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Bioengineering

रक्त-मस्तिष्क बाधा मॉडलिंग के लिए माइक्रोसिम (μSiM) बैरियर ऊतक मंच का उपयोग

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65258
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 3, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

यह रिपोर्ट रक्त-मस्तिष्क बाधा मॉडल के निर्माण के लिए μSiM प्लेटफ़ॉर्म पर असेंबली, सेल कल्चर और परख के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करती है।

Abstract

माइक्रोसिम (μSiM) रक्त-मस्तिष्क बाधा (BBB) मॉडलिंग के लिए एक झिल्ली-आधारित संस्कृति मंच है। पारंपरिक झिल्ली-आधारित प्लेटफार्मों के विपरीत, μSiM प्रयोगवादियों को नई क्षमताओं के साथ प्रदान करता है, जिसमें लाइव सेल इमेजिंग, 'रक्त' और 'मस्तिष्क' कक्षों के बीच निर्बाध पैराक्रिन सिग्नलिंग, और झिल्ली के निष्कर्षण / रिमाउंटिंग की आवश्यकता के बिना सीधे इम्यूनोफ्लोरेसेंस की छवि बनाने की क्षमता शामिल है। यहां हम अल्ट्राथिन नैनोपोरस सिलिकॉन-नाइट्राइड झिल्ली का उपयोग करके बीबीबी के मोनोकल्चर (एंडोथेलियल कोशिकाओं) और सह-संस्कृति (एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट्स) मॉडल को स्थापित करने के लिए मंच के बुनियादी उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। हम प्राथमिक सेल संस्कृतियों और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) संस्कृतियों दोनों के साथ संगतता प्रदर्शित करते हैं। हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के माध्यम से बीबीबी मॉडल के गुणात्मक विश्लेषण के लिए तरीके प्रदान करते हैं और एक छोटे अणु पारगम्यता परख में बाधा समारोह के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए μSiM के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। प्रदान की गई विधियों को उपयोगकर्ताओं को मंच पर अपने बाधा मॉडल स्थापित करने में सक्षम बनाना चाहिए, मानव ऊतकों का अध्ययन करने के लिए ऊतक चिप प्रौद्योगिकी के उपयोग को आगे बढ़ाना चाहिए।

Introduction

जीवित ऊतकों को विशेष कोशिकाओं द्वारा विभाजित किया जाता है जो बाधाओं को बनाते हैं और बनाए रखते हैं और विनियमित करते हैं कि किन कोशिकाओं और अणुओं को एक डिब्बे से दूसरे डिब्बे में ले जाया जाता है। बाधा कार्यों का अनुचित विनियमन तीव्र बीमारियों और पुरानी बीमारी दोनों का स्रोत हो सकता है। रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) मानव शरीर में सबसे प्रतिबंधात्मक ऊतक बाधाहै। बीबीबी की शिथिलता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की बीमारियों की एक विस्तृत श्रृंखला को रेखांकित करती है, जिसमें अल्जाइमर रोग2, पार्किंसंस रोग 3,4, और मल्टीपल स्केलेरोसिस 5,6 शामिल हैं। बीबीबी को चोट भी तीव्र विकारों के परिणामस्वरूप दीर्घकालिक संज्ञानात्मक हानि से जुड़ी हुई है, जैसे कि सेप्सिस7, सीओवीआईडी -198, और पोस्टऑपरेटिव डेलीरियम9। मस्तिष्क विकारों का इलाज करने की क्षमता वाली दवाओं का विकास निराशाजनक रूप से मुश्किल हो गया हैक्योंकि मस्तिष्क में लक्ष्य के लिए बायोएक्टिव अणुओं को वितरित करने के लिए बीबीबी को जानबूझकर तोड़ने की चुनौती है। इन कारणों से, इन विट्रो में बीबीबी फ़ंक्शन का अध्ययन करने के तरीके सीएनएस के रोगों की समझ और उपचार के लिए सर्वोपरि महत्व के हैं।

विट्रो में बाधा समारोह को मापने के लिए बुनियादी तरीकों में एक अर्ध-पारगम्य झिल्ली पर एक मोनोलेयर या सह-संस्कृति की स्थापना और कोशिकाओं द्वारा छोटे अणु प्रसार या छोटी विद्युत धाराओं 11,12,13,14 के लिए प्रदान किए गए प्रतिरोध को मापना शामिल है। जबकि माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) के उद्भव ने 3 डी15,16 में बीबीबी मॉडलिंग के लिए विकल्पों की बहुतायत का उत्पादन किया है, सिस्टम ज्यामिति की विविधता एमपीएस या स्थापित साहित्य मूल्यों के बीच पारगम्यता माप की तुलना करना मुश्किल बनाती है। विश्वसनीय आधारभूत मूल्यों की स्थापना बीबीबी अनुसंधान में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जहां मस्तिष्क संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा व्यापक बाधा विनियमन के कारण, इन विट्रो पारगम्यता मूल्यों की अत्यधिक जांच की जाती है12,17,18. इन कारणों से, 2 डी झिल्ली पर स्थापित मोनोलेयर में पारगम्यता माप आने वाले वर्षों के लिए बीबीबी अध्ययनों में एक प्रमुख बने रहेंगे। यह उपकला बाधाओं सहित अन्य ऊतक बाधाओं के लिए सच है, जहां बेसलाइन पारगम्यता के पूर्ण मूल्यों का उपयोग इन विट्रो मॉडल 19,20,21 को मान्य और तुलना करने के लिए किया जाता है।

बीबीबी अनुसंधान समुदाय के लिए एक मूल्यवान नए उपकरण की स्थापना के लक्ष्य के साथ, हमने पिछले 5 वर्षों में बैरियर टिशू मॉडलिंग में उपयोग के लिए 22 और उन्नत23,24,25,26 माइक्रोडिवाइस पेश किए हैं, जिसमें एक सीलिकॉन एमएम्ब्रेन (μSiM) प्लेटफॉर्म है। मंच की सक्षम विशेषता एक अल्ट्राथिन (<100 एनएम मोटी) झिल्ली है जिसमें सैकड़ों लाखों नैनोपोर्स27,28 या नैनोपोर्स और माइक्रोपोर्स29 का मिश्रण है। फ्री-स्टैंडिंग मेम्ब्रेन चिप्स का उत्पादन 300 μm सिलिकॉन 'चिप' पर किया जाता है जो अल्ट्राथिन संरचनाओं को स्थिर करता है30 और उन्हें डिवाइस असेंबली के लिए चिमटी द्वारा नियंत्रित करने की अनुमति देता है। उनकी अल्ट्राथिन प्रकृति के कारण, झिल्ली में एक पारगम्यता होती है जो वाणिज्यिक झिल्ली संस्कृति उपकरणों31,32 में उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक ट्रैक-अंकित झिल्ली की तुलना में परिमाण के दो क्रम अधिक होती है। व्यवहार में, इसका मतलब है कि नैनोपोर्स (<60 एनएम) से छोटे अणुओं के प्रसार के लिए झिल्ली की बाधा नगण्यहै। इस प्रकार, सेलुलर बाधाओं के लिए, केवल कोशिकाएं और उनके द्वारा जमा किए गए मैट्रिसेस एपिकल से बेसल डिब्बों तक छोटे अणु परिवहन की दर निर्धारित करेंगे जो झिल्ली34 द्वारा अलग किए जाते हैं। डिवाइस डिजाइन और झिल्ली की अल्ट्राथिन प्रकृति भी ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए कई फायदे प्रदान करती है। इनमें 1) चरण कंट्रास्ट या उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग का उपयोग करके लाइव संस्कृतियों का पालन करने की क्षमता, 2) झिल्ली को कवर ग्लास में निकालने और स्थानांतरित करने की आवश्यकता के बिना सीटू में फ्लोरोसेंटली दाग और छवि बनाने की क्षमता, और 3) तथ्य यह है कि झिल्ली कॉन्फोकल 'स्लाइस' की तुलना में पतली होती है ताकि प्रत्यक्ष सह-संस्कृतियों में सेल प्रकारों के बीच अधिक प्राकृतिक अंतर हो जो 6-10 μm-मोटी ट्रैक-अंकित झिल्ली के साथ प्राप्त किया जा सकता है।

हाल ही में, हमने तेजी से असेंबली34 और अनुकूलन 35,36 की सुविधा के लिए मंच को मॉड्यूलर प्रारूप में उन्नत किया। हमने अपने बायोइंजीनियरिंग और सहयोगी मस्तिष्क बाधा प्रयोगशालाओं के बीच डिवाइस घटकों को वितरित करने के लिए मॉड्यूलर प्रारूप का लाभ उठाया। फिर हमने संयुक्त रूप से डिवाइस असेंबली, मोनोकल्चर और सह-संस्कृति, इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला, और छोटे अणु पारगम्यता के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए और दिखाया कि ये विधियां प्रयोगशालाओं के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थीं। इन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने यह भी दिखाया कि मॉड्यूलर प्लेटफॉर्म मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) 37 से मस्तिष्क माइक्रोवास्कुलर जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीएमईसी) बनाने के लिए विस्तारित एंडोथेलियल कल्चर विधि (ईईसीएम) का उपयोग करके विकसित एक मान्य बीबीबी का समर्थन करता है। वर्तमान रिपोर्ट का उद्देश्य इन विधियों की अधिक विस्तार से समीक्षा करना है और साथ के वीडियो की सहायता से, बीबीबी समुदाय में मंच को व्यापक रूप से अपनाने की सुविधा प्रदान करना है।

Protocol

1. μSiM डिवाइस असेंबली

नोट: यह विधि उपकरणों की असेंबली का वर्णन करता है। झिल्ली चिप में एक ट्रेंच-साइड और फ्लैट-साइड होता है, जिसे ट्रेंच-अप या ट्रेंच-डाउन को इकट्ठा किया जा सकता है। ट्रेंच-डाउन डिवाइस आमतौर पर सेल कल्चर के लिए उपयोग किए जाते हैं।

  1. एक बाँझ वातावरण (यानी, एक जैव सुरक्षा हुड) में, असेंबली के लिए सभी सामग्री तैयार करें, जिसमें असेंबली फिक्स्चर, घटक, झिल्ली चिप्स और चिमटी शामिल हैं।
  2. चिप चिमटी का उपयोग करके फिक्स्चर ए 1 के केंद्र पर झिल्ली चिप रखें। चिप की सपाट सतह नीचे की ओर है और ट्रेंच क्षेत्र ट्रेंच-डाउन उपकरणों के लिए ऊपर है, और ट्रेंच-अप उपकरणों के लिए इसके विपरीत ।
    नोट: निम्नलिखित असेंबली चरणों को एक उदाहरण के रूप में ट्रेंच-डाउन डिवाइस का उपयोग करके चित्रित किया गया है, जो शीर्ष कक्ष में एक सपाट विकास क्षेत्र की अनुमति देता है।
  3. चिप के लिए बॉन्ड घटक 1। सबसे पहले, सीधे चिमटी का उपयोग करके घटक 1 के दोनों किनारों पर नीली सुरक्षात्मक परतों को छीलें और इसे फिक्स्चर ए 1, शीर्ष कक्ष में रखें। धीरे-धीरे घटक 1 को नीचे दबाएं जब तक कि दबाव-संवेदनशील चिपकने वाला (पीएसए) चिप को न छू ले।
  4. फिक्स्चर ए 2 को फिक्स्चर ए 1 पर रखें और चिप और घटक के तंग फिट को सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न कोनों पर दृढ़ दबाव लागू करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पीएसए परत को बंद न करें। यह नीली सुरक्षात्मक परतों की तुलना में एक पारदर्शी और कठोर परत है।
  5. चिप के साथ घटक 2 से घटक 1 तक बॉन्ड करें। सबसे पहले, घटक 2 के एक कोने को सीधे चिमटी से पकड़कर और इसे शीट से छीलकर घटक 2 तैयार करें। फिर, घटक 2 के गैर-पीएसए "त्रिकोण" क्षेत्र को पकड़ें और एक साथ घटक 2 की मोटी, पारदर्शी सुरक्षात्मक परत और नीली परत को हटा दें, जिससे पीएसए सतह उजागर हो जाए। घटक 2 को फिक्स्चर बी 1, पीएसए साइड अप में रखें।
  6. घटक 1 को झिल्ली चिप के साथ फिक्स्चर बी 1 में रखें, शीर्ष कक्ष ऊपर की ओर।
  7. घटक 1 पर फिक्स्चर बी 2 डालें और फिक्स्चर बी 2 के विभिन्न कोनों पर दृढ़ दबाव लागू करें।
  8. इकट्ठे डिवाइस को फिक्स्चर से बाहर निकालें और डिवाइस के नीचे किसी भी हवा के बुलबुले को दबाने के लिए सीधे चिमटी का उपयोग करें और झिल्ली क्षेत्र के संपर्क से बचने के लिए चैनलएक्स के किनारों को सील करें। सेल कल्चर के लिए उपयोग करने से पहले, पराबैंगनी (यूवी) -20 मिनट के लिए नए इकट्ठे उपकरणों को निष्फल करें।

2. सेल संस्कृति

नोट: यह विधि मंच पर प्राथमिक और HIPSC-व्युत्पन्न संस्कृतियों के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। विधियां डिवाइस के शीर्ष कक्ष में एंडोथेलियल सेल मोनोकल्चर और नीचे के कक्ष में पेरिसाइट और ट्रेंच-डाउन इकट्ठे उपकरणों के शीर्ष कक्ष में एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ पेरिसाइट और एंडोथेलियल सेल सह-संस्कृति का वर्णन करती हैं। कक्ष आयाम ों और संस्करणों के लिए, तालिका 1 देखें. ये सबसे आम प्रारूप हैं; हालाँकि, उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर अन्य सेल संस्कृति लेआउट का उपयोग किया जा सकता है।

  1. सेल कल्चर चैंबर की तैयारी
    1. अनुभाग 1 में विस्तृत प्रोटोकॉल के अनुसार उपकरणों को इकट्ठा करें।
    2. उपकरणों को बाँझ नली क्लैंप में रखें। सेल कल्चर से पहले, क्लैंप को इथेनॉल में ≥20 मिनट के लिए भिगोकर निष्फल करें। पुन: उपयोग के लिए प्रत्येक प्रयोग के बाद पुन: निर्जलीकरण करें।
    3. उपकरणों को एक बड़े बाँझ पेट्री डिश में कल्चर करें। अतिरिक्त आर्द्रता के लिए, बाँझ पानी से भरा एक छोटा पेट्री डिश या 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब ढक्कन जोड़ें।
    4. उपकरणों के शीर्ष कक्ष को 100 μL बाँझ पानी के साथ दो बार धोएं। नीचे कक्ष सेल संस्कृति के लिए, नीचे के कक्ष को 20 μL बाँझ पानी से धोएं।
  2. एचसीएमईसी / डी 3 सेल लाइन (बीबीबी) मोनोकल्चर
    1. खंड 2.1 के अनुसार सेल कल्चर चैंबर तैयार करें।
    2. शीर्ष कक्षों को कोलेजन I के 25 μg / सेमी 2 और मानव फाइब्रोनेक्टिन के 5 μg / सेमी2 फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) में मिश्रित करें। इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बैठने दें।
    3. कोटिंग समाधान को हटा दें और शीर्ष कक्ष में 100 μL प्रीवार्म्ड ग्रोथ-फैक्टर-क्षीण एंडोथेलियल माध्यम (परख माध्यम) और निचले कक्ष में 20 μL जोड़ें। परख माध्यम तैयार करने के लिए, एंडोथेलियल बेसल माध्यम के 100 एमएल + मानव फाइब्रोब्लास्टिक विकास कारक के 400 μL + हाइड्रोकार्टिसोन के 40 μL + जेंटामाइसिन सल्फेट के 100 μL + भ्रूण गोजातीय सीरम के 2 मिलीलीटर मिलाएं।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एचसीएमईसी / डी 3 कोशिकाओं को पारित करें; ट्रिप्सिनकोशिकाओं को 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और फिर प्रीवार्म्ड एंडोथेलियल माध्यम के अतिरिक्त ट्रिप्सिनाइजेशन को रोकें। सेल निलंबन को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। परख मीडिया में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और शीर्ष कक्षों में कोशिकाओं को 40,000-60,000 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर बीज दें। सेल आसंजन की सुविधा के लिए 2-4 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उपकरणों को इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, 0.37 सेमी 2 चिप पर 40,000 कोशिकाओं / सेमी2 को प्राप्त करने के लिए, शीर्ष कक्ष में 150,000 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के साथ सेल समाधान के 100 μL जोड़ें।
      नोट: हम सेल रखरखाव के लिए एंडोथेलियल ग्रोथ मीडिया -2 (ईजीएम -2) के संशोधित सूत्रीकरण का उपयोग करके और परख के लिए उपसंस्कृति के बाद विकास कारक-कम "परख माध्यम" का उपयोग करके हुडेज़ एट अल .38 के अनुसार एचसीएमईसी / डी 3 को कल्चर और पारित करते हैं। अन्य मीडिया फॉर्मूलेशन उपकरणों के साथ संगत होना चाहिए, हालांकि हम हुडेज़ एट अल .38 से मीडिया फॉर्मूलेशन की सलाह देते हैं यदि उपयोगकर्ता एचसीएमईसी / डी 3 अस्तित्व के साथ समस्याओं का अनुभव करते हैं।
    5. सेल आसंजन के लिए 2-4 घंटे के बाद, मृत या असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए दोनों कक्षों में ताजा परख माध्यम के साथ आदान-प्रदान करें।
    6. 5% सीओ 2 के साथ उपकरणों को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें, प्रयोग तक हर2-3 दिनों में दोनों कक्षों में परख माध्यम का आदान-प्रदान करें। परख आमतौर पर संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद किया जाता है।
  3. HIPSC-व्युत्पन्न EECM-BMEC-जैसे सेल मोनोकल्चर
    1. खंड 2.1 के अनुसार सेल कल्चर चैंबर तैयार करें।
    2. 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए 5 मिलीग्राम कोलेजन IV में 0.5 मिलीग्राम / एमएल एसिटिक एसिड के 5 मिलीलीटर को जोड़कर मानव प्लेसेंटा समाधान से कोलेजन IV तैयार करें। घोल को पूरी तरह से पुनर्गठित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ≥4 घंटे तक बैठने दें। समाधान 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।
    3. कोलेजन IV, गोजातीय फाइब्रोनेक्टिन और बाँझ पानी के 4: 1: 5 अनुपात के 100 μL के साथ शीर्ष कक्षों को कोट करें। 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोट करें।
    4. कोटिंग समाधान निकालें और शीर्ष कक्ष में 100 μL कमरे के तापमान hECSR और निचले कक्ष में 20 μL जोड़ें।
    5. निशिहारा एट अल.37 के अनुसार ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं; कोशिकाओं में एक सेल डिटेचमेंट एंजाइम मिश्रण जोड़ें और 5-8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एंडोथेलियल माध्यम की मात्रा को 4गुना करने और जोड़ने के लिए सेल समाधान को पाइप करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज; 40,000 कोशिकाओं /सेमी2 के घनत्व पर शीर्ष कक्षों में एचईसीएसआर और बीज में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल आसंजन की सुविधा के लिए 2-4 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उपकरणों को इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, 40,000 कोशिकाओं / सेमी2 को प्राप्त करने के लिए, 150,000 कोशिकाओं / एमएल पर सेल समाधान के 100 μL जोड़ें।
    6. सेल आसंजन के लिए 2-4 घंटे के बाद, मृत या असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए दोनों कक्षों में ताजा एचईसीएसआर के साथ आदान-प्रदान करें।
    7. 5% सीओ 2 के साथ उपकरणों को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें, प्रयोग तक हर1-2 दिनों में दोनों कक्षों में एचईसीएसआर का आदान-प्रदान करें। परख आमतौर पर संस्कृति के दिन 6 पर किया जाता है।
  4. एचसीएमईसी / डी 3 और प्राथमिक मानव मस्तिष्क संवहनी पेरिसिलेट (एचबीवीपी) सह-संस्कृति
    1. डिवाइस असेंबली से पहले, पीबीएस में मिश्रित पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) के 2 μg /cm2 के साथ झिल्ली चिप्स को कोट करें। 50-80 μL PLL को एक बूंद में केवल उस तरफ लागू करें जो अंतिम डिवाइस असेंबली में नीचे की ओर होगा। कोटिंग प्रक्रिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे में या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पूरा करें।
    2. कोटिंग का घोल निकाल लें। झिल्ली चिप्स को बाँझ अल्ट्राप्योर पानी से धोएं और उन्हें सूखने दें।
    3. ऊपर अनुभाग 1 में विस्तृत प्रोटोकॉल के अनुसार उपकरणों को इकट्ठा करें, जिसमें पीएलएल-लेपित पक्ष नीचे की ओर है, और अनुभाग 2.1 के अनुसार सेल कल्चर चैंबर तैयार करें।
    4. अनुभाग 2.2.2 के अनुसार शीर्ष कक्षों को कोट करें।
    5. शीर्ष कक्षों में 50 μL प्रीवार्म्ड पेरिसिलेट माध्यम जोड़ें और निचले चैनलों में 20 μL जोड़ें।
    6. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एचबीवीपी पारित करें; ट्रिप्सिनकोशिकाओं को 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें, फिर प्रीवार्म्ड पेरिसिलेट माध्यम के अलावा ट्रिप्सिनाइजेशन को रोकें। सेल सस्पेंशन को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। पेरिसिलेट माध्यम में सेल गोली को पुन: निलंबित करें और नीचे के कक्षों में कोशिकाओं को 14,000-25,000 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर बीज दें। उपकरणों को उल्टा करें लेकिन गैस विनिमय की सुविधा के लिए शीर्ष कक्षों के साथ एक एयर इंटरफेस बनाए रखें।
      नोट: व्युत्क्रमण के दौरान आवश्यक एयर इंटरफेस को उपकरणों को नली क्लैंप के अंदर रखने के बाद फ़्लिप करके और फ़्लिप करने से पहले सभी कोनों पर नीचे धकेलकर, या शीर्ष कक्षों को अबाधित रखने के लिए ऐक्रेलिक या सिलिकॉन की समानांतर स्ट्रिप्स पर उल्टा रखकर प्राप्त किया जा सकता है। सीडिंग घनत्व को प्रत्येक उपयोगकर्ता के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। 14,000 कोशिकाओं / सेमी2 को प्राप्त करने के लिए, ~ 590,000 कोशिकाओं / एमएल पर सेल निलंबन के 20 μL जोड़ें। ध्यान दें कि बुलबुले से बचने के लिए 20 μL को निचले कक्ष में पाइप किया जाता है, लेकिन घनत्व की गणना 10 μL के निचले कक्ष की मात्रा का उपयोग करके की जाती है।
    7. सेल आसंजन को सुविधाजनक बनाने के लिए उल्टी स्थिति में 2-4 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    8. सेल आसंजन के लिए 2-4 घंटे के बाद, उपकरणों को सीधा फ्लिप करें और मृत या असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए दोनों कक्षों में ताजा पेरिसिलेट माध्यम के साथ उनका आदान-प्रदान करें।
    9. पेरिसिलेट सीडिंग के बाद, चरण 2.2.4-2.2.5 का पालन करते हुए शीर्ष कक्ष में एचसीएमईसी /डी 3 एस बीज दें। दोनों कक्षों को परख माध्यम में स्विच करें।
    10. 5% सीओ 2 के साथ उपकरणों को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें, प्रयोग तक हर1-2 दिनों में दोनों कक्षों में परख माध्यम का आदान-प्रदान करें। प्राथमिक सेल सह-संस्कृति आमतौर पर परख से पहले 6-8 दिनों के लिए बनाए रखी जाती है।
      नोट: यदि एचबीवीपी मोनोकल्चर की तुलना एचसीएमईसी / डी 3 मोनोकल्चर या एचसीएमईसी / डी 3 और एचबीवीपी सह-संस्कृतियों से की जाएगी, तो एचबीवीपी को सीडिंग करने के 2-3 दिन बाद परख माध्यम के साथ पेरिसिलेट माध्यम का आदान-प्रदान करें।
  5. HIPSC-व्युत्पन्न EECM-BMEC-जैसी कोशिका और मस्तिष्क पेरिसिलेट-जैसी कोशिका (BPLC) सह-संस्कृति
    1. अनुभाग 2.1 के अनुसार सेल कल्चर कक्ष तैयार करें और चरण 2.3.2-2.3.3 के अनुसार शीर्ष कक्षों को कोट करें।
    2. कोटिंग समाधान निकालें और शीर्ष कक्ष में कमरे के तापमान के 50 μL आवश्यक 6 मध्यम + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (E6 + 10% FBS) जोड़ें।
    3. गैस्टफ्रेंड एट अल.39 के अनुसार बीपीएलसी को पारित करें; कोशिकाओं में एक सेल डिटेचमेंट एंजाइम मिश्रण जोड़ें और 5-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें, जब तक कि ~ 90% कोशिकाएं गोल न हो जाएं। कोशिकाओं को फ़िल्टर करने और पूरी तरह से एकाकीकृत करने के लिए 40 μm सेल स्ट्रेनर का उपयोग करके, 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में DMEM / F12 की मात्रा को 4गुना जोड़ने के लिए सेल समाधान को अलग करें। 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, ई 6 + 10% एफबीएस में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और नीचे के कक्षों में कोशिकाओं को 14,000-25,000 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर बीज दें। उपकरणों को उल्टा करें लेकिन गैस विनिमय की सुविधा के लिए शीर्ष कक्ष के साथ एक एयर इंटरफेस बनाए रखें।
      नोट: व्युत्क्रमण के दौरान आवश्यक वायु इंटरफ़ेस को नली क्लैंप के अंदर रखने के बाद उपकरणों को फ्लिप करके और फ़्लिप करने से पहले सभी कोनों पर नीचे धकेलकर, या शीर्ष कक्षों को अबाधित रखने के लिए एक्रिलिक या सिलिकॉन की समानांतर स्ट्रिप्स पर उल्टा रखकर प्राप्त किया जा सकता है। सीडिंग घनत्व को प्रत्येक उपयोगकर्ता के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। 14,000 कोशिकाओं / सेमी2 को प्राप्त करने के लिए, ~ 590,000 कोशिकाओं / एमएल पर सेल निलंबन के 20 μL जोड़ें। ध्यान दें कि बुलबुले से बचने के लिए 20 μL को निचले कक्ष में पाइप किया जाता है, लेकिन घनत्व की गणना 10 μL के निचले कक्ष की मात्रा का उपयोग करके की जाती है।
    4. सेल आसंजन को सुविधाजनक बनाने के लिए उल्टी स्थिति में 2-4 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    5. सेल आसंजन के लिए 2-4 घंटे के बाद, उपकरणों को सीधा फ्लिप करें और मृत या असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए दोनों कक्षों में ताजा ई 6 + 10% एफबीएस के साथ आदान-प्रदान करें।
    6. पेरिसिलेट सीडिंग के एक दिन बाद, चरण 2.3.5-2.3.6 का पालन करते हुए शीर्ष कक्ष में ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं को बीज दें। दोनों कक्षों को एचईसीएसआर पर स्विच करें।
    7. 5% सीओ 2 के साथ उपकरणों को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें, प्रयोग तक हर1-2 दिनों में दोनों कक्षों में परख माध्यम का आदान-प्रदान करें। एचआईपीएससी-व्युत्पन्न सह-संस्कृति आमतौर पर बीपीएलसी के लिए 7 दिनों के लिए और ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के लिए 6 दिनों के लिए बनाए रखी जाती है।
      नोट: यदि बीपीएलसी मोनोकल्चर की तुलना ईईसीएम-बीएमईसी मोनोकल्चर या ईईसीएम-बीएमईसी और बीपीएलसी सह-संस्कृतियों से की जाएगी, तो बीपीएलसी को सीडिंग करने के 1 दिन बाद एचईसीएसआर के साथ ई 6 + 10% एफबीएस का आदान-प्रदान करें।

3. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

नोट: यह विधि झिल्ली के शीर्ष और / या निचले हिस्से में सुसंस्कृत कोशिकाओं के इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला और इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। इस प्रयोग का उद्देश्य बीबीबी में पाए जाने वाले प्रमुख प्रोटीनों की उपस्थिति और स्थान को निर्धारित करना है जैसे कि पालन और तंग जंक्शन प्रोटीन, और सेल पहचान प्रोटीन। वैकल्पिक और लाइव धुंधला तरीके भी मंच के साथ संगत हैं।

  1. उपकरणों पर निर्धारण और धुंधलापन
    1. पिघलने के लिए बर्फ पर प्राथमिक एंटीबॉडी रखें।
    2. कमरे के तापमान पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान तैयार करें (उदाहरण के लिए, पीबीएस की मात्रा के 3 गुना में 16% पीएफए पतला करें) या -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल ठंडा करें।
    3. तालिका 2 के अनुसार एक उपयुक्त ब्लॉकिंग समाधान बनाएं। बर्फ पर स्टोर करें।
      नोट: ट्राइटन एक्स -100 को पूरी तरह से भंग करने के लिए समाधान को वोर्टेक्स करना आवश्यक हो सकता है।
    4. निचले कक्ष में 20 μL फिक्सेटिव (जैसे, पीएफए या मेथनॉल) और शीर्ष कक्ष में 50 μL को पाइप करके कोशिकाओं को ठीक करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट (पीएफए) या 2 मिनट (मेथनॉल) के लिए उपकरणों को इनक्यूबेट करें।
    5. नीचे के कक्ष के माध्यम से पीबीएस के 20 μL और शीर्ष कक्ष में 100 μL को पाइप करके 3 x 5 मिनट के लिए धोएं।
    6. निचले कक्ष में ब्लॉकिंग समाधान के 20 μL और शीर्ष कक्ष में 50 μL ब्लॉकिंग समाधान जोड़कर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ब्लॉक करें। निचले कक्ष में बुलबुले की जांच करें।
    7. तालिका 2 के अनुसार ब्लॉकिंग समाधान में एंटीबॉडी (आईईएस) को पतला करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। बर्फ पर स्टोर करें।
    8. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 20 μL को नीचे के कक्ष में जोड़कर और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 50 μL के साथ शीर्ष कक्ष की मात्रा को प्रतिस्थापित करके प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग लगाएं। निचले कक्ष में बुलबुले की जांच करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. नीचे के कक्ष के माध्यम से पीबीएस के 20 μL और शीर्ष कक्ष में 100 μL को पाइप करके 3 x 5 मिनट के लिए धोएं।
    10. तालिका 2 के अनुसार ब्लॉकिंग समाधान में एंटीबॉडी (आईईएस) को पतला करके द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर स्टोर करें।
    11. नीचे के कक्ष में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 20 μL को जोड़कर और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 50 μL के साथ शीर्ष कक्ष की मात्रा को प्रतिस्थापित करके द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ दाग लगाएं। निचले कक्ष में बुलबुले की जांच करें। प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. नीचे के कक्ष के माध्यम से पीबीएस के 20 μL और शीर्ष कक्ष में 100 μL को पाइप करके 3 x 5 मिनट के लिए धोएं।
    13. एक परमाणु दाग समाधान बनाओ। पीबीएस में 1: 10,000 पतला करें। नीचे के कक्ष में परमाणु दाग समाधान के 20 μL जोड़ें और शीर्ष कक्ष की मात्रा को परमाणु दाग समाधान के 50 μL के साथ बदलें। निचले कक्ष में बुलबुले की जांच करें। प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    14. नीचे के कक्ष में पीबीएस के 20 μL जोड़कर और शीर्ष कक्ष की मात्रा को 100 μL PBS के साथ बदलकर दाग को हटा दें। उपकरणों को तुरंत छवि दें या उन्हें पैराफिल्म में लपेटे गए पेट्री डिश के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और इमेजिंग के लिए तैयार होने तक प्रकाश से सुरक्षित रहें।
  2. कॉन्फोकल इमेजिंग
    नोट: यह खंड एक उदाहरण के रूप में लंबी कामकाजी दूरी (एलडब्ल्यूडी) 40 x उद्देश्य (पानी, डब्ल्यूडी 590-610, संख्यात्मक एपर्चर 1.15) के साथ एक उल्टे स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उपकरणों की इमेजिंग का वर्णन करता है। कामकाजी दूरी और लेंस संगतता के लिए, McCloskey et al.34 में पूरक सामग्री देखें। पूरे झिल्ली क्षेत्र की छवियों को 10x उद्देश्य का उपयोग करके भी लिया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि 40x छवियां पूरे क्षेत्र का प्रतिनिधि हैं। ये आमतौर पर वाइडफील्ड में लिए जाते हैं।
    1. माइक्रोस्कोप चालू करें और इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
    2. कॉन्फोकल इमेजिंग मोड का उपयोग करके द्वितीयक एंटीबॉडी और परमाणु दाग के गुणों के अनुसार चैनल सेट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए लेजर पावर और एक्सपोज़र समय का अनुकूलन करें कि सिग्नल पृष्ठभूमि से ऊपर है और इमेजिंग कलाकृतियों को कम करता है।
      1. होचस्ट परमाणु धुंधला होने के लिए, उत्तेजना 405, उत्सर्जन 450/50 बैंडपास (बीपी), 500 एमएस एक्सपोजर समय, 50% लेजर शक्ति का उपयोग करें। एलेक्सा फ्लुर (एएफ) 488 के लिए संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करने वाले लेबल के लिए, उत्तेजना 488, उत्सर्जन 525/50 बीपी, 500 एमएस एक्सपोजर समय और 50% लेजर पावर का उपयोग करें। एएफ 568 के लिए संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करने वाले लेबल के लिए, उत्तेजना 561, उत्सर्जन 600/50 बीपी, 500 एमएस एक्सपोजर समय और 100% लेजर पावर का उपयोग करें।
    3. डिवाइस को माइक्रोस्कोप स्लाइड डिवाइस धारक में रखें, शीर्ष कक्ष सामने रखें और माइक्रोस्कोप स्लाइड होल्डर का उपयोग करके माइक्रोस्कोप में सेट करें। लाइव चालू करें और परमाणु दाग के लिए चैनल का चयन करें। कम उद्देश्य का उपयोग करके झिल्ली का पता लगाएं, यह सुनिश्चित करें कि पारदर्शी सिलिकॉन-नाइट्राइड झिल्ली क्षेत्र केंद्रित है, क्योंकि प्रकाश नीले, ठोस सिलिकॉन क्षेत्र के माध्यम से संचारित नहीं होगा। एक बार जब डिवाइस ठीक से केंद्रित हो जाता है और सेल परत मिल जाती है, तो 40x उद्देश्य पर स्विच करें, उद्देश्य को गीला करें, और एक गाइड के रूप में परमाणु दाग का उपयोग करके झिल्ली क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करें।
    4. जेड-स्टैक इमेजिंग चालू करें और स्कैन मोड को स्टार्ट/एंड पर सेट करें। चरण आकार या गणना सेट करें. माइक्रोस्कोप पर मोटे समायोजन नॉब का उपयोग करके, एक गाइड के रूप में परमाणु दाग का उपयोग करते हुए, एंडोथेलियल सेल परत के शीर्ष पर स्कैन शुरू करें, और एक गाइड के रूप में परमाणु दाग का उपयोग करके पेरिसाइट परत के नीचे स्कैन करें। यह सुनिश्चित करने के लिए सभी चैनलों की जांच करें कि सब कुछ इमेजिंग क्षेत्र में कैप्चर किया जाएगा।
      नोट: हम आमतौर पर ऑटो स्टेप का उपयोग करते हैं, जो ~ 0.2 μm स्लाइस है।
    5. छवि का नाम सेट करें और इमेजिंग शुरू करने के लिए अधिग्रहण दबाएं । आवश्यकतानुसार विभिन्न क्षेत्रों पर दोहराएं।
    6. इमेजजे40 या इमारिस का उपयोग करके कॉन्फोकल छवियों को संसाधित करें।
      1. Imaris में प्रक्रिया करने के लिए, छवि फ़ाइल को खोलने के लिए प्रोग्राम में खींचें। x-z और y-z विमानों के संगत दृश्यों के साथ x-y विमान की 2D छवि देखने के लिए शीर्ष मेनू पट्टी पर अनुभाग का चयन करें। 3 डी छवि देखने के लिए शीर्ष मेनू बार पर 3 डी दृश्य का चयन करें। छवि पर क्लिक करें और इसे घुमाने के लिए खींचें। छवि लेने के लिए शीर्ष मेनू बार पर स्नैपशॉट का चयन करें।

4. छोटे अणु पारगम्यता का नमूना परख।

नोट: यह खंड सेल संस्कृतियों के बाधा गुणों के मात्रात्मक माप के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है। इस प्रयोग का उद्देश्य एक फ्लोरोसेंट छोटे अणु की एकाग्रता का पता लगाना है जो सेल परतों से गुजरता है और मंच के निचले कक्ष में प्रवेश करता है। इन आंकड़ों का उपयोग सेलुलर पारगम्यता की गणना करने के लिए किया जाता है।

  1. नमूना करण तकनीक
    1. अनुभाग 1 में विस्तृत प्रोटोकॉल के अनुसार उपकरणों को इकट्ठा करें और अनुभाग 2 में वर्णित वांछित सेल लाइनों को कल्चर करें। सिस्टम पारगम्यता को मापने के लिए सेल-मुक्त, लेपित नियंत्रण उपकरण के रूप में सेवा करने के लिए एक अतिरिक्त डिवाइस शामिल करें।
      नोट: प्रति शर्त न्यूनतम तीन तकनीकी प्रतिकृति की सिफारिश की जाती है; हालांकि, लेपित नियंत्रण की केवल एक प्रतिकृति की आवश्यकता होती है।
    2. नमूना परख शुरू करने से पहले, निचले कक्ष में माध्यम को ताजा माध्यम से बदलें। माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक डिवाइस में एंडोथेलियल मोनोलेयर के संयोजन की जांच करें। सेल मोनोलेयर में किसी भी अंतराल पर ध्यान दें, क्योंकि यह नीचे के कक्ष में डाई के प्रसार को प्रभावित करेगा।
      नोट: एक स्वस्थ एंडोथेलियल संस्कृति 100% कंफ्लुएंट होनी चाहिए।
    3. सेल कल्चर माध्यम में फ्लोरोसेंट छोटे अणु समाधान (जैसे, 150 μg / mL लूसिफर येलो, 457 Da) तैयार करें। मानक समाधानों की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट छोटे अणु समाधान की अतिरिक्त मात्रा तैयार करें जो निचले चैनल से नमूना किए गए फ्लोरोसेंट छोटे अणु की एकाग्रता की गणना करने के लिए संदर्भ के रूप में काम करते हैं।
      नोट: हम फ्लोरोसेंट छोटे अणु की उच्चतम सांद्रता के साथ मानक समाधान के रूप में उपयोग किए जाने वाले 400 μL अतिरिक्त समाधान की तैयारी की सलाह देते हैं।
    4. फ्लोरोसेंट छोटे अणु समाधान के 100 μL के साथ शीर्ष कुएं में माध्यम को बदलें।
      नोट: हम नमूना बंदरगाहों के चारों ओर सर्कल खींचने के लिए हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करने की सलाह देते हैं और फ्लोरोसेंट डाई समाधान के अतिरिक्त हाइड्रोफोबिक स्याही पूरी तरह से सूखने तक प्रतीक्षा करते हैं। यह चरण 4.1.7 पर नमूना पोर्ट के आसपास निचले चैनल से माध्यम के प्रसार को रोकता है। हम अगले डिवाइस में फ्लोरोसेंट समाधान जोड़ने से पहले शीर्ष वेल-वेट 2 मिनट में फ्लोरोसेंट छोटे अणु समाधान को जोड़ने की सलाह देते हैं, या 3 के समूहों में काम करते हैं (समाधान को एक ही समय में तीन उपकरणों में जोड़ें और अगले तीन उपकरणों को जोड़ने के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें)।
    5. उपकरणों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 ।
    6. पिछले चरण में 1 घंटे की लंबी इनक्यूबेशन के दौरान, चरण 4.1.3 पर तैयार फ्लोरोसेंट छोटे अणु समाधान से 2-गुना सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करके मानक समाधान तैयार करें। प्रत्येक घोल के पिपेट 50 μL को तीन प्रतियों में फ्लैट-बॉटम ब्लैक 96-वेल प्लेट में डालें। बेसलाइन मानक समाधान के रूप में रिक्त कक्ष संस्कृति माध्यम का उपयोग करें।
      नोट: मानक समाधान तैयार करने के लिए, हम 200 μL की अंतिम मात्रा पर 11 सीरियल कमजोर पड़ने और बेसलाइन फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के लिए सेल कल्चर माध्यम के उपयोग को रिक्त के रूप में सुझाते हैं।
      1. चरण 4.1.3 पर तैयार किए गए अतिरिक्त फ्लोरोसेंट छोटे अणु समाधान के 400 μL के 200 μL को 200 μL मध्यम वाली ट्यूब में स्थानांतरित करें, अच्छी तरह मिलाएं, और इस घोल के 200 μL को अगली ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 200 μL मध्यम है। 1: 2 कमजोर पड़ने को दोहराएं जब तक कि कुल 10 ट्यूब न हों। पिपेट 50 μL सबसे केंद्रित मानक समाधान को कॉलम 1 में 96-वेल प्लेट (B1, C1, D1) में तीन प्रतियों में विभाजित करता है, कॉलम 2 (B2, C2, D2) मेंदूसरा सबसे केंद्रित समाधान, और इसी तरह। प्लेट में 12वें कॉलम के लिए, तीन प्रतियों (बी 12, सी 12, डी 12) में रिक्त मीडिया के 50 μL को पिपेट करें।
    7. निचले चैनल से फ्लोरोसेंट छोटे अणु समाधान का नमूना लेने के लिए निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
      1. प्रसार की प्रक्रिया को रोकने के लिए कुएं से फ्लोरोसेंट छोटे अणु समाधान को हटा दें।
      2. बंदरगाह में 50 μL के साथ नोक डालकर, डिवाइस को उठाकर और स्थिरीकरण के लिए शीर्ष पर पकड़ते हुए धीरे से नोक को निकालकर जलाशय के रूप में सेवा करने के लिए ऊपरी बंदरगाह में 50 μL मध्यम युक्त एक टिप रखें। डिवाइस को नीचे सेट करें। सुनिश्चित करें कि नमूनाकरण के दौरान निचले कक्ष में बुलबुले जोड़ने से बचने के लिए पाइप की नोक पर पिपेट टिप या हवा में कोई बुलबुले नहीं हैं।
      3. नमूनाकरण के दौरान सेल मोनोलेयर के विघटन को रोकने के लिए शीर्ष कुएं में 50 μL माध्यम जोड़ें।
      4. निचले चैनल से समाधान का नमूना लेने के लिए, एक खाली पाइप टिप के साथ एक पिपेटर को उसके पहले प्रतिरोध में धक्का दें, टिप को सैंपलिंग पोर्ट में डालें, और नीचे चैनल से समाधान के 50 μL को रिवर्स पाइप करें। मानक समाधान वाले फ्लैट-बॉटम ब्लैक 96-वेल प्लेट में सीधे स्थानांतरित करें।
        नोट: हम नमूने के तुरंत बाद माइक्रोस्कोप के नीचे सेल मोनोलेयर की जांच करने की सलाह देते हैं। नीचे चैनल से मीडिया खींचने से कभी-कभी शीर्ष कुएं में सेल परत का विघटन हो सकता है, जिससे असंगत पारगम्यता माप हो सकता है। 4.1.7 में चरणों में जल्दी से काम करना इसे रोकने में मदद करेगा।
    8. उपयोग किए गए फ्लोरोसेंट छोटे अणु के लिए उचित उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य मापदंडों का उपयोग करके माइक्रोप्लेट रीडर में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें। लूसिफर येलो के लिए, इष्टतम लाभ के साथ 428 एनएम उत्तेजना और 536 एनएम उत्सर्जन का उपयोग करें। प्रतिदीप्ति को प्लेट के शीर्ष से मापा जाता है। प्लेट रीडर में प्लेट जोड़ें, नमूने के साथ कुओं को हाइलाइट करें (मानक वक्र सहित) और प्लेट को पढ़ने के लिए प्रारंभ का चयन करें।
  2. पारगम्यता मान की गणना (टेम्पलेट के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)
    1. मापे गए सभी प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों से रिक्त माध्यम के औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता मान को घटाएं।
    2. सिस्टम पारगम्यता पीएस की गणना करने के लिए समीकरण (1) का उपयोग करें:
      Equation 1(1)
      जहां [ए] ए नीचे चैनल से एकत्र किए गए फ्लोरोसेंट छोटे अणु की एकाग्रता है, वी नमूना मात्रा है और प्लेट (0.050 एमएल) में जोड़ा जाता है, [ए] एल शीर्ष कुएं में जोड़े गए फ्लोरोसेंट छोटे अणु की एकाग्रता है (जैसे 0.15 मिलीग्राम / एमएल), टी इनक्यूबेशन का समय है (वांछित इकाइयों के आधार पर एस या मिनट में), और एस झिल्ली सतह क्षेत्र (0.014 सेमी2) है।
      1. प्रतिदीप्ति तीव्रता आउटपुट और मानक समाधानों की ज्ञात सांद्रता से एक मानक वक्र को प्लॉट करके प्राप्त समीकरण का उपयोग करके [ए] ए की गणना करें। समीकरण में उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता मान (वाई) डालकर प्रयोगात्मक नमूनों की सांद्रता (एक्स) की गणना करें।
        नोट: मानक वक्र के उस भाग का उपयोग करें जो रैखिक है। हम माइक्रोस्कोप के तहत ली गई झिल्ली की छवि से झिल्ली की सतह क्षेत्र को मापने की सलाह देते हैं क्योंकि झिल्ली क्षेत्र लॉट संख्या के आधार पर भिन्न हो सकता है और यदि वे लेपित नियंत्रण से भिन्न होते हैं तो गणना की गई पारगम्यता मूल्यों को काफी प्रभावित कर सकते हैं।
    3. सेल मोनोलेयर पीई की पारगम्यता की गणना करने के लिए समीकरण (2) का उपयोग करें:
      Equation 2(2)
      जहां पीएस सिस्टम पारगम्यता है जैसा कि चरण 4.2.2 में गणना की गई है और पीसी सेल-मुक्त, लेपित नियंत्रण डिवाइस का सिस्टम पारगम्यता मूल्य है।

Representative Results

एक ट्रेंच-डाउन डिवाइस की असेंबली चित्रा 1 में दिखाया गया है। फिक्स्चर घटकों और झिल्ली चिप की असेंबली का मार्गदर्शन करते हैं। घटक 1 मुख्य रूप से चिप से संबंध के लिए पीएसए सतह के साथ ऐक्रेलिक है और निचले कक्ष तक पाइप पहुंच के लिए निचले कक्ष और बंदरगाहों को खोलता है। घटक 2 चैनल परत है और इसमें पकड़ने के लिए शीर्ष दाईं ओर एक गैर-चिपकने वाला, पीएसए-मुक्त "त्रिकोण" होता है। ट्रेंच-डाउन डिवाइस शीर्ष कक्ष में एक फ्लैट सेल कल्चर विकास क्षेत्र प्रदान करते हैं, जबकि ट्रेंच-अप उपकरणों में निचले कक्ष में सेल कल्चर के लिए एक सपाट सतह होती है।

हमने एचसीएमईसी /डी 3 और एचबीवीपी और एचआईपीएससी आईएमआर 90-4-व्युत्पन्न ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं और बीपीएलसी के एंडोथेलियल मोनोकल्चर और सह-संस्कृतियों का प्रदर्शन किया और निकोन एक्लिप्स टीएस 2 चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप और 10एक्स उद्देश्य (चित्रा 2) का उपयोग करके चरण छवियों का अधिग्रहण किया। प्राथमिक सेल कल्चर के लिए इष्टतम सीडिंग घनत्व दिखाया गया है (बीजारोपण के 1 दिन बाद ली गई छवियां), साथ ही साथ कम बीज वाले एचबीवीपी (चित्रा 2 ए)। अंतिम कोकल्चर और मोनोकल्चर चरण छवियों (6 दिन एंडोथेलियल सेल कल्चर) को अलग करना मुश्किल हो सकता है (चित्रा 2 सी), और सफल प्राथमिक सेल सह-संस्कृति की पुष्टि के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग की आवश्यकता हो सकती है (प्रोटोकॉल अनुभाग 3 देखें)। निम्न, उच्च और इष्टतम HIPSC-व्युत्पन्न BPLC सीडिंग घनत्व भी सचित्र हैं (चित्रा 2B)। प्राथमिक सह-संस्कृतियों (चित्रा 2 डी) की तुलना में चरण कंट्रास्ट इमेजिंग में एचआईपीएस-व्युत्पन्न सह-संस्कृति स्पष्ट है। कम बीपीएलसी सीडिंग के परिणामस्वरूप खराब पेरिसिलेट कवरेज और पेरिसिलेट क्लंपिंग होती है, जबकि ओवरसीडिंग के परिणामस्वरूप पेरिसिलेट परत झिल्ली से छील जाती है। इसके अलावा, निचले कक्ष में माध्यम का बहुत जल्दी आदान-प्रदान करने से पेरिसिलेट हानि हो सकती है, क्योंकि ये कोशिकाएं कतरनी के प्रति बहुत संवेदनशील होती हैं। बीबीबी मॉडल के लिए पेरिसाइट्स द्वारा इष्टतम कवरेज ~ 90% है, जिसमें एंडोथेलियल परत में कोई अंतराल नहीं है।

इम्यूनोसनाहुआ एचआईपीएस-व्युत्पन्न सह-संस्कृति की प्रतिनिधि छवियों को चित्रा 3 (6 दिन एंडोथेलियल सेल कल्चर) में चित्रित किया गया है। आईएमआर 90-4-व्युत्पन्न बीपीएलसी को पेरिसिलेट मार्कर पीडीजीएफआर के लिए दाग दिया गया था, और आईएमआर 90-4-व्युत्पन्न ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं को पालन जंक्शन मार्कर वीई-कैडरिन के लिए दाग दिया गया था। नाभिक को दागने के लिए होचस्ट का उपयोग किया गया था। छवियों को स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 0.2 μm स्लाइस के साथ 40x LWD उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त किया गया था और Imaris के साथ संसाधित किया गया था। पतली नैनोमेम्ब्रेन न न दिखने के बावजूद दोनों सेल परतों की कल्पना की जा सकती है।

हमने परिणामों की अंतरप्रयोगशाला प्रजनन क्षमता प्रदर्शित करने के लिए बर्न विश्वविद्यालय, स्विट्जरलैंड और रोचेस्टर विश्वविद्यालय, एनवाई, यूएसए में दो शारीरिक रूप से दूर प्रयोगशालाओं में समान प्रयोगात्मक स्थितियों का उपयोग करके नमूना-आधारित छोटे अणु पारगम्यता परख का प्रदर्शन किया (चित्रा 4)34)। HIPSC IMR90-4-व्युत्पन्न EECM-BMEC जैसी कोशिकाओं को μSiM डिवाइस में 2, 4, या 6 दिनों के लिए और ट्रांसवेल फिल्टर पर 6 दिनों के लिए संवर्धित किया गया था। परख दोनों प्रयोगशालाओं में 150 μg / mL लूसिफर येलो (457 DA) का उपयोग करके किया गया था। डिवाइस में 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत एंडोथेलियल कोशिकाओं की पारगम्यता में उच्च परिवर्तनशीलता इंगित करती है कि बाधा परिपक्वता के लिए 2 दिनों की संस्कृति अपर्याप्त थी। बाधा परिपक्वता पर प्रयोगशालाओं के बीच पारगम्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था - 4 दिनों से। हमने यह भी दिखाया कि 6 दिनों के लिए μSiM और ट्रांसवेल फिल्टर में संवर्धित एंडोथेलियल कोशिकाओं की पारगम्यता पहले प्रकाशित40 से मेल खाती है।

Figure 1
चित्र 1: μSiM असेंबली के चरण । (A) चिप को फिक्स्चर A1 पर रखकर तैयार करें। चिप ट्रेंच को अंतिम ट्रेंच-डाउन डिवाइस के लिए ऊपर रखें। अंतिम ट्रेंच-अप डिवाइस के लिए चिप ट्रेंच को नीचे रखें। (बी) घटक 1 से सुरक्षात्मक मास्क को हटाकर और इसे एफए 1 में आमने-सामने रखकर चिप में घटक 1 को बॉन्ड करें। फिक्स्चर ए 2 के साथ दबाव लागू करके बॉन्ड करें। (सी) घटक 2 और घटक 1 को इसकी शीट से घटक 2 को हटाकर और शीर्ष सुरक्षात्मक परतों को छीलकर। चैनल को फिक्स्चर बी 1 में रखें और घटक 1 को घटक 2 फेस-अप के शीर्ष पर रखें। फिक्स्चर बी 2 के साथ दबाव लागू करके बॉन्ड करें। संक्षेप: एफएएन = फिक्स्चर एन; FBn = fixture Bn. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: उपकरणों में सेल संस्कृति की कोकल्चर और प्रतिनिधि चरण कंट्रास्ट छवियों का योजनाबद्ध। (ए) पेरिसिलेट और एंडोथेलियल सेल सीडिंग का स्थान। (बी) झिल्ली चिप की खाई के पार सेल स्थानों का साइड व्यू योजनाबद्ध। (सी) प्राथमिक एचबीवीपी और एचसीएमईसी / डी 3 मस्तिष्क एंडोथेलियल सेल लाइन के लिए कम और इष्टतम सीडिंग घनत्व की प्रतिनिधि छवियां। ये चित्र बीजारोपण (एचबीवीपी) के 1 दिन बाद और सीडिंग (एचसीएमईसी/डी3) के 2 घंटे बाद प्राप्त किए गए थे। (डी) एचआईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क पेरिसिलेट जैसी कोशिकाओं के लिए कम, उच्च और इष्टतम सीडिंग घनत्व की प्रतिनिधि छवियां। बीज बोने के 1 दिन बाद चित्र प्राप्त किए गए थे। (ई) अंतिम एचबीवीपी और एचसीएमईसी / डी 3 सह-संस्कृति और एचसीएमईसी / डी 3 मोनोकल्चर की प्रतिनिधि छवियां। एचबीवीपी सीडिंग के 8 दिन बाद और एचसीएमईसी/डी3 सीडिंग के 7 दिन बाद तस्वीरें ली गईं। (एफ) असफल और सफल बीपीएलसी और ईईसीएम-बीएमईसी जैसी सेल सह-संस्कृति और ईईसीएम-बीएमईसी जैसी सेल मोनोकल्चर की प्रतिनिधि छवियां। बीपीएलसी सीडिंग के 7 दिन बाद और ईईसीएम-बीएमईसी सीडिंग के 6 दिन बाद तस्वीरें ली गईं। बीपीएलसी संस्कृतियों को पर्याप्त कवरेज नहीं मिल पाता है, जबकि बीपीएलसी संस्कृतियों को ओवरसीडिंग करने से वे अधिक प्रभावित हो जाएंगी और सिकुड़ने लगेंगी/घटने लगेंगी। स्केल सलाखों = 100 μm (C-F)। संक्षेप: एचबीवीपी = मानव मस्तिष्क संवहनी पेरिसाइट; HIPSC = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; बीपीएलसी = एचआईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क पेरिसिलेट जैसी कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: उपकरणों में इम्यूनो-सना हुआ एचआईपीएस-व्युत्पन्न सेल सह-संस्कृति की प्रतिनिधि छवियां। एंडोथेलियल सेल मार्कर वीई-कैडरिन (हरा), पेरिसिलेट मार्कर पीडीजीएफआर (लाल), और परमाणु दाग (नीला) के लिए कोशिकाओं को दाग दिया गया था। कोशिकाओं की दो परतों को निकटता में देखा जा सकता है, जो केवल एक पतली सिलिकॉन-नाइट्राइड नैनोमेम्ब्रेन (सफेद तीर बाईं छवि पर झिल्ली स्थान को चिह्नित करता है) द्वारा अलग किया जाता है। स्केल बार = 50 μm। संक्षेप: HIPSC = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; पीडीजीएफआर = प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर बीटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नमूना-आधारित छोटे अणु पारगम्यता परख । (ए) प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। (बी) बर्न विश्वविद्यालय (यूनिबी), स्विट्जरलैंड और रोचेस्टर विश्वविद्यालय (यूआर), एनवाई, यूएसए में दो भौतिक रूप से दूर प्रयोगशालाओं के बीच अंतर-प्रयोगशाला प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन: एचआईपीएससी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं को 2, 4, या 6 दिनों के लिए μSiM डिवाइस में और 6 दिनों के लिए ट्रांसवेल फिल्टर में संवर्धित किया गया था। पारगम्यता परख 150 μg / mL लूसिफर येलो (457 DA) का उपयोग करके किया गया था। लाल पट्टी ट्रांसवेल फिल्टर40 में 6 दिनों के लिए संवर्धित उसी एचआईपीएससी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं के पहले प्रकाशित सोडियम फ्लोरेसिन (376 डीए) पारगम्यता डेटा को इंगित करती है। N = 4-16 प्रति समूह। टुकी के पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ दो-तरफा एनोवा का उपयोग किया गया था, और तुलना केवल प्रासंगिक पी < 0.05 के लिए प्रदर्शित की गई थी। (सी) 2 दिनों के लिए μSiM में संवर्धित HIPSC-व्युत्पन्न EECM-BMEC जैसी कोशिकाओं का उपयोग करके साइटोकिन प्रतिक्रिया का प्रदर्शन; 0.1 ng/mL TNFa + 2 IU/mL IFN3) या मीडिया नियंत्रण (गैर-उत्तेजित, NS) को 150 μg / mL लूसिफर येलो का उपयोग करके पारगम्यता परख से पहले 20 घंटे के लिए शीर्ष कक्ष में जोड़ा गया था। N = 3 प्रति समूह। छात्र का टी-टेस्ट, पी < 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

शीर्ष कक्ष सीडिंग सतह क्षेत्र टॉप वेल वॉल्यूम नीचे कक्ष सीडिंग सतह क्षेत्र नीचे चैनल वॉल्यूम
~ 37 मिमी2 100 μL (धारण कर सकते हैं ≥115 μL) ~ 42 मिमी2 10 μL (बुलबुले से बचने के लिए pipet 20 μL)

तालिका 1: महत्वपूर्ण μSiM सतह क्षेत्र और वॉल्यूम।

लक्ष्य स्थिरीकारक ब्लॉकिंग समाधान तनूकरण
वीई-कैडरिन। 4% पीएफए या 100% एमईओएच 5% GS + 0.4% Tx-100 या 10% GS + 0.3% Triton X-100 1:50
CD31 4% पीएफए या 100% एमईओएच 5% जीएस + 0.3-0.4% ट्राइटन एक्स -100 1:100
क्लॉडिन-5 100% MeOH 5-10% जीएस + 0.3% ट्राइटन एक्स -100 1:200
ZO-1 100% MeOH 5-10% जीएस + 0.3% ट्राइटन एक्स -100 1:200
Occludin 100% MeOH 5-10% जीएस + 0.3% ट्राइटन एक्स -100 1:50
PDGFR2 4% पीएफए 5% जीएस + 0.4% ट्राइटन एक्स -100 1:100
NG2 4% पीएफए 5% जीएस + 0.4% ट्राइटन एक्स -100 1:100
बकरी α-माउस आईजीजी एलेक्सा फ्लुर 488 1:200
बकरी α-माउस आईजीजी एलेक्सा फ्लुर 568 1:200

तालिका 2: μSiM उपकरणों में सह-संस्कृति इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए मान्य एंटीबॉडी और धुंधला करने के तरीके। संक्षेप: पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड; एमईओएच = मेथनॉल; जीएस = बकरी सीरम।

पूरक फ़ाइल 1: पारगम्यता मूल्य की गणना के लिए टेम्पलेट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

जबकि झिल्ली चिप्स को स्थिरता के लिए डिज़ाइन किया गया है, वे असेंबली के दौरान गलत तरीके से संभालने पर क्रैक या टूट सकते हैं। इस प्रकार, चिप चिमटी में चिप को पकड़ना और धीरे से इसे फिक्स्चर में रखना महत्वपूर्ण है। सामान्य रूप से उपकरणों को संभालते समय, उपकरणों को टक्कर या गिराने के लिए अतिरिक्त सावधानी नहीं बरतनी चाहिए। झिल्ली चिप के फिक्स्चर ए 1 से संबंध के दौरान, चिप को सपाट रखा जाना चाहिए और घटक 1 के संबंध के दौरान झिल्ली दरार से बचने के लिए फिक्स्चर ए 1 के स्तंभ पर केंद्रित होना चाहिए। इसके अलावा, सुरक्षात्मक मास्क हटाने के बाद उजागर पीएसए परतों के साथ किसी भी संपर्क से बचना चाहिए। सुरक्षात्मक मास्क को हटाने के बाद घटक 2 को संभालते समय, इसे घटक के किनारे के साथ पकड़ने की सलाह दी जाती है और पीएसए-मुक्त त्रिकोण कोने को पकड़ने के लिए चिमटी का उपयोग करें।

जबकि सेल कल्चर प्रोटोकॉल को संभावित बीबीबी मॉडल के लिए वर्णित किया गया था, यहां वर्णित बीबीबी का बीएमईसी / पेरिसिलेट सह-संस्कृति मॉडल शारीरिक संदर्भ और रुचि के सवालों के आधार पर पर्याप्त या अपर्याप्त हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी बड़े पैमाने पर मस्तिष्क के पोस्टकेशिका शिराओं में होती है41,42. इन क्षेत्रों में, एक पेरिवास्कुलर स्पेस एस्ट्रोसाइट्स द्वारा स्थापित ग्लियल लिमिटन्स से बीएमईसी / पेरिसिटेट बाधा को अलग करता है। इस प्रकार, पोस्टकेशिका शिराओं में, न्यूरोवास्कुलर यूनिट (एनवीयू) में श्रृंखला में दो शारीरिक रूप से अलग बाधाएं शामिल हैं, और एस्ट्रोसाइटिक एंड-फीट सीधे बीएमईसी / पेरिसिलेट रक्त बाधा से संपर्क नहीं करते हैं, जिसे वर्तमान मॉडल द्वारा अच्छी तरह से दर्शाया गया है। यदि लक्ष्य एक एनवीयू मॉडल है जो रक्त बाधा पर एस्ट्रोसाइट-स्रावित कारकों के प्रभाव के लिए जिम्मेदार है, तो डिवाइस में एक एस्ट्रोसाइट कम्पार्टमेंट जोड़ा जा सकता है जो पेरिवास्कुलर स्पेस के माध्यम से घुलनशील कारक विनिमय की अनुमति देता है। इस उदाहरण को पहले34 चित्रित किया गया था और इसे 3 डी 'मस्तिष्क' डिब्बे में माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स जैसे अन्य कोशिकाओं को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। प्लेटफ़ॉर्म का मॉड्यूलर आर्किटेक्चर इन पुनर्संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए सरल असेंबली रणनीतियों का उपयोग करने में सक्षम बनाता है ताकि प्लेटफ़ॉर्म हाथ में परिकल्पनाओं को संबोधित करने के लिए आवश्यक रूप से सरल या जटिल हो। प्रत्येक सेल संस्कृति सेटअप; हालांकि, नई सेल लाइनों और बहु-संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, सिलिकॉन-नाइट्राइड झिल्ली के गुणों के कारण, ऊतक संस्कृति प्लेटों की तुलना में कोटिंग समाधान को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। फाइब्रोनेक्टिन का समावेश आमतौर पर सेल लगाव और अस्तित्व में सहायता करता है। इसके अलावा, उपयोगकर्ता एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट्स को विपरीत दिशाओं में कल्चर कर सकते हैं। इस मामले में, उदाहरण के लिए, पारगम्यता माप बनाने और व्याख्या करने के तरीके को संशोधित करना आवश्यक हो सकता है। हालांकि, इस प्रकार की संस्कृति के लिए कदम प्रदान करना इस पेपर के दायरे से परे है।

सेल कल्चर के दौरान एक और चुनौती मीडिया का त्वरित वाष्पीकरण हो सकता है क्योंकि डिवाइस मानक ऊतक संस्कृति प्लेटों और फ्लास्क की तुलना में पर्यावरण में परिवर्तन के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकते हैं। यदि अतिरिक्त वाष्पीकरण देखा जाता है या सेल की वृद्धि धीमी हो जाती है, तो सटीक सेटिंग्स सुनिश्चित करने के लिए सभी महत्वपूर्ण इनक्यूबेटर मापदंडों को मापा जाना चाहिए। सेल कल्चर चैंबर के अंदर रखे गए ऊतक टोपी या छोटे पेट्री डिश में अधिक पानी जोड़ा जा सकता है, या मीडिया का अधिक बार आदान-प्रदान किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बुलबुले नीचे चैनल में प्रवेश कर सकते हैं और ट्रेंच-डाउन उपकरणों के लिए खाई में फंस सकते हैं। जबकि उन्हें हटाया जा सकता है, पहली जगह में बुलबुले जोड़ने से बचना सबसे आसान है। ऐसा करने के लिए, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि नीचे के कक्ष में मीडिया को पाइप करने से पहले पिपेट टिप या पिपेट टिप के अंत में हवा में कोई बुलबुले नहीं हैं। इसके अलावा, चैनल में मीडिया वाष्पीकरण से मीडिया की सतह और पोर्ट टॉप के बीच अंतर हो सकता है। मीडिया की एक छोटी मात्रा को एक बंदरगाह में पाइप किया जा सकता है जब तक कि मीडिया विपरीत बंदरगाह की सतह तक नहीं पहुंच जाता है, जिसके बाद मीडिया को उस विपरीत बंदरगाह में आदान-प्रदान किया जा सकता है। जबकि एचईसीएसआर और ई 6 + 10% एफबीएस मीडिया को पानी के स्नान में गर्म नहीं किया जाना चाहिए, बुलबुले के गठन को कम करने के लिए अन्य मीडिया को गर्म किया जा सकता है। यदि एक बुलबुला नीचे कक्ष में जाता है, तो इसे चैनल के माध्यम से 100 μL को जल्दी से पाइप करके हटाया जा सकता है। हालांकि, यह विधि डिवाइस की सतह पर फैले कक्षों या मीडिया के बीच संदूषण का कारण बन सकती है। यह सेल परतों को भी बाधित कर सकता है। वैकल्पिक रूप से, मीडिया को पहले चैनल से हटाया जा सकता है और फिर 50 μL वॉल्यूम के साथ फिर से पेश किया जा सकता है। हालांकि, पहले मीडिया को हटाने से चैनल में अधिक बुलबुला बन सकता है। यदि एक बुलबुला सीधे झिल्ली क्षेत्र के नीचे नहीं है, तो इसे सेल संस्कृति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ने के साथ चैनल में छोड़ा जा सकता है।

पेरिसिलेट लगाव और विकास, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, चुनौतीपूर्ण हो सकता है। शारीरिक रूप से प्रासंगिक पेरिसिलेट-टू-एंडोथेलियल सेल अनुपात के साथ एक परत के गठन के लिए एक अनुकूलित सीडिंग घनत्व का उपयोग करना आवश्यक है। इसके अलावा, चूंकि पेरिसाइट्स कतरनी के प्रति संवेदनशील होते हैं, इसलिए कोशिकाओं की रक्षा के लिए चैनल में सभी मीडिया आदान-प्रदान बहुत धीरे-धीरे किए जाने चाहिए। बीपीएलसी संस्कृति के लिए, 800 μg / mL कोलेजन प्रकार IV या 100 μg / mL फाइब्रोनेक्टिन के साथ निचले कक्ष को कोटिंग करके बेहतर लगाव प्राप्त किया जा सकता है।

यहां वर्णित उपकरणों में इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री सेल स्वास्थ्य और कार्य के गुणात्मक विश्लेषण को सक्षम बनाता है। ऊतक संवर्धन प्लेटों या अन्य प्लेटफार्मों में धुंधला होने के तरीकों को सीधे मंच में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। केवल शीर्ष कक्ष में सेल संस्कृति के लिए, निर्धारण के बाद, पीबीएस को नीचे के कक्ष में जोड़ा जा सकता है और शेष चरणों के लिए छोड़ दिया जा सकता है, जिसमें ब्लॉकिंग और धुंधला केवल शीर्ष कक्ष में किया जाता है। यह झिल्ली को तोड़ने या निचले कक्ष में बुलबुले प्राप्त करने के जोखिम को कम करता है। सह-संस्कृति धुंधला करने के लिए, हम सभी चरणों में दोनों कक्षों का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फिक्सेटिव और पीबीएस की चिपचिपाहट मीडिया से अलग है। इस प्रकार, निचले कक्ष में बुलबुले जोड़ना आसान हो सकता है, और नीचे के कक्ष में पाइपिंग से पहले टिप के अंत में हवा के लिए पिपेट युक्तियों की जांच करने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए।

छोटे अणु पारगम्यता परख के लिए वर्णित प्रोटोकॉल μSiM डिवाइस में सुसंस्कृत एंडोथेलियल कोशिकाओं के बाधा समारोह के कार्यात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस परख के दौरान आने वाली एक समस्या प्रोटोकॉल चरण 4.1.7.4 पर नीचे चैनल से नमूना संग्रह के दौरान पिपेट में हवा के बुलबुले खींच रही है। इस समस्या से बचने के लिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि नमूना संग्रह शुरू करने से पहले टिप को पोर्ट में सील कर दिया गया है और नमूना बहुत तेजी से नहीं खींचा जाना चाहिए। यदि यह समस्या को हल नहीं करता है, तो उपयोग की जाने वाली युक्तियों का आकार बंदरगाहों में फिट होने के लिए बहुत छोटा या बहुत बड़ा हो सकता है; सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध युक्तियों का उपयोग करें। यदि एक स्वस्थ दिखने वाले कंफ्लुएंट मोनोलेयर के बावजूद अप्रत्याशित रूप से उच्च पारगम्यता मूल्यों को मापा जाता है, तो नमूना संग्रह के दौरान व्यवधान के लिए मोनोलेयर की अखंडता की जांच की जानी चाहिए। हम हमेशा नमूना संग्रह के तुरंत बाद माइक्रोस्कोप के नीचे मोनोलेयर की जांच करने की सलाह देते हैं। यदि मोनोलेयर अभी भी बरकरार और स्वस्थ लगता है, तो नमूना तय किया जा सकता है और बाधा समारोह के जैविक मार्करों का मूल्यांकन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जंक्शन प्रोटीन के इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से। इसके विपरीत, यदि अप्रत्याशित रूप से कम पारगम्यता मूल्यों को मापा जाता है, तो यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि 50 μL मीडिया को बिना किसी हवा के बुलबुले के नीचे चैनल से नमूना लिया जाता है। यदि जलाशय की नोक रखते ही नमूना बंदरगाह से माध्यम बाहर आता है, तो पिपेट को सैंपलिंग पोर्ट में फिट करने से पहले उस मीडिया को एकत्र किया जाना चाहिए क्योंकि अधिकांश फ्लोरोसेंट छोटे अणु नीचे चैनल से नमूना किए गए प्रारंभिक 10 μL वॉल्यूम में मौजूद होंगे। हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके बंदरगाहों के चारों ओर सर्कल खींचना या बंदरगाह के चारों ओर एक छेद के साथ हाइड्रोफोबिक टेप रखना किसी भी निष्क्रिय रूप से पंप किए गए मीडिया को फैलने से रोकता है। यदि नमूने के दौरान बुलबुले वापस ले लिए जाते हैं या पूर्ण 50 μL नमूना नहीं हटाया जाता है, तो नमूने का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, सटीक मात्रा निर्धारित की जा सकती है और पारगम्यता गणना में उपयोग की जा सकती है; हालाँकि, यह केवल तभी किया जाना चाहिए जब हटाया गया वॉल्यूम ≥40 μL हो, जो ~ 98-99% डाई रिकवरी34 से मेल खाता है।

Disclosures

जेएलएम सिमपुर के सह-संस्थापक हैं और कंपनी में इक्विटी हित रखते हैं। सिमपोर इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली झिल्लियों सहित अल्ट्राथिन सिलिकॉन-आधारित प्रौद्योगिकियों का व्यावसायीकरण कर रहा है।

Acknowledgments

जे.एल.एम., बी.ई., टी.आर.जी., एम.सी.एम., पी.के., एम.टी., के.सी., और एल.डब्ल्यू. को एनआईएच अनुदान आर 33 HL154249 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। J.L.M. को R44 GM137651 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एमएम को श्मिट प्रोग्राम अवार्ड डेल मोंटे इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोसाइंस, रोचेस्टर विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एमटी को आरएफ 1 AG079138 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। के.सी. को इंटरनेशनल फाउंडेशन फॉर एथिकल रिसर्च द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
CD31 Polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific PA5-32321
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 Thermo Fisher Scientific 35-2500
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11011
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 Millipore  MAB2029
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 Thermo Fisher Scientific 33-1500
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 Cell Signaling Technology 3169
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 R&D Systems MAB9381
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal Thermo Fisher Scientific 40-2200
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
100% Methanol VWR 101443-718 Can be substituted with similar products
16% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Can be substituted with similar products
Accutase Thermo Fisher Scientific A1110501
Acetic acid Sigma-Aldrich 695092
B27 supplement Thermo Fischer Scientific 17504044
bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen IV from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL Can be substituted with similar products
DMEM/Ham’s F12 Thermo Fisher Scientific 11320033
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Essential 6 medium Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal bovine serum (FBS) Peak Serum PS-FB1
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Fibronectin human protein, plasma ThermoFisher Scientific 33016015 Can be substituted with similar products
hESFM Thermo Fisher Scientific 11111044
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich 861502
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 500627 Can be substituted with similar products
PBS without calcium, magnesium Cytiva SH30256.01 Can be substituted with similar products
Pericyte Medium ScienCell 1201 Use complete kit (includes supplements)
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL ScienCell 0413
Triton X-100 JT Baker X198-05 Can be substituted with similar products
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen™ 10977015 Can be substituted with similar products
Experimental models: Cell lines
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line Sigma-Aldrich SCC066
Human brain vascular pericytes ScienCell 1200
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells WiCell RRID:CVCL_C437
Glassware and Plasticware
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid Falcon 353025
Clamps VWR MFLX06832-10
Corning tissue culture plates (6-well) Corning 3506
Flat 96-well non-binding microplates Greiner Bio-One 655900
Microscope Slide Device Holder  SiMPore USIM-SB Dimensions compatible with micropscope slide holders
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339653 Tube caps can be filled with water for cell culture
P20-200 pipette tips VWR 76322-516 Alternate brands may not seal as effectively into ports
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) CoStar 3401
Instruments
10X Objective (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD00105 Air; WD: 4 mm; NA 0.45
10X Objective (For Nikon) Nikon Instruments Inc. MRP40102 Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25
40X Objective (LWD) (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD77410 Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15
Andor Spinning Disc Confocal microscope Oxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope Nikon Instruments Inc. Can be substituted with similar products
TECAN Infinite M200 TECAN Can be substituted with similar products
Other
Advanced PAP Pen Millipore Sigma Z672548 2 mm tip is recommended
Assembly kit with fixtures SiMPore USIM-JIGSET Including fixure A1, A2, B1, and B2
Camera Adapter for Microscopes AmScope CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR Φ23.2 - Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera Canon EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 Can be substituted with similar products
Cell strainer, 40 µm Millipore Sigma (Corning) CLS431750
Component 1 SiMPore USIM-C1
Component 2 SiMPore USIM-C2
Membrane chips SiMPore NPSN100-1L Other chips formats are available
SMD handling tweezer double angle Techni-Tool 758TW003 "Chip Tweezers"
Stainless steel precision type GG tweezer Techni-Tool 758TW534 "Straight Tweezers"
Software
Fiji ImageJ For image processing
Fusion Oxford Instruments, Andor Instructions for version 2.3.0.44
i-control TECAN Instructions for version 2.0
Imaris Oxford Instruments For image processing. Instructions for version 9.9.0

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 203
रक्त-मस्तिष्क बाधा मॉडलिंग के लिए माइक्रोसिम (μSiM) बैरियर ऊतक मंच का उपयोग
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McCloskey, M. C., Kasap, P.,… More

McCloskey, M. C., Kasap, P., Trempel, M., Widom, L. P., Kuebel, J., Chen, K., Gaborski, T. R., Engelhardt, B., McGrath, J. L. Use of the MicroSiM (µSiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (203), e65258, doi:10.3791/65258 (2024).

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