Summary
이 보고서는 혈액-뇌 장벽 모델 구축을 위한 μSiM 플랫폼의 조립, 세포 배양 및 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
microSiM(μSiM)은 혈액-뇌 장벽(BBB)을 모델링하기 위한 막 기반 배양 플랫폼입니다. 기존의 멤브레인 기반 플랫폼과 달리 μSiM 은 실험자에게 살아있는 세포 이미징, '혈액'과 '뇌' 챔버 사이의 방해받지 않는 파라크린 신호 전달, 멤브레인의 추출/재장착 없이 면역형광을 직접 이미지화할 수 있는 기능을 포함한 새로운 기능을 제공합니다. 여기서는 초박형 나노다공성 질화규소 멤브레인을 사용하여 BBB의 단일 배양(내피 세포) 및 공동 배양(내피 세포 및 주위 세포) 모델을 구축하기 위한 플랫폼의 기본 사용을 보여줍니다. 당사는 1차 세포 배양 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 배양 모두와의 호환성을 입증합니다. 자사는 면역형광 염색을 통한 BBB 모델의 정성 분석 방법을 제공하고 저분자 투과성 분석에서 장벽 기능의 정량적 평가를 위한 μSiM 의 사용을 시연합니다. 제공된 방법을 통해 사용자는 플랫폼에서 장벽 모델을 설정할 수 있으며, 인체 조직 연구를 위한 조직 칩 기술의 사용을 발전시킬 수 있습니다.
Introduction
살아있는 조직은 장벽을 만들고 유지하며 한 구획에서 다른 구획으로 운반되는 세포와 분자를 조절하는 특수 세포에 의해 구획화됩니다. 장벽 기능의 부적절한 조절은 급성 질환과 만성 질환의 원인이 될 수 있습니다. 혈액뇌장벽(BBB)은 인체에서 가장 제한적인 조직 장벽이다1. BBB의 기능 장애는 알츠하이머병2, 파킨슨병3,4, 다발성경화증5,6을 포함한 광범위한 중추신경계(CNS) 질환의 기초가 됩니다. BBB의 손상은 패혈증7, COVID-198 및 수술 후 섬망9과 같은 급성 장애의 결과로서 장기적인 인지 장애와도 관련이 있다. 뇌 질환을 치료할 수 있는 잠재력을 가진 약물의 개발은 뇌의 표적에 생체 활성 분자를 전달하기 위해 의도적으로 BBB를 뚫어야 하는 과제 때문에 좌절할 정도로 어려웠다(10). 이러한 이유로, BBB 기능을 시험관 내에서 연구하는 방법은 중추신경계 질환의 이해와 치료에 가장 중요합니다.
시험관 내에서 장벽 기능을 측정하는 기본 방법은 반투과성 막에 단층 또는 공동 배양을 설정하고 소분자 확산 또는 작은 전류에 대해 세포가 부여하는 저항을 측정하는 것을 포함합니다11,12,13,14. 미세생리학적 시스템(MPS)의 출현으로 BBB를 3D15,16로 모델링하기 위한 선택의 폭이 넓어졌지만, 시스템 형상의 다양성으로 인해 MPS 간 투과성 측정 또는 확립된 문헌 값과 비교하기가 어렵습니다. 신뢰할 수 있는 기준값의 확립은 뇌혈관 내피세포에 의한 광범위한 장벽 조절로 인해 체외 투과성 값이 매우 면밀히 조사되는 BBB 연구에서 특히 중요합니다12,17,18. 이러한 이유로 2D 멤브레인에 설정된 단층 전반에 걸친 투과성 측정은 향후 몇 년 동안 BBB 연구의 필수 요소로 남을 것입니다. 이는 상피 장벽을 포함한 다른 조직 장벽에 대해서도 마찬가지이며, 여기서 기준선 투과성의 절대값은 시험관 내 모델 19,20,21을 검증하고 비교하기 위해 사용된다.
BBB 연구 커뮤니티를 위한 가치 있는 새로운 도구를 확립하는 것을 목표로 우리는 지난 5년 동안 장벽 조직 모델링에 사용하기 위한 si, licon membrane(μSiM) 플랫폼을 특징으로 하는 마이크로장치를 22개 및 고급23,24,25,26개로 도입했습니다. 플랫폼의 활성화 기능은 수억 개의 나노 기공(27,28) 또는 나노 기공과 미세 기공(29)의 혼합을 갖는 초박형(<100nm 두께) 멤브레인이다. 독립형 멤브레인 칩은 초박형 구조(30)를 안정화하고 장치 조립을 위해 핀셋으로 처리할 수 있도록 하는 300μm 실리콘 '칩' 상에서 생산됩니다. 그들의 초박형 특성으로 인해, 멤브레인은 상업용 멤브레인 배양 장치(31,32)에 사용되는 종래의 트랙-에칭된 멤브레인보다 2배 더 높은 투과성을 갖는다. 실제로, 이것은 nanopores (<60 nm) 보다는 더 작은 분자의 유포에 막의 방해가 무시할 수 있다33이다는 것을 의미한다. 따라서, 세포 장벽의 경우, 세포와 세포가 증착하는 매트릭스만이 막(34)에 의해 분리된 정점으로부터 기저부로의 소분자 수송 속도를 결정할 것이다. 장치 설계와 멤브레인의 초박형 특성은 광학 현미경 검사에 많은 이점을 제공합니다. 여기에는 1) 위상차 또는 명시야 이미징을 사용하여 살아있는 배양을 추적할 수 있는 기능, 2) 멤브레인을 추출하여 커버 유리로 옮길 필요 없이 in situ 형광 염색 및 이미징 기능, 3) 멤브레인이 컨포칼 '슬라이스'보다 얇기 때문에 직접 공동 배양이 6-10μm 두께의 트랙 에칭 멤브레인으로 달성할 수 있는 것보다 세포 유형 간에 더 자연스러운 간격을 갖는다는 사실이 포함됩니다.
가장 최근에는 신속한 조립(34) 및 사용자 정의(35,36)를 용이하게 하기 위해 플랫폼을 모듈식 형식으로 발전시켰습니다. 우리는 모듈식 형식을 활용하여 생명 공학과 협업하는 뇌 장벽 실험실 간에 장치 구성 요소를 배포했습니다. 그런 다음 장치 조립, 단일 배양 및 공동 배양, 면역형광 염색 및 저분자 투과성을 위한 프로토콜을 공동으로 개발했으며 이러한 방법이 실험실 간에 재현 가능하다는 것을 보여주었습니다. 또한 이러한 프로토콜을 사용하여 모듈식 플랫폼이 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)에서 뇌 미세혈관유사 내피세포(BMEC)를 생성하기 위해 확장 내피 배양법(EECM)을 사용하여 개발된 검증된 BBB를 지원한다는 것을 보여주었습니다37. 현재 보고서의 목적은 이러한 방법을 더 자세히 검토하고 함께 제공되는 비디오의 도움으로 BBB 커뮤니티에서 플랫폼의 광범위한 채택을 촉진하는 것입니다.
Protocol
1. μSiM 소자 조립
참고: 이 방법은 장치 조립에 대해 설명합니다. 멤브레인 칩에는 트렌치 측면과 평평한 측면이 있으며 트렌치 업 또는 트렌치 다운으로 조립할 수 있습니다. 트렌치다운 장치는 세포 배양에 가장 일반적으로 사용됩니다.
- 멸균 환경(예: 생물 안전 후드)에서 조립 고정 장치, 구성 요소, 멤브레인 칩 및 핀셋을 포함하여 조립을 위한 모든 재료를 준비합니다.
- 칩 핀셋을 사용하여 멤브레인 칩을 고정 장치 A1의 중앙에 놓습니다. 칩의 평평한 표면은 아래를 향하고 트렌치 다운 장치의 경우 트렌치 영역이 위를 향하고 트렌치 업 장치의 경우 그 반대의 경우도 마찬가지입니다 .
알림: 다음 조립 단계는 트렌치 다운 장치를 ex로 사용하여 설명됩니다.amp상단 챔버에서 평평한 성장 영역을 허용하는 le로. - 칩에 성분 1을 접합합니다. 먼저 직선 핀셋을 사용하여 부품 1의 양쪽에 있는 파란색 보호층을 벗겨내고 상단 챔버가 아래로 향하도록 고정 장치 A1에 놓습니다. 감압 접착제(PSA)가 칩에 닿을 때까지 부품 1을 부드럽게 누릅니다.
- 픽스처 A2를 픽스처 A1에 놓고 칩과 구성 요소가 단단히 맞도록 다른 모서리에 강한 압력을 가합니다.
알림: PSA 레이어를 제거하지 마십시오. 파란색 보호층에 비해 투명하고 뻣뻣한 층입니다. - 칩으로 성분 2를 성분 1에 접합합니다. 먼저 성분 2의 한쪽 모서리를 스트레이트 핀셋으로 잡고 시트에서 벗겨 성분 2를 준비합니다. 그런 다음 성분 2의 비 PSA "삼각형" 영역을 잡고 성분 2의 두껍고 투명한 보호층과 파란색 층을 함께 제거하여 PSA 표면을 노출시킵니다. 구성 요소 2를 PSA 면이 위로 향하게 하여 고정 장치 B1에 놓습니다.
- 멤브레인 칩이 있는 구성 요소 1을 상단 챔버가 위를 향하도록 고정 장치 B1에 놓습니다.
- 고정구 B2를 부품 1에 놓고 고정구 B2의 다른 모서리에 강한 압력을 가합니다.
- 조립된 장치를 고정 장치에서 꺼내고 직선 핀셋을 사용하여 장치 밑면의 기포를 누르고 채널 x'의 가장자리를 밀봉하여 멤브레인 영역과의 접촉을 피합니다. 세포 배양에 사용하기 전에 새로 조립된 장치를 20분 동안 자외선(UV) 멸균합니다.
2. 세포 배양
참고: 이 방법은 플랫폼의 기본 및 hiPSC 파생 문화권에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 장치의 상부 챔버에서 내피 세포 단일배양 및 하부 챔버의 주위 세포 및 트렌치-다운 조립 장치의 상부 챔버에서 내피 세포와 내피 세포를 공동 배양하는 방법을 설명합니다. 챔버 치수 및 부피는 표 1을 참조하십시오. 가장 일반적인 형식입니다. 그러나 사용자 요구에 따라 다른 세포 배양 레이아웃을 사용할 수 있습니다.
- 세포 배양 챔버 준비
- 섹션 1에 자세히 설명된 프로토콜에 따라 장치를 조립합니다.
- 장치를 멸균 호스 cl에 놓으십시오.amps. 세포 배양 전에 클램프를 ≥20분 동안 에탄올에 담가 멸균합니다. 재사용을 위해 각 실험 후에 다시 멸균하십시오.
- 큰 멸균 페트리 접시에서 장치를 배양합니다. 습도를 높이려면 작은 페트리 접시 또는 멸균수를 채운 50mL 원뿔형 튜브 뚜껑을 추가합니다.
- 장치의 상단 챔버를 100μL의 멸균수로 두 번 세척합니다. 하단 챔버 세포 배양의 경우 하단 챔버를 20μL의 멸균수로 세척합니다.
- hCMEC/D3 세포주(BBB) 단일 배양
- 섹션 2.1에 따라 세포 배양 챔버를 준비합니다.
- 인산염 완충 식염수(PBS)에 혼합된 25μg/cm2의 콜라겐 I과 5μg/cm2의 인간 피브로넥틴으로 상단 챔버를 코팅합니다. 37 °C에서 1-2 시간 동안 또는 4 °C에서 밤새 그대로 두십시오.
- 코팅 용액을 제거하고 100μL의 예열된 성장 인자 고갈 내피 배지(분석 배지)를 상단 챔버에 추가하고 20μL를 하단 챔버에 추가합니다. 분석 배지를 준비하려면 내피 기저 배지 100mL + 인간 섬유아세포 성장 인자 400μL + 하이드로코르티손 40μL + 겐타마이신 설페이트 100μL + 소 태아 혈청 2mL를 혼합합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따른 통로 hCMEC/D3 세포; 37°C 인큐베이터에서 3-5분 동안 세포를 트립신화한 다음 미리 데워진 내피 배지를 추가하여 트립신화를 중단합니다. 셀 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 200×g의 원심분리기를 5분 동안 사용합니다. 분석 배지에 세포 펠릿을 재현탁시키고 40,000-60,000 cells/cm2의 밀도로 상단 챔버에 세포를 파종합니다. 세포 접착을 촉진하기 위해 37°C에서 5% 이산화탄소(CO 2)로2-4시간 동안 장치를 배양합니다. 예를 들어, 0.37 cm 2 칩에서 40,000 cells/cm2를 달성하려면 150,000 cells/mL 농도의 세포 용액 100 μL를 상단 챔버에 추가합니다.
참고: Hudecz et al.38에 따라 hCMEC/D3를 배양 및 통과시키며, 세포 유지를 위해 내피 성장 배지-2(EGM-2)의 수정된 제형을 사용하고 분석을 위해 하위 배양 후 성장 인자 감소 "분석 배지"를 사용합니다. 다른 배지 제형은 장치와 호환되어야 하지만, 사용자가 hCMEC/D3 생존에 문제가 있는 경우 Hudecz et al.38 의 배지 제형을 권장합니다. - 세포 접착을 위해 2-4시간 후, 두 챔버에서 신선한 분석 배지로 교환하여 죽은 세포나 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
- 장치를 37 ° C에서 5 % CO2 로 유지하고 실험 할 때까지 2-3 일마다 두 챔버의 분석 배지를 교환합니다. 분석은 일반적으로 배양 2주 후에 수행됩니다.
- hiPSC 유래 EECM-BMEC 유사 세포 단일배양
- 섹션 2.1에 따라 세포 배양 챔버를 준비합니다.
- 0.5mg/mL 아세트산 5mL를 콜라겐 IV 5mg에 첨가하여 1mg/mL 용액을 만들어 인간 태반 용액에서 콜라겐 IV를 준비합니다. 용액을 4°C에서 ≥4시간 동안 그대로 두어 완전히 재구성합니다. 용액은 4°C에서 2주 동안 안정적입니다.
- 100μL의 4:1:5 비율로 콜라겐 IV, 소 피브로넥틴, 멸균수를 상부 챔버에 코팅합니다. 37°C에서 2-4시간 동안 코팅합니다.
- 코팅 용액을 제거하고 상부 챔버에 100μL의 실온 hECSR을 추가하고 하부 챔버에 20μL를 추가합니다.
- Nishihara et al.37에 따른 통로 EECM-BMEC-유사 세포; 세포 분리 효소 혼합물을 세포에 추가하고 37°C 인큐베이터로 5-8분 동안 옮깁니다. 세포 용액을 피펫화하여 단일화하고 원심분리 튜브에서 내피 배지 부피의 4배로 추가합니다. 실온에서 200 × g 에서 5 분 동안 원심 분리기; hECSR에 세포를 재현탁시키고 40,000 cells/cm2의 밀도로 상단 챔버에 파종합니다. 세포 접착을 촉진하기 위해 37 ° C에서 5 % CO 2 로2-4 시간 동안 장치를 배양합니다. 예를 들어, 40,000 cells/cm2를 달성하려면 150,000 cells/mL에서 100μL의 세포 용액을 추가합니다.
- 세포 접착을 위해 2-4시간 후, 두 챔버에서 신선한 hECSR로 교환하여 죽은 세포나 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
- 장치를 37 ° C에서 5 % CO 2 로 유지하고 실험 할 때까지1-2 일마다 두 챔버에서 hECSR을 교환합니다. 분석은 일반적으로 배양 6일째에 수행됩니다.
- hCMEC/D3 및 원발성 인간 뇌혈관 주위세포(HBVP) 공동 배양
- 장치를 조립하기 전에 PBS에 혼합된 2μg/cm2 의 폴리-L-라이신(PLL)으로 멤브레인 칩을 코팅합니다. 50-80 μL PLL을 액적에 담아 최종 장치 어셈블리에서 아래를 향하게 되는 면에만 도포합니다. 37 °C에서 1-2 시간 또는 4 °C에서 하룻밤 안에 코팅 공정을 완료하십시오.
- 코팅 용액을 제거합니다. 멤브레인 칩을 멸균 초순수로 세척하고 건조시킵니다.
- PLL 코팅된 면이 아래를 향하도록 위의 섹션 1에 자세히 설명된 프로토콜에 따라 장치를 조립하고 섹션 2.1에 따라 세포 배양 챔버를 준비합니다.
- 섹션 2.2.2에 따라 상단 챔버를 코팅합니다.
- 50 μL의 예열된 pericyte 배지를 상단 챔버에 추가하고 20 μL를 하부 채널에 추가합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따른 통과 HBVP; 37°C 인큐베이터에서 세포를 3-5분 동안 트립신화한 다음 예열된 주위 세포 배지를 추가하여 트립신화를 중지합니다. 셀 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 200× g 의 속도로 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 주위 세포 배지에 재현탁시키고 14,000-25,000 cells/cm2의 밀도로 하단 챔버에 세포를 파종합니다. 장치를 뒤집되 가스 교환을 용이하게 하기 위해 상단 챔버와 공기 인터페이스를 유지합니다.
알림: 반전 중에 필요한 공기 인터페이스는 호스 cl 내부에 장치를 배치한 후 뒤집음으로써 얻을 수 있습니다.amps 뒤집기 전에 모든 모서리를 아래로 누르거나 상단 챔버가 막히지 않도록 충분히 멀리 떨어진 아크릴 또는 실리콘의 평행 스트립에 장치를 거꾸로 배치하여 얻을 수 있습니다. 시드 밀도는 각 사용자에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다. 14,000 cells/cm2를 달성하려면 ~590,000 cells/mL에서 20μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 기포를 피하기 위해 20μL가 하단 챔버에 피펫팅되지만 밀도는 10μL의 하단 챔버 부피를 사용하여 계산됩니다. - 세포 접착을 용이하게 하기 위해 거꾸로 된 위치에서 2-4시간 동안 5% CO2 로 37°C에서 세포를 배양합니다.
- 세포 접착을 위해 2-4시간 후, 장치를 똑바로 뒤집고 두 챔버의 신선한 주위 세포 배지로 교환하여 죽거나 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
- pericyte seeding 후, 2.2.4-2.2.5 단계에 따라 상단 챔버에 hCMEC/D3s를 파종합니다. 두 챔버를 모두 분석 배지로 전환합니다.
- 장치를 37 % CO 2 로 5 ° C로 유지하고 실험 할 때까지1-2 일마다 두 챔버에서 분석 배지를 교환합니다. 일차 세포 공동 배양은 일반적으로 분석 전 6-8일 동안 유지됩니다.
참고: HBVP 단일배양을 hCMEC/D3 단일배양 또는 hCMEC/D3 및 HBVP 병배양과 비교하는 경우, HBVP를 파종한 후 2-3일 후에 주위 세포 배지를 분석 배지와 교환하십시오.
- hiPSC 유래 EECM-BMEC 유사 세포 및 뇌주위 유사 세포(BPLC) 공동 배양
- 섹션 2.1에 따라 세포 배양 챔버를 준비하고 단계 2.3.2-2.3.3에 따라 상단 챔버를 코팅합니다.
- 코팅 용액을 제거하고 상부 챔버에 실온 Essential 6 Medium + 10% Fetal Bovine Serum(E6 + 10% FBS) 50μL를 추가합니다.
- Gastfriend et al.39에 따른 BPLC 통과; 세포 분리 효소 혼합물을 세포에 추가하고 세포의 ~90%가 둥글어질 때까지 37°C 인큐베이터로 5-15분 동안 옮깁니다. 세포 용액을 피펫화하여 50mL 원심분리 튜브에 DMEM/F12 부피의 4배를 추가하고 40μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 여과하고 완전히 단일화합니다. 15mL 원심분리 튜브로 옮기고, 실온에서 5분 동안 200× g 으로 원심분리하고, 세포 펠릿을 E6 + 10% FBS에 재현탁시키고, 14,000-25,000 cells/cm2의 밀도로 하단 챔버에 세포를 시드합니다. 장치를 뒤집되 가스 교환을 용이하게 하기 위해 상단 챔버와의 공기 인터페이스를 유지합니다.
알림: 반전 중에 필요한 공기 인터페이스는 호스 cl 내부에 장치를 배치한 후 뒤집음으로써 얻을 수 있습니다.amps 뒤집기 전에 모든 모서리를 아래로 누르거나 상단 챔버가 막히지 않도록 충분히 멀리 떨어진 아크릴 또는 실리콘의 평행 스트립에 장치를 거꾸로 놓습니다. 시드 밀도는 각 사용자에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다. 14,000 cells/cm2를 달성하려면 ~590,000 cells/mL에서 20μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 기포를 피하기 위해 20μL가 하단 챔버에 피펫팅되지만 밀도는 10μL의 하단 챔버 부피를 사용하여 계산됩니다. - 세포 접착을 용이하게 하기 위해 거꾸로 된 위치에서 2-4시간 동안 5% CO2 로 37°C에서 세포를 배양합니다.
- 세포 접착을 위해 2-4시간 후 장치를 똑바로 뒤집고 두 챔버에서 신선한 E6 + 10% FBS로 교환하여 죽거나 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
- pericyte seeding 1일 후, 2.3.5-2.3.6 단계에 따라 상단 챔버에 EECM-BMEC 유사 세포를 파종합니다. 두 챔버를 모두 hECSR로 전환합니다.
- 장치를 37 ° C에서 5 % CO 2 로 유지하고 실험 할 때까지1-2 일마다 두 챔버에서 분석 배지를 교환합니다. hiPSC 유래 공동 배양은 일반적으로 분석 전에 BPLC의 경우 7일, EECM-BMEC 유사 세포의 경우 6일 동안 유지됩니다.
참고: BPLC 단일 배양을 EECM-BMEC 단일 배양 또는 EECM-BMEC 및 BPLC 공동 배양과 비교하는 경우 BPLC 파종 후 1일 후에 E6 + 10% FBS를 hECSR로 교환합니다.
3. 면역세포화학
참고: 이 방법은 멤브레인의 상단 및/또는 하단에서 배양된 세포의 면역세포화학적 염색 및 이미징을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 실험의 목적은 부착 단백질 및 밀착 접합 단백질, 세포 식별 단백질과 같이 BBB에서 발견되어야 하는 주요 단백질의 존재와 위치를 결정하는 것입니다. 대체 염색 방법과 라이브 염색 방법도 플랫폼과 호환됩니다.
- 장치에 고정 및 얼룩
- 1차 항체를 얼음 위에 올려 놓아 해동합니다.
- 실온에서 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비하거나(예: PBS 부피의 3배에 16% PFA를 희석) -20°C에서 100% 메탄올을 식힙니다.
- 표 2에 따라 적절한 차단 솔루션을 만듭니다. 얼음 위에 보관하십시오.
참고: Triton X-100을 완전히 용해시키려면 용액을 소용돌이치게 해야 할 수 있습니다. - 20μL의 고정제(예: PFA 또는 메탄올)를 하단 챔버에 피펫팅하고 상단 챔버에 50μL를 피펫팅하여 셀을 고정합니다. 실온에서 10분(PFA) 또는 2분(메탄올) 동안 장치를 배양합니다.
- 하단 챔버를 통해 20μL의 PBS를 피펫팅하고 상단 챔버에 100μL를 피펫팅하여 3 x 5분 동안 세척합니다.
- 차단 용액 20μL를 하단 챔버에 추가하고 차단 용액 50μL를 상단 챔버에 추가하여 실온에서 30분 동안 차단합니다. 하단 챔버에 기포가 있는지 확인하십시오.
- 표 2에 따라 차단 용액에 항체를 희석하여 1차 항체 용액을 제조한다. 얼음 위에 보관하십시오.
- 1차 항체 용액 20μL를 하단 챔버에 첨가하고 상단 챔버의 부피를 1차 항체 용액 50μL로 교체하여 1차 항체로 염색합니다. 하단 챔버에 기포가 있는지 확인하십시오. 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 하단 챔버를 통해 20μL의 PBS를 피펫팅하고 상단 챔버에 100μL를 피펫팅하여 3 x 5분 동안 세척합니다.
- 상기 표 2에 따라 상기 차단용액에 항체(들)를 희석하여 2차 항체 용액을 제조한다. 빛으로부터 보호된 얼음 위에 보관하십시오.
- 20μL의 2차 항체 용액을 하부 챔버에 첨가하고 상단 챔버의 부피를 50μL의 2차 항체 용액으로 교체하여 2차 항체로 염색합니다. 하단 챔버에 기포가 있는지 확인하십시오. 빛으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 하단 챔버를 통해 20μL의 PBS를 피펫팅하고 상단 챔버에 100μL를 피펫팅하여 3 x 5분 동안 세척합니다.
- 핵 얼룩 용액을 만드십시오. PBS에서 희석 Hoechst 1:10,000. 20μL의 핵 염색 용액을 하단 챔버에 추가하고 상단 챔버의 부피를 50μL의 핵 염색 용액으로 교체합니다. 하단 챔버에 기포가 있는지 확인하십시오. 빛으로부터 보호된 실온에서 3분 동안 배양합니다.
- 하단 챔버에 20μL의 PBS를 추가하고 상단 챔버의 부피를 100μL의 PBS로 교체하여 얼룩을 제거합니다. 장치를 즉시 이미징하거나 페트리 접시를 파라필름으로 싸서 이미징할 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관하십시오.
- 컨포칼 이미징
참고: 이 섹션에서는 긴 작동 거리(LWD) 40x 대물렌즈(물, WD 590-610, 개구 1.15)를 사용하는 도립 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 장치를 이미징하는 방법에 대해 설명합니다.amp르. working distances 및 lens 호환성에 대해서는 McCloskey et al.34의 보충 자료를 참조하십시오. 전체 멤브레인 영역의 이미지도 10x 대물렌즈를 사용하여 촬영하여 40x 이미지가 전체 필드를 대표하도록 합니다. 이들은 일반적으로 광시야에서 촬영됩니다.- 현미경을 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다.
- Confocal Imaging Mode를 사용하여 2차 항체와 핵 염색의 특성에 따라 채널을 설정합니다. 레이저 출력과 노출 시간을 최적화하여 신호가 배경 위에 있도록 하고 이미징 아티팩트를 줄입니다.
- Hoechst 핵 염색의 경우 여기 405, 방출 450/50 대역 통과(BP), 500ms 노출 시간, 50% 레이저 출력을 사용하십시오. Alexa Fluor(AF) 488에 접합된 2차 항체를 사용하는 라벨의 경우 여기 488, 방출 525/50BP, 500ms 노출 시간 및 50% 레이저 출력을 사용합니다. AF568에 접합된 2차 항체를 사용하는 라벨의 경우 여기 561, 방출 600/50BP, 500ms 노출 시간 및 100% 레이저 출력을 사용합니다.
- 장치를 현미경 슬라이드 장치 홀더에 놓고 상단 챔버가 위를 향하도록 하고 현미경 슬라이드 홀더를 사용하여 현미경에 설정합니다. Live 를 켜고 핵 얼룩의 채널을 선택합니다. 낮은 대물렌즈를 사용하여 멤브레인을 찾고 투명한 질화규소 멤브레인 영역이 중앙에 있는지 확인하여 빛이 파란색의 단단한 실리콘 영역을 통해 투과되지 않도록 합니다. 장치가 제대로 중앙에 배치되고 세포층이 발견되면 40x 대물렌즈로 전환하고 대물렌즈를 적시고 핵 염색을 가이드로 사용하여 막 영역에 초점을 맞춥니다.
- z-stack 이미징을 켜고 스캔 모드를 시작/종료로 설정합니다. 걸음 수 또는 개수를 설정합니다. 현미경의 거친 조정 손잡이를 사용하여 핵 염색을 가이드로 사용하여 스캔 시작을 내피 세포층 상단으로 설정하고 핵 염색을 가이드로 사용하여 스캔 끝을 주피 세포층 하단으로 설정합니다. 모든 채널을 확인하여 모든 것이 이미징 필드에 캡처되는지 확인하십시오.
참고 : 우리는 일반적으로 ~ 0.2 μm 슬라이스 인 자동 단계를 사용합니다. - Image Name(이미지 이름)을 설정하고 Acquire(획득 )를 눌러 이미징을 시작합니다. 필요에 따라 다른 영역에서 반복합니다.
- ImageJ40 또는 Imaris를 사용하여 컨포칼 이미지를 처리합니다.
- Imaris에서 처리하려면 이미지 파일을 프로그램으로 드래그하여 엽니다. 상단 메뉴 모음에서 단면을 선택하여 x-y 평면의 2D 이미지와 x-z 및 y-z 평면의 해당 뷰를 확인합니다. 상단 메뉴 모음에서 3D 보기를 선택하여 3D 이미지를 확인합니다. 이미지를 클릭하고 드래그하여 회전합니다. 상단 메뉴 표시줄에서 스냅샷 을 선택하여 이미지를 촬영합니다.
4. 저분자 투과성의 샘플링 분석
NOTE: 이 섹션에서는 세포 배양의 장벽 특성을 정량적으로 측정하기 위한 방법론에 대해 설명합니다. 이 실험의 목적은 세포층을 통과하여 플랫폼의 바닥 챔버로 들어가는 형광 소분자의 농도를 검출하는 것입니다. 그런 다음 이러한 데이터를 사용하여 세포 투과성을 계산합니다.
- 샘플링 기법
- 섹션 1에 자세히 설명된 프로토콜에 따라 장치를 조립하고 섹션 2에 설명된 대로 원하는 세포주를 배양합니다. 시스템 투과성을 측정하기 위해 cell-free, 코팅된 제어 장치 역할을 하는 추가 장치를 포함합니다.
참고: 조건당 최소 3회의 기술 반복이 권장됩니다. 그러나 코팅된 대조군의 복제는 한 번만 필요합니다. - 샘플링 분석을 시작하기 전에 하단 챔버의 배지를 새 배지로 교체합니다. 현미경으로 각 장치에서 내피 단층의 밀도를 확인하십시오. 세포 단층의 틈은 염료가 바닥 챔버로 확산되는 데 영향을 미치기 때문에 주의하십시오.
참고: 건강한 내피 배양은 100% 융합되어야 합니다. - 형광 저분자 용액(예: 150μg/mL Lucifer Yellow, 457Da)을 세포 배양 배지에서 준비합니다. 하단 채널에서 샘플링된 형광 소분자의 농도를 계산하기 위한 참조 역할을 하는 표준 용액의 제조에 사용할 형광 소분자 용액의 초과 부피를 준비합니다.
알림: 형광 소분자 농도가 가장 높은 표준 용액으로 사용할 400μL의 초과 용액을 준비하는 것이 좋습니다. - 상단 웰의 배지를 100μL의 형광 소분자 용액으로 교체합니다.
알림: 소수성 펜을 사용하여 샘플링 포트 주위에 원을 그리고 소수성 잉크가 완전히 마를 때까지 기다렸다가 형광 염료 용액을 추가하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 4.1.7단계에서 샘플링 포트 주위의 하단 채널에서 매체가 확산되는 것을 방지할 수 있습니다. 형광 소분자 용액을 상단 웰에 엇갈리게 추가하는 것이 좋습니다.-형광 용액을 다음 장치에 추가하기 전에 2분 동안 기다리거나 3개 그룹으로 작업합니다(용액을 동시에 3개의 장치에 추가하고 5분 동안 기다렸다가 다음 3개의 장치를 추가). - 37 °C, 5 % CO2 에서 1 시간 동안 장치를 배양합니다.
- 이전 단계에서 1시간 동안 배양하는 동안 4.1.3단계에서 준비한 형광 저분자 용액에서 2배 연속 희석을 수행하여 표준 용액을 준비합니다. 각 용액 50μL를 평평한 바닥의 검은색 96웰 플레이트에 세 번에 피펫합니다. 빈 세포 배양 배지를 기본 표준 용액으로 사용합니다.
참고: 표준 용액을 준비하려면 최종 부피 200μL에서 11회 연속 희석하고 세포 배양 배지를 블랭크로 사용하여 기준선 형광 강도를 측정하는 것이 좋습니다.- 단계 4.1.3에서 제조한 과잉 형광 저분자 용액 400μL 중 200μL를 200μL의 배지를 포함하는 튜브에 옮기고, 잘 혼합하고, 이 용액 200μL를 200μL의 배지를 포함하는 다음 튜브에 옮긴다. 총 10개의 튜브가 될 때까지 1:2 희석을 반복합니다. 가장 농축된 표준 용액 50μL를 96웰 플레이트(B1, C1, D1)의 컬럼 1에 3회분으로 피펫하고, 두번째로 농축된 용액을 컬럼 2(B2, C2, D2)에 피펫하는 식입니다. 플레이트의 12번째 컬럼의 경우 50μL의 블랭크 배지를 삼중으로 피펫합니다(B12, C12, D12).
- 다음 단계를 수행하여 하단 채널에서 형광 소분자 용액을 샘플링합니다.
- 확산 과정을 중지하기 위해 웰에서 형광 소분자 용액을 제거합니다.
- 50μL의 배지가 들어 있는 팁을 상부 포트에 삽입하고 장치를 들어 올린 다음 안정화를 위해 상단을 잡고 팁을 부드럽게 배출하여 저장소 역할을 할 상부 포트에 넣습니다. 장치를 내려 놓습니다. 샘플링 중 하단 챔버에 기포가 추가되지 않도록 피펫 팁에 기포가 없거나 피펫 팁에 공기가 없는지 확인하십시오.
- 샘플링 중 세포 단층이 파괴되는 것을 방지하기 위해 50μL의 배지를 상단 웰에 추가합니다.
- 하단 채널에서 용액을 샘플링하려면 빈 피펫 팁이 있는 피펫터를 첫 번째 저항까지 밀어 넣고 팁을 샘플링 포트에 삽입한 다음 하단 채널에서 용액의 50μL를 역방향 피펫으로 빼냅니다. 표준 용액이 들어 있는 평평한 바닥의 검은색 96웰 플레이트로 직접 옮깁니다.
알림: 샘플링 직후 현미경으로 세포 단층을 확인하는 것이 좋습니다. 하단 채널에서 배지를 가져오면 때때로 상단 웰의 세포층이 붕괴되어 일관되지 않은 투과성 측정이 발생할 수 있습니다. 4.1.7의 모든 단계에서 빠르게 작업하면 이를 방지하는 데 도움이 됩니다.
- 사용된 형광 소분자에 대한 적절한 excitation 및 emission 파장 파라미터를 사용하여 microplate reader에서 형광 강도를 측정합니다. Lucifer Yellow의 경우 최적의 게인으로 428nm 여기와 536nm 방출을 사용합니다. 형광은 플레이트 상단에서 측정됩니다. 플레이트를 플레이트 리더에 추가하고, 샘플이 있는 웰(표준 곡선 포함)을 강조 표시한 다음 시작 을 선택하여 플레이트를 읽습니다.
- 섹션 1에 자세히 설명된 프로토콜에 따라 장치를 조립하고 섹션 2에 설명된 대로 원하는 세포주를 배양합니다. 시스템 투과성을 측정하기 위해 cell-free, 코팅된 제어 장치 역할을 하는 추가 장치를 포함합니다.
- 투과성 값 계산(템플릿은 보충 파일 1 참조)
- 측정된 모든 형광 강도 값에서 블랭크 매질의 평균 형광 강도 값을 뺍니다.
- 방정식 (1)을 사용하여 시스템 투과성 P s를 계산합니다.
(1)
여기서, [A]A는 하단 채널에서 수집된 형광 소분자의 농도이고, V는 샘플링되어 플레이트에 첨가된 부피(0.050mL)이고, [A]L 은 상단 웰에 첨가된 형광 소분자의 농도(예: 0.15mg/mL)이고, t는 배양 시간(원하는 단위에 따라 s 또는 min)이고, S는 멤브레인 표면적(0.014cm2)입니다.- 형광 강도 출력과 표준 용액의 알려진 농도에서 표준 곡선을 플로팅하여 얻은 방정식을 사용하여 [A]A 를 계산합니다. 실험 샘플의 형광 강도 값(y)을 방정식에 삽입하여 농도(x)를 계산합니다.
참고: 표준 곡선에서 선형인 부분을 사용합니다. 멤브레인 면적은 로트 번호에 따라 달라질 수 있고 코팅된 대조군과 다를 경우 계산된 투과성 값에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 현미경으로 촬영한 멤브레인 이미지에서 멤브레인 표면적을 측정하는 것이 좋습니다.
- 형광 강도 출력과 표준 용액의 알려진 농도에서 표준 곡선을 플로팅하여 얻은 방정식을 사용하여 [A]A 를 계산합니다. 실험 샘플의 형광 강도 값(y)을 방정식에 삽입하여 농도(x)를 계산합니다.
- 방정식 (2)를 사용하여 셀 단층 PE의 투과성을 계산합니다.
(2)
여기서,PS 는 단계 4.2.2에서 계산된 시스템 투과성이고,PC 는 무세포, 코팅된 제어 장치의 시스템 투과성 값이다.
(1)
(2)Representative Results
트렌치 다운 장치의 조립은 그림 1에 나와 있습니다. 고정 장치는 구성 요소와 멤브레인 칩의 조립을 안내합니다. 성분 1은 주로 칩에 접착하기 위한 PSA 표면과 하단 챔버에 대한 개구부 및 하단 챔버에 대한 피펫 접근을 위한 포트가 있는 아크릴입니다. 성분 2는 채널 레이어이며 그리핑을 위해 오른쪽 상단에 비접착, PSA가 없는 "삼각형"이 포함되어 있습니다. 트렌치-다운 장치는 상단 챔버에 평평한 세포 배양 성장 영역을 제공하는 반면, 트렌치업 장치는 하단 챔버에서 세포 배양을 위한 평평한 표면을 제공합니다.
hCMEC/D3 및 HBVP와 hiPSC IMR90-4 유래 EECM-BMEC 유사 세포 및 BPLC의 내피 단일배양 및 공동 배양을 수행하고 Nikon Eclipse Ts2 위상차 현미경과 10x 대물렌즈를 사용하여 위상 이미지를 획득했습니다(그림 2). 1차 세포 배양을 위한 최적의 파종 밀도(파종 후 1일 후 촬영한 이미지)와 파종되지 않은 HBVP가 표시됩니다(그림 2A). 최종 공동 배양 및 단일 배양 단계 이미지(6일 내피 세포 배양)는 구별하기 어려울 수 있으며(그림 2C), 성공적인 일차 세포 공동 배양을 확인하려면 면역형광 염색이 필요할 수 있습니다(프로토콜 섹션 3 참조). 낮은, 높은, 최적의 hiPSC 유래 BPLC 파종 밀도도 예시되어 있습니다(그림 2B). hiPSC 유래 공동 배양은 1차 공동 배양에 비해 위상차 이미징에서 더 명확하게 구별할 수 있습니다(그림 2D). 낮은 BPLC 파종은 주위 세포 커버리지 불량과 주위 세포 응집을 초래하는 반면, 과잉 파종은 주위 세포층이 막에서 벗겨지는 결과를 초래합니다. 또한, 바닥 챔버에서 배지를 너무 빨리 교환하면 이러한 세포가 전단에 매우 민감하기 때문에 주위 세포 손실이 발생할 수 있습니다. pericyte에 의한 최적의 커버리지는 내피층에 틈이 없는 BBB 모델의 경우 ~90%입니다.
면역염색된 hiPSC 유래 공동 배양의 대표적인 이미지는 그림 3 (6일 내피 세포 배양)에 나와 있습니다. IMR90-4 유래 BPLC는 pericyte marker PDGFRβ에 대해 염색하고, IMR90-4 유래 EECM-BMEC-유사 세포는 부착 접합 마커 VE-cadherin에 대해 염색했습니다. Hoechst는 핵을 염색하는 데 사용되었습니다. 이미지는 0.2μm 슬라이스의 40x LWD 대물렌즈를 사용하여 Spinning Disc 컨포칼 현미경으로 획득하고 Imaris로 처리했습니다. 두 세포층 모두 얇은 나노막이 보이지 않더라도 시각화할 수 있습니다.
결과의 실험실 간 재현성을 입증하기 위해 스위스 베른 대학교와 미국 뉴욕 로체스터 대학교의 물리적으로 멀리 떨어진 두 실험실에서 동일한 실험 조건을 사용하여 샘플링 기반 저분자 투과성 분석을 수행했습니다(그림 4)34. hiPSC IMR90-4 유래 EECM-BMEC 유사 세포를 μSiM 장치에서 2일, 4일 또는 6일 동안 배양하고 트랜스웰 필터에서 6일 동안 배양했습니다. 분석은 두 실험실 모두에서 150μg/mL Lucifer Yellow(457Da)를 사용하여 수행되었습니다. 장치에서 2일 동안 배양한 내피 세포의 투과성의 높은 변동성은 2일의 배양이 장벽 성숙에 불충분했음을 나타냅니다. 장벽 성숙 시 실험실 간에 투과성에는 4일 후부터 유의미한 차이가 없었습니다. 또한 μSiM 및 트랜스웰 필터에서 6일 동안 배양한 내피 세포의 투과성이 이전에 발표된40개와 일치함을 보여주었습니다.
그림 1: μSiM 조립 단계 . (A) 칩을 픽스처 A1에 올려 놓아 준비합니다. 최종 트렌치 다운 장치를 위해 칩 트렌치를 위로 놓습니다. 최종 트렌치업 장치를 위해 칩 트렌치를 아래로 놓습니다. (B) 부품 1에서 보호 마스크를 제거하고 앞면이 아래로 향하도록 하여 부품 1을 칩에 접착합니다. 고정 장치 A2와 압력을 가하여 접착합니다. (C) 시트에서 성분 2를 제거하고 상단 보호층을 벗겨내어 성분 2와 성분 1을 접착합니다. 채널을 조명기 B1에 놓고 구성요소 1을 구성요소 2 위가 위로 향하게 놓습니다. 고정구 B2로 압력을 가하여 접착합니다. 약어: FAn = 고정 장치 An; FBn = 픽스처 Bn. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 공동 배양 개략도 및 장치 내 세포 배양의 대표 위상차 이미지. (A) pericyte 및 endothelial cell seeding의 위치. (B) 멤브레인 칩의 트렌치를 가로지르는 셀 위치의 측면도 개략도. (C) 일차 HBVP 및 hCMEC/D3 뇌 내피 세포주에 대한 낮고 최적의 파종 밀도의 대표 이미지. 이미지는 파종 후 1일(HBVP) 및 파종 후 2시간(hCMEC/D3)에 획득했습니다. (D) hiPSC 유래 뇌 주피세포 유사 세포에 대한 낮은, 높은, 최적 파종 밀도의 대표 이미지. 이미지는 파종 후 1일 후에 획득했습니다. (E) 최종 HBVP 및 hCMEC/D3 공동 배양 및 hCMEC/D3 단일 배양의 대표 이미지. 이미지는 HBVP 파종 후 8일 및 hCMEC/D3 파종 후 7일 후에 획득되었습니다. (F) 실패한 BPLC 및 EECM-BMEC 유사 세포 공동 배양 및 EECM-BMEC 유사 세포 단일 배양의 대표 이미지. 이미지는 BPLC 시딩 후 7일 및 EECM-BMEC 시딩 후 6일 후에 획득되었습니다. 과소 파종된 BPLC 배양은 충분한 커버리지를 갖지 못하는 반면, 과잉 파종된 BPLC 배양은 과밀화되어 뭉치거나 후퇴하기 시작합니다. 스케일 바 = 100μm(CF). 약어: HBVP = 인간 뇌 혈관 주위 세포; hiPSC = 인간 유도 만능 줄기 세포; BPLC = hiPSC 유래 뇌 주위 세포 유사 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 장치에서 면역 염색된 hiPSC 유래 세포 공동 배양의 대표 이미지. 세포는 내피 세포 마커 VE-cadherin(녹색), pericyte marker PDGFRβ(빨간색) 및 핵 염색(파란색)에 대해 염색되었습니다. 두 층의 세포를 가까운 거리에서 볼 수 있으며, 얇은 질화규소-나노막(흰색 화살표는 왼쪽 이미지의 막 위치를 표시함)으로만 분리되어 있습니다. 눈금 막대 = 50μm. 약어: hiPSC = 인간 유도 만능 줄기 세포; PDGFRβ = 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 샘플링 기반 소분자 투과성 분석 . (A) 실험 워크플로의 개략도. (B) 스위스 베른 대학교(UniBe)와 미국 뉴욕 로체스터 대학교(UR)의 물리적으로 멀리 떨어진 두 실험실 간의 실험실 간 재현성 시연: hiPSC 유래 내피 세포를 μSiM 장치에서 2일, 4일 또는 6일 동안 배양하고 트랜스웰 필터에서 6일 동안 배양했습니다. 투과성 분석은 150μg/mL Lucifer Yellow(457Da)를 사용하여 수행되었습니다. 적색 막대는 트랜스웰 필터(40)에서 6일 동안 배양한 동일한 hiPSC-유래 내피 세포의 이전에 공개된 나트륨 플루오레세인(376Da) 투과성 데이터를 나타낸다. N = 그룹당 4-16. Tukey의 사후 검정을 사용한 이원 분산 분석이 사용되었으며 비교는 관련 p < 0.05에 대해서만 표시되었습니다. (C) μSiM에서 2일 동안 배양한 hiPSC 유래 EECM-BMEC 유사 세포를 사용한 사이토카인 반응 시연; 0.1ng/mL TNFα + 2IU/mL IFNγ) 또는 배지 대조군(비자극, NS)을 150μg/mL Lucifer Yellow를 사용하여 투과성 분석 전에 20시간 동안 상단 챔버에 추가했습니다. N = 그룹당 3개. 스튜던트 t-검정, p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 탑 챔버 파종 표면적 | 탑 웰 체적(Top Well Volume | 하단 챔버 파종 표면적 | 하단 채널 볼륨 |
| ~37mm2 | 100 μL (≥115 μL 수용 가능) | ~42mm2 | 10 μL (기포 방지를 위한 피펫 20 μL) |
표 1: 중요한 μSiM 표면적 및 부피.
| 과녁 | 고정제 | 차단 솔루션 | 희석 |
| VE-카데린 | 4% PFA 또는 100% MeOH | 5% GS + 0.4% Tx-100 또는 10% GS + 0.3% Triton X-100 | 1:50 |
| CD31 시리즈 | 4% PFA 또는 100% MeOH | 5% GS + 0.3-0.4% 트리톤 X-100 | 1:100 |
| Claudin-5 (클라우딘-5) | 100% MeOH | 5-10% GS + 0.3% 트리톤 X-100 | 1:200 |
| ZO-1 (조-1) | 100% MeOH | 5-10% GS + 0.3% 트리톤 X-100 | 1:200 |
| 오클루딘 | 100% MeOH | 5-10% GS + 0.3% 트리톤 X-100 | 1:50 |
| PDGFRβ | PFA 4% 함유 | GS 5% + 트리톤 X-100 0.4% | 1:100 |
| NG2 (영문) | PFA 4% 함유 | GS 5% + 트리톤 X-100 0.4% | 1:100 |
| 염소 α-마우스 IgG Alexa Fluor 488 | 1:200 | ||
| 염소 α-마우스 IgG Alexa Fluor 568 | 1:200 |
표 2: μSiM 장치에서 공동 배양 면역세포화학을 위해 검증된 항체 및 염색 방법. 약어: PFA = 파라포름알데히드; MeOH = 메탄올; GS = 염소 혈청.
보충 파일 1: 투과성 값 계산을 위한 템플릿. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
멤브레인 칩은 안정성을 위해 설계되었지만 조립 중에 잘못 취급하면 균열이 생기거나 파손될 수 있습니다. 따라서 칩 핀셋 노치에 칩을 잡고 고정 장치에 부드럽게 놓는 것이 중요합니다. 일반적으로 장치를 취급할 때 장치를 부딪히거나 떨어뜨리지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다. 멤브레인 칩을 고정구 A1에 접합하는 동안 칩을 평평하게 배치하고 고정구 A1의 기둥 중앙에 배치하여 부품 1에 접합하는 동안 멤브레인 균열을 방지해야 합니다. 또한 보호 마스크를 제거한 후에는 노출된 PSA 층과의 접촉을 피해야 합니다. 보호 마스크를 제거한 후 부품 2를 취급할 때는 부품 가장자리를 따라 잡고 핀셋을 사용하여 PSA가 없는 삼각형 모서리를 잡는 것이 좋습니다.
가능한 BBB 모델에 대해 세포 배양 프로토콜이 설명되었지만, 여기에 설명된 BBB의 BMEC/주위 세포주위 공동 배양 모델은 생리학적 맥락 및 관심 있는 질문에 따라 충분하거나 불충분할 수 있습니다. 예를 들어, 면역 세포 이동은 주로 뇌의 모세혈관 후 정맥에서 일어난다41,42. 이 영역에서, 혈관 주위 공간은 BMEC/주위 세포 장벽을 성상교세포에 의해 확립된 신경교세포(glial limitans)로부터 분리합니다. 따라서, 모세혈관 후 정맥에서, 신경혈관 단위(NVU)는 물리적으로 분리된 두 개의 장벽을 직렬로 구성하며, 성상세포의 말단은 현재 모델에서 잘 표현되는 BMEC/주위 혈액 장벽과 직접 접촉하지 않습니다. 성상교세포 분비 인자가 혈액 장벽에 미치는 영향을 설명하는 NVU 모델이 목표인 경우, 혈관 주위 공간을 통해 용해성 인자 교환을 가능하게 하는 성상세포 구획을 장치에 추가할 수 있습니다. 이 예는 이전에 예시된 바 있으며(34) 3D '뇌' 구획에 있는 미세아교세포 및 뉴런과 같은 다른 세포를 포함하도록 확장될 수 있다. 플랫폼의 모듈식 아키텍처는 이러한 재구성을 달성하기 위해 간단한 조립 전략을 사용할 수 있도록 하여 플랫폼이 당면한 가설을 해결하는 데 필요한 만큼 단순하거나 복잡하도록 합니다. 각 세포 배양 설정; 그러나 새로운 세포주와 다중 배양에 최적화되어야 합니다. 예를 들어, 질화규소 멤브레인의 특성으로 인해 조직 배양 플레이트와 비교하여 코팅 용액을 조정해야 할 수 있습니다. 피브로넥틴의 포함은 일반적으로 세포 부착 및 생존에 도움이 됩니다. 또한, 사용자는 내피 세포와 주위 세포를 반대 방향으로 배양할 수 있습니다. 이 경우, 예를 들어 투과성 측정이 이루어지고 해석되는 방식을 수정해야 할 수 있습니다. 그러나 이러한 유형의 문화에 대한 단계를 제공하는 것은 이 문서의 범위를 벗어납니다.
세포 배양 중에 직면할 수 있는 또 다른 문제는 장치가 표준 조직 배양 플레이트 및 플라스크에 비해 환경 변화에 더 민감할 수 있기 때문에 배지의 빠른 증발입니다. 과도한 증발이 보이거나 세포 성장이 느려지는 경우 정확한 설정을 보장하기 위해 모든 중요한 인큐베이터 파라미터를 측정해야 합니다. 세포 배양 챔버 내부에 놓인 조직 캡 또는 작은 페트리 접시에 더 많은 물을 추가하거나 배지를 더 자주 교환해야 합니다. 또한 기포가 하단 채널로 들어가 트렌치 다운 장치의 트렌치에 끼일 수 있습니다. 제거할 수 있지만 처음부터 거품을 추가하지 않는 것이 가장 쉽습니다. 이를 위해서는 피펫팅 배지를 하단 챔버로 피펫팅하기 전에 피펫 팁에 기포가 없거나 피펫 팁 끝에 공기가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 채널의 매체 증발로 인해 매체 표면과 포트 상단 사이에 틈이 생길 수 있습니다. 미디어가 반대쪽 포트의 표면에 도달할 때까지 소량의 미디어를 하나의 포트로 피펫할 수 있으며, 그 후 미디어는 반대쪽 포트에서 교환될 수 있습니다. hECSR 및 E6 + 10% FBS 배지는 수조에서 가열해서는 안 되지만 다른 매체는 기포 형성을 줄이기 위해 예열할 수 있습니다. 기포가 하단 챔버로 들어가면 채널을 통해 100μL를 빠르게 피펫팅하여 제거할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 챔버 사이의 오염 또는 장치 표면에 쏟아진 매체로 이어질 수 있습니다. 또한 세포층을 파괴할 수 있습니다. 또는 배지를 먼저 채널에서 제거한 다음 50μL 용량으로 다시 주입할 수 있습니다. 그러나 미디어를 먼저 제거하면 채널에 더 많은 기포가 형성될 수 있습니다. 기포가 멤브레인 영역 바로 아래에 있지 않으면 세포 배양에 영향을 주지 않고 채널에 남아 있을 수 있습니다.
그림 2에서 볼 수 있듯이 주위 세포의 부착 및 성장은 어려울 수 있습니다. 최적화된 파종 밀도를 사용하는 것은 생리학적으로 관련된 주위 세포 대 내피 세포 비율을 가진 층을 형성하는 데 필수적입니다. 또한, pericyte는 전단에 민감하기 때문에 채널의 모든 배지 교환은 세포를 보호하기 위해 매우 천천히 수행되어야 합니다. BPLC 배양의 경우 800μg/mL 콜라겐 유형 IV 또는 100μg/mL 피브로넥틴으로 하단 챔버를 코팅하여 부착을 개선할 수 있습니다.
여기에 설명된 장치의 면역세포화학은 세포 건강 및 기능에 대한 정성적 분석을 가능하게 합니다. 조직 배양 플레이트 또는 기타 플랫폼에서 염색하는 방법은 플랫폼으로 직접 변환할 수 있어야 합니다. 상단 챔버에서만 세포 배양의 경우, 고정 후 PBS를 하단 챔버에 추가하고 나머지 단계를 위해 그대로 둘 수 있으며, 상단 챔버에서만 차단 및 염색을 수행할 수 있습니다. 이렇게 하면 멤브레인이 파손되거나 하단 챔버에 기포가 유입될 위험이 최소화됩니다. 공동 배양 염색의 경우 모든 단계에서 두 챔버를 모두 사용하는 것이 좋습니다. 고정제와 PBS의 점도는 매체의 점도와 다르다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 하단 챔버에 기포를 추가하는 것이 더 쉬울 수 있으며, 하단 챔버에 피펫팅하기 전에 팁 끝에서 피펫 팁의 공기가 있는지 확인하기 위해 각별한 주의를 기울여야 합니다.
저분자 투과성 분석에 대해 설명된 프로토콜은 μSiM 장치에서 배양된 내피 세포의 장벽 기능에 대한 기능적 및 정량적 평가를 가능하게 합니다. 이 분석 중에 발생할 수 있는 한 가지 문제는 프로토콜 단계 4.1.7.4의 하단 채널에서 샘플을 수집하는 동안 피펫으로 기포를 끌어들이는 것입니다. 이 문제를 방지하려면 샘플 수집을 시작하기 전에 팁이 포트에 밀봉되어 있는지 확인하고 샘플을 너무 빨리 채취하지 않는 것이 중요합니다. 그래도 문제가 해결되지 않으면 사용된 팁의 크기가 너무 작거나 커서 포트에 맞지 않을 수 있습니다. 재료 목차에 나열된 팁을 사용하십시오. 건강해 보이는 합류 단층에도 불구하고 예기치 않게 높은 투과성 값이 측정되는 경우, 시료 채취 중에 단층의 무결성이 중단되지 않았는지 확인해야 합니다. 샘플 채취 직후 항상 현미경으로 단층을 확인하는 것이 좋습니다. 단층이 여전히 온전하고 건강해 보이면 샘플을 고정할 수 있으며 예를 들어 접합 단백질의 면역염색을 통해 장벽 기능의 생물학적 마커를 평가할 수 있습니다. 반대로, 예기치 않게 낮은 투과성 값이 측정되는 경우 기포 없이 하단 채널에서 50μL의 매체를 샘플링하는 것이 중요합니다. 저장소 팁이 배치되자마자 샘플링 포트에서 배지가 나오는 경우, 대부분의 형광 소분자가 하단 채널에서 샘플링된 초기 10μL 부피에 존재하므로 피펫을 샘플링 포트에 장착하기 전에 해당 배지를 수집해야 합니다. 소수성 펜을 사용하여 포트 주위에 원을 그리거나 포트 주위에 구멍이 있는 소수성 테이프를 배치하면 수동적으로 펌핑된 매체가 퍼지는 것을 방지할 수 있습니다. 샘플링 중에 기포가 제거되거나 전체 50μL 샘플이 제거되지 않은 경우 샘플을 사용해서는 안 됩니다. 대안적으로, 정확한 부피를 결정하여 투과성 계산에 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 제거된 부피가 ≥40 μL인 경우에만 행해져야 하며, 이는 ~98-99% 염료 회수율34에 해당한다.
Disclosures
J.L.M.은 SiMPore의 공동 설립자이며 회사의 지분을 보유하고 있습니다. SiMPore는 이 연구에 사용된 멤브레인을 포함한 초박형 실리콘 기반 기술을 상용화하고 있습니다.
Acknowledgments
J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. 및 L.W.는 NIH 보조금 R33 HL154249로 자금을 지원받았습니다. J.L.M.은 R44 GM137651에서 자금을 지원받았습니다. M.M.은 로체스터 대학의 Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience에서 자금을 지원받았습니다. M.T.는 RF1 AG079138에서 자금을 지원받았습니다. K.C.는 국제윤리연구재단(International Foundation for Ethical Research)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
| Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
| Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
| VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
| ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| 100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
| DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
| hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
| PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
| Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
| Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
| Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
| Experimental models: Cell lines | |||
| Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
| Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
| iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
| Glassware and Plasticware | |||
| 150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
| Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
| Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
| Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
| Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
| P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
| Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
| Instruments | |||
| 10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
| 10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
| 40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
| Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
| Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
| TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
| Other | |||
| Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
| Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
| Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 - Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
| Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
| Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
| Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
| Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
| Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
| SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
| Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
| Software | |||
| Fiji | ImageJ | For image processing | |
| Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
| i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
| Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |
References
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