600/50 BP, die Belichtungszeit von 500 ms und die Laserleistung von 100 %.
    3. Legen Sie das Gerät mit der oberen Kammer nach oben in den Objektträgerhalter und setzen Sie es mit einem Objektträgerhalter in das Mikroskop ein. Schalten Sie Live ein und wählen Sie den Kanal für die Kernfärbung aus. Finden Sie die Membran mit einem niedrigen Objektiv und achten Sie darauf, dass der transparente Siliziumnitrid-Membranbereich zentriert ist, da das Licht nicht durch den blauen, festen Silikonbereich dringt. Sobald das Gerät richtig zentriert ist und die Zellschicht gefunden ist, wechseln Sie zum 40-fach-Objektiv, befeuchten Sie das Objektiv und konzentrieren Sie sich auf die Membranregion, indem Sie sich an der Kernfärbung orientieren.
    4. Aktivieren Sie die Z-Stapel-Bildgebung und legen Sie den Scanmodus auf Start/Ende fest. Legen Sie die Schrittweite oder -anzahl fest. Stellen Sie mit dem groben Einstellknopf am Mikroskop den Scanstart auf die Oberseite der Endothelzellschicht ein, wobei die Kernfärbung als Führung dient, und das Scanende am unteren Rand der Perizytenschicht, wobei Sie die Kernfärbung als Führung verwenden. Überprüfen Sie alle Kanäle, um sicherzustellen, dass alles im Imaging-Feld erfasst wird.
      HINWEIS: Wir verwenden in der Regel Auto-Step, d. h. ~0,2 μm-Schichten.
    5. Legen Sie den Bildnamen fest und drücken Sie Erfassen , um die Bildbearbeitung zu starten. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf in verschiedenen Regionen.
    6. Verarbeiten Sie die konfokalen Bilder mit ImageJ40 oder Imaris.
      1. Um sie in Imaris zu verarbeiten, ziehen Sie die Bilddatei in das zu öffnende Programm. Wählen Sie in der oberen Menüleiste Abschnitt aus, um ein 2D-Bild der X-Y-Ebene mit den entsprechenden Ansichten der X-Z- und Y-Z-Ebene anzuzeigen. Wählen Sie in der oberen Menüleiste 3D-Ansicht aus, um ein 3D-Bild anzuzeigen. Klicken Sie auf das Bild und ziehen Sie es, um es zu drehen. Wählen Sie in der oberen Menüleiste Schnappschuss aus, um ein Bild aufzunehmen.

4. Probenahme-Assay der Permeabilität kleiner Moleküle

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird eine Methodik zur quantitativen Messung der Barriereeigenschaften der Zellkulturen beschrieben. Ziel dieses Experiments ist es, die Konzentration eines fluoreszierenden kleinen Moleküls nachzuweisen, das die Zellschichten durchdringt und in die untere Kammer der Plattform eintritt. Diese Daten werden dann verwendet, um die Zellpermeabilität zu berechnen.

  1. Probenahme-Technik
    1. Montieren Sie die Geräte gemäß dem in Abschnitt 1 beschriebenen Protokoll und kultivieren Sie die gewünschten Zelllinien wie in Abschnitt 2 beschrieben. Fügen Sie ein zusätzliches Gerät hinzu, das als zellfreies, beschichtetes Steuergerät zur Messung der Systemdurchlässigkeit dient.
      HINWEIS: Es werden mindestens drei technische Replikate pro Bedingung empfohlen. Es ist jedoch nur eine Replikation der beschichteten Kontrolle erforderlich.
    2. Bevor Sie mit der Probenahme beginnen, ersetzen Sie das Medium in der unteren Kammer durch frisches Medium. Überprüfen Sie die Konfluenz der endothelialen Monoschicht in jedem Gerät unter dem Mikroskop. Achten Sie auf Lücken in den Zellmonoschichten, da dies die Diffusion des Farbstoffs in die untere Kammer beeinträchtigt.
      HINWEIS: Eine gesunde Endothelkultur sollte zu 100 % konfluent sein.
    3. Die fluoreszierende niedermolekulare Lösung (z. B. 150 μg/ml Luzifergelb, 457 Da) wird in Zellkulturmedium hergestellt. Bereiten Sie das überschüssige Volumen der fluoreszierenden niedermolekularen Lösung vor, das für die Herstellung der Standardlösungen verwendet werden soll, die als Referenzen zur Berechnung der Konzentration des fluoreszierenden kleinen Moleküls dienen, das aus dem unteren Kanal entnommen wird.
      HINWEIS: Wir empfehlen die Herstellung von 400 μl überschüssiger Lösung, die als Standardlösung mit der höchsten Konzentration des fluoreszierenden kleinen Moleküls verwendet wird.
    4. Ersetzen Sie das Medium in der oberen Vertiefung durch 100 μl der fluoreszierenden niedermolekularen Lösung.
      HINWEIS: Wir empfehlen, einen hydrophoben Stift zu verwenden, um Kreise um die Probenahmeöffnungen zu zeichnen, und zu warten, bis die hydrophobe Tinte vollständig getrocknet ist, bevor Sie fluoreszierende Farbstofflösung hinzufügen. Dadurch wird verhindert, dass sich das Medium aus dem unteren Kanal um die Probenahmeöffnung in Schritt 4.1.7 ausbreitet. Wir empfehlen, die Zugabe der fluoreszierenden niedermolekularen Lösung in die obere Vertiefung zu staffeln, 2 Minuten zu warten, bevor Sie die fluoreszierende Lösung zum nächsten Gerät hinzufügen, oder in Gruppen von 3 zu arbeiten (fügen Sie die Lösung in drei Geräte gleichzeitig hinzu und warten Sie 5 Minuten, um die nächsten drei Geräte hinzuzufügen).
    5. Inkubieren Sie die Geräte bei 37 °C, 5 % CO2 für 1 h.
    6. Während der 1-stündigen Inkubation im vorherigen Schritt werden Standardlösungen hergestellt, indem 2-fache serielle Verdünnungen aus der in Schritt 4.1.3 hergestellten fluoreszierenden niedermolekularen Lösung durchgeführt werden. Pipetieren Sie 50 μl jeder Lösung in dreifacher Ausführung in die schwarze 96-Well-Platte mit flachem Boden. Verwenden Sie ein leeres Zellkulturmedium als Basis-Standardlösung.
      HINWEIS: Zur Herstellung von Standardlösungen empfehlen wir 11 serielle Verdünnungen mit einem Endvolumen von 200 μl und die Verwendung von Zellkulturmedium als Blindwert zur Messung der Basisfluoreszenzintensität.
      1. 200 μl von 400 μl der überschüssigen fluoreszierenden niedermolekularen Lösung, die in Schritt 4.1.3 hergestellt wurde, werden in ein Röhrchen mit 200 μl Medium überführt, gut gemischt und 200 μl dieser Lösung in das nächste Röhrchen mit 200 μl Medium überführt. Wiederholen Sie die Verdünnungen im Verhältnis 1:2, bis insgesamt 10 Röhrchen vorhanden sind. Pipetieren Sie 50 μl der am stärksten konzentrierten Standardlösung in dreifacher Ausführung in Säule 1 in der 96-Well-Platte (B1, C1, D1), die 2. konzentrierteste Lösung in Säule 2 (B2, C2, D2) usw. Für die 12. Säule in der Platte pipettieren Sie 50 μl Leermedium in dreifacher Ausführung (B12, C12, D12).
    7. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um die fluoreszierende niedermolekulare Lösung aus dem unteren Kanal zu entnehmen.
      1. Entfernen Sie die fluoreszierende niedermolekulare Lösung aus der Vertiefung, um den Diffusionsprozess zu stoppen.
      2. Setzen Sie eine Spitze mit 50 μl Medium in den oberen Anschluss ein, um als Reservoir zu dienen, indem Sie die Spitze mit 50 μl in den Anschluss einführen, das Gerät anheben und die Spitze vorsichtig auswerfen, während Sie sich zur Stabilisierung an der Oberseite festhalten. Legen Sie das Gerät ab. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der Pipettenspitze oder Luft an der Spitze der Pipette befinden, um zu vermeiden, dass während der Probenahme Blasen in die untere Kammer gelangen.
      3. Geben Sie 50 μl Medium in die obere Vertiefung, um die Unterbrechung der Zellmonoschicht während der Probenahme zu verhindern.
      4. Um die Lösung aus dem unteren Kanal zu entnehmen, schieben Sie eine Pipette mit einer leeren Pipettenspitze auf den ersten Widerstand, stecken Sie die Spitze in die Probenahmeöffnung und pipettieren Sie 50 μl der Lösung umgekehrt aus dem unteren Kanal heraus. Direkt in die schwarze 96-Well-Platte mit flachem Boden geben, die die Standardlösungen enthält.
        HINWEIS: Wir empfehlen, die Zellmonoschicht unmittelbar nach der Probenahme unter dem Mikroskop zu überprüfen. Das Entnehmen von Medien aus dem unteren Kanal kann gelegentlich zu einer Unterbrechung der Zellschicht in der oberen Vertiefung führen, was zu inkonsistenten Permeabilitätsmessungen führen kann. Schnelles Arbeiten in den Schritten in 4.1.7 hilft, dies zu verhindern.
    8. Messen Sie die Fluoreszenzintensität in einem Mikroplatten-Reader unter Verwendung der richtigen Anregungs- und Emissionswellenlängenparameter für das verwendete fluoreszierende kleine Molekül. Verwenden Sie für Lucifer Yellow eine Anregung von 428 nm und eine Emission von 536 nm mit optimaler Verstärkung. Die Fluoreszenz wird von der Oberseite der Platte aus gemessen. Fügen Sie die Platte in den Plattenleser ein, markieren Sie die Vertiefungen mit der Probe (einschließlich der Standardkurve) und wählen Sie Start , um die Platte zu lesen.
  2. Berechnung des Permeabilitätswertes (siehe Ergänzungsdatei 1 für Vorlage)
    1. Subtrahieren Sie den gemittelten Fluoreszenzintensitätswert des Blindmediums von allen gemessenen Fluoreszenzintensitätswerten.
    2. Mit Gleichung (1) wird die Systempermeabilität Ps berechnet:
      Equation 1(1)
      Dabei ist [A]A die Konzentration des fluoreszierenden kleinen Moleküls, das aus dem unteren Kanal gesammelt wird, V das Volumen, das entnommen und der Platte zugegeben wird (0,050 ml), [A]L ist die Konzentration des fluoreszierenden kleinen Moleküls, das in die obere Vertiefung gegeben wird (z. B. 0,15 mg/ml), t ist die Inkubationszeit (in s oder min, je nach den gewünschten Einheiten), und S ist die Membranoberfläche (0,014cm2).
      1. Berechnen Sie [A]A unter Verwendung der Gleichung, die durch Zeichnen einer Standardkurve aus den Fluoreszenzintensitätsausgaben und den bekannten Konzentrationen der Standardlösungen erhalten wird. Berechnen Sie die Konzentrationen (x) der experimentellen Proben, indem Sie ihre Fluoreszenzintensitätswerte (y) in die Gleichung einfügen.
        HINWEIS: Verwenden Sie den Teil der Standardkurve, der linear ist. Wir empfehlen, die Membranoberfläche anhand eines unter dem Mikroskop aufgenommenen Bildes der Membran zu messen, da die Membranfläche je nach Chargennummer variieren kann und die berechneten Permeabilitätswerte erheblich beeinflussen kann, wenn sie von der beschichteten Kontrolle abweichen.
    3. Berechnen Sie mit Gleichung (2) die Permeabilität der Zellmonolage Pe:
      Equation 2(2)
      Dabei istP S die Systempermeabilität gemäß Schritt 4.2.2 und PC der Systempermeabilitätswert des zellfreien, beschichteten Steuergeräts.

Representative Results

Die Montage einer Grabenabsperrvorrichtung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Vorrichtungen führen die Montage der Komponenten und des Membranchips. Komponente 1 besteht in erster Linie aus Acryl mit einer PSA-Oberfläche für die Verklebung mit dem Chip und einer Öffnung zur Bodenkammer und Öffnungen für den Pipettenzugang zur Bodenkammer. Bauteil 2 ist die Kanalschicht und enthält oben rechts ein nicht klebendes, PSA-freies "Dreieck" zum Greifen. Trench-Down-Geräte bieten eine flache Zellkulturwachstumsfläche in der oberen Kammer, während Trench-up-Geräte eine flache Oberfläche für die Zellkultur in der unteren Kammer haben.

Wir führten endotheliale Monokulturen und Co-Kulturen von hCMEC/D3 und HBVPs sowie von hiPSC IMR90-4-abgeleiteten EECM-BMEC-ähnlichen Zellen und BPLCs durch und nahmen Phasenbilder mit einem Nikon Eclipse Ts2 Phasenkontrastmikroskop und einem 10x-Objektiv auf (Abbildung 2). Gezeigt werden optimale Aussaatdichten für primäre Zellkulturen (Bilder 1 Tag nach der Aussaat) sowie unterausgesäte HBVPs (Abbildung 2A). Abschließende Bilder der Kokultur- und Monokulturphase (6-Tage-Endothelzellkultur) können schwer zu unterscheiden sein (Abbildung 2C), und die Bestätigung einer erfolgreichen primären Zell-Kokultur kann eine Immunfluoreszenzfärbung erfordern (siehe Protokollabschnitt 3). Niedrige, hohe und optimale hiPSC-abgeleitete BPLC-Seeding-Dichten sind ebenfalls dargestellt (Abbildung 2B). hiPSC-abgeleitete Kokulturen sind in der Phasenkontrastbildgebung im Vergleich zu primären Kokulturen klarer zu unterscheiden (Abbildung 2D). Eine niedrige BPLC-Aussaat führt zu einer schlechten Perizytenabdeckung und Perizytenverklumpung, während eine Übersaat dazu führt, dass sich die Perizytenschicht von der Membran ablöst. Darüber hinaus kann ein zu schneller Austausch des Mediums in der unteren Kammer zu einem Verlust von Perizyten führen, da diese Zellen sehr empfindlich auf Scherung reagieren. Die optimale Abdeckung durch Perizyten beträgt ~90% für ein BHS-Modell, ohne Lücken in der Endothelschicht.

Repräsentative Bilder einer immungefärbten hiPSC-abgeleiteten Kokultur sind in Abbildung 3 (6 Tage Endothelzellkultur) dargestellt. IMR90-4-abgeleitete BPLCs wurden für den Perizytenmarker PDGFRβ gefärbt, und IMR90-4-abgeleitete EECM-BMEC-ähnliche Zellen wurden für den adhärenten Verbindungsmarker VE-cadherin gefärbt. Hoechst wurde verwendet, um die Kerne zu färben. Die Bilder wurden auf einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop mit einem 40-fachen LWD-Objektiv mit 0,2 μm-Schichten aufgenommen und mit Imaris bearbeitet. Beide Zellschichten können sichtbar gemacht werden, obwohl die dünne Nanomembran nicht zu sehen ist.

Wir führten den Probenahme-basierten Permeabilitätstest für kleine Moleküle unter den gleichen experimentellen Bedingungen in zwei räumlich voneinander entfernten Labors an der Universität Bern, Schweiz, und der University of Rochester, NY, USA, durch, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den Laboratorien zu demonstrieren (Abbildung 4)34. hiPSC IMR90-4-abgeleitete EECM-BMEC-ähnliche Zellen wurden im μSiM-Gerät für 2, 4 oder 6 Tage und 6 Tage auf Transwell-Filtern kultiviert. Der Assay wurde in beiden Labors mit 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da) durchgeführt. Eine hohe Variabilität in der Permeabilität der Endothelzellen, die 2 Tage lang im Gerät kultiviert wurden, deutet darauf hin, dass 2 Tage Kultur für die Barrierereifung nicht ausreichten. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Permeabilität zwischen den Laboren bei der Reifung der Barriere - ab 4 Tagen. Wir zeigten auch, dass die Permeabilität der Endothelzellen, die in μSiM- und Transwell-Filtern für 6 Tage kultiviert wurden, mit den zuvor veröffentlichten40 übereinstimmte.

Figure 1
Abbildung 1: Schritte der μSiM-Montage . (A) Bereiten Sie den Chip vor, indem Sie ihn auf die Halterung A1 legen. Platzieren Sie den Spänegraben nach oben, um eine endgültige Grabenablösung zu erhalten. Legen Sie den Spänegraben nach unten, um ein endgültiges Trench-up-Gerät zu erhalten. (B) Kleben Sie Bauteil 1 mit dem Chip, indem Sie die Schutzmasken von Bauteil 1 entfernen und mit der Vorderseite nach unten in FA1 legen. Verklebung durch Druck mit der Vorrichtung A2. (C) Verkleben Sie die Komponenten 2 und 1, indem Sie die Komponente 2 von ihrer Folie entfernen und die oberen Schutzschichten abziehen. Setzen Sie den Kanal nach oben in die Halterung B1 ein und legen Sie Komponente 1 mit der Vorderseite nach oben auf Komponente 2. Verklebung durch Druck mit der Vorrichtung B2. Abkürzungen: FAn = Fixture An; FBn = Fixture Bn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Kokultur und repräsentative Phasenkontrastbilder der Zellkultur in Geräten. (A) Ort der Aussaat von Perizyten- und Endothelzellen. (B) Schematische Darstellung der Zellpositionen entlang des Grabens des Membranchips. (C) Repräsentative Bilder niedriger und optimaler Aussaatdichten für primäre HBVP- und hCMEC/D3-Hirnendothelzelllinien. Die Bilder wurden 1 Tag nach der Aussaat (HBVP) und 2 h nach der Aussaat (hCMEC/D3) aufgenommen. (D) Repräsentative Bilder von niedrigen, hohen und optimalen Seeding-Dichten für hiPSC-abgeleitete Hirnperizyten-ähnliche Zellen. Die Bilder wurden 1 Tag nach der Aussaat aufgenommen. (E) Repräsentative Bilder der endgültigen HBVP- und hCMEC/D3-Kokultur und der hCMEC/D3-Monokultur. Die Bilder wurden 8 Tage nach der HBVP-Aussaat und 7 Tage nach der hCMEC/D3-Aussaat aufgenommen. (F) Repräsentative Bilder von fehlgeschlagenen und erfolgreichen BPLC- und EECM-BMEC-ähnlichen Zell-Kokulturen und EECM-BMEC-ähnlichen Zellmonokulturen. Die Bilder wurden 7 Tage nach der BPLC-Aussaat und 6 Tage nach der EECM-BMEC-Aussaat aufgenommen. Untersäte BPLC-Kulturen haben keine ausreichende Abdeckung, während übersäende BPLC-Kulturen überkonfluent werden und anfangen zu verklumpen/sich zurückzuziehen. Maßstabsbalken = 100 μm (C-F). Abkürzungen: HBVPs = Gefäßperizyten des menschlichen Gehirns; hiPSC = humane induzierte pluripotente Stammzelle; BPLCs = hiPSC-abgeleitete Perizyten-ähnliche Zellen des Gehirns. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von immungefärbten hiPSC-abgeleiteten Zell-Kokulturen in Geräten. Die Zellen wurden auf den Endothelzellmarker VE-Cadherin (grün), den Perizytenmarker PDGFRβ (rot) und die Kernfärbung (blau) gefärbt. In unmittelbarer Nähe sind zwei Zellschichten zu sehen, die nur durch eine dünne Siliziumnitrid-Nanomembran getrennt sind (weißer Pfeil markiert die Position der Membran im linken Bild). Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: hiPSC = humane induzierte pluripotente Stammzelle; PDGFRβ = Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor beta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Probenahme-basierter Permeabilitätstest für kleine Moleküle. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs. (B) Demonstration der Reproduzierbarkeit zwischen zwei räumlich entfernten Laboratorien an der Universität Bern (UniBe), Schweiz, und der University of Rochester (UR), NY, USA: hiPSC-abgeleitete Endothelzellen wurden 2, 4 oder 6 Tage lang im μSiM-Gerät und 6 Tage lang in Transwell-Filtern kultiviert. Der Permeabilitätstest wurde mit 150 μg/ml Luzifergelb (457 Da) durchgeführt. Der rote Balken zeigt die zuvor veröffentlichten Daten zur Permeabilität von Natriumfluorescein (376 Da) derselben hiPSC-abgeleiteten Endothelzellen, die 6 Tage lang in Transwellfiltern40 kultiviert wurden. N = 4-16 pro Gruppe. Es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey verwendet, und Vergleiche wurden nur für relevante p < 0,05 angezeigt. (C) Nachweis der Zytokinantwort unter Verwendung von hiPSC-abgeleiteten EECM-BMEC-ähnlichen Zellen, die 2 Tage lang in μSiM kultiviert wurden; 0,1 ng/ml TNFα + 2 IE/ml IFNγ) oder Medienkontrolle (nicht stimuliert, NS) wurde 20 Stunden lang in die obere Kammer gegeben, bevor der Permeabilitätstest mit 150 μg/ml Lucifer Yellow durchgeführt wurde. N = 3 pro Gruppe. Studentischer t-Test, p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Aussaatfläche der oberen Kammer Top-Well-Volumen Aussaatfläche der unteren Kammer Lautstärke des unteren Kanals
~37 Millimeter2 100 μl (fasst ≥115 μl) ~42 Millimeter2 10 μl (Pipette 20 μl, um Blasen zu vermeiden)

Tabelle 1: Kritische μSiM-Oberfläche und -Volumina.

Ziel Fixiermittel Blockierende Lösung Verdünnung
VE-Cadherin 4 % PFA oder 100 % MeOH 5 % GS + 0,4 % Tx-100 oder 10 % GS + 0,3 % Triton X-100 1:50
CD31-KARTON 4 % PFA oder 100 % MeOH 5% GS + 0,3-0,4% Triton X-100 1:100
Claudin-5 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:200
ZO-1-KARTON 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:200
Okkludin 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:50
PDGFRβ 4% PFA 5 % GS + 0,4 % Triton X-100 1:100
NG2-KARTON 4% PFA 5 % GS + 0,4 % Triton X-100 1:100
Ziege α-Maus IgG Alexa Fluor 488 1:200
Ziege α-Maus IgG Alexa Fluor 568 1:200

Tabelle 2: Antikörper und Färbemethoden, die für die Kokultur-Immunzytochemie in μSiM-Geräten validiert wurden. Abkürzungen: PFA = Paraformaldehyd; MeOH = Methanol; GS = Ziegenserum.

Ergänzungsdatei 1: Vorlage zur Berechnung des Permeabilitätswertes. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Obwohl Membranchips auf Stabilität ausgelegt sind, können sie bei unsachgemäßer Handhabung während der Montage reißen oder brechen. Daher ist es wichtig, den Chip in den Kerben der Chippinzette zu greifen und vorsichtig in die Vorrichtung zu legen. Beim Umgang mit den Geräten im Allgemeinen müssen besondere Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um die Geräte nicht anzustoßen oder fallen zu lassen. Während der Verklebung des Membranchips mit der Vorrichtung A1 muss der Chip flach und zentriert auf die Säule der Vorrichtung A1 gelegt werden, um Membranrisse während der Verklebung mit Bauteil 1 zu vermeiden. Darüber hinaus muss jeder Kontakt mit den freiliegenden PSA-Schichten nach dem Abnehmen der Schutzmasken vermieden werden. Bei der Handhabung von Bauteil 2 nach dem Entfernen der Schutzmasken empfiehlt es sich, es an der Bauteilkante festzuhalten und mit einer Pinzette die PSA-freie Dreiecksecke zu greifen.

Während Zellkulturprotokolle für mögliche BHS-Modelle beschrieben wurden, kann das hier beschriebene BMEC/Perizyten-Kokulturmodell der BHS je nach physiologischem Kontext und Fragestellungen ausreichend oder unzureichend sein. Zum Beispiel findet der Transport von Immunzellen hauptsächlich in den postkapillären Venolen des Gehirns statt41,42. In diesen Regionen trennt ein perivaskulärer Raum die BMEC/Perizyten-Barriere von den glialen Limitanen, die von Astrozyten gebildet werden. So besteht die neurovaskuläre Einheit (NVU) in postkapillären Venolen aus zwei physikalisch getrennten Barrieren in Reihe, und die astrozytären Endfüße berühren nicht direkt die BMEC/Perizyten-Blutschranke, die durch das aktuelle Modell gut repräsentiert wird. Wenn das Ziel ein NVU-Modell ist, das den Einfluss von Astrozyten-sezernierten Faktoren auf die Blutschranke berücksichtigt, könnte dem Gerät ein Astrozytenkompartiment hinzugefügt werden, das den Austausch löslicher Faktoren durch den perivaskulären Raum ermöglicht. Dieses Beispiel wurde bereits34 illustriert und könnte erweitert werden, um andere Zellen wie Mikroglia und Neuronen in einem 3D-"Gehirn"-Kompartiment einzubeziehen. Die modulare Architektur der Plattform ermöglicht es, einfache Montagestrategien zu verwenden, um diese Rekonfigurationen zu erreichen, so dass die Plattform so einfach oder komplex ist, wie es erforderlich ist, um die vorliegenden Hypothesen zu erfüllen. Jedes Zellkultur-Setup; muss jedoch für neue Zelllinien und Multikulturen optimiert werden. Aufgrund der Eigenschaften der Siliziumnitrid-Membranen müssen beispielsweise Beschichtungslösungen im Vergleich zu Gewebekulturplatten angepasst werden. Der Einschluss von Fibronektin hilft in der Regel bei der Zellanhaftung und dem Überleben. Darüber hinaus konnten Anwender Endothelzellen und Perizyten in entgegengesetzte Richtungen kultivieren. In diesem Fall kann es notwendig sein, z. B. die Art und Weise, wie die Permeabilitätsmessungen durchgeführt und interpretiert werden, zu ändern. Die Bereitstellung von Schritten für diese Art von Kultur würde jedoch den Rahmen dieses Artikels sprengen.

Eine weitere Herausforderung, auf die man bei der Zellkultur stoßen kann, ist die schnelle Verdunstung von Medien, da die Geräte im Vergleich zu Standard-Gewebekulturplatten und -kolben empfindlicher auf Veränderungen in der Umgebung reagieren können. Wenn eine übermäßige Verdunstung beobachtet oder das Zellwachstum verlangsamt wird, müssen alle kritischen Parameter des Inkubators gemessen werden, um genaue Einstellungen zu gewährleisten. Die Gewebekappe oder die kleine Petrischale, die sich in der Zellkulturkammer befindet, können mit mehr Wasser gefüllt werden, oder die Medien müssen häufiger ausgetauscht werden. Darüber hinaus können Blasen in den unteren Kanal eindringen und im Graben stecken bleiben. Sie können zwar entfernt werden, aber es ist am einfachsten, das Hinzufügen von Blasen von vornherein zu vermeiden. Dazu ist es wichtig, vor dem Pipettieren von Medien in die Bodenkammer zu überprüfen, ob sich keine Blasen in der Pipettenspitze oder Luft am Ende der Pipettenspitze befinden. Darüber hinaus kann die Medienverdunstung im Kanal zu einem Spalt zwischen der Medienoberfläche und der Anschlussoberseite führen. Ein kleines Medienvolumen kann in einen Anschluss pipettiert werden, bis das Medium die Oberfläche des gegenüberliegenden Anschlusses erreicht, woraufhin das Medium in diesem gegenüberliegenden Anschluss ausgetauscht werden kann. Während hECSR- und E6 + 10% FBS-Medien nicht im Wasserbad erwärmt werden sollten, können andere Medien vorgewärmt werden, um die Blasenbildung zu reduzieren. Wenn eine Blase in die untere Kammer gelangt, kann sie entfernt werden, indem schnell 100 μl durch den Kanal pipettiert werden. Diese Methode kann jedoch zu einer Kontamination zwischen den Kammern oder zu Medien führen, die über die Oberfläche des Geräts verschüttet werden. Es kann auch Zellschichten zerstören. Alternativ kann das Medium zuerst aus dem Kanal entnommen und dann mit einem Volumen von 50 μL wieder eingeführt werden. Wenn Sie das Medium zuerst entfernen, kann dies jedoch zu einer stärkeren Blasenbildung im Kanal führen. Wenn sich eine Blase nicht direkt unter dem Membranbereich befindet, kann sie ohne Auswirkungen auf die Zellkultur im Kanal belassen werden.

Die Anheftung und das Wachstum von Perizyten, wie in Abbildung 2 gezeigt, können eine Herausforderung darstellen. Die Verwendung einer optimierten Aussaatdichte ist essentiell für die Bildung einer Schicht mit einem physiologisch relevanten Perizyten-Endothelzell-Verhältnis. Da die Perizyten empfindlich auf Scherung reagieren, sollte der gesamte Medienaustausch im Kanal sehr langsam erfolgen, um die Zellen zu schützen. Bei BPLC-Kulturen kann eine verbesserte Anhaftung erreicht werden, indem die Bodenkammer mit 800 μg/ml Kollagen Typ IV oder 100 μg/ml Fibronektin beschichtet wird.

Die Immunzytochemie in den hier beschriebenen Geräten ermöglicht eine qualitative Analyse der Zellgesundheit und -funktion. Methoden zur Färbung in Gewebekulturplatten oder anderen Plattformen sollten direkt in die Plattform übersetzbar sein. Bei Zellkulturen, die sich nur in der oberen Kammer befinden, kann PBS nach der Fixierung in die untere Kammer gegeben und für die restlichen Schritte belassen werden, wobei die Blockierung und Färbung nur in der oberen Kammer erfolgt. Dies minimiert das Risiko, dass die Membranen brechen oder Blasen in die Bodenkammer gelangen. Für die Co-Kultur-Färbung empfehlen wir, in allen Schritten beide Kammern zu verwenden. Es ist wichtig zu beachten, dass sich die Viskosität des Fixiermittels und PBS von der des Mediums unterscheidet. Daher kann es einfacher sein, Blasen in die untere Kammer zu geben, und es sollte besonders darauf geachtet werden, die Pipettenspitzen am Ende der Spitze auf Luft zu überprüfen, bevor sie in die untere Kammer pipettiert werden.

Das für den niedermolekularen Permeabilitätsassay beschriebene Protokoll ermöglicht eine funktionelle und quantitative Bewertung der Barrierefunktion der im μSiM-Gerät kultivierten Endothelzellen. Ein Problem, das bei diesem Assay auftreten kann, ist das Ziehen von Luftblasen in die Pipette während der Probenentnahme aus dem unteren Kanal in Protokollschritt 4.1.7.4. Um dieses Problem zu vermeiden, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Spitze vor Beginn der Probenentnahme im Anschluss versiegelt ist und die Probe nicht zu schnell entnommen werden sollte. Wenn das Problem dadurch nicht behoben wird, ist die Größe der verwendeten Spitzen möglicherweise zu klein oder zu groß, um in die Anschlüsse zu passen. Verwenden Sie die Tipps, die in der Materialtabelle aufgeführt sind. Werden trotz einer gesund aussehenden konfluenten Monolage unerwartet hohe Permeabilitätswerte gemessen, muss die Integrität der Monoschicht während der Probenentnahme auf Störungen überprüft werden. Wir empfehlen, die Monoschicht immer sofort nach der Probenentnahme unter dem Mikroskop zu überprüfen. Scheint die Monoschicht noch intakt und gesund zu sein, kann die Probe fixiert und biologische Marker der Barrierefunktion bestimmt werden, zum Beispiel durch Immunfärbung der Verbindungsproteine. Umgekehrt ist bei der Messung unerwartet niedriger Permeabilitätswerte darauf zu achten, dass 50 μl Medien ohne Luftblasen aus dem Bodenkanal entnommen werden. Wenn Medium aus der Probenahmeöffnung austritt, sobald die Reservoirspitze platziert wird, muss dieses Medium aufgefangen werden, bevor die Pipette in die Probenahmeöffnung eingesetzt wird, da der größte Teil des fluoreszierenden kleinen Moleküls in dem anfänglichen 10-μl-Volumen vorhanden ist, das aus dem unteren Kanal entnommen wird. Das Zeichnen von Kreisen um die Anschlüsse mit einem hydrophoben Stift oder das Anbringen eines hydrophoben Bandes mit einem Loch um den Anschluss verhindert, dass sich passiv gepumpte Medien ausbreiten. Wenn während der Probenahme Blasen entfernt werden oder die volle 50-μl-Probe nicht entnommen wird, darf die Probe nicht verwendet werden. Alternativ kann das genaue Volumen ermittelt und in der Permeabilitätsberechnung verwendet werden; Dies sollte jedoch nur erfolgen, wenn das entfernte Volumen ≥40 μl beträgt, was einer Farbstoffrückgewinnung von ~98-99% entspricht34.

Disclosures

J.L.M. ist Mitbegründer von SiMPore und hält eine Kapitalbeteiligung an dem Unternehmen. SiMPore vermarktet ultradünne siliziumbasierte Technologien, einschließlich der in dieser Studie verwendeten Membranen.

Acknowledgments

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. und L.W. wurden durch den NIH-Zuschuss R33 HL154249 finanziert. J.L.M. wurde durch R44 GM137651 finanziert. M.M. wurde durch den Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester, gefördert. M.T. wurde von RF1 AG079138 finanziert. K.C. wurde von der International Foundation for Ethical Research finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
CD31 Polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific PA5-32321
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 Thermo Fisher Scientific 35-2500
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11011
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 Millipore  MAB2029
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 Thermo Fisher Scientific 33-1500
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 Cell Signaling Technology 3169
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 R&D Systems MAB9381
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal Thermo Fisher Scientific 40-2200
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
100% Methanol VWR 101443-718 Can be substituted with similar products
16% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Can be substituted with similar products
Accutase Thermo Fisher Scientific A1110501
Acetic acid Sigma-Aldrich 695092
B27 supplement Thermo Fischer Scientific 17504044
bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen IV from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL Can be substituted with similar products
DMEM/Ham’s F12 Thermo Fisher Scientific 11320033
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Essential 6 medium Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal bovine serum (FBS) Peak Serum PS-FB1
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Fibronectin human protein, plasma ThermoFisher Scientific 33016015 Can be substituted with similar products
hESFM Thermo Fisher Scientific 11111044
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich 861502
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 500627 Can be substituted with similar products
PBS without calcium, magnesium Cytiva SH30256.01 Can be substituted with similar products
Pericyte Medium ScienCell 1201 Use complete kit (includes supplements)
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL ScienCell 0413
Triton X-100 JT Baker X198-05 Can be substituted with similar products
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen™ 10977015 Can be substituted with similar products
Experimental models: Cell lines
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line Sigma-Aldrich SCC066
Human brain vascular pericytes ScienCell 1200
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells WiCell RRID:CVCL_C437
Glassware and Plasticware
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid Falcon 353025
Clamps VWR MFLX06832-10
Corning tissue culture plates (6-well) Corning 3506
Flat 96-well non-binding microplates Greiner Bio-One 655900
Microscope Slide Device Holder  SiMPore USIM-SB Dimensions compatible with micropscope slide holders
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339653 Tube caps can be filled with water for cell culture
P20-200 pipette tips VWR 76322-516 Alternate brands may not seal as effectively into ports
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) CoStar 3401
Instruments
10X Objective (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD00105 Air; WD: 4 mm; NA 0.45
10X Objective (For Nikon) Nikon Instruments Inc. MRP40102 Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25
40X Objective (LWD) (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD77410 Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15
Andor Spinning Disc Confocal microscope Oxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope Nikon Instruments Inc. Can be substituted with similar products
TECAN Infinite M200 TECAN Can be substituted with similar products
Other
Advanced PAP Pen Millipore Sigma Z672548 2 mm tip is recommended
Assembly kit with fixtures SiMPore USIM-JIGSET Including fixure A1, A2, B1, and B2
Camera Adapter for Microscopes AmScope CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR Φ23.2 - Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera Canon EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 Can be substituted with similar products
Cell strainer, 40 µm Millipore Sigma (Corning) CLS431750
Component 1 SiMPore USIM-C1
Component 2 SiMPore USIM-C2
Membrane chips SiMPore NPSN100-1L Other chips formats are available
SMD handling tweezer double angle Techni-Tool 758TW003 "Chip Tweezers"
Stainless steel precision type GG tweezer Techni-Tool 758TW534 "Straight Tweezers"
Software
Fiji ImageJ For image processing
Fusion Oxford Instruments, Andor Instructions for version 2.3.0.44
i-control TECAN Instructions for version 2.0
Imaris Oxford Instruments For image processing. Instructions for version 9.9.0

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References

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Bioengineering Ausgabe 203
Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke
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McCloskey, M. C., Kasap, P.,… More

McCloskey, M. C., Kasap, P., Trempel, M., Widom, L. P., Kuebel, J., Chen, K., Gaborski, T. R., Engelhardt, B., McGrath, J. L. Use of the MicroSiM (µSiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (203), e65258, doi:10.3791/65258 (2024).

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